用于捕获生物活性剂的细胞标靶的组合物和方法
【专利说明】用于捕获生物活性剂的细胞标靶的组合物和方法
[0001] 相关申请的交叉引用
[0002] 本申请要求于2012年12月12日提交的序号为61/736, 426的美国临时专利申请； 以及于2013年9月19日提交的序号为61/883, 313的美国临时专利申请的优先权；这两篇 文献通过引入整体并入本文。
[0003] 领域
[0004] 本发明提供了用于捕获和鉴定生物活性剂的细胞标靶的组合物和方法。特别地， 本文提供了束缚至捕获配体、细胞标靶（内源的或者任选用报告分子标记的）、捕获蛋白 (任选作为捕获融合体存在）、表面（例如，展示捕获配体、捕获蛋白或捕获融合体）的生物 活性剂，以及以此来捕获和鉴定生物活性剂的细胞标靶的方法。
[0005] 背景
[0006] 细胞基表型筛选正越来越多地用于发现生物活性药物候选物。药物候选物的标靶 在细胞环境内天然地运行，并且它们如何与生物活性分子（例如，合成分子）相互作用受到 该环境的显著影响。为此，当试图鉴定生物活性分子的未知标靶时，优选在捕获用于鉴定前 使该标靶结合至活细胞内的生物活性分子。因此，在捕获前使结合发生于细胞裂解物中的 方法不是优选的。对于介导期望的生物活性的初级标靶而言以及对于可导致倾向性或干扰 的脱靶而言，情况确实如此。发现并验证这样的生物活性分子的蛋白标靶常常使用亲和富 集与质谱法的组合。这样的方法面临一些挑战。首先，靶分子与蛋白标靶之间经常的中度 结合至弱结合使其难以捕获靶蛋白或靶蛋白复合物，使结果偏向高亲和相互作用子。此外， 亲和富集法通常使用固定有候选靶分子的固体载体。当与溶液基动力学比较时，固体表面 上的结合动力学慢得多，进一步减少了捕获靶蛋白或靶蛋白复合物的机会。来自细胞裂解 物的蛋白与固体载体的非特异性结合导致高背景，这进一步复杂化使用质谱（MS)鉴定细 胞标靶。这样的方法常常导致大量的推定命中，使其必须进行二次筛选来验证潜在的标靶。 还需要开发和优化用于靶分子-蛋白相互作用的高通量验证测定，使其成为资源密集型方 法。
[0007] 概述
[0008] 在一些实施方案中，本发明提供了组合物和系统（例如，细胞、反应混合物、试剂 盒、容器等），其包含以下中的一种或多种（例如，所有）：(a)生物活性剂的细胞标靶；(b) 第一捕获蛋白和第二捕获蛋白的融合体；（c)束缚至第一捕获配体的所述生物活性剂，其 中所述第一捕获配体与所述第一捕获蛋白基于其相互作用形成共价键；以及（d)展示第二 捕获配体的固体表面，其中所述第二捕获配体与所述第二捕获蛋白基于其相互作用形成共 价键。在一些实施方案中，（a)包括生物活性化合物的多种细胞标靶。在一些实施方案中， 所述细胞标革El在细胞内表达为与报告分子的融合体。在一些实施方案中，所述报告分子是 生物发光报告分子。在一些实施方案中，所述报告分子是生物发光蛋白的部分、组分或亚 基。在一些实施方案中，所述生物发光报告分子包含与SEQ ID NO. :3具有至少70% (例 如，75%、80%、85%、90%、95%、98%、99%)序列同一性的多肽。在一些实施方案中，所述 第一捕获蛋白和第二捕获蛋白二者都包含与SEQ ID NO. :1的至少70% (例如，75%、80%、 85%、90%、95%、98%、99% )序列同一性。在一些实施方案中，所述融合体是同二聚物。在 一些实施方案中，所述生物活性剂是小分子。在一些实施方案中，所述细胞标靶是所述生物 活性剂的结合配偶体。在一些实施方案中，所述细胞标靶包括分子组合，例如，两个或更多 个蛋白的复合物，或者蛋白与核酸的复合物。在一些实施方案中，所述第一捕获配体和第二 捕获配体包含相同的分子结构。在一些实施方案中，所述固体表面选自由以下组成的清单： 孔、管、载片、板、基质、树脂、微流通道、毛细管、珠、颗粒（例如，微粒、纳米颗粒等）等。在 一些实施方案中，固体表面是磁性的。在一些实施方案中，固体表面是非磁性的。在一些实 施方案中，所述细胞标靶结合至所述生物活性剂，所述第一捕获蛋白结合至所述第一捕获 配体，并且所述第二捕获蛋白结合至所述固体表面上的所述第二捕获配体。
[0009] 在某些实施方案中，本发明提供捕获细胞标靶的方法，其包括以下步骤：(a)在使 所述细胞标靶结合生物活性剂的条件下，将束缚至第一捕获配体的所述生物活性剂施用至 包含所述生物活性剂的细胞标靶的细胞；(b)裂解所述细胞以产生细胞裂解物；（c)在所述 第一捕获配体与第一捕获蛋白形成共价键的条件下，使所述细胞裂解物与所述第一捕获蛋 白和第二捕获蛋白的融合体接触；(d)在所述第一捕获配体与所述第一捕获蛋白形成共价 键的条件下，使所述细胞裂解物与展示第二捕获配体的固体表面接触；以及（e)从所述细 胞裂解物分离所述固体表面。在另一些实施方案中，本发明提供捕获细胞标靶的方法，其包 括以下步骤：(a)在使所述细胞标靶结合生物活性剂的条件下，将束缚至第一捕获配体的 所述生物活性剂施用至包含所述生物活性剂的细胞标靶的细胞；(b)裂解所述细胞以产生 细胞裂解物；(c)使所述细胞裂解物与展示结合至第一捕获蛋白和第二捕获蛋白的融合体 的第二捕获配体的固体表面接触，其中所述第二捕获蛋白与所述第二捕获配体共价结合； 以及（d)从所述细胞裂解物分离所述固体表面。在一些实施方案中，所述细胞标靶是细胞 内源的。在一些实施方案中，所述细胞标靶是与报告分子的融合体。
[0010] 在某些实施方案中，本发明提供捕获细胞标靶的方法，其包括以下步骤：(a)在使 所述细胞标靶结合生物活性剂的条件下，将束缚至第一捕获配体的所述生物活性剂施用至 包含所述生物活性剂的细胞标靶的细胞；(b)在所述第一捕获配体与第一捕获蛋白形成共 价键的条件下，使所述第一捕获配体与所述第一捕获蛋白和第二捕获蛋白的融合体接触； (c)在所述第一捕获配体与所述第一捕获蛋白形成共价键的条件下，使所述捕获融合体与 展示第二捕获配体的固体表面接触；以及（d)从所述细胞裂解物分离所述固体表面。在一 些实施方案中，方法包括裂解细胞以形成裂解物的步骤。在另一些实施方案中，本发明提供 捕获细胞标靶的方法，其包括以下步骤：(a)在使所述细胞标靶结合生物活性剂的条件下， 将束缚至第一捕获配体的所述生物活性剂施用至包含所述生物活性剂的细胞标靶的细胞； (b)使所述第一捕获配体与展示结合至第一捕获蛋白和第二捕获蛋白的融合体的第二捕获 配体的固体表面接触，其中所述第二捕获蛋白与所述第二捕获配体共价结合；以及（C)从 所述细胞裂解物分离所述固体表面。在一些实施方案中，方法包括裂解细胞以形成裂解物 的步骤。在一些实施方案中，所述细胞标靶是与报告分子的融合体。在一些实施方案中，在 不进行细胞裂解的情况下，使步骤（a)和/或（b)的产物从细胞中排出（例如，分泌、胞吐、 活性去除）。
[0011] 在一些实施方案中，本发明提供细胞的细胞裂解物、细胞组分或细胞级分，其包 含：(a)生物活性剂的细胞标靶，以及（b)束缚至第一捕获配体的生物活性剂；所述细胞裂 解物还包含：(C)第一捕获蛋白和第二捕获蛋白的融合体，其中所述第一捕获配体与所述 第一捕获蛋白基于其相互作用而形成共价键，以及（d)展示第二捕获配体的固体表面，其 中所述第二捕获配体与所述第二捕获蛋白基于其相互作用而形成共价键。在一些实施方案 中，（a)包括生物活性化合物的多种细胞标靶。在一些实施方案中，所述细胞标靶是与报告 分子的融合体。在一些实施方案中，所述报告分子是生物发光报告分子。在一些实施方案 中，所述报告分子是生物发光蛋白的部分、组分或亚基。在一些实施方案中，所述生物发光 报告分子包含与SEQ ID NO. :3具有至少70% (例如，75%、80%、85%、90%、95%、98%、 99%)序列同一性的多肽。在一些实施方案中，所述第一捕获蛋白和第二捕获蛋白二者都 包含与 SEQ ID NO. :1 的至少 70% (例如，75%、80%、85%、90%、95%、98%、99%)序列 同一性。在一些实施方案中，所述融合体是同二聚物。在一些实施方案中，所述生物活性剂 是小分子。在一些实施方案中，所述细胞标靶是所述生物活性剂的结合配偶体。在一些实 施方案中，所述细胞标靶包括分子组合，例如，两个或更多个蛋白的复合物，或者蛋白与核 酸的复合物。在一些实施方案中，所述第一捕获配体和第二捕获配体包含相同的分子结构。 在一些实施方案中，所述固体表面选自由以下组成的清单：孔、管、载片、板、基质、树脂、微 流通道、毛细管、珠、颗粒（例如，微粒、纳米颗粒等）等。在一些实施方案中，所述细胞标靶 结合至所述生物活性剂，所述第一捕获蛋白结合至所述第一捕获配体，并且所述第二捕获 蛋白结合至所述固体表面上的所述第二捕获配体。
[0012] 在一些实施方案中，本发明提供了组合物和系统（例如，细胞、反应混合物、试剂 盒、容器等），其包含以下中的一种或多种（例如，所有）：(a)生物活性剂的细胞标靶；(b) 束缚至捕获配体的所述生物活性剂；以及（c)展示捕获蛋白的固体表面，其中所述捕获蛋 白与所述捕获配体基于其相互作用而形成共价键。在一些实施方案中，（a)包括生物活性化 合物的多种细胞标靶。在一些实施方案中，所述细胞标靶是细胞内源的。在一些实施方案 中，所述细胞标革G在细胞内表达为与报告分子的融合体。在一些实施方案中，所述报告分子 是生物发光报告分子。在一些实施方案中，所述报告分子是生物发光蛋白的部分、组分或亚 基。在一些实施方案中，所述生物发光报告分子包含与SEQ ID NO. :3具有至少70%序列 同一性的多肽。在一些实施方案中，所述捕获蛋白包含与SEQ ID NO. :1的至少70%序列 同一性。在一些实施方案中，本发明包括测量结合至所述固体表面或从所述固体表面释放 的生物发光的附加步骤（e)。在一些实施方案中，所述生物活性剂是小分子。在一些实施方 案中，所述小分子是合成分子。在一些实施方案中，所述小分子是蛋白功能抑制剂，例如酶 或受体的抑制剂。在一些实施方案中，所述细胞标靶包括分子组合，例如，两个或更多个蛋 白的复合物，或者蛋白与核酸的复合物。在一些实施方案中，所述细胞标靶是所述生物活性 剂的结合配偶体。在一些实施方案中，所述细胞标靶包括分子组合，例如，两个或更多个蛋 白的复合物，或者蛋白与核酸的复合物。在一些实施方案中，所述细胞标靶非共价地结合至 所述生物活性剂。在一些实施方案中，所述固体表面选自由以下组成的清单：孔、管、载片、 板、基质、树脂、微流通道、毛细管、珠、颗粒（例如，微粒、纳米颗粒等）等。在一些实施方案 中，所述细胞标靶结合至所述生物活性剂，并且所述捕获蛋白结合至所述捕获配体。在一些 实施方案中，所述细胞标靶非共价地结合至所述生物活性剂，并且所述捕获蛋白共价地结 合至所述捕获配体。在一些实施方案中，所述捕获配体是氯代烷。在一些实施方案中，所述 捕获配体包含连接体。在一些实施方案中，所述捕获配体包含氨基甲酸酯连接体。在一些 实施方案中，所述捕获配体包含可切割连接体。在某些实施方案中，所述捕获配体包含氨基 甲酸酯连接体和可切割连接体。
[0013] 在一些实施方案中，本发明提供组合物和系统（例如，反应混合物、试剂盒、容器 等），其包含：(a)束缚至捕获配体的生物活性剂；以及（b)展示捕获蛋白的固体表面，其中 所述捕获蛋白与所述捕获配体基于其相互作用形成共价键。在一些实施方案中，所述生物 活性剂非共价地结合至细胞标靶。在一些实施方案中，所述细胞标靶是细胞内源的。在一 些实施方案中，所述细胞标靶在细胞内表达为与报告分子的融合体。在一些实施方案中，所 述报告分子是生物发光报