肿瘤特异性t细胞受体的制作方法
【专利说明】肿瘤特异性T细胞受体 发明领域
[0001] 本发明涉及用于制备新型T细胞受体（TCR)的方法，所述新型T细胞受体提供降 低的免疫治疗（特别是过继性T细胞转移）中的不良事件的风险。根据本发明方法制备的 TCR对肿瘤细胞为特异的并且不与健康组织反应。另外提供编码本发明的TCR的核酸、包含 本发明的TCR的载体和宿主细胞以及这些化合物在治疗肿瘤性疾病中的用途。
[0002] 描述
[0003] 虽然在被诊断患有癌症的患者可用的诊断和治疗选项中取得显著的技术进步，但 预后经常仍然是不良的，许多患者不能被治愈。免疫疗法拥有为被诊断患有各种肿瘤的患 者提供有效的且靶向的治疗的希望，同时根除恶性肿瘤细胞而不会损害正常组织的潜力。 理论上，免疫系统的T细胞能够识别对肿瘤细胞特异的蛋白模式并且通过多种效应机理介 导其破坏。过继性T细胞治疗为利用并放大患者自身T细胞的根除肿瘤的能力，然后将这些 效应物以使得它们有效地消除残余的肿瘤而不会损害健康组织的状态返回至患者的尝试。 虽然该方法对肿瘤免疫学领域不是新的，但过继性T细胞治疗的临床使用中的许多缺点阻 碍该方法在癌症治疗中的全面使用。
[0004] TCR为免疫球蛋白超家族的异二聚体细胞表面蛋白质，其与参与介导信号传导的 CD3复合物的不变蛋白质相关。TCR以α β和γ δ形式存在，所述形式为结构上类似的，但 具有完全不同的解剖学定位以及可能具有完全不同的功能。天然异二聚体α β TCR的细胞 外部分由两条多肽组成，所述多肽中的每一条都具有膜近端的恒定结构域和膜远端的可变 结构域。恒定结构域和可变结构域中的每一种都包括链内二硫键。可变结构域含有与抗体 的互补决定区（CDR)类似的高度多态的环。TCR基因治疗的使用克服许多当前的障碍。其 允许患者自身的T细胞备有期望的特异性并在短的时段内生成足够数目的T细胞，从而避 免它们的耗尽。TCR将被转导入中央型记忆T细胞或具有干细胞特性的T细胞，这可以确保 转移后较好的持久性和功能。将TCR工程改造的T细胞输注入通过化疗或辐射而使淋巴细 胞减少的癌症患者，这允许有效的植入但抑制免疫抑制。表达人MHC分子和多种人TCR库 的转基因小鼠用作迅速分析肽抗原是否为免疫原性（即它们能由MHC分子有效地处理和呈 递吗？在免疫之后，它们能有效地诱导T细胞响应吗？）的工具（Li等人，2010Nat Med)。
[0005] 使用人TCR转基因小鼠，并非由小鼠基因组编码的任何人肽序列都适合于免疫并 且将产生具有最佳亲和力的TCR。最佳亲和力意指T细胞限于人自身的MHC分子并将肽抗原 识别为外来物，如代表不能耐受的库。通过使用肽/MHC多聚体，可分选转基因小鼠的特异 性T细胞，如通过单细胞PCR分离人TCR，优化TCR用于有效表达同时避免与内源性TCR的错 配并用于用病毒载体转导患者的T细胞（Uckert等人，2008Cancer Immunol Immunother; Kammertoens T 等人，2009Eur J Tmmunol) 〇
[0006] ATT的关键问题为靶向正确的抗原以预防肿瘤复发和毒性副作用。考虑到大数目 的推定的肿瘤抗原，这听起来简单。然而，大多数为肿瘤相关的（自身）抗原（TAA)。正常 细胞也表达TAA。通常不分析罕见但重要细胞的表达。此外，TAA表达在指定个体的肿瘤/ 转移内可为异质的。因此，靶向TAA具有对长期响应无效并破坏正常组织的风险。
[0007] 如针对Melan-A/MART-l、gp100 、HER-2和癌胚抗原的TCR(或嵌合抗体受体；CAR) 工程改造的T细胞的临床试验支持该假设。
[0008] Morgan RA和同事提供了一名患有过表达ERBB2的癌症的患者的病例报告，所述 患者通过将用识别ERBB2的嵌合抗原受体转导的T细胞输注入患者来治疗。在输注15分 钟后，患者经历呼吸性窘迫和显著的肺浸润。患者在5天后死亡。该显著结果强调在过继 性T细胞治疗的背景下毒性不良作用的问题。
[0009] 另一方法利用小鼠的免疫、T细胞和来自这些细胞的T细胞受体的随后分离以便 转导肿瘤患者自体的外周淋巴细胞。转导的淋巴细胞经扩增，然后再输注。虽然观察到肿 瘤消退，但患者仍显示正常细胞的破坏（Johnson LA等人，2009Blood)。
[0010] Parkhurst和同事（2010M〇1 Ther)基因工程改造患有标准治疗难以治疗的转移 性结肠直肠癌的患者的自体的T淋巴细胞。改变T淋巴细胞以表达针对癌胚抗原（CEA)的 鼠 T细胞受体。报告再次显示肿瘤的消退，然而在所有患者中具有严重的短暂性炎性结肠 炎作为副作用。
[0011] 因此，有效的过继性T细胞治疗对于许多（如果不是大部分）肿瘤相关抗原的显 著毒性为可预测的。
[0012] 鉴于上述【背景技术】的主要缺点，本发明的目标为提供过继性T细胞治疗的新型方 法，当基因工程改造的T细胞受体被引入自体淋巴细胞并再输注入人患者时，其可克服免 疫治疗中观察到的严重的副作用。本发明的更具体的目标为提供特异性靶向肿瘤细胞而非 健康细胞的新型抗原识别构建体。
[0013] 在本发明的第一方面，以上目标通过用于制备人T细胞受体（TCR)或T细胞的方 法解决，所述人T细胞受体或T细胞对肿瘤细胞为特异的并且减少过继性T细胞治疗中的 不良作用，所述方法包括以下方法步骤：
[0014] a.提供表达未重排的人TCR基因座的宿主生物体，
[0015] b.用包含对肿瘤特异性抗原（TSA)特异的表位的肽免疫所述宿主生物体，
[0016] c.从所述宿主生物体或细胞中分离对所述人突变的TSA具有活性的T细胞克隆，
[0017] d.任选地，从所述T细胞克隆分离TCR，
[0018] 其中所述TSA从体细胞突变的抗原类别中选出。
[0019] 本发明的令人惊讶的发现是，与本领域现有方法相比，如果突变的驱动癌症的癌 基因，特别是体细胞突变的抗原类别中的TSA，通过过继性T细胞治疗（ATT)靶向，则本领域 现状中已知的TAA的许多问题为已解决的。除了癌症病毒编码的抗原以外，突变的抗原为 唯一的肿瘤特异性抗原。
[0020] 当然，根据本文所述的本发明方法制备的TCR不但在过继性T细胞治疗中提供其 有利的作用，而且在任何其它治疗性方法提供其有利的作用，其中使用TCR与其靶标的特 异性结合。
[0021] 由于其降低的在过继性T细胞治疗中观察到的不良作用的风险，根据本发明的方 法分离的TCR优于本领域现有的抗原识别构建体。在过继性T细胞转移背景下的不良作用 主要是由于自身免疫反应或脱靶反应。本发明特别意在通过提供T细胞来解决前面的问 题，所述T细胞对肿瘤细胞为高度特异的并且不介导针对患者的健康组织的免疫反应。本 发明寻求减少在人自体的或同种异体的淋巴细胞输注后的不良事件可为不同的。在本发明 的优选实施方案中，当在过继性T细胞治疗中用于诱导健康组织损伤时，通过本发明获得 的TCR提供降低的风险，所述健康组织损伤可能导致水肿和坏死。
[0022] 在本发明的一个优选实施方案中，所述宿主生物体还包含用于表达人主要组织相 容性复合物（MHC)I或II类等位基因的转基因。优选地，MHC为人白细胞抗原（HLA)型， 其为已知的或疑似能够呈递所述突变的TSA。甚至更优选的为在所述宿主生物体中表达的 HLA型为已知的或疑似能够呈递来源于所述突变的TSA的肽。该肽应包含含有突变的氨基 酸序列，所述突变特别存在于与相同蛋白质的相应的未突变（野生型）版本相反的突变的 TSA 中。
[0023] 与MHC I类相应的HLA包括A型、B型和C型。HLA I类复合物呈递在呈递细胞内 处理的肽（包括外来肽，诸如病毒肽（如果出现的话））。通常，此类HLA I类肽是长度为约 9个氨基酸的小的聚合物。与MHC II类相应的HLA包括DP型、DM型、DOA型、DOB型、DQ型 和DR型。HLA II类复合物呈递源自细胞外的抗原。它们的长度可为12至18个氨基酸。 负责呈递选择的抗原的HLA等位基因的特性为本领域通常已知的方法。
[0024] 在根据本发明使用的所述宿主生物体中-在不是人的情况下-未重排的人TCR基 因座优选以所述宿主生物体的基因组中的一个或多个转基因存在。优选地，这些基因座编 码TCRa和β链，并且优选地包含多个，理想上所有人TCR V、D、J和/或C基因。
[0025] 对于根据本发明的方法，所述宿主生物体具有适应性免疫系统和/或能够增加所 述人TCR基因座内的VDJC重排优选为必要条件。此外，优选能够表达异源性TCR的宿主生 物体。在本发明的某些优选实施方案中，所述宿主生物体为转基因动物，优选为哺乳动物， 更优选为非人哺乳动物，最优选为小鼠、大鼠、驴、兔、野兔或猴或本领