一种基于树突状细胞的特异性肿瘤疫苗的制备方法
【专利摘要】本发明涉及一种基于树突状细胞的特异性肿瘤疫苗的制备方法。该制备方法包括：(1)在体外，在适当温度下利用适当强度的高静水对肿瘤组织或肿瘤组织来源的细胞压进行处理，引发肿瘤细胞发生凋亡；(2)将发生凋亡的肿瘤细胞与黄芪多糖溶液进行混合，对未成熟的人树突状细胞进行活化，得到成熟的树突状细胞，即所述疫苗。本发明通过高静水压在体外对肿瘤组织或肿瘤组织来源的细胞进行处理，引发肿瘤细胞发生凋亡；将凋亡的肿瘤细胞作为抗原性物质与一定浓度的黄芪多糖联用，在体外对树突状细胞进行活化，进而高效刺激抗原特异性T淋巴的激活，引发机体发生抗肿瘤特异性免疫反应。
【专利说明】一种基于树突状细胞的特异性肿瘤疫苗的制备方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种基于树突状细胞的特异性肿瘤疫苗的制备方法，属于细胞工程与 生物医药【技术领域】。
【背景技术】
[0002] 肿瘤已经成为继心血管疾病以外威胁人类健康的第二大杀手。目前，治疗肿瘤的 手段主要包括手术，放疗和化疗，除此以外，肿瘤免疫治疗已成为临床的第四大治疗方法， 具有十分广阔的应用前景。根据机体抗肿瘤的免疫效应机制，肿瘤免疫治疗可分为两类：主 动免疫治疗和被动免疫治疗。
[0003] 主动免疫治疗又包括非特异性主动免疫治疗和特异性主动免疫治疗。非特异性主 动免疫治疗是指应用一些免疫调节剂通过非特异性地增强机体的免疫功能，激活机体的抗 肿瘤免疫应答以达到治疗肿瘤的目的。特异性主动免疫治疗是指调动宿主自身的抗肿瘤免 疫机制，采用"瘤苗"给患者接种以诱导特异性肿瘤免疫反应。目前治疗用的瘤苗主要有肿 瘤细胞瘤苗、基因工程疫苗、抗独特型抗体瘤苗、抗原提呈细胞为基础的瘤苗。肿瘤的主动 免疫疗法与传统免疫疫苗的概念不同，主要不是用于肿瘤的预防，而是给机体输入具有抗 原性的肿瘤疫苗,刺激机体产生特异性抗肿瘤免疫，以达到治疗肿瘤、预防肿瘤转移和复发 的目的。
[0004] 肿瘤细胞疫苗是肿瘤疫苗的一种，其是指将自身或同种异体的肿瘤细胞，经过物 理因素（照射、高温）、化学因素（酶解）以及生物因素（病毒感染、基因转移等）的处理， 改变或消除其致瘤性，保留其免疫原性，对肿瘤治疗有一定疗效。
[0005] 树突状细胞（Dendritic Cells，DC)也是肿瘤疫苗的一种，DC是人体内抗原递呈 能力最强的细胞，具有强大的T细胞激活能力，并能活化初始型T细胞、刺激B淋巴细胞增 殖成熟、刺激Th细胞及NK细胞活性。DC能够诱导特异性抗肿瘤细胞毒T淋巴细胞（CTL)， 引发机体产生抗肿瘤免疫应答。它不仅能够激活自体的抗肿瘤免疫，同样能够提高异体的 抗肿瘤效应。因此，利用树突状细胞制备肿瘤疫苗可望提供一种有效的肿瘤免疫治疗方法。 通常情况下，人体内的DC细胞数量很少，只有在抗原递呈细胞正常发挥抗原递呈作用的时 候，身体才能有效识别病原，激活全身性免疫系统，产生正常的免疫反应。DC细胞治疗是指 通过采用患者自体的单个核细胞在体外培养诱导生成DC，然后负载相应的肿瘤抗原，制成 负载肿瘤抗原的DC细胞，再将这些DC细胞回输入患者体内，刺激体内的肿瘤杀伤性T淋巴 细胞增殖，发挥长期监视肿瘤作用和杀伤肿瘤作用，达到消灭肿瘤的目的。
[0006] 目前DC肿瘤疫苗的制备方法包括：应用肿瘤抗原肽致敏DC、应用肿瘤细胞的蛋白 提取物致敏DC、应用肿瘤抗原编码基因致敏DC、应用肿瘤全细胞抗原致敏DC等。由于目前 肿瘤特异性抗原或肿瘤相关抗原多肽获得明确鉴定的较少，因此以全部肿瘤抗原信息致敏 DC成为一种简便有实效的方法。如何通过安全、有效的方法制备DC细胞成为了本领域亟待 解决的问题。
【发明内容】
[0007] 为解决上述技术问题，本发明的目的在于提供一种基于树突状细胞（Dendritic Cells，DC)的特异性肿瘤疫苗的制备方法。具有安全有效、简单易行、易于推广实践等优点， 可通过本方法为临床提供肿瘤治疗用途的DC疫苗。
[0008] 为达到上述目的，本发明提供了一种基于DC细胞的特异性肿瘤疫苗的制备方法， 其是利用高静水压（High Hydrostatic Pressure，HHP)制备具有强免疫原性肿瘤抗原，联 合黄芪多糖（Astragalus Polysaccharids，APS)作为免疫佐剂，在体外对树突状细胞进行 活化，进而高效刺激抗原特异性T淋巴细胞的激活，引发机体发生抗肿瘤特异性免疫反应。 其包括以下步骤：
[0009] 在体外对肿瘤组织或肿瘤组织来源的细胞在一定适当温度下利用适当强度的HHP 进行处理，引发肿瘤细胞发生凋亡；在肿瘤细胞发生凋亡的48小时后，可以检测其免疫原 性细胞死亡标记表达水平；
[0010] 将HHP处理后的肿瘤细胞与适量的APS溶液混合，然后对人单个核细胞（PBMC)来 源的DC细胞进行活化，得到所述疫苗；可以使用流式细胞仪对DC细胞特定表面分子表达量 的水平进行检测，检测DC的成熟度；将自体淋巴细胞与一定比例的成熟DC细胞进行混合培 养，检测特异性T淋巴细胞的激活情况。
[0011] 肿瘤细胞的检测指标包括：细胞表面热激蛋白70(Heat Shock Protein70, Hsp70)，热激蛋白 90(Heat Shock Protein90，Hsp90)，|丐网织蛋白（Calreticulin，CRT)的 展示水平以及细胞内活化的caspase_3(Active caspase-3)含量等。Hsp70，Hsp90等家族 蛋白可以在肿瘤细胞凋亡时，与肿瘤细胞内的抗原肽结合形成复合物，该复合物可与肿瘤 细胞表面的MHC I类分子结合，通过MHC I类分子将抗原递呈给DC，或者肿瘤特异性T淋 巴细胞，促进后者活化，诱导机体的抗肿瘤免疫反应（王清，王林艳《细胞与分子免疫学报》 2013,29(1))。CRT分子展示到肿瘤细胞表面后可以作为"eat me"信号，吸引具有抗原递呈 作用的DC细胞与肿瘤细胞发生粘附，使后者活化后，启动肿瘤特异性免疫反应（洪超，高晓 明《生物物理学报》2012, 28 (8))，而Caspase-3则是细胞凋亡过程中最主要的终末剪切酶。
[0012] DC成熟度的检测指标包括：形态学观察、DC细胞表面标志物⑶80、⑶83和⑶86 等。在大多数组织中，DC以不成熟形式存在，主要发挥着"哨卫"的作用，有强大的摄取抗原 的功能。DC成熟后，其抗原捕获能力迅速下降，已捕获的抗原经其加工、处理后可迅速与其 胞质内的MHC-II类分子结合形成MHC-II/肽复合体，表达于DC表面，同时表达高水平的协 同刺激因子，如CD80、CD86等。成熟DC能有效的内化、加工和提呈可溶性抗原，并能激活初 始T细胞，启动T细胞介导的特异性免疫应答。另外，它能刺激B淋巴细胞增殖和分化，激 活自然杀伤（NK)细胞，同时具有向局部淋巴结迁移的能力。
[0013] 特异性T淋巴细胞激活的检测指标包括：使用流式细胞仪分析产生INF-Y的 CD8+T淋巴细胞的比例等。特异性T淋巴细胞活化水平的检测方法包括细胞因子检测法和 靶细胞杀伤能力测定法。特异性T细胞在活化后可以分泌一些具有特定功能的细胞因子， 例如INF- γ，介导细胞毒性杀伤作用。特异性T淋巴细胞分为不同亚群，一般情况下，CD8+T 淋巴细胞是发挥细胞毒杀伤活性的主要T淋巴细胞亚群。此外，活化后的特异性T淋巴细 胞可以通过细胞表现的T细胞受体（T cell Receptor, TCR)等分子，识别某些表达特异性 抗原分子的细胞，例如肿瘤细胞的表面分子，与其结合后通过释放穿孔素，颗粒酶等物质， 杀伤祀细胞；或者通过Fas受体（Fas ligand)介导祀细胞发生凋亡（潘景轩，马涧泉《免 疫学杂志》1997,01)。
[0014] 根据本发明的具体实施方案，优选地，上述制备方法包括以下具体步骤：
[0015] (1)在体外对不同类型的人肿瘤细胞用HHP进行处理，处理条件为HHP = 100MPa-600MPa，处理温度4°C -40°C，处理时间10分钟-60分钟。
[0016] (2)将HHP处理后的肿瘤细胞继续培养48小时，收集细胞，对细胞进行流式细胞术 检测，检测指标包括：Hsp70、Hsp90、CRT，以及使用ELISA方法对细胞内的Caspase-3活性 进行测定；将完成检测的肿瘤细胞以一定细胞密度冻存于液氮中备用。
[0017] (3)用密度梯度离心法从人外周血或机采血中分离获得单个核细胞（PBMC)，利用 贴壁法并配合使用特定细胞因子培养获取未成熟的DC细胞（iDC细胞）；将肿瘤细胞与iDC 细胞以一定比例混合，共孵育一段时间后，加入一定浓度的APS溶液，继续培养，获得成熟 DC细胞。
[0018] (4)对收获的DC细胞进行形态学观察，以及流式细胞术检测；并将DC细胞与自体 淋巴细胞以一定比例混合培养，检测特异性T淋巴细胞的激活情况；将完成检测的DC细胞 以一定细胞密度冻存于液氮中备用。
[0019] 在上述分离方法中，优选地，在步骤（1)中，人肿瘤细胞是患者自体来源的肿瘤细 胞或细胞系的肿瘤细胞。
[0020] 在上述分离方法中，优选地，在步骤（1)中，HHP的处理条件为100MPa_600MPa，更 为优选地，HHP的处理条件为200MPa-300MPa。
[0021] 在上述分离方法中，优选地，在步骤（1)中，处理温度4°C -25°C。
[0022] 在上述分离方法中，优选地，在步骤（1)中，处理时间为10分钟-60分钟；更为优 选地，处理时间为10分钟-30分钟。
[0023] 在上述分离方法中，优选地，在步骤（2)中，肿瘤细胞的培养条件为：培养基选用 添加10%胎牛血清的RPMI 1640培养基，37°C，5% CO2，饱和湿度的条件下培养继续培养48 小时。
[0024] 在上述分离方法中，优选地，在步骤（2)中，流式细胞术检测的细胞浓度为IOfVml。 用于检测Hsp70, Hsp90和CRT的样品用4%多聚甲醛室温固定10分钟。
[0025] 在上述分离方法中，优选地，在步骤（2)中，肿瘤细胞冻存时的细胞密度为IOfVml， 冻存液选择含有10% DMSO的可商购获得的冻存液。
[0026] 在上述分离方法中，优选地，在步骤（3)中，密度梯度离心法是利用细胞分离液进 行的单次密度梯度离心分离，抗凝外周血或机采血用生理盐水或PBS稀释，稀释后的血样 与分离液的比例为1-2 : 1，离心条件为2000rmp，离心温度为室温。
[0027] 在上述分离方法中，优选地，在步骤（3)中，贴壁法为本领域技术人员所公知的一 项技术方法。
[0028] 在上述分离方法中，优选地，在步骤（3)中，肿瘤细胞与iDC的比例为1 : 5,孵育 时间为12小时，孵育条件为：37°C，5% C02。
[0029] 在上述分离方法中，优选地，在步骤（3)中，APS溶液是注射用黄芪多糖的PBS溶 液，浓度为50-500 μ g/ml ;更为优选地，浓度为50-200 μ g/ml。
[0030] 在上述分离方法中，优选地，在步骤（3)中，加入APS溶液后的细胞培养条件为：可 商购的免疫细胞无血清培养基，37°C，5% C02。
[0031] 在上述分离方法中，优选地，在步骤（4)中，自体淋巴细胞的获得同样通过密度梯 度离心法，抗凝外周血或机采血用生理盐水或PBS稀释，稀释后的血样与分离液的比例为 1-2 : 1，离心条件为400g，离心温度为室温。
[0032] 在上述分离方法中，优选地，在步骤（4)中，DC细胞与自体淋巴细胞的比例为 1 : 10,细胞混合培养条件为：37°C，5% CO2，饱和湿度的条件下培养继续培养7天，其中，第 2天向培养基中加入IL-2,其浓度为20IU/ml。
[0033] 在上述分离方法中，优选地，在步骤（4)中，DC细胞冻存时的细胞密度为106/ml， 冻存液选择含有10% DMSO的可商购获得的冻存液。
[0034] 本发提供的基于树突状细胞的特异性肿瘤疫苗的制备方法，具有安全有效、简单 易行、易于推广实践等优点，可通过本方法为临床提供肿瘤治疗用途的DC疫苗。
【专利附图】
【附图说明】
[0035] 图la、图Ib和图Ic分别为T47-D、H1299和SW480三种肿瘤细胞经过HHP处理后检 测与凋亡相关蛋白hsp70、hsp90、CRT在细胞表面的展示水平及细胞内活化的Casepase-3 含量的结果比较图。
[0036] 图2a、图2b分别为T47-D和H1299两种肿瘤细胞在不同处理方法下刺激DC后， DC细胞表面标志物（⑶80、⑶83、⑶86)的检测结果比较图。
[0037] 图3为T47-D和H1299两种肿瘤细胞在不同处理方法下刺激DC后，成熟DC细胞 激活T淋巴细胞的检测结果比较图（INF-γ的⑶8+T淋巴细胞的比例）。
[0038] 图4为B16肿瘤细胞经过不同方法免疫C57小鼠后，小鼠体内分离得到的CTL对 靶细胞的杀伤活性比较图。
[0039] 图5为B16肿瘤细胞经过不同方法免疫C57小鼠后，小鼠体内DC细胞的活化水平 比较图。
【具体实施方式】
[0040] 为了对本发明的技术特征、目的和有益效果有更加清楚的理解，现对本发明的技 术方案进行以下详细说明，但不能理解为对本发明的可实施范围的限定。
[0041] 实施例IHHP处理肿瘤细胞与凋亡相关蛋白的检测
[0042] 分别选用人乳腺癌细胞系T47-D、人非小细胞肺癌细胞系H1299、人结肠癌细胞系 SW480用HHP进行处理（肿瘤细胞系均购自中国协和医科大学基础医学研究所），处理条 件为HHP = 250MPa，处理温度25°C，处理时间20分钟。处理后，细胞用含有10% FBS的 RPMI1640在37°C，5% CO2，饱和湿度的条件下培养继续培养48小时。对照组的肿瘤细胞使 用UV-B (240Jm/cm2)处理10分钟，之后56°C孵育30分钟；以及0. 5% H2O2处理10分钟，之 后培养24小时。
[0043] 培养后，收集细胞，用荧光标记抗体标记细胞结合流式技术检测处理后 细胞表面热激蛋白 70 (Heat Shock Protein70，Hsp70)，热激蛋白 90 (Heat Shock Protein90, Hsp90)，|丐网织蛋白（Calreticulin，CRT)的展示水平，以及细胞内活化的 caspase-3 (Active caspase-3)的含量（PE 标记的小鼠抗人 Hsp70 (LSBio 公司，Cat. No. LS-C63261-100) ;FITC 标记的小鼠抗人 Hsp90 (Creative Diagnostic 公司，Cat. No. DCABH-7606) ;APC 标记的小鼠抗人 Calreticulin(R&D 公司，Cat. No. FAB3898A)。 〇&8口386-3&(：1:;^;^7 38837 1^1:(031'公司，〇31:.1^〇.5723))。检测前，对样品处理的操作方 法为：将细胞收集后，IOOOrpm离心10分钟；用冷的PBS在相同离心条件下清洗细胞样品2 遍；计数，将细胞浓度调整为l〇 6/ml。用于检测Hsp70，HSp90和CRT的样品用4%多聚甲醛 室温固定10分钟。
[0044] 取5x10s个细胞作为检测样品，离心弃去上清，重悬于0. 2% BSA-PBS中，加入不同 的荧光标记抗体进行染色，分别标记Hsp70, Hsp90, CRT，避光室温孵育15min。孵育后样品 用PBS洗样品一次，再用PBS重悬于500 μ 1，用流式细胞仪检测上述分子在细胞表面或者细 胞内的含量。
[0045] Caspase-3 活性测定的检测按照 CST Caspase_3activity assay kit 检测试剂盒 的说明进行。
[0046] 分别用UV-B处理组，0. 5% H2O2处理组以及HHP处理组测得的荧光强平均值与阴 性对照组进行比较，计算相对倍数，比较不同处理组间的相对倍数，反应不同处理对凋亡肿 瘤细胞Hsp70, Hsp90, CRT在细胞表面的展示水平；以及Caspase-3活性的水平。
[0047] 分析结果表明，HHP处理组与UV-B处理组和0· 5% H2O2组相比，Hsp70，Hsp90以及 CRT再细胞表面的展示水平明显升高；同时细胞内的活化的Caspase-3水平也显著高于其 他两个处理组，说明：HHP比UV-B和H 2O2能更有效的诱导肿瘤细胞发生凋亡。
[0048] 同时HHP处理组的凋亡的肿瘤细胞中Hsp70, Hsp90和CRT的展示率更高，由此提 示，使用HHP处理后的凋亡的肿瘤细胞具有更强的免疫原性。
[0049] 所获细胞样品中的细胞密度为106/ml，保存体积为1ml，用无血清冻存液 (Cryostor CS10,美国Biolife Solutions公司）重悬后，冻存于液氮中。
[0050] 图la、图Ib和图Ic分别为T47-D、H1299和SW480三种肿瘤细胞经过HHP处理后检 测与凋亡相关蛋白hsp70、hsp90、CRT在细胞表面的展示水平及细胞内活化的Casepase-3 含量的结果比较图。
[0051] 实施例2HHP处理后的肿瘤细胞与黄芪多糖联合使用对PBMC来源的DC细胞的活 化作用
[0052] 将5ml细胞分离液（人单个核细胞分离液1. 077,货号25710,北京东方华辉生物 医药科技有限公司）加入到15ml离心管（德国SARSTEDT公司），再将5ml PBS缓冲液（北 京东方华辉生物医药科技有限公司）1 : 1稀释后的外周血样本沿管壁小心铺在细胞分离 液上，在温度为20°C，离心转速为2000rpm的条件下进行离心15分钟。然后停止离心，PBMC 在分离液和血浆的交界面形成比较明显的云雾层，利用移液管将血清层吸出并弃置不用， 再利用移液管小心将云雾状细胞条带吸出置入另一离心管中，加入5倍体积的Hank' S液 (北京东方华辉生物医药科技有限公司），1500rpm离心10min，洗涤细胞2次。末次离心后， 弃上清，加入含有10%小牛血清的RPMI 1640培养基（北京东方华辉生物医药科技有限公 司）重悬细胞，调整细胞浓度为l-1.5X108/ml。5% C0237°C孵育2-3h后，吸出培养液于另 一支离心管备用（用于制备自体淋巴细胞悬液）；应用PBS溶液2-3ml轻轻清洗培养瓶，力口 入浊61^^? 500叨/1111，浊11^-4200几/1111的10%小牛血清的1^]\0 1640培养液41111，继续于 5% C02, 37°C连续培养5天，在培养第3天半量换液，同时补加两种细胞因子保持其终浓度 不变，得到未成熟DC细胞（immature DC, iDC)。
[0053] 将获得的iDC以107ml接种于6孔培养板中，每孔1ml。将不同方法处理后的肿 瘤细胞，按照肿瘤细胞：iDC = 1 : 5的比例与未成熟的DC等体积混合；在37°C，5% CO2, 饱和湿度的条件下孵育12小时。
[0054] 取出培养板，加入配制好的APS溶液（天津赛诺制药有限公司，国药准字 Z20040086)加入含有肿瘤细胞和iDC的培养孔中，终浓度为lSOyg/ml ;或者是终浓度 为50ng/ml的TNF-α，阴性对照组加入等体积的PBS进行刺激活化，使iDC转化为成熟 DC(mature DC，mDC)。TNF-a是已被证实的用于体外刺激DC细胞成熟的有效的试剂，一 般使用的终浓度为500-1000IU/ml (谭广，任金帅等《中国普外基础与临床杂志》2006， 13(6))。
[0055] 实验分组如下表所示：
【权利要求】
1. 一种基于树突状细胞的特异性肿瘤疫苗的制备方法，其包括以下步骤： (1) 在体外，在适当温度下利用适当强度的高静水压对肿瘤组织或肿瘤组织来源的细 胞进行处理，引发肿瘤细胞发生凋亡； (2) 将发生凋亡的肿瘤细胞与黄芪多糖溶液进行混合，对未成熟的人树突状细胞进行 活化，得到成熟的树突状细胞，即所述疫苗。
2. 根据权利要求1所述的制备方法，其中，在步骤（1)中，所述温度为4°C-40°C，优选 地，所述温度为4°C -25°C。
3. 根据权利要求1所述的制备方法，其中，在步骤（1)中，所述强度为100MPa-600MPa， 优选地，所述强度为200MPa-300MPa。
4. 根据权利要求1所述的制备方法，其中，在步骤（1)中，处理时间为10分钟-60分 钟，优选地，处理时间为10分钟-30分钟。
5. 根据权利要求1所述的制备方法，其中，在步骤⑴中，凋亡的肿瘤细胞用液氮进行 冷冻保存。
6. 根据权利要求1所述的制备方法，其中，在步骤（2)中，肿瘤细胞与未成熟的人树突 状细胞的个数比例为1 : 5,对树突状细胞进行活化的时间为12小时，条件为：37°C，5% C02。
7. 根据权利要求1所述的制备方法，其中，在步骤（2)中，所述黄芪多糖溶液是注射用 黄芪多糖的PBS溶液，浓度为50-200 μ g/ml。
8. 根据权利要求1所述的制备方法，其中，在步骤（2)中，经过活化的树突状细胞用液 氮进行冷冻保存。
【文档编号】A61P35/00GK104258384SQ201410509973
【公开日】2015年1月7日 申请日期:2014年9月29日 优先权日:2014年9月29日
【发明者】赵宇, 谷荣杰, 朱宝森, 黄前荣, 王金凤, 赵凯龙, 李雷, 黄德川 申请人:北京时合生物科技有限公司