一种产生物表面活性剂的混合菌及其筛选方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种油田微生物采油技术，尤其涉及一种产生物表面活性剂的混合菌 及其筛选方法。
【背景技术】
[0002] 强化采油是一类通过改善油藏及油藏流体的物理和化学特性，提高原油采收率的 开采技术。石油开采技术大致可以分为一次采油、二次采油和三次采油。一次采油是利用油 层中的天然能量进行的；二次采油是利用一定工艺技术恢复油层压力来进行油田开发的， 常见的为注水采油；此后提高采收率的技术属于三次采油。目前，除中东地区外，世界主要 产油国家的主力油田都已进入开发后期。因此大力开发各类新型三次采油技术，提高油井 采收率，对于提高原油产量，缓解石油危机意义重大。
[0003] 微生物可在石油勘探、采收和石油环保三方面发挥重要作用。我国在"九五"、 "十五"期间，先后对微生物采油技术立项攻关。中国石化与中科院合作，在胜利油田围绕石 油微生物技术进行了大量的室内基础研宄和矿场应用研宄。胜利油田1995年就建立了石 油微生物菌种库，已掌握了 120多种不同用途的菌种。石油微生物技术在石油工业的生产 过程中具有较强的适应性和广阔的应用前景，它不但能进一步提高石油采收率，延长油田 开发寿命，而且能够有效地降解石油污染物，解决油田生产中的原油污染问题，没有二次污 染。目前，世界采油工业采收率也就50%左右，美国能源部（DOE)的研宄表明，微生物可提 高采收率10% -15%，可延长油藏开发5-10年。挪威Statoil公司在Norne油田使用微生 物采油技术，结果增产7% -10%，预计在15年内可累计增3000万桶原油。我国胜利油田 在四个块区的微生物采油试验也已累计增油6万余桶。
[0004] 目前，世界各主要产油国都把微生物采油技术确定为新一代采油技术进行重点研 宄，在生物增产领域，新的生物表面活性剂制剂，可以应用在射孔、作业洗修井、完井等工艺 中，解决植物胶残渣的伤害，并有良好的降粘清洁油垢，诱导油流，不伤害油藏。用该技术完 井，在环境保护的有利基础上，比同类油井增产30%以上。然而，如何筛选产生物表面活性 剂的混合菌，尚未取得突破性进展。
【发明内容】
[0005] 为解决上述技术问题，本发明的目的是提供一种可生化提取得到高效的生物表面 活性催化制剂的产生物表面活性剂的混合菌的筛选方法。
[0006] 本发明提供一种产生物表面活性剂的混合菌，混合菌包括里氏木霉、施氏假单胞 菌和鼠李糖乳杆菌，其中里氏木霉购自中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心， 编号为CGMCC No. 3. 3711，施氏假单胞菌购自中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物 中心，编号为CGMCC No. 1. 10279,鼠李糖乳杆菌购自中国微生物菌种保藏管理委员会普通 微生物中心，编号为CGMCC No. 1. 2568。
[0007] 进一步的，里氏木霉的活菌数为总活菌数的10-20%，施氏假单胞菌的活菌数为总 活菌数的20-30%，鼠李糖乳杆菌的活菌数为总活菌数的50-70%。
[0008] 本发明还提供一种产生物表面活性剂的混合菌的筛选方法，包括以下步骤：
[0009] S1、采油菌挑选：包括以下11种菌株：
[0010] 购自中国普通微生物菌种保藏管理中心的：
[0011] 3. 3711 里氏木霉 Trichoderma reesei
[0012] 1. 10279 施氏假单胞菌 Pseudomonas stutzeri
[0013] 1. 926 铜绿假单胞菌 Pseudomonas aeruginosa
[0014] I. 2568 鼠李糖乳杆菌 Lactobacillus rhamnosus
[0015] 1. 1858 地衣芽抱杆菌 Bacillus Iicheniformis
[0016] 4. 1476 扭托甲基杆菌 Methylobacterium extorquens
[0017] 1. 6492 嗜热栖热菌 Thermus thermophiIus
[0018] 购自美国典型菌种保藏中心（ATCC)的：
[0019] ATCC?_ 43〇52?诺卡氏菌 Nocardioides luteus Prauser
[0020] ATCC? 39323?拟抱囊菌 Kibdelosporangium aridum subsp. aridum Shearer et al.
[0021] ATCC? 33911?脱硫杆菌 Desulfobacter postgatei
[0022] 购自英国典型菌种保藏中心（NCTC)的：
[0023] NCTC 10651 链杆菌 Streptobacillus moniliformis
[0024] S2、菌株活化及培养；
[0025] S3、血平板法初筛：采用血平板法初步筛选产生物表面活性剂的菌株，得到初筛发 酵液；
[0026] S4、排油圈法复筛：采用排油圈法复筛步骤S2中的初筛发酵液，得到产生物表面 活性剂的混合菌。
[0027] 本发明还提供产生物表面活性剂的混合菌，在制备生物表面活性剂上的应用。
[0028] 借由上述方案，本发明至少具有以下优点：
[0029] BER0?是利用微生物生化提取得生物表面活性催化制剂，在提高采油方面比微生 物生化更具直接性，效果反应快，是国内外油田化学最先进的提高采收率、强化采油的技 术。BER0?增产技术，具有适用范围广、工艺简单、投资少、见效快、不损伤油层和无污染等 优点，可以让低渗透的老油田重新获得强化生产。
[0030] 生物表面活性剂是微生物采油技术中较领先的技术，它运用基因工程、细胞工程、 酶工程等现代生物工程技术，具有高效释放固体粒子表面碳氢化合物（油）的能力。生物 表面活性剂是一种高效、环保型液体产品，具有非常高的释放固体表面原油的能力，可进行 生物降解，能迅速剥离固体表面的碳氢化合物（原油）。生物表面活性剂注入地层后，可以 将近井地带结晶、堆积在岩石颗粒上的蜡及沥青质剥落下来，一部分生物表面活性剂附着 在岩石表面，使岩石润湿性由油湿转变为水湿，降低原油在地层空隙中的流动阻力，使原油 从岩石颗粒表面释放，从微孔隙中析出，进入水中的BER0?分子，可以被水运送到砂岩地层 周围更远的地带，并打开新的流通通道，在砂岩地层中产生新的出油通道，达到注水井解堵 增注、油井解堵增产、驱油、提高采收率的目的。
[0031] 上述说明仅是本发明技术方案的概述，为了能够更清楚了解本发明的技术手段， 并可依照说明书的内容予以实施，以下以本发明的较佳实施例详细说明如后。
【具体实施方式】
[0032] 下面结合实施例，对本发明的【具体实施方式】作进一步详细描述。以下实施例用于 说明本发明，但不用来限制本发明的范围。
[0033] 实施例一
[0034] 本发明所涉及的培养基，具体如下：
[0035] I. 1斜面培养基
[0036] 牛肉膏3g，蛋白胨10g，氯化钠5g，琼脂20g，蒸馏水lOOOmL，pH7. 0，121°C蒸汽灭 菌 20min〇
[0037] I. 2种子培养基
[0038] 葡萄糖 5g，牛肉膏 3g，蛋白胨 10g，MgS04*7H202g，去离子水 lOOOmL，ρΗ7· 2,121°C 蒸汽灭菌20min。
[0039] I. 1淀粉培养基
[0040] 牛肉膏3g，蛋白胨10g，氯化钠5g，可溶性淀粉2g，琼脂20g，溶于1000 mL水中， 121°C蒸汽灭菌20min。
[0041] 1.3明胶培养基
[0042] 牛肉膏3g，蛋白胨10g，氯化钠5g，溶于IOOmL水中，加入明胶12~18g，在水浴锅 中将上述成分溶化，不断搅拌，溶化后调pH 7. 2~7. 4,121°C蒸汽灭菌30min。
[0043] 1. 4石蕊牛奶培养基
[0044] 牛奶粉 100g，石蕊 0. 075g，溶于 1000 mL 水中，pH6. 8,121°C蒸汽灭菌 15min。
[0045] 1. 5糖发酵培养基
[0046] 蛋白胨10g，氯化钠5g，溶于蒸馏水1000mL，调pH至7. 6。将上述培养基分装于试 管内，试管内放置德汉氏小管，121°C蒸汽灭菌20min。配置20%葡萄糖、乳糖溶液各10mL， 再121°0蒸汽灭菌3〇11^11。分别灭菌后，每管以无菌操作加入20%的无菌糖溶液0.5111匕
[0047] 1.6葡萄糖蛋白胨水培养基
[0048] 蛋白胨5g，葡萄糖5g，KH2P042g，溶于蒸馏水1000mL，调pH 7. 0~7. 2，过滤分装 后112°C蒸汽灭菌30min。
[0049] 1. 7朽1檬酸盐培养基
[0050] NH4H2P041g，K2HP041g，NaCI5g，MgS040. 2g，柠檬酸钠 2g，琼脂 20g，溶于蒸馏水 1000 mL中。将上述各成分加热熔解后，调pH至6. 8,加入指示剂I %溴麝香草酚蓝乙醇溶液 10mL，摇匀后脱脂棉过滤，再分装试管在121°C蒸汽灭菌20min后制成斜面。
[0051] L 8醋酸铅培养基
[0052] ?!17.4的牛肉膏蛋白胨琼脂1001^，硫代硫酸钠0.258，10%醋酸铅水溶液1111匕将 牛肉膏蛋白胨琼脂培养基IOOmL加热溶解，待冷却至60°C时加入硫代硫酸钠0. 25g，调pH 为7. 2,分装于三角瓶中，115°C蒸汽灭菌15min。取出后冷却至55~60°C，加入灭菌的10% 醋酸铅水溶液lmL，混匀后倒入灭菌试管。
[0053] 1. 9卵黄琼脂平板培养基
[0054] 酵母膏5g，蛋白胨10g，NaCI 10g，琼脂20g，5%卵黄悬液，溶于1000 mL水中，用IM NaOH 调 pH 至 7. 0,121°C 蒸汽灭菌 20min。
[0055] 1. 10硝酸盐培养基
[0056] 硝酸钾〇.2g，蛋白胨5g，蒸馏水1000mL。调pH至7.4，分装于试管中，121°〇蒸汽 灭菌15min 〇
[0057] I. 11血平板分尚培养基
[0058] 牛肉膏38，蛋白胨1(^，氯化钠58，琼脂15 8~2(^，蒸馏水10001^，？!17.0~7.2， 121°C蒸汽灭菌20min。在培养基冷却至45°C左右时，加入IOOmL新鲜猪血上清液，混匀。
[0059] 1.12 SOC 培养基
[0060] 胰化蛋