一种生物表面活性素的生产方法
【技术领域】
[0001] 本发明设及用芽抱杆菌属微生物发酵与分离表面活性素（Surfactin)的方法，具 体设及一种生物表面活性素的生产方法。
【背景技术】
[0002] 表面活性素（Surfactin)是一种由解淀粉芽抱杆菌合成的环肤，由于其分子结构 中存在亲水的肤键和疏水的脂肪酸链，使其具有极强的表面活性。Surfactin能与细胞膜发 生作用，造成细胞膜的穿孔导致细胞质外泄，从而干扰正常细胞结构。Surfactin除具有高 表面活性能W外，还被证实具有、抗肿瘤、抗支原体及抗病毒功效，因此被广泛用于医药、食 品、农业生防及养殖领域。
[0003] 在Sudactin的发酵过程中，由于其极强的表面活性，在通气和揽拌的过程中，培 养液会急剧起泡，不但影响氧气的传递速率，而且造成培养液逃液并增大染菌的风险。由于 Surfactin极强的表面活性，普通消泡剂不能起到很好的消泡效果。Davis等研究表明当培 养基中锭根被耗尽且处于厌氧环境时，硝酸根作为末端电子受体，Surfactin的产量增加。
[0004] SurfactinW胶束形式存在与水溶液中，其分离纯化成本较高。传统的分离方法主 要为酸沉淀。Surfactin在酸性条件下生产沉淀析出，但此时大分子蛋白、糖类及色素也随 之沉淀，造成样品纯度较低。Sen使用膜对Su计actin进行分离与浓缩;化en向Su计actin粗 提液中加入33%乙醇W破坏Su计actin胶束，并使用100脚a的PES膜截留Su计actin胶束。 化en使用0.2mm的中空纤维式聚氣乙締（PVDF)膜对SuWact in进行非分散萃取；Juang对 Surfactin粗提液进行反胶束萃取。但上述工艺均为实验室手段，进行工业化生产成本较 高。因此开发一种适用于工业化生产的分离方法有重要意义。
【发明内容】
[0005] 本发明的目的在于为了解决W上现有技术的不足而提供一种生物表面活性素的 生产方法，能够实现工业化大规模生产高纯度生物表面活性素，弥补目前生物表面活性素 不能大规模生产的不足。
[0006] 本发明的技术方案如下：
[0007] -种生物表面活性素的生产方法，其特征在于，包括生物表面活性素的发酵制备 与分离；
[000引其中发酵制备的过程为:先将保藏号为CGMCC No.6249的解淀粉芽抱杆菌fmb50接 种于PDA斜面培养基进行培养，再取PDA斜面培养基培养后的菌种接种于BPY种子培养基继 续培养，最后取BPY种子培养基培养后的菌种接种于发酵培养基培养后得到含有生物表面 活性素的培养液；
[0009]分离的过程为:将发酵培养基培养后得到的培养液加水使稀释因子为2.0-3.0,调 pH至4.0-6.0，于30-50°C恒溫保持10-60min，然后加入壳聚糖、海藻酸钢和娃藻±，揽拌混 合后过滤并弃去原始滤液;然后再加水过滤至后续滤液透光率达到90% W上，停止过滤，将 滤饼吹干;按照滤饼含水量加入低级醇，同时加入活性炭，将抑调至7.0 W上，使加入低级醇 后过滤的滤液透光率为90% W上，然后将滤液减压蒸馈得到生物表面活性素粗品；其中低 级醇加入体积的计算公式如下：
[0010] y = (1.665e^-2.3305e+0.8388)x,
[0011] 上式中，y代表单位质量滤饼所需体积，单位为L/kg，e代表滤液低级醇体积分数， 单位为％，X代表滤饼含水比例，单位为％。
[0012] 进一步地，所述发酵制备的过程中，解淀粉芽抱杆菌fmb50于PDA斜面培养基进行 培养的溫度为37°C，培养时间12-2地。
[0013] 进一步地，所述发酵制备的过程中，解淀粉芽抱杆菌fmb50于BPY种子培养基培养 的条件为37°C，180巧m培养10-1化。
[0014] 进一步地，所述PDA斜面培养基的配方为马铃馨150~200g/L、葡萄糖20g/L、琼脂 粉15-20g/L。
[0015] 进一步地，所述BPY种子培养基的配方为牛肉膏5g/L、酵母膏5g/L、化Cl 5g/L、蛋 白腺lOg/L、葡萄糖lOg/L、抑7.0。
[0016] 进一步地，所述发酵培养基的配方为黄豆粉50-100g/L、麦芽糊精10-30g/L、 K2HPO4 ? 3此0 9g/L、MgS〇4 ? 7出0 0.6g/L、CaCl2 0.1g/L、FeS〇4 ? 7此0 0.01g/L、MnS〇4 ?出0 0.05g/L、尿素 Ig/L、乳化硅油0.5mL/L、pH 7.0，其中麦芽糊精单独灭菌后加入。
[0017] 进一步地，W上发酵培养基的培养过程为:发酵培养溫度为33°C，菌种接种后维持 D0〉20%培养至发酵液中还原糖含量降低至5g/L，然后加入麦芽糊精4-8g/l;之后发酵培养 至DCK5 %且通过提高转速无法控制00巧％时，加入尿素 Ig/L，维持空气通量0.7-1WM，并维 持DCK5%，继续发酵;发酵全程中维持抑6.5 W上，当继续发酵培养至pH〉7.5、D0〉5%或培 养时间超过40h即可放罐。
[0018] 进一步地，分离的过程中加入的低级醇为甲醇、乙醇、异丙醇或正下醇中的一种。
[0019] 进一步地，分离的过程中加入壳聚糖的质量浓度为20-80mg/L，加入海藻酸钢的质 量浓度为30-50mg/L，加入娃藻±的质量体积百分比为1-3%，加入活性炭的质量浓度为4-lOg/Lo
[0020] 进一步地，分离的过程中所述的过滤为使用板框压滤。
[0021 ]与现有技术相比，本发明的有益效果如下：
[0022] (1)本发明通过将解淀粉芽抱杆菌fmb50进行扩大培养，得到了含有生物表面活性 素的发酵产物;再利用生物表面活性素在水溶液中可W形成胶束的特性，提供了一种分阶 段的生物活性酸提取手段，区别于传统的离屯、、萃取方法。
[0023] (2)本发明在分离生物表面活性素的过程中使用壳聚糖W及海藻酸钢进行絮凝， 然后结合絮凝与低级醇破坏胶束的原理，通过特定的公式计算得到的所用量的低级醇进行 生物表面活性素的有效提取，使得到的生物表面活性素的纯度W及回收率远远高于目前实 验室传统方法提取所达到的纯度与回收率，同时使用本发明提供的公式计算得到的低级醇 用量能够很好地兼顾滤饼W及所用低级醇的特性，达到了很好的提取效果的同时避免了过 量加入低级醇提取时所带来的提取液中生物表面活性素含量降低，杂质增加，脱色过程中 产物损失率增加等缺陷。
[0024] (3)本发明提供的生物表面活性素的生产方法能够实现工业化大规模生产，生产 条件易于控制，生产得到的产品纯度高，有效弥补了目前不能大规模制备生物表面活性素 的不足。
【附图说明】
[0025] 图1为表面活性素标准品液相色谱图；
[0026] 图2为表面活性素标准品标准曲线。
【具体实施方式】：
[0027] 实施例1:黄豆粉浓度对表面活性素产量的影响
[0028] 将解淀粉芽抱杆菌fmb50(保藏号CGMCC No.6249)在PDA斜面培养基上37°C培养 24h，之后接种一环于BPY种子培养基，37°C，ISOrpm培养1她，按3v/v%接种量接种于下述不 同碳源的培养基中，于33°C，180巧m培养36h。
[0029] 基础组分：葡萄糖20g/L、K2HP〇4 ? 3此0 9g/L、MgS〇4 ? 7出0 0.6g/L、CaCl2 O.lg/L、 FeS〇4.7出0 0.01g/L、MnS〇4 ?出0 0.05g/L、尿素 lg/L、pH 7.0、其中葡萄糖单独灭菌。向上 述组成中添加单独灭菌的40旨/1、60旨/1、80旨/1、100旨凡黄豆粉之一。通过册1村则定表面活性 素的含量(其标准品液相色谱图见图1)，并用外标法计算得到不同含量黄豆粉发酵产生表 面活性素的量(表面活性素标准曲线见图2)，见下表1:
[0030] 亲 1
[0031]
[0032] 实施例2:碳源对表面活性素产量的影响
[0033] 将解淀粉芽抱杆菌fmb50(保藏号CGMCC No.6249)在PDA斜面培养基上37°C培养 24h，之后接种一环于BPY种子培养基，37°C，ISOrpm培养1她，按3v/v%接种量接种于下述不 同碳源的培养基中，于33°C，180巧m培养36h。
[0034] 基础组分：黄豆粉80g/L、K2HP〇4 ? 3此0 9g/L、MgS〇4 ? 7出0 0.6g/L、CaCl2 O.lg/L、 FeS〇4.7出0 0.01g/L、MnS〇4 ?出0 0.05g/L、尿素 lg/L、pH 7.0。
[0035] 向上述组成中添加单独灭菌的下述碳源之一。
[0036] 10g/L、20g/L、30g/L的糖蜜、葡萄糖、可溶性淀粉、麦芽糖浆、麦芽糊精及其组合。
[0037] 离屯、培养液，通过下述HPLC方法对上清液中的表面活性素进行定量。
[0038] 下面显示各碳源发酵产生表面活性素的量，见下表2:
[0039] 表 2
[0040]
[0041 ]实施例3: IOL发酵罐中表面活性素的生产
[0042] 将解淀粉芽抱杆菌fmb50(保藏号CGMCC No.6249)在PDA斜面培养基上37°C培养 24h，之后接种一环于BPY种子培养基，37°C，ISOrpm培养16h，按1.5v/v%接种量接种于发酵 培养基，33°C、培养40h，所述发酵培养基配方为：黄豆粉80g/L、麦芽糊精20g/L、K2HP^ ? 3出0 9邑/1、]\%504.7出0 0.6邑/1、(：曰(：120.1邑/1、化504.7出0 0.01邑/1、]\1记04*出0 0.05邑/1、 尿素 Ig/L、乳化硅油0.5mL/L、pH 7.0,其中麦芽糊精单独灭菌后加入。接种后调节空气通量 1VVM，转速18化pm时调节溶氧为100%，维持空气通量1VVM，维持转速介于180与60化pm之间 进而保持D0〉20%，期间通过DNS法测定发酵液中的还原糖含量，当发酵培养至1她时还原糖 含量接近5g/L，不利于后续产物积累，此时加入麦芽糊精4g/l;继续培养至20h时，发酵液中 DCK5%且通过提高转速无法控制00巧％，此时取消DO与转速的关联，加入尿素 Ig/L，维持空 气通量0.7-1VVM，维持DCK5%继续发酵。当发酵至9形7.5、00巧％或培养时间超过4化即可 放罐。W上整个发酵过程中使用0.5M化OH调节并维持pH 6.5为W上。最终发酵液中 Surfactin为14.23g/L。
[0043] 实施例4:絮凝条件对表面活性素培养液絮凝效果的影响
[0044] 将壳聚糖用1%的冰醋酸配置成质量浓度为lOg/L的溶液，海藻酸钢用水配置成质 量浓度为lOg/L的溶液。将培养液加水稀释至稀释因子为3.0,分别进行1)将抑调节至4、5、 6,同时向其中加入50mg/L壳聚糖；2)将抑调节至5,加入20、30、40、