专利名称：一种树突状细胞肿瘤疫苗及其制备方法
技术领域：
本发明涉及一种生物疫苗及其制备方法，特别是涉及一种肿瘤疫苗及其制备方法。
背景技术：
常规的肿瘤治疗方法包括手术治疗、放射线治疗以及化疗等。但现有的肿瘤治疗方法往往不能解决肿瘤复发的问题。主要原因是构成肿瘤的细胞中含有肿瘤干细胞，其具有干细胞的生物学特性，即自我更新、多潜能分化、高耐受性，即对化疗药物的高耐药性。因此肿瘤干细胞是肿瘤发生和发展的真正元凶。树突状细胞(DC，Dendritic Cell)是人体内功能最强的专职抗原递呈细胞，具有活化初始型T细胞的功能。通俗地讲DC相当于信使，将抗原信息传递给可以发挥免疫效应 和杀伤功能的效应者即T细胞。树突状细胞肿瘤疫苗(DC肿瘤疫苗)是携带肿瘤抗原信息的功能性树突状细胞，能激活特异性T细胞产生免疫应答，产生抗肿瘤效应及免疫记忆功倉泛。DC肿瘤疫苗的优势以肿瘤抗原诱导DC并使其将肿瘤抗原信息传递给T细胞，使T细胞可以重新认识并杀伤肿瘤细胞。用不同形式的肿瘤抗原体外冲击致敏DC后，可以产生较强的抗肿瘤免疫，并能抑制肿瘤生长和转移。可在患者体内诱发免疫记忆，使患者体内获得长期的抗痛效应，防止肿瘤的复发。细胞因子诱导的杀伤细胞(CIK, cytokine induced killer cell)是一种新型的免疫活性细胞，它是将核细胞在体外用多种细胞因子共同培养一段时间后获得的一群异质细胞，由于该种细胞同时表达CD3和CD56两种膜蛋白分子，故又被称为NK细胞样T淋巴细胞，CIK细胞具有增殖速度快、杀瘤活性高、杀瘤谱广及非MHC限制性杀瘤的优点。CIK细胞、DC肿瘤疫苗临床可应用于多种癌症不同阶段的治疗，如肺癌(小细胞肺癌、鳞癌、腺癌等)及其转移癌。消化系统食道癌、胃癌、肝癌、胰腺癌、结、直肠癌及其转移癌。泌尿系统肾癌、肾上腺癌，及其转移癌。妇科肿瘤子宫癌、卵巢癌及其转移癌。血液系统急慢性白血病、淋巴瘤(除外T细胞淋巴瘤)，及其转移癌。其他肿瘤恶性黑色素瘤、鼻咽癌、乳腺癌、前列腺癌、舌癌等等。应用至今，未见肝肾损伤、骨髓抑制等重大临床不良反应报告，少部分患者可出现一过性类流感样症状，如发热、头痛，关节酸痛，按常规处理即可，大多可自行缓解。临床研究表明，DC与CIK细胞共培养可大大增强CIK细胞的数量和杀伤活性，提高CIK细胞治疗的临床疗效。利用负载肿瘤抗原的DC细胞与CIK细胞共孵育，可以同时促进细胞和DC的增殖及免疫功能，从而发挥CIK细胞的广谱杀瘤和DC激活的特异性抗肿瘤的双重效应。现有技术中的DC肿瘤疫苗，都是以普通肿痛细胞为靶标，即通过裂解普通肿痛细胞得到抗原，并将该抗原负载到患者的树突状细胞上。如此得到的靶向肿瘤细胞的树突状细胞用于治疗癌症，存在肿瘤在化疗后耐药性增加、复发和转移率高的问题。原因是肿瘤中的肿瘤干细胞并未被全部杀死，而造成癌组织死灰复燃的生长，甚至极少数的肿瘤干细胞还驱动肿瘤的形成。
发明内容
本发明所解决的技术问题是提供一种新的树突状细胞肿瘤疫苗(DC肿瘤疫苗)，其是以肿瘤干细胞为靶标，负载了通过裂解肿瘤干细胞得到的抗原组合物，在治疗时可以直接靶向杀死肿瘤干细胞，提高肿瘤疾病的治愈率。同时本发明还通过筛选具有多重耐药性的肿瘤干细胞来获取抗原组合物，使其适用于各类患者。本发明的另一个目的是提供上述树突状细胞肿瘤疫苗的制备方法。本发明采用的技术方案是一种树突状细胞肿瘤疫苗，其负载有多重耐药性肿瘤干细胞抗原组合物。
本发明提供的DC肿瘤疫苗中负载的抗原组合物来自于肿瘤组织本身，主要针对于肿瘤干细胞，具体是将肿瘤组织经过肿瘤干细胞原代分离、培养后得到肿瘤干细胞，再经过流式细胞仪筛选具有多重耐药性的肿瘤干细胞，最后经过全细胞抗原制备而得到。本发明的树突状细胞肿瘤疫苗的制备方法，包括以下步骤(I)对肿瘤组织进行原代分离和培养得到肿瘤干细胞；(2)采用流式细胞仪筛选具有多重耐药性的肿瘤干细胞；(3)将步骤⑵得到的肿瘤干细胞制备得到全细胞抗原；(4)分离树突状细胞并培养；(5)将步骤(3)得到的全细胞抗原与步骤⑷的树突状细胞共培养得到负载有多重耐药性肿瘤干细胞抗原组合物的树突状细胞肿瘤疫苗。由于利用负载肿瘤抗原的DC细胞与CIK细胞共孵育，可以同时促进CIK细胞和DC细胞的增殖及免疫功能，所以本发明的树突状细胞肿瘤疫苗的制备方法，还可以是以下步骤(I)对肿瘤组织进行原代分离和培养得到肿瘤干细胞；(2)采用流式细胞仪筛选具有多重耐药性的肿瘤干细胞；(3)将步骤⑵得到的肿瘤干细胞制备得到全细胞抗原；(4)分离树突状细胞(DC细胞)和细胞因子诱导的杀伤细胞(CIK细胞)并培养；(5)将步骤(3)得到的全细胞抗原与步骤(4)的树突状细胞和细胞因子诱导的杀伤细胞共培养得到负载有多重耐药性肿瘤干细胞抗原组合物的树突状细胞肿瘤疫苗。本发明采用的肿瘤组织为已从患者体内分离出的离体肿瘤组织，为临床医学中的废弃物，离体后可在适当环境中长期保存，而肿瘤干细胞的原代分离和培养技术已是十分成熟的技术，在体外环境中干细胞可长期保存并快速增值，可临床应用。而耐药性的肿瘤干细胞的筛选和全细胞抗原的制备方法也已是已知的技术。本发明的DC细胞或CIK细胞来自于外周血或脐带血，以来自于脐带血为优。外周血和脐带血可以通过专门储存的机构得到，如血库或脐带血库，也可在适当环境中长期保存，随取随用，适于临床应用。而DC细胞或CIK细胞的分离和培养技术也是已知的技术。本发明的树突状细胞肿瘤疫苗的制备方法，可以采用各种离体肿瘤组织来制备，如肺癌食道癌、胃癌、肝癌、胰腺癌、结、直肠癌、肾癌、子宫癌、卵巢癌组织等等。优选乳腺肿瘤组织。其中多重耐药性肿瘤干细胞的筛选的机制是基于肿瘤化疗耐药性的机制，多是由于多重耐药基因(MDRl)及其产物P-糖蛋白(Pgp)的表达增高，因此本方法基于抗原抗体反应的基本原理，采用流式细胞技术，对培养得到的肿瘤干细胞进行多重耐药基因(MDRl)及其产物P-糖蛋白(PgP)的检测，筛选出这两项表面标志物皆为阳性的细胞，即为多重耐药性的肿瘤干细胞。常规以普通肿瘤干细胞为靶标的癌症免疫治疗方法仍然存在放疗和化疗后肿瘤耐受性尤其是耐药性增加，复发率和转移率高的问题。本发明针对具有多重耐药性的肿瘤干细胞，用制备得到的抗原负载到树突状细胞上，并用所得树突状细胞疫苗来特异性杀伤肿瘤干细胞。树突状细胞疫苗相对于蛋白质、分子水平的疫苗来说，有以下优点①制备简单；②包含有多种T细胞表位，可保证免疫的全面性及强效性；③符合异质性肿瘤个体化治疗方案。
图I是DC-CIK细胞疫苗杀瘤实验结果图；图2是DC细胞疫苗杀瘤实验结果图。
具体实施例方式为进一步说明本发明，结合以下实施例具体说明本实施例以优选的乳腺肿瘤组织为干细胞来源，制备得到的DC肿瘤疫苗用于制备治疗乳腺肿瘤疾病的药物，但是本发明不仅仅限于乳腺肿瘤，其可以以任何其它肿瘤组织为干细胞来源，制备过程和治疗效果与本实施例类似或本领域技术人员可以通过有限次试验得到。一、乳腺癌干细胞的分离培养方法将肿瘤组织用含抗生素的生理盐水冲洗，用眼科手术剪刀剪碎，37°C酶消化2小时，并用细胞筛过滤，将细胞悬液用Stemedia WIT-1 Culture Medium(stemgent)培养。该培养基是针对于乳腺癌上皮细胞的专用培养基，无需其他细胞生长因子使细胞保持为腔上皮状细胞的形态，细胞会从上上皮细胞形态逐渐变化成类似腺癌细胞的形状。再换成Stemedia WIT-P Culture Medium (stemgent)培养基培养，三天换液一次，5天传代一次。二、乳腺癌干细胞的鉴定使用流式细胞仪对所培养的乳腺癌干细胞表面标志物进行培养，表型为⑶45-⑶31-TER119-(Lin_)⑶29+⑶24+，完全符合乳腺癌干细胞的细胞表型。多重耐药性乳腺癌干细胞的筛选由于肿瘤干细胞可能对毒物(如化疗药物)具有自身保护机制，对化疗药物更具耐药性。因此分离出具有多重耐药性的肿瘤干细胞，并对其进行靶向的治疗，为肿瘤的临床治疗提供指导作用。目前的文献中得知，肿瘤化疗耐药性的机制是由于多重耐药基因(MDRl)及其产物P-糖蛋白(PgP)的表达增高。因此本发明基于抗原抗体反应的基本原理，采用流式细胞技术，对培养得到的乳腺癌干细胞进行多重耐药基因(MDRl)及其产物P-糖蛋白(Pgp)的检测，筛选出这两项表面标志物皆为阳性的细胞，即为多重耐药性乳腺癌干细胞。其他肿瘤干细胞的多重耐药性的筛选标记也是这两种，筛选方法类似。三、肿瘤干细胞抗原组合物的制备方法用生理盐水洗涤并重悬干细胞；肿瘤干细胞热休克在39°C水浴锅里孵育干细胞2小时；肿瘤干细胞反复冻融使用筛选得到的具有多重耐药性实验的乳腺癌干细胞全细胞进行反复冻融，使细胞裂解，从而释放出全细胞抗原，由DC去选择肿瘤抗原并对其进行加工、呈递。冷冻的温度选择为零下196度，融化的温度选择为室温。由于经过热休克后，本发明的肿瘤干细胞会产生热休克蛋白，裂解后仍然存在所述热休克蛋白，热休克蛋白的存在有助于负载后的树突状细胞免疫应答。裂解完成后，通常通过离心和过滤的步骤除去裂解液中过大的细胞碎片。离心 600rpm, I分钟，上清用0. 45um滤膜过滤。四、制备DC来源于血库的脐带血或外周血，用淋巴细胞分离液获得浓缩白细胞，生理盐水洗涤的得到新鲜的单核细胞。DC诱导用RPM1640培养基重悬新鲜制备的单核细胞后铺于6孔细胞培养板中，放置于37°C，50ml/L C02培养箱中90min后，洗去未贴壁细胞，于培养板内加入含IOOug/LCM-CSF, 50ug/LRPM1640完全培养基，第3天进行换液，第5天收获iDC。抗原负载DC :用RPM1640完全培养基重悬imDC，加入前述制备的细胞抗原，37°C，50ml/L C02培养箱共同培养48小时，收获DC细胞。进行细胞技术和表型检测。五、负载多重耐药性乳腺癌干细胞疫苗对乳腺癌干细胞的杀伤作用的研究采用CCK-8检测自体/异体抗原负载的DC与CIK共培养以及无抗原负载的DC与CIK共培养、单独培养CIK对自体原代培养肿瘤干细胞的杀伤活性，为验证实验。多重耐药性乳腺癌干细胞的抗原组合物制备的DC疫苗对肿瘤干细胞的杀伤作用试验I、DC、CIK的体外诱导扩增、抗原负载及表型检测分离脐带血单个核细胞体外诱导制备DC、CIK细胞。于第8d天收集DC、CIK细胞，进行共培养，分为无抗原DC组，自体肿瘤全细胞抗原递呈DC组，异体肿瘤细胞裂解物抗原递呈DC组，以10 : I的比例与培养至第8d的CIK混合培养，三天后进行靶细胞杀伤实验。流式细胞仪检测DC表面成熟标志⑶83、⑶80、⑶86、HLA-DR的表达，CIK细胞检测⑶3、⑶4、CD8、CD56的表达。该产品对肿瘤细胞杀伤作用检测应用CCK-8法检测CIK，CIK-DC，CIK-DC-肿瘤干细胞抗原，分别对原代培养并筛选的多重耐药性肿瘤干细胞的杀瘤活性。CCK-8试剂可用于简便而准确的细胞增殖和毒性分析。其基本原理为该试剂中含有WST-8 [其化学名称为2-(2-甲氧基-4-硝基苯基)-3-(4-硝基苯基)-5-(2，4-二磺酸苯)-2H_四唑单钠盐],它在电子载体I-甲氧基-5-甲基吩嗪硫酸二甲酯(I-MethoxyPMS)的作用下被细胞线粒体中的脱氢酶还原为具有高度水溶性的黄色甲基染料(Formazandye)。生成的甲基化合物的数量与活细胞的数量成正比，因此可利用这一特性直接进行细胞增殖和毒性分析。2、实验结果
根据CCK-8试剂盒(Cell Counting Kit_8,上海碧云天生物技术有限公司)说明书设立对照组，本试验分为四组，一组为CIK组，一组为CIK-DC混合培养组，一组为肿瘤干细胞抗原负载的CIK-DC组，一组为只有肿瘤干细胞的对照组。应用CCK-8试剂盒检测特异性靶细胞杀伤率。测定492nm的吸光度值，最后根据公式[(试验孔-SR效应细胞-SR靶细胞)/ (MR靶细胞-SR靶细胞)]X 100%。实验共重复3次，对结果进行分析处理，比较各组细胞杀伤率的差异。CCK-8试剂ELISA法检测结果，经计算得到结果见表I和图I :表I
权利要求
1.一种树突状细胞肿瘤疫苗，其特征在于所述树突状细胞肿瘤疫苗负载有多重耐药性肿瘤干细胞抗原组合物。
2.根据权利要求I所述的树突状细胞肿瘤疫苗，其特征在于所述多重耐药性肿瘤干细胞抗原组合物是将肿瘤组织经过肿瘤干细胞原代分离、培养后得到肿瘤干细胞，再经过流式细胞仪筛选具有多重耐药性的肿瘤干细胞，最后经过全细胞抗原制备而得到。
3.根据权利要求2所述的树突状细胞肿瘤疫苗，其特征在于所述具有多重耐药性的肿瘤干细胞为多重耐药基因及其产物P-糖蛋白这两项表面标志物都为阳性的细胞。
4.权利要求I所述的树突状细胞肿瘤疫苗的制备方法，其特征在于包括以下步骤 (1)对肿瘤组织进行原代分离和培养得到肿瘤干细胞； (2)采用流式细胞仪筛选具有多重耐药性的肿瘤干细胞； (3)将步骤(2)得到的肿瘤干细胞制备得到全细胞抗原； (4)分离树突状细胞并培养； (5)将步骤(3)得到的全细胞抗原与步骤(4)的树突状细胞共培养得到负载有多重耐药性肿瘤干细胞抗原组合物的树突状细胞肿瘤疫苗。
5.权利要求I所述的树突状细胞肿瘤疫苗的制备方法，其特征在于包括以下步骤 (1)对肿瘤组织进行原代分离和培养得到肿瘤干细胞； (2)采用流式细胞仪筛选具有多重耐药性的肿瘤干细胞； (3)将步骤(2)得到的肿瘤干细胞制备得到全细胞抗原； (4)分离树突状细胞和细胞因子诱导的杀伤细胞并培养； (5)将步骤(3)得到的全细胞抗原与步骤(4)的树突状细胞和细胞因子诱导的杀伤细胞共培养得到负载有多重耐药性肿瘤干细胞抗原组合物的树突状细胞肿瘤疫苗。
6.根据权利要求4或5所述的制备方法，其特征在于所述步骤(I)中的肿瘤组织为乳腺肿瘤组织。
7.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于所述步骤(2)中采用流式细胞仪对培养得到的乳腺肿瘤干细胞进行多重耐药基因及其产物P-糖蛋白的检测，筛选出这两项表面标志物都为阳性的细胞，即为具有多重耐药性的乳腺肿瘤干细胞。
8.权利要求6或7所述的制备方法制备得到的树突状细胞肿瘤疫苗。
9.权利要求I所述的树突状细胞肿瘤疫苗在制备治疗肿瘤疾病的药物中的应用。
10.权利要求8所述的树突状细胞肿瘤疫苗在制备治疗乳腺肿瘤疾病的药物中的应用。
全文摘要
本发明涉及一种树突状细胞肿瘤疫苗，其负载有多重耐药性肿瘤干细胞抗原组合物。本发明提供的DC肿瘤疫苗中负载的抗原组合物来自于肿瘤组织本身，主要针对于肿瘤干细胞，具体是将肿瘤组织经过肿瘤干细胞原代分离、培养后得到肿瘤干细胞，再经过流式细胞仪筛选具有多重耐药性的肿瘤干细胞，最后经过全细胞抗原制备而得到。
文档编号A61K39/00GK102793912SQ201110137738
公开日2012年11月28日 申请日期2011年5月26日 优先权日2011年5月26日
发明者田杰 申请人:北京清美联创干细胞科技有限公司