抗肿瘤生长的dna疫苗及其使用方法

专利名称：抗肿瘤生长的dna疫苗及其使用方法
技术领域：
本发明涉及编码可有效引发抗肿瘤细胞免疫应答的适宜分子的脱氧核糖核酸(DNA)疫苗。更具体地说，本发明涉及编码癌症相关凋亡抑制家族(IAP)蛋白和免疫活性基因产物的DNA疫苗。本发明还涉及使用该DNA疫苗抑制肿瘤生长的方法。
背景技术：
通过给予非常有限的预防性制剂，疫苗已用于对多种疾病提供长期保护，所述预防性制剂可刺激机体免疫系统在病原体增殖和引起病理反应之前破坏病原体。关于疫苗和用疫苗接种的各种方法述于Bernard R.Glick and Jack J.Pasternak，Molecular Biotechnology，Principles and Applications of Recombinant DNA，Second Edition，ASMPress pp.253-276，(1998)。
接种疫苗是一种诱导机体自身免疫系统在感染物引起病理反应之前发现和消灭该感染物的方法。典型的疫苗是活的但减毒的感染物(病毒或细菌)或灭活形式的感染物。含活细菌或活病毒的疫苗必须是非病原性的。典型的细菌或病毒培养物通过物理或化学方式处理而减毒(弱化)。虽然这些感染物是非毒性的，但其仍可在疫苗治疗患者中引发免疫应答。
免疫应答由抗原引发，而抗原可以是特异性大分子或感染物。这些抗原通常是蛋白、多糖、脂质或糖脂，它们被称为B细胞和T细胞的淋巴细胞识别为“异物”。这两类淋巴细胞与抗原接触引发快速的细胞分裂和分化反应，导致形成接触淋巴细胞的多个克隆。B细胞产生浆细胞，后者又产生称为抗体(Ab)的蛋白，抗体可选择性结合感染性物中存在的抗原，从而中和或灭活病原体(体液免疫)。在某些情况下，B细胞应答需要CD4辅助T细胞的辅助。
针对抗原接触而形成的特异性T细胞克隆是细胞毒性T淋巴细胞(CTL)，其能够结合并除去存在抗原的病原体和组织(细胞介导免疫或细胞免疫)。在某些情况下，抗原提呈细胞(APC)如树突状细胞，通过胞吞作用包裹病原体或其它外源细胞。然后APC加工细胞中的抗原，并将这些抗原以组织相容性分子肽复合物的形式提呈至CTL上的T细胞受体(TCR)，由此刺激免疫应答。
以形成特异性抗体为特征的体液免疫通常对抗急性细菌感染和病毒的反复感染最有效，而细胞介导免疫对抗病毒感染、慢性胞内细菌感染和真菌感染最有效。已知细胞免疫还可起抗癌的保护性作用，并负责排斥器官移植。
针对先前感染抗原而产生的抗体在很长时间内都可以在血液中检测到，因而提供了检测以前接触的病原体的方法。当再次接触同一种病原体时，免疫系统可通过在该病原体增殖和产生病理反应之前除去病原体而有效预防其再感染。
有时，由病原体引发的免疫应答也可以由与病原体具有相同抗原的非病原物产生。在这种情况下，患者无需先前受到感染也可以得到抗随后接触的病原体的保护作用。
但是，并不是所有的感染物都可如疫苗配制所要求的那样轻易培养和灭活。现代重组DNA技术允许基因工程改造获得新疫苗，从而设法克服上述局限。可以创造缺失致病基因的感染物，由此可将活的、非毒性形式的微生物用作疫苗。也可以将相对非病原性的微生物如大肠杆菌工程改造为具有病原载体的细胞表面抗原。用这种转化载体接种的患者的免疫系统就会受到“欺骗”，由此形成针对该病原体的抗体。将病原物的抗原性蛋白进行工程改造，使其在非病原性物种中表达，可分离并纯化该抗原性蛋白，获得“亚单位疫苗”。亚单位疫苗具有稳定、安全、化学结构确定的优点；但其生产可能受到成本限制。
近年来出现了新的疫苗生产方法，广义地称为基因免疫。该方法是将编码病原物抗原的基因有效插入到要免疫患者的细胞中。处理细胞优选为抗原提呈细胞(APC)，例如树突状细胞，其经过转化，产生病原体的抗原性蛋白。然后，这些体内产生的抗原在宿主内引发所需的免疫应答。用于此类基因疫苗的遗传物质可以是DNA或RNA构建物。通常，将编码抗原的多核苷酸连同其它启动子多核苷酸序列一起导入，以增强基因的插入、复制或表达。
编码抗原基因的DNA疫苗可通过各种传递系统导入到患者的宿主细胞中。这些传递系统包括原核和病毒传递系统。例如，一种方法是用病毒性载体，如整合了新遗传物质的痘苗毒株，接种宿主细胞。另一种方法是可将遗传物质整合在质粒载体中，或作为“裸”多核苷酸(即简单作为纯化DNA)直接导入宿主细胞中。此外，DNA可稳定地转染到减毒细菌如鼠伤寒沙门氏杆菌(Salmonellatyphimurium)中。患者用转化的沙门氏杆菌(Salmonella)口服接种时，则细菌就转运到肠道的淋巴集结处(即次级淋巴组织)，然后刺激免疫应答。
DNA疫苗提供了免疫对抗不是由非传统病原体所引起的疾病(如遗传疾病和癌症)的良机。通常，遗传癌症疫苗将编码抗原的基因导入到APC中，如此转化的APC生产针对特定类型肿瘤细胞的抗原。因此，有效地抗多种癌症的通用疫苗可能需要多种能免疫对抗每种癌症细胞的单个疫苗。
凋亡抑制蛋白(即IAP-家族蛋白)是一类在多种不同肿瘤细胞中表达的天然抗原。顾名思义，这些蛋白以其天然形式抑制凋亡(即程序性细胞死亡)，而对凋亡的抑制又可导致癌症细胞对诱发凋亡的化疗剂如依托泊苷的抗性。IAP-家族蛋白的实例包括X染色体相关性IAP(XIAP)、NAIP、cIAP1(也称为BIRC2)、cIAP2(也称为BIRC3)、bruce(也称为BIRC6)、生存蛋白(也称为BIRC5)和liyin(也称为BIRC7、KIAP和ML-IAP)。哺乳动物IAP家族蛋白包括具有三个BIR结构域的蛋白(例如XIAP、cIAP1、cIAP2和NAIP)以及具有单个BIR结构域的蛋白(例如生存蛋白和livin)。
Tamm等，Cancer Res.1998；58(23)5315-20已经报道了人生存蛋白在60多种人肿瘤细胞系中表达。Tamm等还报道了生存蛋白和XIAP都有效抑制凋亡诱导剂如Bax或Fas(CD95)治疗癌症细胞所诱发的程序性细胞死亡(凋亡)。有报道指生存蛋白和IAP-家族蛋白通过结合效应细胞死亡蛋白酶如胱天蛋白酶-3和胱天蛋白酶-7抑制凋亡。IAP-家族蛋白突变可导致凋亡抑制活性乃至凋亡诱导活性相对野生型IAP-家族蛋白活性下降。IAP-家族蛋白的抗凋亡活性据信与BIR结构域相关。
生存蛋白据报道存在于大多数常见人癌症细胞中，包括肺癌、前列腺癌、乳癌和胰腺癌。此外，在高恶度非Hodgkin氏淋巴瘤中也鉴定出生存蛋白，但在低恶度非Hodgkin氏淋巴瘤中未鉴定出生存蛋白。据报道，胎儿发育期的正常细胞中存在生存蛋白，但与大多数其它IAP-家族蛋白不同，生存蛋白实际上在正常成年人组织中不能检出。参阅Ambrosini等，Nat.Med.1997；3(8)917-21。
已经在某些成人组织和胚胎组织中检测出livin。据报道livin在黑素瘤、结肠癌细胞、膀胱癌细胞和肺癌细胞中的表达水平提高。已经报道了两种livin剪接变体，它们都包含单个BIR结构域。全长α变体有298个氨基酸残基，而β变体有280个氨基酸残基。
除了人之外，还在其它多个物种中鉴定出IAP-家族蛋白，这些物种包括哺乳动物如小鼠、两栖动物如非洲爪蟾(Xenopus)属、昆虫如果蝇(Drosophila)属，以及杆状病毒。
生存蛋白在癌症细胞中普遍且高度选择性表达的特性使其成为潜在有用的癌症诊断标记。例如，据Rohayem等Cancer Res.2000；601815-17报道，已经在人肺癌和结直肠癌患者中鉴别出针对生存蛋白的自身抗体。
还已经将生存蛋白确定为癌症治疗靶点。生存蛋白对胱天蛋白酶-3和胱天蛋白酶-7的抑制作用与癌症细胞对各种凋亡刺激性化疗的抗性相关。已经报道了针对生存蛋白表达的反义寡核苷酸在腺癌细胞系中下调生存蛋白表达，并使癌症细胞对化疗剂依托泊苷敏化。参阅Olie等，Cancer Res.2000；602805-9；和Mesri等，J.Clinical Res.，2001；108981-990。
细胞因子是由细胞产生的可影响其它细胞行为的蛋白和多肽，所述细胞行为例如为细胞增殖、细胞分化、调节免疫应答、血细胞生成和炎症反应。细胞因子被分类为许多家族，包括趋化因子、血细胞生成素、免疫球蛋白、肿瘤坏死因子和各种未指定的分子。一般参见Oxford Dictionary of Biochemistry and Molecular Biology，Revised Edition，Oxford University Press，2000；和C.A.Janeway，P.Travers，M.Walport and M.Schlomchik，Immunobiology，Fifth Edition，Garland Publishing，2001(后文称为Janeway and Travers)。细胞因子的简明分类描述于Janeway and Travers，Appendix III，677-679页，该文献的相关公开内容通过引用结合到本文中。
血细胞生成素包括例如促红细胞生成素、白介素-2(IL-2，由T细胞产生的133个氨基酸的蛋白，参与T细胞增殖)、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-9、IL-11、IL-13、IL-15(114个氨基酸的IL-2样蛋白，其刺激肠上皮细胞、T细胞和NK细胞生长)、粒细胞集落刺激因子(G-CSF)、粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)、制癌蛋白M(OSM)和白血病抑制因子(LIF)。
干扰素包括例如IFN-α、IFN-β和IFN-γ(由T细胞和NK细胞产生的143个氨基酸的同源二聚体蛋白，其参与巨噬细胞活化、增加MHC分子和抗原加工元件的表达、IG类别转换以及TH2抑制)。
免疫球蛋白包括例如B7.1(CD80)和B7.2(CD86)，它们共刺激T细胞应答。
肿瘤坏死因子(TNF)家族包括例如TNF-α、TNF-β(淋巴毒素)、淋巴毒素-β(LT-β)、CD40配体、Fas配体、CD27配体、CD30配体、4-1BB配体、肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体(Trail)和OPG配体。
未指定具体家族的各种细胞因子包括例如肿瘤生长因子-β(TGF-β)、IL-1α、IL-1β、IL-1RA、IL-10、IL-12(天然杀伤细胞刺激因子；具有一条197个氨基酸的链和一条306个氨基酸的链的异源二聚体，其参与NK细胞活化和诱导T细胞分化为TH1-样细胞)、巨噬细胞抑制因子(MIF)、IL-16、IL-17(一种诱导细胞因子产生的因子，其在上皮细胞、内皮细胞和成纤维细胞中诱导细胞因子产生)和IL-18。
趋化因子是一个为相对较小的趋化蛋白和多肽的细胞因子的家族，其刺激各种细胞的迁移和活化，例如白细胞迁移(如吞噬细胞和淋巴细胞)。趋化因子对炎症和其它免疫反应起作用。趋化因子分类为多个家族，包括C趋化因子、CC趋化因子、CXC趋化因子和CX3C趋化因子。这些名称表示分子中半胱氨酸残基的数目和间隔；C趋化因子具有一个半胱氨酸，CC趋化因子具有两个连续的半胱氨酸，CXC趋化因子具有两个半胱氨酸，它们由一个氨基酸残基分隔，而CX3C趋化因子具有两个半胱氨酸，它们由三个氨基酸残基分隔。趋化因子作用于细胞表面上存在的多种趋化因子受体。参见Janeway andTravers，Appendix IV，680页，该文献的相关公开内容通过引用结合到本文中。
另外，趋化因子可具有免疫调节活性，参与对癌症的免疫应答。例如，鼠6Ckine/SLC是现在一般称为CCL21的人次级淋巴组织趋化因子(SLC)的小鼠类似物，据报道其在C-26结肠癌肿瘤细胞系中诱导抗肿瘤反应。参阅Vicari等，J.Immunol.2000；165(4)1992-2000。人CCL21及其鼠对应物6Ckine/SLC被分类为CC趋化因子，其作用于CCR7趋化因子受体。Vicari等还报道了鼠6Ckine/SLC(muCCL21)是CXCR3趋化因子受体的配体。人CCL21、鼠muCCL21和各种其它趋化因子都参与调节各种免疫系统细胞，例如树突状细胞、T细胞和天然杀伤(NK)细胞。
Mig和IP-10是作用于CXCR3受体的CXC趋化因子，CXCR3与T细胞活化有关。淋巴细胞趋化因子(Lymphotactin)是C趋化因子，作用于与T细胞和NK细胞相关的XCR1受体。Fractalkine是CX3C趋化因子，作用于与T细胞、单核细胞和嗜中性粒细胞相关的CX3CR1受体。
NK细胞是大颗粒淋巴细胞，识别并破坏感染病毒的细胞。NK细胞可由免疫调节多肽配体和NK细胞表面受体之间的相互作用调节。例如，可调节NK细胞活性的NKG2D受体的配体包括趋化因子如muCCL21，以及应激诱导性多肽配体如MHC I类链相关抗原和UL16结合蛋白。据报道，鼠H60次要组织相容性抗原肽也结合NKG2D受体。参阅例如Robertson等，Cell Immunol 2000；199(1)8-14；Choi等，Immunity 2002，17(5)593-603和Farag等，Blood，2002；100(6)1935-1947。
目前，急需可刺激抗癌症细胞的系统免疫应答的疫苗，本发明通过提供单一载体中的编码癌症相关IAP-家族蛋白和免疫活性基因产物的DNA疫苗而满足了该需要。
发明概述有效激发抗癌症细胞的免疫应答的DNA疫苗包含药物可接受载体中，DNA构建物，该DNA构建物有效编码癌症相关IAP-家族蛋白和免疫活性基因产物。所述DNA构建物优选有效整合入载体如减毒细菌(例如减毒鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella typhimurium)载体)中。DNA疫苗包括编码至少一种癌症相关IAP-家族蛋白的多核苷酸和编码免疫活性基因产物的多核苷酸。DNA构建物优选编码成人组织基本没有、但在癌症组织中增加的癌症相关IAP-家族蛋白，例如生存蛋白(如人生存蛋白、鼠生存蛋白等)或livin蛋白。由DNA构建物编码的免疫活性基因产物优选为细胞因子、天然杀伤细胞表面受体的配体或类似的免疫活性分子。
在一个实施方案中，DNA疫苗优选包含有效编码生存蛋白的DNA，所述生存蛋白选自(a)具有SEQ ID NO2氨基酸残基序列的野生型人生存蛋白；(b)其氨基酸残基序列与SEQ ID NO2至少80％相同的野生型人生存蛋白的免疫原性同源物；(c)具有SEQ ID NO23氨基酸残基序列的人生存蛋白剪接变体；(d)具有SEQ ID NO24氨基酸残基序列的人生存蛋白剪接变体；和(e)结合MHC I类分子并由细胞毒性T细胞识别的生存蛋白片段。
在又一个实施方案中，DNA疫苗优选包含有效编码livin蛋白的DNA构建物，所述livin蛋白选自(a)具有SEQ ID NO27氨基酸残基序列的全长野生型人livin α剪接变体；(b)具有SEQ ID NO29氨基酸残基序列的人livinβ剪接变体；(c)其氨基酸残基序列与SEQ IDNO27至少80％相同的全长野生型人livin的免疫原性同源物；(d)其氨基酸残基序列与SEQ ID NO29至少80％相同的野生型人livinβ剪接变体的免疫原性同源物；和(e)结合MHC I类分子并由细胞毒性T细胞识别的livin蛋白片段。
优选的细胞因子包括趋化因子，如人CCL21、鼠CCL21、淋巴细胞趋化因子、Fractalkine、IP-10等；血细胞生成素，如IL-2、IL-15等；干扰素，如IFN-γ等；以及其它与T细胞和NK细胞迁移或增殖相关的细胞因子，如IL-12、IL-17等。
优选的天然杀伤细胞表面受体配体是结合NKG2D细胞表面受体的应激诱导性蛋白，如人MICA、人MICB、人ULBP1、人ULBP2、人ULBP3等。特别优选的NKG2D配体是MICA和MICB。
疫苗中也可存在常规佐剂如铝、水包油乳液、防腐剂等。本发明的DNA疫苗刺激抗肿瘤细胞的免疫应答，包括刺激肿瘤细胞凋亡，由此抑制肿瘤生长和转移。
在本发明的方法方面，DNA疫苗用于在疫苗接种患者中提供肿瘤生长的长期抑制。将药物可接受载体中的包含有效编码IAP-家族蛋白和免疫活性基因产物的多核苷酸构建物的DNA疫苗，以足以激发抗肿瘤细胞免疫应答的量，给予(优选口服)需要抑制肿瘤生长的患者。
本发明疫苗可用于治疗各种类型的癌症。例如，患肺癌、结直肠癌、黑素瘤等的患者，可受益于本发明疫苗的免疫。
附图简述在附图中，

图1显示编码人生存蛋白的核酸序列SEQ ID NO1；图2显示人生存蛋白的氨基酸残基序列SEQ ID NO2；图3显示编码鼠TIAP的核酸序列SEQ ID NO3；图4显示鼠TIAP的氨基酸残基序列SEQ ID NO4；图5显示人生存蛋白和鼠TIAP之间的蛋白同源性；图6显示编码人SLC(CCL21)的核酸序列SEQ ID NO5；图7显示人SLC(CCL21)的氨基酸残基序列SEQ ID NO6；图8显示编码鼠6Ckine/SLC(muCCL21)的核酸序列SEQ IDNO7；图9显示鼠6Ckine/SLC(muCCL21)的氨基酸残基序列SEQ IDNO8；图10显示人SLC(CCL21)和鼠6Ckine/SLC(muCCL21)之间的蛋白同源性；图11显示编码鼠次要组织相容性抗原肽H60的部分核酸序列SEQ ID NO9；图12显示次要组织相容性抗原肽H60的部分氨基酸残基序列SEQ ID NO10；图13图示在pBudCE4.1载体中的编码生存蛋白(鼠生存蛋白，也称为TIAP)和免疫调节细胞因子(CCL21，也称为SLC)的DNA构建物；图14A图示用对照缓冲液(E)、含空载体的对照疫苗(D)、含趋化因子的DNA疫苗(C)、含生存蛋白的疫苗(B)和本发明疫苗(A)治疗的小鼠中Lewis肺癌肺转移瘤的平均肿瘤体积；图14B包括由图14A所述接种小鼠切除的典型肺癌转移瘤的图片；图15显示由图14A所述DNA疫苗诱导的抗D121肺癌细胞的T细胞介导细胞毒性；对每类接种，以裂解百分率(Y轴)对三个不同的效应细胞/靶细胞(E/T)比率作图(即100∶1，第一个数据点；50∶1，第二个数据点；和25∶1，第三个数据点)；图16根据流式细胞仪分析测定，图示说明本发明疫苗接种小鼠中T细胞活化分子的表达上调；图17图示说明本发明疫苗和各种对照疫苗接种小鼠后树突状细胞对共刺激分子的表达增强；图18根据流式细胞仪分析测定，图示说明本发明疫苗和各种对照疫苗接种小鼠后诱导胞内细胞因子释放；图19显示FACS图，表明用本发明疫苗和各种对照疫苗对小鼠(A)接种后3小时和(B)接种后24小时D121肺癌细胞的凋亡增加；图20图示整合TIAP和次要组织相容性抗原肽H60的表达构建物；图21图示对分离自本发明疫苗接种小鼠的脾细胞的细胞毒性测定的数据；
图22显示由实施例10所述接种小鼠切除的肺(顶部)和治疗组小鼠平均肺重量的条图(底部)；图23图示接种并用CT-26肿瘤细胞攻击的小鼠的生存百分率；图24图示H60肽(A)和鼠生存蛋白(B)的表达；图25显示编码6CKine/SLC的CCL21b变体的核酸序列SEQ IDNO11；图26显示6CKine/SLC的CCL21b变体的氨基酸残基序列SEQ IDNO12；图27显示编码人MICA的核酸序列SEQ ID NO13；图28显示人MICA的氨基酸残基序列SEQ ID NO14；图29显示编码人MICB的核酸序列SEQ ID NO15；图30显示人MICB的氨基酸残基序列SEQ ID NO16；图31显示编码人ULBP1的核酸序列SEQ ID NO17；图32显示人ULBP1的氨基酸残基序列SEQ ID NO18；图33显示编码人ULBP2的核酸序列SEQ ID NO19；图34显示人ULBP2的氨基酸残基序列SEQ ID NO20；图35显示编码人ULBP3的核酸序列SEQ ID NO21；图36显示人ULBP3的氨基酸残基序列SEQ ID NO22；图37显示人生存蛋白剪接变体生存蛋白-2B(SEQ ID NO23)和剪接变体生存蛋白-ΔEx3(SEQ ID NO24)的氨基酸残基序列；图38是检索号NP 005922的GENBANK记录副本，描述了MICB的等位基因变异体；图39显示编码全长人livinα剪接变体的核酸序列SEQ ID NO26；图40显示人livinα剪接变体的氨基酸残基序列SEQ ID NO27；图41显示编码人livinβ剪接变体的核酸序列SEQ ID NO28；图42显示人livin β剪接变体的氨基酸残基序列SEQ ID NO29。
优选实施方案详述有效激发抗肿瘤细胞的免疫应答的DNA疫苗包含有效编码IAP-家族蛋白和免疫活性基因产物的DNA构建物。本文和后附权利要求书中使用的术语“DNA构建物”是指可在靶细胞中转录的合成DNA结构。该构建物可包含线性核酸，如纯化DNA、整合到质粒载体中，DNA或整合到任何其它适于将DNA导入宿主细胞的载体的DNA。优选所述DNA整合到病毒或细菌载体中，更优选整合到非致病性减毒病毒或细菌载体中，最优选整合到减毒细菌载体中。
本文使用的术语“免疫性”指抗毒性感染物或肿瘤抗原的长期免疫保护。术语“免疫接种”指预防性接触非毒性来源的病原体抗原，使受治疗患者对该病原体产生免疫性。
本文使用的术语“抗体”是指特异性结合抗原的为糖基化蛋白、免疫球蛋白的分子。
本文使用的术语“抗原”是指这种物质当其导入到免疫活性动物中时，刺激产生可结合该抗原的一种或多种特异性抗体。本文使用的术语“免疫原”是指这种物质其自身不能刺激抗体产生，但如果与载体组合就可以。
本文使用的术语“保守置换”是指一个氨基酸残基由另一个生物学相似的残基置换。保守置换的实例包括一个疏水残基如异亮氨酸、缬氨酸、亮氨酸或甲硫氨酸由另一个疏水残基置换，或者一个亲水残基如精氨酸由赖氨酸置换或反之，谷氨酸由天冬氨酸置换或反之，或谷氨酰胺由天冬酰胺置换或反之，等等。
本文使用的术语“大致相当于”以各种语法形式修饰肽序列时，是指所述肽序列在其氨基端和羧基端的任一侧或两侧加或减至多3个氨基酸残基，并在多肽序列上仅包含保守置换。
本文及后附权利要求书使用的术语“免疫活性基因产物”及其语法变体包括具有免疫调节活性的蛋白和多肽，例如作用于T细胞和NK细胞并调节其活性的蛋白和多肽。
本文及后附权利要求书使用的术语“IAP-家族蛋白”包括在肿瘤细胞中表达的、以其天然形式抑制凋亡的任一类天然抗原。IAP家族蛋白包括例如人生存蛋白、人X染色体连锁-IAP(XIAP)、鼠TIAP(生存蛋白的鼠类似物)、人livin、人c-IAP-1、人c-IAP-2、人NAIP、任何包括至少一个杆状病毒凋亡抑制重复蛋白(BIR)结构域的其它蛋白或其同源物。BIR结构域存在于所有的野生型IAP-家族蛋白中。该结构域包含4个相对较短的α-螺旋和一个三链反向平行β折叠结构区。该结构域用三个半胱氨酸残基和一个组氨酸残基结合Zn，它们在IAP-家族蛋白中是保守的。本文及后附权利要求书使用的术语“IAP-家族蛋白”还包括野生型IAP蛋白的变体，例如剪接变体和置换变体等，以及其结合主要组织相容性(MHC)I类分子并由细胞毒性T细胞识别的片段和免疫原性同源物(即生存蛋白表位)。
本文及后附权利要求书使用的术语“癌症相关”在修饰IAP-家族蛋白时是指在癌症细胞中的表达水平比在正常非癌症细胞中的表达水平高的IAP-家族蛋白。癌症相关IAP-家族蛋白的实例包括但不限于人生存蛋白和人livin。
本文及后附权利要求书使用的术语“生存蛋白”包括全长人生存蛋白分子(SEQ ID NO2)、其全长鼠类似物(即本文所述的TIAP)、人生存蛋白或鼠生存蛋白变体如剪接变体和置换变体，以及结合主要组织相容性(MHC)I类分子并由细胞毒性T细胞识别的人生存蛋白片段(例如表位)和人生存蛋白免疫原性同源物。已知的人生存蛋白置换变体包括在SEQ ID NO2氨基酸残基序列中具有T34A置换的蛋白、在SEQ ID NO2氨基酸残基序列中具有D53A置换的蛋白以及在SEQ ID NO2氨基酸残基序列中具有C84A置换的蛋白(参见Song等，Mol.Biol.Cell，2004；15(3)1287-1296，2003年12月29日电子出版)。这些已知变体每个都具有凋亡活性，与野生型生存蛋白具有抗凋亡活性相反。
在一个优选实施方案中，本发明的DNA疫苗包含有效编码生存蛋白的DNA构建物，所述生存蛋白例如为具有SEQ ID NO2氨基酸残基序列的野生型人生存蛋白、其氨基酸残基序列与SEQ ID NO2至少80％相同的野生型人生存蛋白的免疫原性同源物、具有SEQ IDNO23氨基酸残基序列的人生存蛋白剪接变体、具有SEQ ID NO24氨基酸残基序列的人生存蛋白剪接变体，以及结合MHC I类分子并由细胞毒性T细胞识别的生存蛋白片段。
本文及后附权利要求书使用的术语“livin蛋白”包括全长人livinα剪接变体(SEQ ID NO27)、人livinβ剪接变体(SEQ ID NO29)、人livinα和β剪接变体的置换变体，以及结合MHC I类分子并由细胞毒性T细胞识别的livin蛋白片段和免疫原性同源物。
在另一个优选实施方案中，本发明的DNA疫苗包含有效编码livin蛋白的DNA构建物，所述livin蛋白例如为具有SEQ ID NO27氨基酸残基序列的全长野生型人livinα剪接变体、具有SEQ ID NO29氨基酸残基序列的人livinβ剪接变体、其氨基酸残基序列与SEQ IDNO27至少80％相同的全长野生型人livin的免疫原性同源物、其氨基酸残基序列与SEQ ID NO29至少80％相同的野生型人livinβ剪接变体的免疫原性同源物，以及结合MHC I类分子并由细胞毒性T细胞识别的livin蛋白片段。
本文及后附权利要求书使用的术语“免疫原性同源物”及其语法变体当用于修饰癌症相关IAP-家族蛋白如生存蛋白和livin时，是指与野生型癌症相关IAP-家族蛋白具有高度同源性的蛋白，其可结合MIC I类分子，并可由对相应野生型IAP-家族蛋白有活性的细胞毒性T细胞识别。免疫原性类似物优选其氨基酸残基序列与野生型癌症相关IAP-家族蛋白至少约80％相同，更优选至少约90％相同，最优选至少约95％相同。
非为理论所囿，相信用本发明疫苗接种患者如人类患者，可使来源于癌症相关IAP-家族蛋白的抗原选择性提呈至免疫细胞如抗原提呈细胞的表面，另外还在这些细胞中选择性表达免疫活性基因产物。抗原提呈细胞表面上癌症相关IAP-家族蛋白如生存蛋白或livin蛋白的提呈增加，结合免疫活性基因产物如细胞因子或NK细胞表面受体的配体的表达，导致对表达癌症相关IAP-家族蛋白如生存蛋白或livin蛋白的癌症细胞的免疫应答增强。在成年人中，生存蛋白几乎仅在癌症细胞中表达。同样，据报道livin在某些癌症细胞系中表达升高，特别是在黑素瘤细胞系中。
在一个优选实施方案中，DNA疫苗包含有效编码生存蛋白和细胞因子的多核苷酸序列。所述生存蛋白优选为人生存蛋白、鼠生存蛋白，或其表位。所述细胞因子优选调节T细胞或NK细胞活性。优选的细胞因子包括趋化因子、血细胞生成素和干扰素。其它优选的细胞因子包括活化NK细胞的细胞因子如IL-12和刺激细胞因子产生的因子如IL-17。
在另一个优选实施方案中，DNA疫苗包含有效编码livin蛋白和细胞因子的多核苷酸序列。所述livin蛋白优选为野生型人livin或其表位。所述细胞因子优选调节T细胞或NK细胞活性。优选的细胞因子包括趋化因子、血细胞生成素和干扰素。其它优选的细胞因子包括活化NK细胞的细胞因子如IL-12和刺激细胞因子产生的因子如IL-17。
优选的趋化因子包括CC趋化因子，特别是为CCR7趋化因子受体配体的CC趋化因子，如CCL21(SLC)等；为CR1受体配体的C趋化因子，如淋巴趋化因子等；为CX3CR1受体配体的CX3C趋化因子，如Fractalkine等；CXC趋化因子，特别是为CXCR3受体配体的CXC趋化因子，如IP-10等。所述趋化因子最优选为人CCL21或其鼠类似物(鼠CCL21)。
优选的血细胞生成素包括T细胞生长因子，如IL-2、IL-15等。优选的干扰素包括T细胞和NK细胞产生的干扰素，例如IFN-γ等。其它优选的细胞因子包括活化NK细胞的细胞因子如IL-12等；以及在上皮细胞、内皮细胞和成纤维细胞之类的细胞中诱导细胞因子产生的细胞因子，包括IL-17等。
在另一个优选实施方案中，DNA疫苗包含有效编码生存蛋白及天然杀伤细胞表面受体配体的多核苷酸序列。所述生存蛋白优选为人生存蛋白、鼠生存蛋白或人生存蛋白表位。所述天然杀伤细胞表面受体配体优选为NKG2D细胞表面受体配体。NKG2D细胞表面受体配体优选为MHC I类链相关(MIC)抗原如MICA和MICB、UL16结合蛋白(ULBP)如ULBP1、ULBP2和ULBP3等。鼠NKG2D配体包括例如Rae1和次要组织相容性抗原肽H60。NKG2D细胞表面受体配体最优选为MICA或MICB。
在又一个优选实施方案中，DNA疫苗包含有效编码livin蛋白和NK细胞受体配体的多核苷酸序列。livin蛋白可为野生型人livin或人livin表位或livin变体。
有效编码癌症相关IAP-家族蛋白和免疫活性基因产物的本发明DNA构建物，优选还有效连接至本领域广为人知的基因表达所需调节元件。
所述DNA构建物优选有效整合入表达载体中，如可得自Invitrogen，Inc.，Carlsbad，CA的BUDCEA.1表达载体。其它合适的表达载体可由例如BD Biosciences Clontech，Palo Alto，CA商购。一旦整合入表达载体中，则可通过用该表达载体转染宿主细胞，将所述DNA构建物导入到宿主载体如减毒活细菌载体中，从而提供本发明的疫苗。
DNA构建物优选包括核苷酸表达所必需的调控元件。此类元件包括例如启动子、起始密码子、终止密码子和多腺苷酸化信号。此外，免疫原性靶蛋白编码序列的表达通常还需要增强子。如本领域所知，这些调控元件优选有效与编码目的蛋白的序列相连接。选择的调控元件优选与其被施用的物种相容。
起始密码子和终止密码子优选是编码本发明基因疫苗中生存蛋白和免疫调节多肽的核苷酸序列的一部分。当然，起始密码子和终止密码子必须符合生存蛋白和免疫调节多肽的编码序列读框。
本发明疫苗所包含的启动子和多腺苷酸化信号优选在被免疫患者细胞中有功能。
用于本发明疫苗的启动子，特别是用于生产人基因疫苗的启动子，其实例包括但不限于猿病毒40(SV40)启动子、小鼠乳癌病毒(MMTV)启动子、人免疫缺陷病毒(HIV)如HIV长末端重复序列(LTR)启动子、莫洛尼病毒启动子、巨细胞病毒(CMV)启动子如CMV立即早期启动子、EB病毒(EBV)启动子、劳氏肉瘤病毒(RSV)启动子以及来自人基因的启动子，如人肌动蛋白、人肌球蛋白、人血红蛋白、人肌酸和人金属硫蛋白的启动子。
用于本发明疫苗的多腺苷酸化信号，特别是在用于生产人基因疫苗的多腺苷酸化信号，其实例包括但不限于SV40多腺苷酸化信号和LTR多腺苷酸信号。
除了DNA表达所需的调控元件外，在DNA分子中还可包括其它元件。这些其它元件包括增强子。增强子可以是例如人肌动蛋白、人肌球蛋白、人血红蛋白、人肌酸的增强子和病毒增强子，如CMV、RSV和EBV病毒增强子。
调控序列和密码子通常是与种属相关的。为了最大量地生产蛋白，选择在被免疫种属中有效的调控序列和密码子。本领域一般技术人员可轻易制备出在给定种属中有功能的DNA构建物。
本发明疫苗的DNA构建物可以是如Restifo等，Gene Therapy2000；789-92中所定义的“裸”DNA，该文献的相关公开内容通过引用结合到本文中。所述DNA优选有效整合到载体中。可使用的传递载体包括生物可降解微胶囊、免疫刺激复合体(ISCOM)或脂质体，以及经遗传改造的减毒活载体，如病毒或细菌。
适宜的减毒活细菌载体的实例包括鼠伤寒沙门氏杆菌(Salmonella typhimurium)、伤寒沙门氏杆菌(Salmonella typhi)、志贺氏菌(Shigella)属、芽孢杆菌(Bacillus)属、乳杆菌(Lactobacillus)属、卡介苗(Bacille Calmette-Guerin(BCG))、大肠杆菌(Escherichia coli)、霍乱弧菌(Vibrio cholerae)、弯曲杆菌(Campylobacter)属、李斯特氏菌(Listeria)属或本领域已知的任何其它合适的细菌载体。载体优选为减毒活鼠伤寒沙门氏杆菌(Salmonella typhimurium)载体。优选的减毒活鼠伤寒沙门氏杆菌(Salmonella typhimurium)包括AroA-菌株如SL7207，或者双减毒AroA-、dam-菌株，如RE88。特别优选的载体是双减毒AroA-、dam-鼠伤寒沙门氏杆菌(Salmonella typhimurium)。
用外源DNA构建物转化活细菌载体的方法在本领域广为阐述。参阅例如Joseph Sambrook and David W.Russell，Molecular Cloning，ALaboratory Manual，3rd Ed.，Cold Spring Harbor Laboratory Press，ColdSpring Harbor，New York(2001)(Sambrook and Russell)。
优选的病毒载体包括噬菌体、疱疹病毒、腺病毒、脊髓灰质炎病毒、牛痘病毒和禽痘病毒。用外源DNA构建物转化病毒载体的方法在本领域也是广为阐述。见上述Sambrook and Russell。
有用的脂质体载体是单层或多层囊泡，具有由亲脂性物质所形成的膜部分和内部的水相部分。本发明所使用的水相部分包含有要传递至靶细胞的多核苷酸物质。通常，优选脂质体形成物质具有一个阳离子基团如季铵基团，以及一个或多个亲脂性基团，如具有大约6-30个碳原子的饱和或不饱和烷基。公开号为No.0187702的欧洲专利描述了一组合适的物质，Wolff等的美国专利No.6,228,844进行了进一步的讨论，这两个文献的相关公开内容通过引用结合到本文中。文献中还描述了许多其它合适的脂质体形成阳离子脂质化合物。参阅例如L. Stamatatos等.，Biochemistry 1988；273917-3925；和H.Eibl等，Biophysical Chemistry 1979；10261-271。另一方面，也可使用微球体，如丙交酯-乙交酯共聚物生物可降解微球体。为将核酸传递到组织中，将核酸构建物用脂质体或微球体包装或复合，如本领域技术人员已知的。
其它有用的载体包括含生物可降解聚(原酸酯)物质的多聚微球体，如Wang等，Nat.Mater.，2004；3(3)190-6.Epub 2004Feb.15所述，该文献的相关公开内容通过引用结合到本文中。
本发明的方法方面包括将DNA疫苗施用于哺乳动物(如人)组织，其中，所述DNA疫苗有效编码癌症相关IAP-家族蛋白和免疫活性基因产物。在某些优选实施方案中，DAN疫苗经口服、肌内、鼻内、腹膜内、皮下、皮内或局部施用。DNA疫苗优选经口服施用。
在一个优选方法中，本发明的DNA疫苗可在用疫苗治疗的患者中提供长期的肿瘤生长抑制。所述DNA疫苗包含有效编码癌症相关IAP-家族蛋白(如生存蛋白)和免疫活性基因产物(如细胞因子或NK细胞表面受体配体)的DNA多核苷酸构建物，以及用于其的药物可接受载体。以足以激发抗肿瘤细胞的免疫应答的量，将该疫苗给予需要抑制肿瘤生长的哺乳动物。
本发明疫苗治疗的哺乳动物优选为人。患有癌症，如肺癌或结肠癌、乳癌或前列腺癌等癌症的患者可受益于本发明疫苗的免疫接种。
本发明的疫苗优选与药物可接受的载体或赋形剂如水、盐水、葡萄糖、甘油等及其组合一起配制。该疫苗也可以含有助剂，如保湿剂、乳化剂、缓冲剂、防腐剂、佐剂等。
本发明的疫苗优选以药物可接受载体中的溶液或悬浊液形式经口服给予哺乳动物，如人，其中DNA浓度为约1-10微克/毫升。疫苗的适用剂量因接种患者不同而不同，部分根据施用或要求施用疫苗的医师的判断而定。
本发明疫苗可以多剂量或单位剂量形式包装在适宜的灭菌容器中，例如安瓿、瓶或小瓶中。容器优选在装入疫苗制备物后密封。优选将疫苗包装在贴有标签的容器中，标签标注疫苗标识，并附有政府部门如美国食品和药品管理局所规定的表明该疫苗得到相关法律许可的通告以及剂量信息等。标签优选包含对给予患者疫苗的卫生保健专业人员来说有用的疫苗信息。包装优选还含有有关疫苗施用、用法说明、适应症及任何必须警告等印刷信息资料。
人生存蛋白DNA序列及其对应的蛋白序列已由Strausberg报告，在European Bioinformatics Institute，Wellcome Trust GenomeCampus，Hinxton，Cambridge CB10 1SD，UK的EMBL数据库中，DNA检索号为No.BC034148，其公开内容通过引用结合到本文中。鼠TIAP的DNA序列及对应的蛋白序列已由Kobayashi等，Proc.Natl.Acad.Sci.1999；961457-62报道，在European Bioinformatics Institute，WellcomeTrust Genome Campus，Hinxton，Cambridge CB10 1SD，UK的EMBL数据库中，DNA检索号为No.AB01389，其公开内容通过引用结合到本文中。
图1显示了编码人生存蛋白的核酸序列(SEQ ID NO1)，图2提供了其对应氨基酸残基序列(SEQ ID NO2)。图3显示了编码鼠生存蛋白(即TIAP)的核酸序列(SEQ ID NO3)，图4提供了其对应氨基酸残基序列(SEQ ID NO4)。
图5显示了人生存蛋白及其鼠对应物TIAP之间的蛋白同源性。如图5所示，人生存蛋白(SEQ ID NO2)和鼠TIAP(SEQ ID NO4)之间的氨基酸残基同源性大约为83％。
Mahotka等鉴别出两种人生存蛋白剪接变体，命名为生存蛋白-ΔEx3和生存蛋白-2B，它们也适用于本发明。Mahotka等，Cancer Res.，1999；596097-6102的相关公开内容通过引用结合到本文中。生存蛋白-2B(SEQ ID NO23)和生存蛋白-ΔEx3(SEQ ID NO24)的氨基酸残基序列示于图37。Hirohashi等鉴别出生存蛋白-2B的有效T细胞表位，氨基酸残基序列为AYACNTSTL(SEQ ID NO25)，命名为生存蛋白-2B80-88，其激发抗生存蛋白-2B的细胞毒性T淋巴细胞应答。Hirohashi等，Clinical Cancer Res.，2002；81731-39的相关公开内容通过引用结合到本文中。该表位是能够结合MHC I类分子并由细胞毒性T细胞识别的生存蛋白片段，适于用作本发明疫苗的IAP-家族蛋白组分。
人生存蛋白的另一个剪接变体是Badran等，Biochem.Biophys.Res.Commun.，2004；314(3)902-907描述的生存蛋白-3B变体。编码生存蛋白-3B的多核苷酸序列及其对应的氨基酸残基序列报告于EuropeanBioinformatics Institute，Wellcome Trust Genome Campus，Hinxton，Cambridge CB10 1SD，UK的EMBL数据库中，DNA检索号No.AB154416，其公开内容通过引用结合到本文中。
全长人livin(称为α变体)是具有单一BIR结构域并由298个氨基酸残基组成的IAP-家族蛋白。人livinα变体的DNA序列及对应蛋白序列由Clark等报告，在European Bioinformatics Institute，WellcomeTrust Genome Campus，Hinxton，Cambridge CB10 1SD，UK的EMBL数据库中，DNA检索号为No.NM139317，其公开内容通过引用结合到本文中。人livinβ变体的DNA序列及对应蛋白序列报告于EuropeanBioinformatics Institute，Wellcome Trust Genome Campus，Hinxton，Cambridge CB10 1SD，UK的EMBL数据库中，DNA检索号No.NM022161，其公开内容通过引用结合到本文中。
图39显示了编码全长人livin(α变体)的核酸序列(SEQ ID NO26)，图40提供了其对应氨基酸残基序列(SEQ ID NO27)。图41显示了编码人livin β变体的核酸序列(SEQ ID NO28)，图42提供了其对应氨基酸残基序列(SEQ ID NO29)。人livinβ变体没有全长人livinα剪接变体(SEQ ID NO27)的氨基酸残基216-233。人livin的β变体和α变体在所有其它方面都相同。人livin的α和β变体的BIR结构域都是在SEQ ID NO27和SEQ ID NO29的氨基酸残基R90至氨基酸残基L155的区域中。
在一个优选实施方案中，本发明疫苗包含编码一种或多种生存蛋白(例如人生存蛋白、TIAP(鼠生存蛋白))及其免疫原性同源物的DNA构建物。所述免疫原性同源物优选与人生存蛋白具有至少约80％的氨基酸残基序列一致性，更优选与SEQ ID NO2具有至少约90％的氨基酸残基序列一致性，最优选与SEQ ID NO2具有至少约95％的氨基酸残基序列一致性。另一方面，该疫苗可包含编码一个或多个人生存蛋白T细胞表位的DNA构建物。
在另一个优选实施方案中，本发明疫苗包含编码一种或多种livin蛋白(例如人livinα和β剪接变体(分别为SEQ ID NO27和29))及其免疫原性同源物的DNA构建物。所述免疫原性同源物优选与人livinα和β剪接变体具有至少约80％的氨基酸残基序列一致性，更优选与SEQ ID NO27或SEQ ID NO29具有至少约90％的氨基酸残基序列一致性，最优选与SEQ ID NO27或SEQ ID NO29具有至少约95％的氨基酸残基序列一致性。另一方面，该疫苗可包含编码一个或多个人livin蛋白T细胞表位的DNA构建物。
由于遗传密码固有的简并性，编码与天然(即天然存在的)癌症相关IAP-家族蛋白(如人生存蛋白、鼠生存蛋白和人livin剪接变体)基本相同或功能等同的氨基酸残基序列的DNA序列，也可用于本发明疫苗。此类DNA序列包括能够与天然生存蛋白或livin DNA序列以及等位基因变体等杂交的序列。功能等同同源物的DNA优选与编码前述天然生存蛋白或livin蛋白的DNA具有至少约70％的核苷酸序列一致性，更优选具有至少约80％的核苷酸序列一致性。
由本发明疫苗的DNA构建物编码的免疫活性基因产物优选为细胞因子或天然杀伤细胞表面受体的配体。特别优选的细胞因子是CC趋化因子。特别有用的CC趋化因子是CCR7趋化因子受体的配体。选择性CCR7配体包括CCL19(也称为exodus-3、ELC、MIP-3β和CKβ11)和CCL21(也称为exodus-2、SLC、6CKine、TCA4和CKβ9)。特别优选的趋化因子是人CCL21及其鼠对应物6CKine/SLC(muCCL21)以及与其大致相当的趋化因子。
人SLC的DNA和蛋白序列由Nishimura等报告，在EuropeanBioinformatics Institute，Wellcome Trust Genome Campus，Hinxton，Cambridge CB10 1SD，UK的EMBL数据库中，DNA检索号为No.AB002409，其公开内容通过引用结合到本文中。6CKine/SLC的鼠CCL21a变体的DNA和蛋白序列由Hromas等，J Immunol.1997；159(6)2554-2558报道，在European Bioinformatics Institute，WellcomeTrust Genome Campus，Hinxton，Cambridge CB10 1SD，UK的EMBL数据库中，DNA检索号为No.NM011335，其公开内容通过引用结合到本文中。6CKine/SLC的鼠CCL21b变体的DNA和蛋白序列由Hedrick等，J. Immunol.1997；159(4)1589-1593报道，在EuropeanBioinformatics Institute，Wellcome Trust Genome Campus，Hinxton，Cambridge CB10 1SD，UK的EMBL数据库中，DNA检索号为No.NM011124，其公开内容通过引用结合到本文中。
图6显示了编码人CCL21(SLC)的核酸序列(SEQ ID NO5)，图7提供了其对应氨基酸残基序列(SEQ ID NO6)。图8显示了编码鼠CCL21(CCL21b变体)的核酸序列(SEQ ID NO7)，图9提供了其对应氨基酸序列(SEQ ID NO8)。
图10显示了人CCL21(SLC)与其鼠对应物(鼠6CKine/SLC，CCL21b)之间的蛋白同源性。如图10所示，人CCL21(SEQ ID NO6)和鼠CCL21(SEQ ID NO8)之间的氨基酸残基序列一致性约为73％。
图25显示了编码鼠SLC的CCL21a变体的核酸序列(SEQ IDNO11)，图26提供了其对应氨基酸序列(SEQ ID NO12)。
优选的天然杀伤细胞表面受体的配体是鼠NKG2D表面受体的配体。优选的NKG2D表面受体配体是MICA、MICB、ULBP1、ULBP2和ULBP3等。最优选MICA和MICB。其它已知的NKG2D表面受体配体包括鼠Rea-1β和鼠次要组织相容性抗原肽H60。
鼠H60次要组织相容性抗原肽的DNA和蛋白序列由Malarkannan等，J. Immunol.1998；161(7)3501-3509报道，在EuropeanBioinformatics Institute，Wellcome Trust Genome Campus，Hinxton，Cambridge CB10 1SD，UK的EMBL数据库中，DNA检索号为No.AF084643，其公开内容通过引用结合到本文中。图11显示了编码鼠H60次要组织相容性抗原肽的部分核酸序列(SEQ ID NO9)，图12提供了其对应的部分氨基酸残基序列(SEQ ID NO10)。
人MICA的DNA和蛋白序列由Zwirner等报道，在EuropeanBioinformatics Institute，Wellcome Trust Genome Campus，Hinxton，Cambridge CB10 1SD，UK的EMBL数据库中，DNA检索号为No.AY204547，其公开内容通过引用结合到本文中。图27显示了编码人MICA的核酸序列(SEQ ID NO13)，图28提供了其对应氨基酸残基序列(SEQ ID NO14)。
人MICB的DNA和蛋白序列由Bahram等，Immunogenetics 1996；45(2)161-162报道，在European Bioinformatics Institute，WellcomeTrust Genome Campus，Hinxton，Cambridge CB10 1SD，UK的EMBL数据库中，DNA检索号为No.U65416，其公开内容通过引用结合到本文中。图29显示了编码人MICB的核酸序列(SEQ ID NO15)，图30提供了其对应氨基酸残基序列(SEQ ID NO16)。MICB的等位基因变体描述于GENBANK检索号No.NP005922，其通过引用结合到本文中。图38是检索号No.NP005922的GENBANK条目副本。
人ULBP1的DNA和蛋白序列由Cosman等，Immunity 2001；14(2)123-133报道，在European Bioinformatics Institute，WellcomeTrust Genome Campus，Hinxton，Cambridge CB10 1SD，UK的EMBL数据库中，DNA检索号为No.AF304377，其公开内容通过引用结合到本文中。图31显示了编码人ULBP1的核酸序列(SEQ ID NO17)，图32提供了其对应氨基酸残基序列(SEQ ID NO18)。
人ULBP2的DNA和蛋白序列由Cosman等，Immunity 2001；14(2)123-133报道，在European Bioinformatics Institute，WellcomeTrust Genome Campus，Hinxton，Cambridge CB10 1SD，UK的EMBL数据库中，DNA检索号为No.AF304378，其公开内容通过引用结合到本文中。图33显示了编码人ULBP2的核酸序列(SEQ ID NO19)，图34提供了其对应氨基酸残基序列(SEQ ID NO20)。
人ULBP3的DNA和蛋白序列由Cosman等，Immunity 2001；14(2)123-133报道，在European Bioinformatics Institute，WellcomeTrust Genome Campus，Hinxton，Cambridge CB10 1SD，UK的EMBL数据库中，DNA检索号为No.AF304379，其公开内容通过引用结合到本文中。图35显示了编码人ULBP3的核酸序列(SEQ ID NO21)，图36提供了其对应氨基酸残基序列(SEQ ID NO22)。
特别优选的天然杀伤细胞表面受体配体包括NKG2D受体配体，例如MICA、MICB、ULBP1、ULBP2、ULBP3及其功能等同物。所述功能等同物优选与前述免疫调节多肽具有至少约80％的氨基酸残基序列一致性，更优选具有至少约90％的氨基酸残基序列一致性，最优选具有至少约95％的氨基酸残基序列一致性。
由于遗传密码固有的简并性，编码与有用的天然免疫活性基因产物(如人CCL21、鼠CCL21、MICA、MICB、ULBP1、ULBP2、ULBP3及与其大致相当的类似物质)基本相同或功能等同的氨基酸残基序列的DNA序列，也可用于本发明疫苗。此类DNA序列包括能够与免疫调节多肽DNA序列以及等位基因变体等杂交的序列。功能等同同源物的DNA优选与编码前述天然免疫调节多肽的DNA具有至少约70％的核苷酸序列一致性。
可用于本发明的改变的DNA序列包括在编码野生型癌症相关IAP-家族蛋白的天然多核苷酸序列中不同核苷酸残基的缺失、添加或置换，获得编码野生型蛋白或其免疫原性同源物的序列。可用于本发明的改变的DNA序列还可包括在编码野生型免疫原性基因产物的天然多核苷酸中不同核苷酸残基的缺失、添加或置换，获得编码免疫活性基因产物或其功能等同物的序列。功能等同的免疫活性基因产物可在野生型细胞因子或NK细胞表面受体配体中包含导致沉默改变的氨基酸残基的缺失、添加或置换，由此产生功能等同分子。此类氨基酸置换(例如保守置换)可以所涉及残基的极性、电荷、可溶性、疏水性、亲水性和/或两亲性特性方面的相似性为基础进行。例如，带负电氨基酸包括天冬氨酸和谷氨酸；带正电氨基酸包括赖氨酸和精氨酸；其不带电极性头部基团亲水值相似的氨基酸包括亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸；甘氨酸、丙氨酸；天冬酰胺、谷氨酰胺；丝氨酸、苏氨酸；苯丙氨酸、酪氨酸。
本文使用的功能等同的免疫活性基因产物，例如细胞因子或NK细胞表面受体配体，是指与其对应天然免疫活性基因产物具有大致相同的免疫调节活性的多肽。
用于本发明疫苗的有效编码IAP-家族蛋白和免疫活性基因产物的DNA序列可进行基因工程改造，以改变编码序列来用于各种目的，包括但不限于改变以修饰基因产物的加工和表达。例如，可使用本领域众所周知的技术如定点诱变来导入突变，以插入新的限制性位点、改变糖基化模式、磷酸化等。
本发明的另一个方面是接种哺乳动物抗癌症的方法。该方法包括以足以激发抗癌症细胞的免疫应答的量，给予哺乳动物本发明疫苗，如本文所述。优选哺乳动物为人。
在另一方面，本发明还包括用载体转染的转化宿主细胞，所述载体包含有效编码凋亡抑制家族蛋白和免疫活性基因产物的DNA构建物，如本文所述。宿主细胞可为原核细胞或真核细胞。
本发明还提供含有效编码凋亡抑制家族蛋白和免疫活性基因产物的DNA构建物的分离质粒载体。该载体用于转染宿主细胞，例如减毒细菌细胞，以制备本发明疫苗。
提供以下的实施例是为了进一步阐述本发明的特征和实施方案，没有限制意义。
材料、方法和实施例材料。C57/BL/6J和Balb/C小鼠来自Scripps Research Institute饲养场。编码TIAP(生存蛋白的鼠形式)的DNA通过PCR由MC3PcDNA克隆。编码鼠6Ckine(鼠CCL21)的DNA由脾细胞克隆。编码H60次要组织相容性抗原肽(MICA和MICB的鼠形式)的DNA由University of California(Berkley)的Dr.David H.Ranlet惠赠。对于MuCCL21使用限制位点HindIII和BamHI，对于鼠生存蛋白两端使用XhoI，将编码鼠CCL21(muCCL21，也称为6Ckine/SLC)和鼠生存蛋白(也称为TIAP)的疫苗DNA克隆入Invitrogen，Inc.的pBudCE4.1真核表达载体中。对于H60使用限制位点HindIII和XbaI，对于鼠生存蛋白使用限制位点KpnI和XhoI，将编码H60和TIAP的DNA克隆入Invitrogen，Inc.的pBudCE4.1真核表达载体中。鼠伤寒沙门氏杆菌(Salmonella typhimurium)AroA-减毒菌株(SL2707)和鼠伤寒沙门氏杆菌(Salmonella typhimurium)双减毒AroA-、dam-菌株(RE88)得自Remedyne，Santa Barbara，CA。抗体得自BD Biosciences，Bedford，MA。异硫氰酸荧光素(FITC)和R-藻红蛋白(PE)得自Molecular Probes，Eugene，OR。FITC标记抗体和PE标记抗体根据厂家推荐方法制备。
A.得自转化的AroA-减毒鼠伤寒沙门氏杆菌(Salmonella typhimurium)的疫苗实施例1.编码鼠生存蛋白和muCCL21的DNA疫苗的制备用Bio-Rad脉冲发生器，按照厂家推荐的方法，在2.5kV、25μF和200Ω下将含鼠生存蛋白和muCCL21 DNA的pBudCE4.1载体(约1-10μg pDNA)电穿孔入到新制备的减毒鼠伤寒沙门氏杆菌(Salmonella typhimurium)(SL2707)中。在含有Zeocin的平板上选择含有载体的沙门氏杆菌(Salmonella)。第二天挑出菌落并在添加Zeocin的LB培养液(EM Science，Gibbstown，NJ)中培养过夜。分离细菌并用磷酸缓冲盐溶液(PBS)漂洗。然后以约1×109个重组沙门氏杆菌(Salmonella)/ml PBS的浓度，将漂洗过的细菌悬浮在PBS培养基中，以形成之后要使用的疫苗溶液。
另外，按照同样步骤，制备对照疫苗，包括用仅有载体、仅整合鼠生存蛋白DNA的载体、仅整合muCCL21DNA的载体转化的沙门氏杆菌(Salmonella)。图13提供了展示表达构建物的图。
在使用前，将疫苗保存在密封安瓿中。质粒DNA在转化沙门氏杆菌(Salmonella)之前保存于约-80℃。
实施例2.用实施例1的DNA疫苗免疫接种小鼠用实施例1的DNA疫苗(约1×108个重组沙门氏杆菌的约100μlPBS溶液)经口管饲接种Balb/C小鼠(每个处理组约8只小鼠)，每两周接种一次，共三次。
实施例3.评价接种小鼠对肿瘤的抗性最后一次接种后约1周，用约1×105个D121Lewis肺癌细胞(皮下)攻击实施例2的Balb/C小鼠(每个处理组约8只小鼠)。生长约2周，以使肿瘤自发弥散至肺，此后经手术去除皮下Lewis肺癌肿瘤。每隔一天测量皮下肿瘤生长的长度和宽度，并根据下式计算每个肿瘤的肿瘤体积体积＝(宽度2)(长度÷2)。去除皮下原发肿瘤后约24至约28天，评价肺部D121自发转移瘤的数量。将小鼠杀死后解剖，根据肿瘤所覆盖的肺表面积百分比评价肺部肿瘤负荷，无肿瘤记为“0”；肿瘤覆盖约小于20％记为“1”；肿瘤覆盖约20％至约30％记为“2”；肿瘤覆盖约大于50％记为“3”。
表1提供了实施例1疫苗接种小鼠的肿瘤负荷记分。图14显示了实施例1疫苗接种小鼠的肺部图片。表1和图14报告了肿瘤体积。在图14中，条A表示用本发明的鼠生存蛋白/muCCL21疫苗接种小鼠的平均肺部肿瘤体积(mm3)；条B表示仅整合鼠生存蛋白DNA的疫苗接种小鼠的平均肿瘤体积；条C表示仅整合muCCL21 DNA的疫苗接种小鼠的平均肿瘤体积；条D表示仅整合空载体的疫苗接种小鼠的平均肿瘤体积；而条E表示用PBS缓冲液接种小鼠的平均肿瘤体积。图14还包括展示每个处理组的代表性切除肺的图片，每张图分别示于图14其各自条的下方。
表1.D121 Lewis肺癌细胞攻击的Balb/C小鼠的转移瘤
表1和图14(图A和图B)提供的结果证明，含编码IAP-家族蛋白(即鼠生存蛋白)和免疫活性基因产物(即muCCL21)的DNA构建物的DNA疫苗可有效免疫小鼠抗肺转移瘤，并抑制肺部肿瘤生长。
实施例4.由本发明DNA疫苗诱导的抗D121肺癌细胞的T细胞介导细胞毒性如实施例2所述，用实施例1的DNA疫苗接种C5/7BL/6J小鼠(每个处理组约8只小鼠)。接种后约4天分离脾细胞，如CurrentProtocols in Immunology的3.11.4，Coligan等编辑，John Wiley & Sons，Inc.(1994)所述，用4小时51Cr-释放法分析其裂解活性。D121细胞用作脾细胞的靶细胞。
图15图示由本发明DNA疫苗诱导的抗D121肺癌细胞的T细胞介导细胞毒性。空心圆圈代表的数据点表示得自抑制实验的数据，其中细胞用50μg/ml抗H-2Kb/H-2DbMHC I类抗原的抗体(克隆SF1-1.1；34-2-12IgG2a，κ)处理，实心黑色方块代表没有抑制性抗体的数据。对每个接种组，将肿瘤细胞裂解百分率(Y轴)对三个不同的效应细胞/靶细胞(E/T)比率作图(即第一个数据点为100∶1的E/T；第二个数据点为50∶1；第三个数据点为25∶1)。结果表明，本发明的鼠生存蛋白/muCCL21疫苗(标记为SLC/TIAP)相比于含PBS、空载体和muCCL21DNA的对照疫苗，在100∶1E/T比率时诱导的裂解几乎增加了5倍，相比于仅含鼠生存蛋白DNA的对照疫苗，增加了约2倍。
实施例5.接种疫苗小鼠脾细胞(CD8+T细胞)中CD25、CD69和CD28活化标记物的上调如实施例2所述，用实施例1的DNA疫苗接种C5/7BL/6J小鼠(每个处理组约4只小鼠)。最后一次接种后约1周从免疫小鼠和对照小鼠组中分离脾细胞。然后用FITC-偶联的CD8+抗体和PE-偶联的CD25、CD69和CD28抗体对细胞进行染色。用双色流式细胞仪BectonDickenson FAC scan评测细胞悬液，以确定每种脾细胞中CD25、CD28和CD69呈阳性的CD8+T细胞的百分比。图16列出了结果。每张FACS图右上象限的数值表示同时提呈CD8+抗原以及CD25、CD28或CD69(具体视情况而定)的细胞百分率。数值结果示于表2。这些结果表明使用本发明疫苗使T细胞标记物表达增加，这表示T细胞活化增强。
表2.接种小鼠脾细胞中CD25、CD69和CD28活化标记物的上调
表2和图16的数据证实，实施例1的含编码鼠生存蛋白和muCCL21的DNA构建物的本发明疫苗，使T细胞活化分子表达上调。
实施例6.接种疫苗小鼠中树突状细胞上共刺激分子的表达增强如实施例2所述，用实施例1的DNA疫苗接种C5/7BL/6J小鼠(每个处理组约4只小鼠)。最后一次接种后约1周从免疫小鼠和对照小鼠组中分离脾细胞。然后用FITC-偶联的CD11c抗体联合共刺激分子B7(CD80)、ICAM-1和DEC205的PE-偶联抗体对细胞进行染色。用双色流式细胞仪Becton Dickenson FAC scan评测细胞悬液。图17图示了细胞的平均荧光值，结果显示与对照疫苗相比，分离自本发明鼠生存蛋白/muCCL21疫苗接种小鼠脾细胞的ICAM-1(顶部)、CD80(中部)和DEC205(底部)的表达增加。
实施例7.胞内细胞因子释放的诱导如实施例3所述，用D121肺癌细胞攻击如实施例2所述免疫的小鼠(每组8只小鼠)。肿瘤细胞攻击后约1周，由每只小鼠收集脾细胞。用FITC-抗CD3抗体染色脾细胞，然后固定化、透化，随后用PE偶联的抗IFN-γ抗体染色。用FACS流式细胞仪分析双色染色细胞。结果示于图18。使用BD Pharmingen，La Jolla，CA的胞内染色StarterKit固定细胞。
图示于图18的结果表明，对于分离自本发明疫苗接种小鼠的脾细胞，释放细胞因子IFN-γ的细胞百分率增加至约3.17％，相比之下，接受PBS对照疫苗小鼠仅有0.41％，接受空载体对照疫苗的小鼠约为0.38％，接受SLC对照疫苗的小鼠约为0.96％，而接受鼠生存蛋白对照疫苗的小鼠约为1.53％。
实施例8.疫苗接种小鼠中肺癌细胞的凋亡增加如实施例3所述，用D121肺癌细胞攻击如实施例2所述免疫的小鼠(每组8只小鼠)。肿瘤细胞攻击后约1周，由每只小鼠收集脾细胞。将脾细胞和D121肿瘤细胞在约37℃的温度温育约3小时。然后通过FCAS分离和分析细胞。使用Annexin V-FITC定量群体中能够进行凋亡的细胞的百分率。使用BD Pharmingen，La Jolla，CA的凋亡检测试剂盒，使用碘化丙锭(PI)区分存活和非存活的细胞。
图19图示了约3小时后(图顶部)和约24小时后(图底部)评价的FACS分析结果。每张图右下象限的数字表示每个处理组进行凋亡的细胞的百分率。3小时后，约5.39％的完整D121细胞(即未接触脾细胞)凋亡。在与仅含PBS缓冲液的对照疫苗接种小鼠的脾细胞温育的D121细胞中，约有2.28％凋亡。在与含空载体DNA的对照疫苗接种小鼠的脾细胞温育的D121细胞中，仅有约5.19％凋亡。以类似的方式，D121细胞在与仅含muCCL21 DNA的对照疫苗接种小鼠的脾细胞温育时约有5.15％凋亡；而D121细胞与仅含鼠生存蛋白DNA的对照疫苗接种小鼠的脾细胞温育时约有11.46％凋亡。令人惊奇的是，D121细胞与同时含muCCL21和鼠生存蛋白DNA的本发明疫苗接种小鼠的脾细胞温育时，3小时后约有18.44％凋亡。
同样，在选通FACS分析(选通凋亡细胞)中，24小时后没有完整的D121细胞(即未接触脾细胞)经历凋亡。在与仅含PBS缓冲液的对照疫苗接种小鼠的脾细胞温育的D121细胞中，约有8.46％凋亡。在与含空载体DNA的对照疫苗接种小鼠的脾细胞温育的D121细胞中，仅有约4.78％凋亡。令人惊奇的是，D121细胞与同时含muCCL21和鼠生存蛋白DNA的本发明疫苗接种小鼠的脾细胞温育时，24小时后约有59.2％凋亡。
实施例9.制备编码TIAP和鼠H60次要组织相容性抗原肽的DNA疫苗用Bio-Rad脉冲发生器，按照厂家推荐的方法，在2.5kV、25μF和200Ω下将含TIAP和鼠H60次要组织相容性抗原DNA的pBudCE4.1载体(约1μg pDNA)电穿孔入新制备的减毒鼠伤寒沙门氏杆菌(Salmonella typhimurium)(SL2707)中。图20提供了H60和鼠生存蛋白整合入载体的表达载体图。
在含有Zeocin的平板上选择含有载体的沙门氏杆菌(Salmonella)。第二天挑出菌落并在添加Zeocin的LB培养液(EMScience，Gibbstown，NJ)中培养过夜。分离细菌并用磷酸缓冲盐溶液(PBS)漂洗。然后以约5×109个重组沙门氏杆菌(Salmonella)/ml PBS的浓度，将漂洗过的细菌悬浮在PBS培养基中，以形成之后要使用的疫苗溶液。
另外，按照同样步骤，制备对照疫苗，包括用仅有载体、仅整合鼠生存蛋白DNA的载体和仅整合鼠H60次要组织相容性抗原(H60)DNA的载体转化的沙门氏杆菌(Salmonella)。
在使用前，将疫苗保存在密封安瓿中。质粒DNA在转化沙门氏杆菌(Salmonella)之前保存在约-20℃。
实施例10.用实施例9的DNA疫苗免疫接种小鼠用实施例9的DNA疫苗(约5×108个重组沙门氏杆菌(Salmonella)的约100μl PBS溶液)经口管饲接种Balb/C小鼠(每个处理组约8只小鼠)，每两周接种一次，共三次。
实施例11.分离自实施例10的DNA疫苗接种小鼠的脾细胞的细胞毒性测定由实施例10的接种小鼠分离脾细胞，用照射过的CT-26细胞刺激。5天后，收获脾细胞，以CT-26细胞和Yac-1细胞(NK敏感性T细胞)为靶进行细胞毒性测定。如Current Protocols in Immunology的3.11.4，Coligan等编辑，John Wiley & Sons，Inc.(1994)所述，以4小时51Cr-释放实验，测定E/T比率为25∶1、50∶1和100∶1时的细胞特异性裂解程度。结果图示于图21。
结果表明，相比于由用空载体、H60和鼠生存蛋白对照疫苗接种小鼠分离的脾细胞，含鼠生存蛋白和H60DNA的本发明疫苗接种小鼠的脾细胞在100∶1E/T比率时裂解的CT-26结直肠癌细胞增加了2倍或2倍以上。所有疫苗在所有E/T比率下观测到的Yac-1裂解都非常少，表明观测到的杀伤可能由T细胞介导。
实施例12.评价接种小鼠对肿瘤的抗性第三次接种后约2周，用约1×105个CT-26结直肠癌细胞(静脉；i.v.)攻击实施例10的Balb/C小鼠(每个处理组约8只小鼠)。
用CT-26细胞i.v.攻击后约25天，评价肺部CT-26细胞自发转移瘤的量。将小鼠杀死后解剖，通过记录各组的肺平均重量，评价肺部肿瘤负荷。正常肺重量为约0.2克。图22展示了由接种的CT-26攻击小鼠中取出的典型肺脏(顶部)。图22还包括各个处理组平均肺重量的图解(底部)。与对照疫苗相比，观察到本发明H60/鼠生存蛋白疫苗接种小鼠的肿瘤负荷显著缩小。
图23包括26天后各个处理组小鼠存活百分率的图解。与对照疫苗相比，观察到本发明H60/鼠生存蛋白疫苗接种小鼠的存活明显增加。
实施例13.评价H60和鼠生存蛋白在293T细胞中的表达图24A图解了H60的表达。用空载体(V)或pH60(H)转染293T细胞24小时，收获，并用NKG2D四聚体染色，用流式细胞仪进行分析。根据pGFP(绿色荧光蛋白)转染的评测，转染效率约为45％。图24B图解了鼠生存蛋白的表达。用空载体或鼠生存蛋白转染293T细胞24小时，收获，裂解，用蛋白质印迹进行分析。蛋白质印迹分析表明，鼠生存蛋白在转染细胞中可检出，但在天然细胞中不能检出。
B.得自转化的AroA-、dam-双减毒鼠伤寒沙门氏杆菌(Salmonellatyphimurium)的疫苗实施例14.编码鼠生存蛋白和muCCL21的DNA疫苗的制备使用1μg分别提取自D121小鼠Lewis肺癌细胞和活化小鼠脾细胞的总RNA，通过反转录-聚合酶链反应扩增鼠生存蛋白和鼠CCL21(muCCL21)的全长编码区。总RNA用RNEASY Mini Kit(Qiagen，Valencia，CA)提取，用铂定量RT-PCR Thermoscript One-Step系统(Gibco/BRL)按照生产商的说明进行RT-PCR。使用设计用于使单个质粒的两种基因独立在哺乳动物表达载体中表达的PCR产物，基于pBudCEA.1载体(Invitrogen)制备几种构建物。第一种构建物是包含全长鼠生存蛋白和鼠CCL21的鼠生存蛋白/muCCL21，将其插入到限制位点HindIII和BamHI之间的多克隆位点A中。通过将基因分别插入到限制位点XhoI和NotI之间的多克隆位点B中，产生趋化因子muCCL21。其它用于DNA接种的载体是基于第一种构建物，而不是基于muCCL21或鼠生存蛋白的缺失。制备空载体作为对照。
将质粒转染入COS-7细胞中，之后分别使用抗生存蛋白和抗CCL21抗体对细胞裂解物进行蛋白质印迹，来证实鼠生存蛋白和muCCL21的蛋白质表达。经口给予108个用pEGFP转化的鼠伤寒沙门氏杆菌(Salmonella typhimurium)(AroA-、dam-菌株RE88)后，在C57BL/6J小鼠的淋巴集结中检测到EGFP活性的表达。在8、16和36小时的时间点处死小鼠，取出新鲜的小肠样本，用PBS彻底清洗后进行分析。用共聚焦显微镜检测EGFP的荧光表达。
通过对比双减毒AroA-、dam-菌株RE88和单减毒AroA-菌株SL2707，评价减毒细菌可能在宿主中产生的毒性。使用RE88菌株使全部16只小鼠都存活，无任何明显的毒副作用，而SL2707菌株免疫的16只小鼠中有2只死于毒性和感染。因此，RE88菌株的dam-突变可控制细菌毒力，明显使该菌株成为特别有用的DNA疫苗载体。
实施例15.用实施例14的疫苗口服接种小鼠和肿瘤攻击小鼠将C57BL/6J小鼠分为5个小组，用含约1×108个双减毒鼠伤寒沙门氏杆菌(S.typhimurium)(RE88)的约100μl PBS连同PBS治疗组，以2周间隔经口管饲对这些小鼠进行免疫接种三次，其中所述RE88具有以下载体空载体pBUd；pBUd-鼠生存蛋白/muCCL21、pBUd-鼠生存蛋白或pBUd-muCCL21的单独表达载体。在最后一次免疫后约1周，通过i.v.注射约1×105个D121鼠Lewis肺癌细胞攻击预防治疗的所有小鼠。在治疗模式中，首先给小鼠i.v.注射约1×105个D121鼠Lewis肺癌细胞，1周后用转化的鼠伤寒沙门氏杆菌(S.typhimurium)进行3次接种。每天检查小鼠，在预防模式中肿瘤细胞攻击后约28天或在治疗模式中于初次肿瘤细胞接种后63天，处死小鼠并检查肺转移瘤。
表3显示了分别用PBS、空载体、CCL21、生存蛋白或CCL21/生存蛋白疫苗免疫接种以进行疫苗预防治疗后的转移瘤分数。表3中结果显示为肿瘤转移记分，表示融合转移瘤灶覆盖肺表面积的百分比0＝没有；1＝小于5％；2＝5-50％；3＝大于50％。CCL21/生存蛋白疫苗治疗的小鼠组和所有对照组之间的转移瘤记分差异是统计学显著的(P＝＜0.001)。在此治疗模式中还观测到肿瘤生长受到抑制。
表3.接种后用D121 Lewis肺癌细胞攻击的BalB/C小鼠的转移瘤
在此预防模式中，我们观察到，在以2周间隔接种3次接着1周后i.v.注射肿瘤细胞攻击的小鼠中，D121鼠Lewis肺癌的弥散性肺转移瘤受到明确抑制。实际上，8只小鼠中有6只完全排斥了所有的肺转移瘤，而其余小鼠表现出对转移瘤的抑制显著增强(参见表3)。相反，基于生存蛋白而没有muCCL21的DNA疫苗仅在8只小鼠的1只中诱导出对转移瘤的完全抑制，2只小鼠转移瘤生长低于5％，而其余所有小鼠都表现出大范围的转移瘤生长。仅用PBS或空载体对照接种治疗的其它小鼠根本没有表现出肿瘤防护，在肿瘤细胞攻击后的4周内由于大范围的转移瘤而死亡。尽管用仅携带分泌性muCCL21质粒的双减毒沙门氏杆菌(Salmonella)免疫接种没有明显抑制肿瘤转移，但与对照相比仍使转移统计学显著地延迟。
重要之处在于，在治疗模式中，在所有实验动物中，基于鼠生存蛋白/muCCL21的DNA疫苗也能明显有效地抑制已经完全确立的肺转移瘤生长。相反，所有仅接受基于自身鼠生存蛋白或muCCL21的疫苗或空载体和PBS对照的小鼠，在该实验模式中表现为D121非小细胞肺癌大范围弥散性肺转移瘤。治疗模式的各个实验组的肺重量列于表4。正常肺重量约为0.3g。
表4.D121 Lewis肺癌细胞预攻击的Balb/C小鼠的转移瘤-肺重量
实施例16.测定实施例15的疫苗接种小鼠的抗血管生成反应最后一次免疫后两周，将含约400ng/ml鼠FGF-2(Pepro Tech，Rocky Hill，NJ)和以1000Gy照射过的D121肿瘤细胞(1×104/ml)的约500ml减少生长因子的Matrigel(BD Biosciences)皮下(s.c.)注射到小鼠的胸骨区。6天后，通过将200ml 0.1mg/ml荧光西非单叶豆(Bandeiraea simplicifolia)凝集素I-同工凝集素B4(Vector Laboratories，Burlingame，CA.)注射到侧尾静脉中，染色除2只对照动物之外的所有小鼠的内皮组织；约30分钟后，处死小鼠，取出Matrigel栓(plug)，目视评价。然后将凝集素-FITC由100ml各栓提取到500ml RIPA裂解液中，用荧光测定法于490nm定量。每个测定都要扣除2只未注射对照小鼠中产生的本底荧光。
基于鼠生存蛋白/muCCL21的疫苗明确抑制肿瘤脉管系统的血管生成。据Matrigel实验和用FITC缀合凝集素体内染色小鼠内皮后检测的相对荧光定量所示，观测到肿瘤新血管生成显著下降。在检测皮下注射FITC缀合凝集素后6天取出的代表性Matrigel凝固物时，肉眼观察到鼠生存蛋白/muCCL21疫苗处理组和对照组之间在肿瘤血管生成方面存在明显差异。本发明疫苗接种小鼠表现出明显少于对照组的肿瘤血管生成。
实施例17.细胞毒性实验由成功接种的小鼠在肿瘤细胞攻击后5天分离脾细胞。用标准51Cr-释放实验评测对靶细胞(D121肿瘤细胞或过表达生存蛋白的鼠内皮细胞)的细胞毒性。为测定特异性MHC I类限制性细胞毒性，用10μg/ml抗小鼠MHC I类H-2Kb/Db抗体(PharMingen，San Diego，CA)进行抑制评价。
51Cr-释放实验表明，由接种并随后用D121 Lewis肺癌细胞攻击的小鼠获得的特异性CD8+T细胞诱导显著的细胞毒性。分离自用自身鼠生存蛋白/muCCL21或鼠生存蛋白疫苗免疫小鼠脾细胞的CD8+T细胞分别有效裂解50％和30％的D121肿瘤细胞。相反，分离自对照小鼠的CD8+T细胞没有引起任何明显的肿瘤细胞杀伤作用，因为它们仅显示出本底细胞毒性活性。所观测到的CD8+T细胞介导的细胞毒性表征为MHC I类抗原限制性，因为加入抗-H2Kb/H2Db抗体可完全消除细胞毒性。
实施例18.流式细胞仪分析和细胞因子释放实验用BD Biosciences FACScan，通过2或3色流式细胞仪分析测定T细胞活化标记物以及CD11c和MHCII类抗原阳性DC上共刺激分子的表达。通过用FITC标记的抗CD-3e抗体联合PE-偶联的抗CD-25、CD28或CD69抗体染色刚分离自成功接种小鼠的脾细胞，测定T细胞活化。用FITC标记的抗CD11c抗体和生物素化抗IAb抗体、接着用链霉抗生物素蛋白-别藻蓝蛋白，联合PE-偶联的抗-ICAM-1、CD80或DEC205抗体，检测APC上共刺激分子的活化。所有的流式细胞仪实验都在0.1μg/ml碘化丙锭存在下进行，以排除死细胞。用于这些实验的所有试剂都得自BD Pharmingen(La Jolla，CA)。
使用流式细胞仪检测胞内细胞因子。为此，在D121肿瘤细胞攻击后约2周收集B57BL/6J小鼠的脾细胞，在完全T细胞培养基中与如前所述照射过的D121细胞一起培养约24小时。将预温育的细胞与约1mg纯化2.4G2抗体(BD Pharmingen)混合，以封闭非特异性染色。漂洗细胞，然后用0.5mg FITC缀合的抗CD3+抗体染色。漂洗两次后，固定细胞，用1mg/ml PE缀合的抗IL-2抗体或抗IFN-g抗体染色，以进行流式细胞仪分析。所有抗体都得自BD Pharmingen(LaJolla，CA)。
仅有自身的鼠生存蛋白/muCCL21疫苗最有效地明显上调CD25、CD28和CD69T细胞活化标记物的表达。CD28上调特别重要，因为已知其与DC上B7共刺激分子的相互作用是原初T细胞和抗原提呈DC之间实现关键复杂的相互作用所必需的。相反，仅编码自身鼠生存蛋白或muCCL21的DNA疫苗只将T细胞活化标记物的表达增加了1倍。鼠生存蛋白/muCCL21疫苗同时活化CD4+和CD8+T细胞还表现于胞内促炎细胞因子IFN-g和IL-2的明显增加。相比之下，发现PBS和空载体对照以及仅编码鼠生存蛋白或muCCL21的DNA疫苗对诱导这些细胞因子明显效果较小。
基于鼠生存蛋白/muCCL21的DNA疫苗实现了DC上ICAM-1、CD80和DEC205的表达上调，这是非常重要的，因为众所周知T细胞活化关键取决于与DC上表达的这些共刺激分子的细胞-细胞强相互作用，以达到和T细胞受体的最佳连接。再者，用携带编码鼠生存蛋白/muCCL21的真核质粒的双减毒鼠伤寒沙门氏杆菌(Salmonellatyphimurium)免疫接种最有效地诱导这些活化标记物上调，比对照高2-3倍。
实施例19.肿瘤细胞凋亡分析分别在接种后约3小时和约24小时检测由接种诱导的D121肿瘤细胞凋亡。对照和实验小鼠都在3次免疫的最后一次之后1周用约1×105个D121细胞i.v.攻击。肿瘤细胞攻击后1周收集各个小鼠的脾细胞，此后将约2.5×107个脾细胞与约5×105个D121细胞在6孔培养板中共培养4小时。使用ANNEXINV-FITC凋亡检测试剂盒II(BD Biosciences Pharmingen，San Diego，CA)确认凋亡的早期阶段。为检验后期肿瘤细胞凋亡，将约5×105个D121细胞和约2.5×107个脾细胞共培养约24小时，然后用APO-DIRECTTM试剂盒(BDBiosciences Phramingen，San Diego，CA)，按照生产商的说明，以TUNEL实验通过FACS分析凋亡。
早在3小时就观察到凋亡，24小时后，如Annexin V或TUNEL实验所获的流式细胞仪分析数据所示，凋亡明显地进一步增加。因此，在由这些小鼠收集的脾细胞与肿瘤细胞共培养后，鼠生存蛋白/muCCL21疫苗免疫小鼠组的早期凋亡比对照高3-4倍。仅编码鼠生存蛋白的疫苗稍微引发凋亡，但仅比对照高1倍。但是，在24小时时，只在鼠生存蛋白/muCCL21疫苗免疫小鼠中观测到凋亡急剧增加85％，这提示CTL诱导的强烈肿瘤细胞免疫触发本事件。
实施例20.制备编码鼠生存蛋白和H60的DNA疫苗含全长鼠NKG2D配体-H60的质粒由Drs.A.Diefenbach和D.H.Raulet(University of California，Berkeley，CA)惠赠。如上所述在pBudCE4.1(Invitrogen)上构建表达载体。
如前文所述，通过电穿孔用DNA疫苗质粒转化双减毒鼠伤寒沙门氏杆菌(S.typhimurium)(AroA-、dam-)。简而言之，在冰上于0.1cm小杯中混合新鲜制备的处于对数生长中期的细菌(约1×108个)和质粒DNA(1-2μg)，以约2.0KV、25μF和100Ω电穿孔。培养具有DNA疫苗载体的抗性菌落，在验证编码序列后将其储存于-80℃。
实施例21.用实施例20的疫苗口服接种小鼠和肿瘤攻击小鼠以2周的间隔，用含具有表达载体的约5×108个双减毒鼠伤寒沙门氏杆菌(S.typhimurium)的100μl PBS溶液经口管饲2次免疫BALB/c A2Kb小鼠组(n＝4-12)。预防模式在最后一次接种后2周，治疗模式在首次接种前5天，用约1×105个CT-26细胞i.v.攻击BALB/c小鼠。肿瘤攻击后25天或28天处死小鼠，分别检测肺转移瘤或肺重量，并将其与对照相比。以Student的t检验法确定实验组和对照之间结果差异的统计学显著性。如果双尾P值＜0.05，则认为结果是显著的。
通过转染293T细胞并用流式细胞仪或蛋白质印迹分析检验，证实H60和鼠生存蛋白的表达。H60的表达通过NKG2D四聚体阳性染色证实。根据预测分子量约16.5KDa处的单一条带所示，生存蛋白转染的细胞测试为阳性。CT-26表达的NKG2D配体水平比阳性对照Yac-1细胞低。先前报道了NKG2D配体表达水平低的肿瘤细胞不能诱导肿瘤排斥。在预防模式中，在肿瘤攻击后25天处死小鼠后评价肺重量和转移瘤记分(如上文所述)。结果示于表5和表6。数据显示，单独的H60和鼠生存蛋白疫苗在一定程度上保护小鼠，而H60和鼠生存蛋白组合(鼠生存蛋白/H60疫苗)显著增强抗肿瘤攻击的保护，证据是肺转移瘤记分明显降低，肿瘤负担缩小。这些结果与PBS、pBud、pH60和p鼠生存蛋白对照组相比具有统计学显著性(分别为p＜0.0001、0.002、0.01和0.005)。
在治疗模式(即抗已经建立的结肠癌转移瘤)中，在第28天处死小鼠后评价肺部肿瘤负荷。值得注意的是，H60/鼠生存蛋白疫苗处理的12只小鼠中有8只存活，更重要的是，这些存活小鼠有2只完全没有转移瘤，而另外2只融合转移瘤覆盖的肺表面积少于5％。相比之下，空pBud载体处理的对照组仅有2只小鼠存活，融合转移瘤覆盖了所有存活小鼠超过50％的肺表面积。在治疗模式中，仅用鼠生存蛋白疫苗接种没有产生任何显著的保护作用，仅用H60疫苗接种只具有最低限度的治疗作用。后者的依据是存活率稍微提升，其中一只存活小鼠融合转移瘤覆盖肺的表面积仅仅小于5％。
表5.免疫接种后用CT-26细胞攻击的BalB/C小鼠的转移肿
表6.免疫接种前用CT-26细胞攻击的BalB/C小鼠的转移瘤
实施例22.细胞毒性实验如前文所述，用标准51Cr-释放实验检测细胞毒性。简而言之，在最后一次免疫后2周收集脾细胞，在补加10％FBS、L-谷氨酰胺、15mM HEPES、非必需氨基酸、丙酮酸钠、2-ME和20U/ml重组IL-2(PeproTech，Rocky Hill，NJ)的RPMI 1640中，用照射(1,000Gy)过的CT-26细胞于37℃体外刺激5天。收集脾细胞，用Lympholyte-M细胞分离培养基(Cedarlane Laboratories Limited，Hornby，Ontario，Canada)分离。用51Cr于室温标记靶细胞约1.5小时，于37℃将靶细胞与各种E/T比率的效应细胞温育约4小时。以式[(E-S)/(T-S)]×100计算特异性靶细胞裂解的百分率，其中E是平均实验释放，S是平均自发释放，而T是平均总释放。
发现H60疫苗免疫小鼠的NK活性显著增强，甚至高于在鼠生存蛋白/H60疫苗免疫小鼠中观测到的NK杀伤活性。鼠生存蛋白/H60疫苗免疫小鼠的脾细胞显示最高的抗CT-26靶细胞的细胞毒性，相反，分离自pBud免疫对照的这种脾细胞显示出最小的细胞毒性杀伤作用，而H60疫苗或鼠生存蛋白接种小鼠自身的脾细胞显示出稍微高的细胞毒性杀伤作用。细胞培养5天后，NK细胞似乎在此细胞毒性实验中没有起主要作用，因为在使用Yac-1NK靶细胞时没有观测到显著的差异，提示检测到的细胞毒性作用主要由CTL介导。
在不偏离本发明新特征的精神和范围的情况下，可对上述实施方案进行各种变化和改变。本文描述的具体实施方案没有也不应推测其有限制作用。
序列表<110>Xiaug，RongZhou，HeReisfeld，Ralph A.
The Scripps Research Institute<120>抗肿瘤生长的DNA疫苗及其使用方法<130>TSRI-874.1<150>60/457,009<151>2003-03-24<160>29<170>FastSEQ for Windows Version 4.0<210>1<211>1643<212>DNA<213>智人<400>1agatttgaat cgcgggaccc gttggcagag gtggcggcgg cggcatgggt gccccgacgt 60tgccccctgc ctggcagccc tttctcaagg accaccgcat ctctacattc aagaactggc 120ccttcttgga gggctgcgcc tgcaccccgg agcggatggc cgaggctggc ttcatccact 180gccccactga gaacgagcca gacttggccc agtgtttctt ctgcttcaag gagctggaag 240gctgggagcc agatgacgac cccatagagg aacataaaaa gcattcgtcc ggttgcgctt 300tcctttctgt caagaagcag tttgaagaat taacccttgg tgaatttttg aaactggaca 360gagaaagagc caagaacaaa attgcaaagg aaaccaacaa taagaagaaa gaatttgagg 420aaactgcgaa gaaagtgcgc cgtgccatcg agcagctggc tgccatggat tgaggcctct 480ggccggagct gcctggtccc agagtggctg caccacttcc agggtttatt ccctggtgcc 540accagccttc ctgtgggccc cttagcaatg tcttaggaaa ggagatcaac attttcaaat 600tagatgtttc aactgtgctc ttgttttgtc ttgaaagtgg caccagaggt gcttctgcct 660gtgcagcggg tgctgctggt aacagtggct gcttctctct ctctctctct tttttggggg 720ctcatttttg ctgttttgat tcccgggctt accaggtgag aagtgaggga ggaagaaggc 780agtgtccctt ttgctagagc tgacagcttt gttcgcgtgg gcagagcctt ccacagtgaa 840tgtgtctgga cctcatgttg ttgaggctgt cacagtcctg agtgtggact tggcaggtgc 900ctgttgaatc tgagctgcag gttccttatc tgtcacacct gtgcctcctc agaggacagt 960ttttttgttg tgtttttttt tttttttttt ggtagatgca tgacttgtgt gtgatgagag 1020aatggagaca gagtccccgg ctcctctact gtttaacaac atggctttct tattttgttt 1080
gaattgttaa ttcacagaat agcacaaact acaattaaaa ctaagcacaa agccattcta 1140agtcattggg gaaacggggt gaacttcagg tggatgagga gacagaatag agtgatagga 1200agcgtctggc agatactcct tttgccactg ctgtgtgatt agacaggccc agtgagccgc 1260ggggcacatg ctggccgctc ctccctcaga aaaaggcagt ggcctaaatc ctttttaaat 1320gacttggctc gatgctgtgg gggactggct gggctgctgc aggccgtgtg tctgtcagcc 1380caaccttcac atctgtcacg ttctccacac gggggagaga cgcagtccgc ccaggtcccc 1440gctttctttg gaggcagcag ctcccgcagg gctgaagtct ggcgtaagat gatggatttg 1500attcgccctc ctccctgtca tagagctgca gggtggattg ttacagcttc gctggaaacc 1560tctggaggtc atctcggctg ttcctgagaa ataaaaagcc tgtcatttca aataaaaaaa 1620aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaa 1643<210>2<211>142<212>PRT<213>智人<400>2Met Gly Ala Pro Thr Leu Pro Pro Ala Trp Gln Pro Phe Leu Lys Asp1 5 10 15His Arg Ile Ser Thr Phe Lys Asn Trp Pro Phe Leu Glu Gly Cys Ala20 25 30Cys Thr Pro Glu Arg Met Ala Glu Ala Gly Phe Ile His Cys Pro Thr35 40 45Glu Asn Glu Pro Asp Leu Ala Gln Cys Phe Phe Cys Phe Lys Glu Leu50 55 60Glu Gly Trp Glu Pro Asp Asp Asp Pro Ile Glu Glu His Lys Lys His65 70 75 80Ser Ser Gly Cys Ala Phe Leu Ser Val Lys Lys Gln Phe Glu Glu Leu85 90 95Thr Leu Gly Glu Phe Leu Lys Leu Asp Arg Glu Arg Ala Lys Asn Lys100 105 110Ile Ala Lys Glu Thr Asn Asn Lys Lys Lys Glu Phe Glu Glu Thr Ala115 120 125Lys Lys Val Arg Arg Ala Ile Glu Gln Leu Ala Ala Met Asp130 135 140<210>3<211>955<212>DNA<213>小家鼠<400>3
ggcacgaggg ggccggggct ctcccggcat gctctgcggc gcgcctccgc ccgcgcgatt 60tgaatcctgc gtttgagtcg tcttggcgga ggttgtggtg acgccatcat gggagctccg 120gcgctgcccc agatctggca gctgtacctc aagaactacc gcatcgccac cttcaagaac 180tggcccttcc tggaggactg cgcctgcacc ccagagcgaa tggcggaggc tggcttcatc 240cactgcccta ccgagaacga gcctgatttg gcccagtgtt ttttctgctt taaggaattg 300gaaggctggg aacccgatga caacccgata gaggagcata gaaagcactc ccctggctgc 360gccttcctca ctgtcaagaa gcagatggaa gaactaaccg tcagtgaatt cttgaaactg 420gacagacaga gagccaagaa caaaattgca aaggagacca acaacaagca aaaagagttt 480gaagagactg caaagactac ccgtcagtca attgagcagc tggctgccta atgctgagcc 540tttgctgaga taacttggac ctgagtgaca tgccacatct aagccacgca tcccagcttt 600tccagccagg gcctcctagc aggatcttag agaaggagac agtggtattt tgaaactgga 660tatcaaatat ttttggtttt gctttaaagt ggctacctct ctttggtttt gtggctttgc 720tctattgtga cgtggactta agcaataagg aagtgatgaa gggacagtgt tctctgacag 780gacctgtggg ggtcggggtg cctgtgcaag gtcttggttc tgattgtgat atttccatac 840agggctgcta atgcagccca tgggtaagtg tggttatatg tgtttgtgct gataattttg 900tcctgatgag ttttcctacc acggggtaac ggaataaaat cacttgaaaa agtgg 955<210>4<211>140<212>PRT<213>小家鼠<400>4Met Gly Ala Pro Ala Leu Pro Gln Ile Trp Gln Leu Tyr Leu Lys Asn1 5 10 15Tyr Arg Ile Ala Thr Phe Lys Asn Trp Pro Phe Leu Glu Asp Cys Ala20 25 30Cys Thr Pro Glu Arg Met Ala Glu Ala Gly Phe Ile His Cys Pro Thr35 40 45Glu Asn Glu Pro Asp Leu Ala Gln Cys Phe Phe Cys Phe Lys Glu Leu50 55 60Glu Gly Trp Glu Pro Asp Asp Asn Pro Ile Glu Glu His Arg Lys His65 70 75 80Ser Pro Gly Cys Ala Phe Leu Thr Val Lys Lys Gln Met Glu Glu Leu85 90 95Thr Val Ser Glu Phe Leu Lys Leu Asp Arg Gln Arg Ala Lys Asn Lys100 105 110Ile Ala Lys Glu Thr Asn Asn Lys Gln Lys Glu Phe Glu Glu Thr Ala115 120 125Lys Thr Thr Arg Gln Ser Ile Glu Gln Leu Ala Ala130 135 140
<210>5<211>852<212>DNA<213>智人<400>5cttgcagctg cccacctcac cctcagctct ggcctcttac tcaccctcta ccacagacat 60ggctcagtca ctggctctga gcctccttat cctggttctg gcctttggca tccccaggac 120ccaaggcagt gatggagggg ctcaggactg ttgcctcaag tacagccaaa ggaagattcc 180cgccaaggtt gtccgcagct accggaagca ggaaccaagc ttaggctgct ccatcccagc 240tatcctgttc ttgccccgca agcgctctca ggcagagcta tgtgcagacc caaaggagct 300ctgggtgcag cagctgatgc agcatctgga caagacacca tccccacaga aaccagccca 360gggctgcagg aaggacaggg gggcctccaa gactggcaag aaaggaaagg gctccaaagg 420ctgcaagagg actgagcggt cacagacccc taaagggcca tagcccagtg agcagcctgg 480agccctggag accccaccag cctcaccaac gcttgaagcc tgaacccaag atgcaagaag 540gaggctatgc tcaggggccc tggagcagcc accccatgct ggccttgcca cactctttct 600cctgctttaa ccaccccatc tgcattccca gctctaccct gcatggctga gctgcccaca 660gcaggccagg tccagagaga ccgaggaggg agagtctccc agggagcatg agaggaggca 720gcaggactgt ccccttgaag gagaatcatc aggaccctgg acctgatacg gctccccagt 780acaccccacc tcttccttgt aaatatgatt tatacctaac tgaataaaaa gctgttctgt 840cttcccaccc gc 852<210>6<211>134<212>PRT<213>智人<400>6Met Ala Gln Ser Leu Ala Leu Ser Leu Leu Ile Leu Val Leu Ala Phe1 5 10 15Gly Ile Pro Arg Thr Gln Gly Ser Asp Gly Gly Ala Gln Asp Cys Cys20 25 30Leu Lys Tyr Ser Gln Arg Lys Ile Pro Ala Lys Val Val Arg Ser Tyr35 40 45Arg Lys Gln Glu Pro Ser Leu Gly Cys Ser Ile Pro Ala Ile Leu Phe50 55 60Leu Pro Arg Lys Arg Ser Gln Ala Glu Leu Cys Ala Asp Pro Lys Glu65 70 75 80Leu Trp Val Gln Gln Leu Met Gln His Leu Asp Lys Thr Pro Ser Pro85 90 95Gln Lys Pro Ala Gln Gly Cys Arg Lys Asp Arg Gly Ala Ser Lys Thr100 105 110Gly Lys Lys Gly Lys Gly Ser Lys Gly Cys Lys Arg Thr Glu Arg Ser
115 120 125Gln Thr Pro Lys Gly Pro130<210>7<211>615<212>DNA<213>小家鼠<400>7gaattcggcc aaagaggcct acggccaaag agggctaaac ttgcggctgt ccatctcacc 60tacagctctg gtctcatcct caactcaacc acaatcatgg ctcagatgat gactctgagc 120ctccttagcc tggtcctggc tctctgcatc ccctggaccc aaggcagtga tggagggggt 180caggactgct gccttaagta cagccagaag aaaattccct acagtattgt ccgaggctat 240aggaagcaag aaccaagttt aggctgtccc atcccggcaa tcctgttctc accccggaag 300cactctaagc ctgagctatg tgcaaaccct gaggaaggct gggtgcagaa cctgatgcgc 360cgcctggacc agcctccagc cccagggaaa caaagccccg gctgcaggaa gaaccgggga 420acctctaagt ctggaaagaa aggaaagggc tccaagggct gcaagagaac tgaacagaca 480cagccctcaa gaggatagcc cagtagcccg cctggagccc aggagatccc ccacgaactt 540caagctgggt ggttcacggt ccaactcaca ggcaaagagg gagctagaaa acagactcag 600gagccgctag tcgag 615<210>8<211>133<212>PRT<213>小家鼠<400>8Met Ala Gln Met Met Thr Leu Ser Leu Leu Ser Leu Val Leu Ala Leu1 5 10 15Cys Ile Pro Trp Thr Gln Gly Ser Asp Gly Gly Gly Gln Asp Cys Cys20 25 30Leu Lys Tyr Ser Gln Lys Lys Ile Pro Tyr Ser Ile Val Arg Gly Tyr35 40 45Arg Lys Gln Glu Pro Ser Leu Gly Cys Pro Ile Pro Ala Ile Leu Phe50 55 60Ser Pro Arg Lys His Ser Lys Pro Glu Leu Cys Ala Asn Pro Glu Glu65 70 75 80Gly Trp Val Gln Asn Leu Met Arg Arg Leu Asp Gln Pro Pro Ala Pro85 90 95Gly Lys Gln Ser Pro Gly Cys Arg Lys Asn Arg Gly Thr Ser Lys Ser100 105 110
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<210>28<211>1268<212>DNA<213>智人<220>
<221>CDS<222>(174)...(1016)<400>28ccctgggata ctcccctccc agggtgtctg gtggcaggcc tgtgcctatc cctgctgtcc 60ccagggtggg ccccgggggt caggagctcc agaagggcca gctgggcata ttctgagatt 120ggccatcagc ccccatttct gctgcaaacc tggtcagagc cagtgttccc tcc atg 176Met1gga cct aaa gac agt gcc aag tgc ctg cac cgt gga cca cag ccg agc224Gly Pro Lys Asp Ser Ala Lys Cys Leu His Arg Gly Pro Gln Pro Ser5 10 15cac tgg gca gcc ggt gat ggt ccc acg cag gag cgc tgt gga ccc cgc272His Trp Ala Ala Gly Asp Gly Pro Thr Gln Glu Arg Cys Gly Pro Arg20 25 30tct ctg ggc agc cct gtc cta ggc ctg gac acc tgc aga gcc tgg gac320Ser Leu Gly Ser Pro Val Leu Gly Leu Asp Thr Cys Arg Ala Trp Asp35 40 45cac gtg gat ggg cag atc ctg ggc cag ctg cgg ccc ctg aca gag gag368His Val Asp Gly Gln Ile Leu Gly Gln Leu Arg Pro Leu Thr Glu Glu50 55 60 65gaa gag gag gag ggc gcc ggg gcc acc ttg tcc agg ggg cct gcc ttc416Glu Glu Glu Glu Gly Ala Gly Ala Thr Leu Ser Arg Gly Pro Ala Phe70 75 80ccc ggc atg ggc tct gag gag ttg cgt ctg gcc tcc ttc tat gac tgg464Pro Gly Met Gly Ser Glu Glu Leu Arg Leu Ala Ser Phe Tyr Asp Trp85 90 95ccg ctg act gct gag gtg cca ccc gag ctg ctg gct gct gcc ggc ttc512Pro Leu Thr Ala Glu Val Pro Pro Glu Leu Leu Ala Ala Ala Gly Phe
100 105 110ttc cac aca ggc cat cag gac aag gtg agg tgc ttc ttc tgc tat ggg 560Phe His Thr Gly His Gln Asp Lys Val Arg Cys Phe Phe Cys Tyr Gly115 120 125ggc ctg cag agc tgg aag cgc ggg gac gac ccc tgg acg gag cat gcc 608Gly Leu Gln Ser Trp Lys Arg Gly Asp Asp Pro Trp Thr Glu His Ala130 135 140 145aag tgg ttc ccc agc tgt cag ttc ctg ctc cgg tca aaa gga aga gac 656Lys Trp Phe Pro Ser Cys Gln Phe Leu Leu Arg Ser Lys Gly Arg Asp150 155 160ttt gtc cac agt gtg cag gag act cac tcc cag ctg ctg ggc tcc tgg 704Phe Val His Ser Val Gln Glu Thr His Ser Gln Leu Leu Gly Ser Trp165 170 175gac ccg tgg gaa gaa ccg gaa gac gca gcc cct gtg gcc ccc tcc gtc 752Asp Pro Trp Glu Glu Pro Glu Asp Ala Ala Pro Val Ala Pro Ser Val180 185 190cct gcc tct ggg tac cct gag ctg ccc aca ccc agg aga gag gtc cag 800Pro Ala Ser Gly Tyr Pro Glu Leu Pro Thr Pro Arg Arg Glu Val Gln195 200 205tct gaa agt gcc cag gag cca gga gcc agg gat gtg gag gcg cag ctg 848Ser Glu Ser Ala Gln Glu Pro Gly Ala Arg Asp Val Glu Ala Gln Leu210 215 220 225cgg cgg ctg cag gag gag agg acg tgc aag gtg tgc ctg gac cgc gcc 896Arg Arg Leu Gln Glu Glu Arg Thr Cys Lys Val Cys Leu Asp Arg Ala230 235 240gtg tcc atc gtc ttt gtg ccg tgc ggc cac ctg gtc tgt gct gag tgt 944Val Ser Ile Val Phe Val Pro Cys Gly His Leu Val Cys Ala Glu Cys245 250 255gcc ccc ggc ctg cag ctg tgc ccc atc tgc aga gcc ccc gtc cgc agc 992Ala Pro Gly Leu Gln Leu Cys Pro Ile Cys Arg Ala Pro Val Arg Ser260 265 270cgc gtg cgc acc ttc ctg tcc tag gccaggtgcc atggccggcc aggtgggctg 1046
Arg Val Arg Thr Phe Leu Ser *275 280cagagtgggc tccctgcccc tctctgcctg ttctggactg tgttctgggc ctgctgagga 1106tggcagagct ggtgtccatc cagcactgac cagccctgat tccccgacca ccgcccaggg 1166tggagaagga ggcccttgct tggcgtgggg gatggcttaa ctgtacctgt ttggatgctt 1226ctgaatagaa ataaagtggg ttttccctgg aggtacccag ca 1268<210>29<211>280<212>PRT<213>智人<400>29Met Gly Pro Lys Asp Ser Ala Lys Cys Leu His Arg Gly Pro Gln Pro1 5 10 15Ser His Trp Ala Ala Gly Asp Gly Pro Thr Gln Glu Arg Cys Gly Pro20 25 30Arg Ser Leu Gly Ser Pro Val Leu Gly Leu Asp Thr Cys Arg Ala Trp35 40 45Asp His Val Asp Gly Gln Ile Leu Gly Gln Leu Arg Pro Leu Thr Glu50 55 60Glu Glu Glu Glu Glu Gly Ala Gly Ala Thr Leu Ser Arg Gly Pro Ala65 70 75 80Phe Pro Gly Met Gly Ser Glu Glu Leu Arg Leu Ala Ser Phe Tyr Asp85 90 95Trp Pro Leu Thr Ala Glu Val Pro Pro Glu Leu Leu Ala Ala Ala Gly100 105 110Phe Phe His Thr Gly His Gln Asp Lys Val Arg Cys Phe Phe Cys Tyr115 120 125Gly Gly Leu Gln Ser Trp Lys Arg Gly Asp Asp Pro Trp Thr Glu His130 135 140Ala Lys Trp Phe Pro Ser Cys Gln Phe Leu Leu Arg Ser Lys Gly Arg145 150 155 160Asp Phe Val His Ser Val Gln Glu Thr His Ser Gln Leu Leu Gly Ser165 170 175Trp Asp Pro Trp Glu Glu Pro Glu Asp Ala Ala Pro Val Ala Pro Ser180 185 190Val Pro Ala Ser Gly Tyr Pro Glu Leu Pro Thr Pro Arg Arg Glu Val195 200 205Gln Ser Glu Ser Ala Gln Glu Pro Gly Ala Arg Asp Val Glu Ala Gln210 215 220Leu Arg Arg Leu Gln Glu Glu Arg Thr Cys Lys Val Cys Leu Asp Arg
225 230 235 240Ala Val Ser Ile Val Phe Val Pro Cys Gly His Leu Val Cys Ala Glu245 250 255Cys Ala Pro Gly Leu Gln Leu Cys Pro Ile Cys Arg Ala Pro Val Arg260 265 270Ser Arg Val Arg Thr Phe Leu Ser275 280
权利要求
1.一种适于激发抗肿瘤细胞的免疫应答的DNA疫苗，所述疫苗在药物可接受载体中含有有效编码至少一种癌症相关凋亡抑制家族蛋白(IAP-家族蛋白)和至少一种免疫活性基因产物的DNA构建物。
2.权利要求1的DNA疫苗，其中所述癌症相关IAP-家族蛋白选自生存蛋白和livin蛋白。
3.权利要求1的DNA疫苗，其中所述DNA有效编码选自以下的生存蛋白(a)具有SEQ ID NO2氨基酸残基序列的野生型人生存蛋白；(b)其氨基酸残基序列与SEQ ID NO2至少80％相同的野生型人生存蛋白的免疫原性同源物；(c)具有SEQ ID NO23氨基酸残基序列的人生存蛋白剪接变体；(d)具有SEQ ID NO24氨基酸残基序列的人生存蛋白剪接变体；和(e)结合MHC I类分子并由细胞毒性T细胞识别的生存蛋白片段。
4.权利要求1的DNA疫苗，其中所述DNA构建物有效编码具有SEQ ID NO2氨基酸残基序列的野生型人生存蛋白。
5.权利要求1的DNA疫苗，其中所述DNA构建物有效编码具有SEQ ID NO23氨基酸残基序列的人生存蛋白剪接变体。
6.权利要求1的DNA疫苗，其中所述DNA构建物有效编码具有SEQ ID NO24氨基酸残基序列的人生存蛋白剪接变体。
7.权利要求1的DNA疫苗，其中所述DNA构建物有效编码其氨基酸残基序列与SEQ ID NO2至少80％相同的野生型人生存蛋白的免疫原性同源物。
8.权利要求1的DNA疫苗，其中所述DNA构建物有效编码其氨基酸残基序列与SEQ ID NO2至少90％相同的野生型人生存蛋白的免疫原性同源物。
9.权利要求1的DNA疫苗，其中所述DNA构建物有效编码其氨基酸残基序列与SEQ ID NO2至少95％相同的野生型人生存蛋白的免疫原性同源物。
10.权利要求1的DNA疫苗，其中所述DNA构建物有效编码选自以下的livin蛋白(a)具有SEQ ID NO27氨基酸残基序列的全长野生型人livinα剪接变体；(b)具有SEQ ID NO29氨基酸残基序列的人livinβ剪接变体；(c)其氨基酸残基序列与SEQ ID NO27至少80％相同的全长野生型人livin的免疫原性同源物；(d)其氨基酸残基序列与SEQ ID NO29至少80％相同的野生型人livinβ剪接变体的免疫原性同源物；和(e)结合MHCI类分子并由细胞毒性T细胞识别的livin蛋白片段。
11.权利要求1的DNA疫苗，其中所述DNA构建物有效编码具有SEQ ID NO27氨基酸残基序列的人livin剪接变体。
12.权利要求1的DNA疫苗，其中所述DNA构建物有效编码具有SEQ ID NO29氨基酸残基序列的人livin剪接变体。
13.权利要求1的DNA疫苗，其中所述DNA构建物有效编码其氨基酸残基序列与SEQ ID NO27或SEQ ID NO29至少80％相同的野生型人生存蛋白的免疫原性同源物。
14.权利要求1的DNA疫苗，其中所述DNA构建物有效编码其氨基酸残基序列与SEQ ID NO27或SEQ ID NO29至少90％相同的野生型人livin的免疫原性同源物。
15.权利要求1的DNA疫苗，其中所述DNA构建物有效编码其氨基酸残基序列与SEQ ID NO27或SEQ ID NO29至少95％相同的野生型人livin的免疫原性同源物。
16.权利要求l的DNA疫苗，其中所述由DNA构建物有效编码的免疫活性基因产物是细胞因子或天然杀伤细胞表面受体的配体。
17.权利要求16的DNA疫苗，其中所述细胞因子选自趋化因子、血细胞生成素、干扰素、天然杀伤细胞刺激因子和诱导细胞因子产生的因子。
18.权利要求17的DNA疫苗，其中所述细胞因子是人CCL21。
19.权利要求16的DNA疫苗，其中所述由DNA构建物有效编码的天然杀伤细胞表面受体的配体是应激诱导性蛋白，所述应激诱导性蛋白选自人MICA、人MICB、人ULBP1、人ULBP2和人ULBP3。
20.权利要求1的DNA疫苗，其中所述DNA构建物有效整合入质粒载体中。
21.权利要求1的DNA疫苗，其中所述DNA构建物有效整合入减毒细菌载体中。
22.权利要求21的DNA疫苗，其中所述减毒细菌载体选自减毒的鼠伤寒沙门氏杆菌(Salmonella typhimurium)、伤寒沙门氏杆菌(Salmonella typhi)、志贺氏菌(Shigella)属、芽孢杆菌(Bacillus)属、乳杆菌(lactobacillus)属、卡介苗(BCG)、大肠杆菌(Escherichia coli)、霍乱弧菌(Vibrio cholerae)、弯曲杆菌(Campylobacter)属和李斯特氏菌(Listeria)属。
23.权利要求21的DNA疫苗，其中所述减毒细菌载体是减毒鼠伤寒沙门氏杆菌(Salmonella typhimurium)。
24.权利要求23的DNA疫苗，其中所述减毒鼠伤寒沙门氏杆菌(Salmonella typhimurium)是AroA-鼠伤寒沙门氏杆菌(Salmonellatyphimurium)菌株。
25.权利要求23的DNA疫苗，其中所述减毒鼠伤寒沙门氏杆菌(Salmonella typhimurium)是AroA-、dam-鼠伤寒沙门氏杆菌(Salmonellatyphimurium)菌株。
26.权利要求1的DNA疫苗，其中所述有效编码癌症相关IAP-家族蛋白的DNA构建物包含选自以下的多核苷酸序列SEQ ID NO1、SEQ ID NO3、SEQ ID NO26和SEQ ID NO28。
27.权利要求26的DNA疫苗，其中所述DNA构建物有效整合入减毒鼠伤寒沙门氏杆菌(Salmonella typhimurium)载体中。
28.权利要求1的DNA疫苗，其中所述有效编码免疫活性基因产物的DNA构建物包含选自以下的多核苷酸序列SEQ ID NO5、SEQID NO7、SEQ ID NO11、SEQ ID NO13、SEQ ID NO15、SEQID NO17、SEQ ID NO19和SEQ ID NO21。
29.权利要求28的DNA疫苗，其中所述DNA构建物有效整合入减毒鼠伤寒沙门氏杆菌(Salmonella typhimurium)载体中。
30.一种在哺乳动物中抑制肿瘤生长的方法，所述方法包括以下步骤给予哺乳动物有效免疫应答激发量的DNA疫苗，所述DNA疫苗在药物可接受载体中含有有效编码癌症相关IAP-家族蛋白和免疫活性基因产物的DNA构建物，所述哺乳动物籍此表现出由疫苗激发的肿瘤细胞特异性免疫应答。
31.权利要求30的方法，其中所述由DNA构建物编码的癌症相关IAP-家族蛋白选自生存蛋白和livin蛋白。
32.权利要求30的方法，其中所述由DNA构建物编码的免疫活性基因产物是细胞因子或天然杀伤细胞表面受体的配体。
33.权利要求30的方法，其中所述哺乳动物是人。
34.权利要求30的方法，其中所述DNA构建物有效整合入减毒细菌载体中。
35.权利要求34的方法，其中所述减毒细菌载体选自减毒的鼠伤寒沙门氏杆菌(Salmonella typhimurium)、伤寒沙门氏杆菌(Salmonellatyphi)、志贺氏菌(Shigella)属、芽孢杆菌(Bacillus)属、乳杆菌(Lactobacillus)属、卡介苗(BCG)、大肠杆菌(Escherichia coli)、霍乱弧菌(Vibrio cholerae)、弯曲杆菌(Campylobacter)属和李斯特氏菌(Listeria)属。
36.权利要求34的方法，其中所述减毒细菌载体是减毒鼠伤寒沙门氏杆菌(Salmonella typhimurium)。
37.权利要求36的方法，其中所述减毒鼠伤寒沙门氏杆菌(Salmonella typhimurium)是AroA-鼠伤寒沙门氏杆菌(Salmonellatyphimurium)菌株。
38.权利要求36的方法，其中所述减毒鼠伤寒沙门氏杆菌(Salmonella typhimurium)是AroA-、dam-鼠伤寒沙门氏杆菌(Salmonellatyphimurium)菌株。
39.一种包括权利要求1的疫苗的制品，所述疫苗包装在密封无菌容器中，所述容器上粘贴有标签，标签上印有疫苗标识资料，并提供对将所述疫苗给予患者的个人来说有用的信息。
40.一种分离的质粒载体，所述质粒载体包含有效编码癌症相关IAP-家族蛋白和免疫活性基因产物的DNA构建物。
41.一种用载体转染的转化宿主细胞，所述载体包含有效编码癌症相关IAP-家族蛋白和免疫活性基因产物的DNA构建物。
42.一种免疫接种哺乳动物抗癌症的方法，所述方法包括以下步骤给予哺乳动物有效免疫应答激发量的DNA疫苗，该DNA疫苗在药物可接受载体中含有有效编码癌症相关IAP-家族蛋白和免疫活性基因产物的DNA构建物，所述哺乳动物籍此表现出由疫苗激发的肿瘤细胞特异性免疫应答。
43.权利要求42的方法，其中所述由DNA构建物编码的癌症相关IAP-家族蛋白选自生存蛋白和livin蛋白。
44.权利要求42的方法，其中所述由DNA构建物编码的免疫活性基因产物是细胞因子和天然杀伤细胞表面受体的配体。
45.权利要求42的方法，其中所述哺乳动物是人。
46.权利要求42的方法，其中所述DNA构建物有效整合入减毒细菌载体中。
47.权利要求46的方法，其中所述减毒细菌载体选自减毒的鼠伤寒沙门氏杆菌(Salmonella typhimurium)、伤寒沙门氏杆菌(Salmonellatyphi)、志贺氏菌(shigella)属、芽孢杆菌(Bacillus)属、乳杆菌(Lactobacillus)属、卡介苗(BCG)、大肠杆菌(Escherichia coli)、霍乱弧菌(Vibrio cholerae)、弯曲杆菌(Campylobacter)属和李斯特氏菌(Listeria)属。
48.权利要求46的方法，其中所述减毒细菌载体是减毒鼠伤寒沙门氏杆菌(Salmonella typhimurium)。
49.权利要求48的方法，其中所述减毒鼠伤寒沙门氏杆菌(Salmonella typhimurium)是AroA-鼠伤寒沙门氏杆菌(Salmonellatyphimurium)菌株。
50.权利要求49的方法，其中所述减毒鼠伤寒沙门氏杆菌(Salmonella typhimurium)是AroA-、dam-鼠伤寒沙门氏杆菌(Salmonellatyphimurium)菌株。
全文摘要
适于激发抗癌症细胞的免疫应答的DNA疫苗在药物可接受载体中含有有效编码癌症相关凋亡抑制家族蛋白(IAP－家族蛋白)和免疫活性基因产物的DNA构建物，其中所述免疫活性基因产物例如为细胞因子或天然杀伤细胞表面受体的配体。优选的细胞因子是CCL21。优选的天然杀伤细胞表面受体的配体包括人MICA、人MICB、人ULBP1、人ULBP2和人ULBP3。癌症相关凋亡抑制物(IAP)－家族蛋白优选为生存蛋白或livin蛋白。本发明还描述了通过给予哺乳动物本发明疫苗来抑制肿瘤生长的方法。
文档编号C07H21/00GK1791433SQ200480013556
公开日2006年6月21日 申请日期2004年3月24日 优先权日2003年3月24日
发明者R·香, H·周, R·A·赖斯菲尔德 申请人:斯克里普斯研究学院