一种培养dc细胞的培养基及培养方法
【专利摘要】本发明属于细胞生物学领域，具体涉及一种培养DC细胞的培养基及培养方法。本发明所述培养DC的培养基，包括组分1、组分2和组分3；所述组分1为含有牛血清白蛋白、白介素4、GM?CSF和干细胞生长因子SCF的RPMI1640培养基；所述组分2为含有牛血清白蛋白、白介素14、白介素2、白介素4和GM?CSF的RPMI1640培养基；所述组分3为含有牛血清白蛋白、CD40L、GM?CSF和白介素4的RPMI1640培养基。结果显示采用所述培养基培养的DC细胞的抗原提呈能力更强，对T细胞的致敏能力更强，对肿瘤的杀伤能力也大大提高。同时避免了血清的使用，减少了病原微生物的风险。
【专利说明】
_种培养DG细胞的培养基及培养方法
技术领域
[0001] 本发明属于细胞生物学领域，具体涉及一种培养DC细胞的培养基及培养方法。
【背景技术】
[0002] DC细胞是已知体内功能最强、唯一能活化静息T细胞的专职抗原提呈细胞，是启 动、调控和维持免疫应答的中心环节。通过大量体外活化培养负载肿瘤抗原的DC细胞，当细 胞数量达到一定数量后回输给病人，可诱导机体产生强烈的抗肿瘤免疫反应。国际上已经 有通过利用DC细胞制作的肿瘤疫苗，就是通过DC细胞的抗原提呈能力，将肿瘤细胞抗原提 呈给T细胞，从而使得T细胞能够针对性的杀伤肿瘤。而DC细胞在血液中的含量并不高，因此 通过体外培养来获得大量的DC细胞在免疫细胞治疗方面具有非常重大的意义。
[0003] 通常用于培养DC细胞的培养方案是:通过获取外周血中的贴壁细胞，然后用含有 10%FBS、500U/mL 的 GM-CSF 和 IL-4 的 RPMI1640培养基培养 6 天，再加入 20ng/mL 的 TNF-α 刺激 DC细胞成熟2天。
[0004] 然而DC细胞很难被增殖，采用现有的方法培养DC细胞后DC细胞的增殖倍数大都仅 在几倍或者几十倍，因此往往需要大量抽取病人血液以获取足够数量的DC细胞来致敏其他 T细胞，而病人由于自身疾病的关系，能够抽取的血液量较少，并且其中DC细胞的含量更少， 就更加难以扩增。
【发明内容】
[0005] 有鉴于此，本发明的目的在于针对现有技术存在的问题，提供一种培养DC细胞增 殖倍数大的培养基及培养方法。采用本发明所述培养基培养的DC细胞的抗原提呈能力更 强，对T细胞的致敏能力更强，对肿瘤的杀伤能力也大大提高。
[0006] 为了实现本发明的目的，本发明采用如下技术方案：
[0007] -种培养DC的培养基，包括组分1、组分2和组分3;所述组分1为含有牛血清白蛋 白、白介素4、GM-CSF和干细胞生长因子SCF的RPMI1640培养基;所述组分2为含有牛血清白 蛋白、白介素14、白介素2、白介素4和GM-CSF的RPMI1640培养基;所述组分3为含有牛血清白 蛋白、CD40L、GM-CSF和白介素4的RPMI1640培养基。
[0008] 其中GM-CSF为粒细胞集落刺激生物因子，⑶40L为肿瘤坏死因子相关激活蛋白。 [0009]作为优选，所述培养DC的培养基中，
[0010] 所述组分1的RPMI1640培养基中各成分含量为： 牛血清白蛋白 2Qmg/m丨-8.0: mg/ml 白介素4 5ng/ml-50 rng/mi
[0011] GM-CSF 8ng/rnl-45 ng/ml 千细胞生长因子 SCF 6 ng/_ml-35 ng/_:ml_;
[0012] 所述组分2的RPMI1640培养基中各成分含量为： 牛血清白蛋白：20 rng/in丨-70mg/ml 白介素丨 4 10 ng/ml -90ng/ml
[0013] 白介素 2 80 u /ml -500 u /ml 白介素 4 80 u /mi -400 u /mi GM-CSF 6 ng/mi -30ng/ml;
[0014] 所述组分3的RPMI1640培养基中各成分含量为： 牛血清白蛋白20 mgZm丨-90mg/mI CD40L 7 ng/ml -45ng/m!
[0015] ° 0 GM-CSF 5 ng/ml -60ng/rn! 白介素 4 80 u /ml -600 u /ml。
[0016] 在一些实施方案中，所述培养DC的培养基中， [0017] 所述组分1的RPMI1640培养基中各成分含量为： 牛血清白蛋·白 50mg/ml
[0018] 白介素 4 20ng/ml GM-CSF 20ng/ml
[0019] 千细胞生长因子SCF 15 ng/ml;
[0020] 所述组分2的RPMI1640培养基中各成分含量为： 牛血清白蛋白50mg/rn丨 白介素 14 35ng/ml
[0021] 白介素 2 200 u /ml 白介素 4 200 u/ml GM-CSF 20ng/ml;
[0022] 所述组分3的RPMI1640培养基中各成分含量为： 牛血清白蛋白50rng/m丨 CD40L 15ng/ml
[0023] GM-CSF 20ng/ml 白介素 4 200 u /ml〇
[0024] 在一些实施方案中，所述培养DC的培养基中， [0025] 所述组分1的RPMI1640培养基中各成分含量为： 牛血清白蛋白 20mg/m I 白介素 4 5ng/ml
[0026] GM-CSF 8ng/ml 千细胞生长因子SCF 6ng/ml;
[0027] 所述组分2的RPMI1640培养基中各成分含量为： 牛血清白蛋白20mg/m丨 白介素 14 1 Ong/ml
[0028] 白介素2 80u ./ml 白介素 4 80 u /ml GM-CSF 6 ng/ml;
[0029] 所述组分3的RPMI1640培养基中各成分含量为： 牛血清白蛋白20mg/rn丨 CD40L 7ng/ml
[0030] ' GM-CSF 5ng/ml 白介素 4 80 u/irtL
[0031] 在另一些实施方案中，所述培养DC的培养基中，
[0032] 所述组分1的RPMI1640培养基中各成分含量为： 牛血清白蛋白 80 mg/m 1 白介素 4 50na;/ml
[0033] GM-CSF 45ng/ml 干细胞生长因子SCF 35 ng/ml;
[0034] 所述组分2的RPMI1640培养基中各成分含量为： 牛血清白蛋白70mg/m丨 白介素丨4 90ng/ml
[0035] 白介素 2 500 u /ml 白介素 4 400 u /ml GM-CSF 30ng/ml;
[0036] 所述组分3的RPMI1640培养基中各成分含量为： 牛血清白蛋白90mg/m I CD40L 45ng/ml
[0037] GM-CSF 60ng/ml 白介素 4 600 u/ml。
[0038]本发明还提供了一种DC的培养方法，包括以下步骤：
[0039] 1)第0天将单个核细胞用权利要求1所述培养基的组分1重悬，37°C，5%C02培养48 小时；
[0040] 2)第2天向培养基中添加白介素14和白介素2继续培养；
[0041] 3)第4天补加权利要求1所述培养基的组分2,之后每3天补加权利要求1所述培养 基的组分2,到第10天；
[0042] 4)第10天向培养基中加入⑶40L，之后每3天补加权利要求1所述培养基的组分3， 到第16天；
[0043] 5)第17天加入TNFa培养24小时；
[0044] 6)第18天加入K562细胞共培养48小时，收获DC细胞。
[0045] 其中，本发明所述的培养方法中步骤1)所述重悬后的细胞密度优选为5 X105个/ ml-ΙΧΙΟ6 个/ml〇
[0046] 本发明所述的培养方法中步骤3补加权利要求1所述培养基的组分2后的细胞密度 优选为 5 X 105 个/ml-1 X 106 个/ml。
[0047] 本发明所述的培养方法中步骤4补加权利要求1所述培养基的组分3后的细胞密度 优选为 5 X 105 个/ml-1 X 106 个/ml。
[0048] 本发明所述的培养方法在第2天向培养基中添加白介素14和白介素2。其中添加白 介素14至终浓度35ng/ml，添加白介素2至终浓度50ng/ml。
[0049] 在本发明培养第10天时向培养基中添加⑶40L。所述⑶40L的添加量为至终浓度 15ng/ml〇
[0050] 在本发明培养第17天时向培养基中添加 TNFa，刺激DC细胞成熟，所述TNFa的添加 量为至终浓度l〇ng/ml。
[0051] 本领域技术人员可以理解，本发明所述培养方法中所述单个核细胞可以由外周血 或脐带血分离得到。
[0052]由上述技术方案可知，本发明提供了一种培养DC细胞的培养基及培养方法。本发 明所述培养DC的培养基，包括组分1、组分2和组分3;所述组分1为含有牛血清白蛋白、白介 素4、GM-CSF和干细胞生长因子SCF的RPMI1640培养基;所述组分2为含有牛血清白蛋白、白 介素14、白介素2、白介素4和GM-CSF的RPMI1640培养基;所述组分3为含有牛血清白蛋白、 ⑶40L、GM-CSF和白介素4的RPMI1640培养基。本发明所述培养DC的方法，将单个核细胞所述 培养基的组分1重悬，37°C，5%⑶ 2培养48小时;第2天向培养基中添加白介素14和白介素2 继续培养;第4天补加权利要求1所述培养基的组分2,之后每3天补加权利要求1所述培养基 的组分2,到第10天;第10天向培养基中加入CD40L，之后每3天补加权利要求1所述培养基的 组分3，到第16天;第17天加入TNFa培养24小时;第18天加入K562细胞共培养48小时，收获DC 细胞。试验结果显示本发明培养的DC细胞CD86+CDllc+的比例以及DC细胞增殖倍数高于现 有培养方法。且培养获得的DC细胞对肿瘤细胞的杀伤效果远远高于现有培养方法。表明采 用本发明所述培养基培养的DC细胞的抗原提呈能力更强，对T细胞的致敏能力更强，对肿瘤 的杀伤能力也大大提高。同时避免了血清的使用，减少了病原微生物的风险。
【具体实施方式】
[0053] 下面将结合本发明实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述， 显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的 实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都 属于本发明保护的范围。
[0054] 为了更好的理解本发明，下面结合具体实施例对本发明进行详细阐述。如无特殊 说明本发明所述K562细胞，为购买自美国ATCC。
[0055]实施例1 DC细胞培养 [0056]培养基配方：
[0057] 组分 1: RPMI丨640培养基 500ml 牛血清白蛋白 50nig/ml
[0058] 白介素 4(IL-4) 20ng/ml GM-CSF 20ng/ml SCF (干细胞生长因子) 15 ng/ ml;
[0059] 组分 2: RPMI丨640培养基 500ml 牛血清白蛋白 50mg/m丨 白介素丨 4(IL-14) 35ng/ml
[0060] 白介素 2 (IL-2 ) 200 u /ml 白介素 4(IL-4 ) 200 u/ml GM-CSF (粒细胞集落刺激生物因子)20ng/ml;
[0061] 组分 3: RPMI1640培养基 500ιη 丨 牛血清白蛋白 50mg/ml
[0062] CD40L 15ng/ml GM-CSF 20ng/ml 白介素 4(IL-4) 200u/mL
[0063] 培养方法：
[0064] 第0天抽取20ml外周血，用ficoll法分离其中的PBMC，将分离出来的PBMC用组分1 重悬至密度为5X 105-1 X 106/ml，放入培养瓶中培养箱中37°C，5%C02培养48小时。
[0065] 第2天向培养基中添加35ng/ml白介素14和50ng/ml白介素2。
[0066]第4天计算细胞数，按照5 X 105-1 X 106/ml的密度向培养瓶补加组分2。之后每3天 按照5X 105-1 X 106/ml的密度向培养瓶补加组分2,到第10天。
[0067] 第10天向培养基中加入15ng/ml的⑶40L，之后每3天按照5X105-lX106/ml的密度 向培养瓶补加组分3,到第16天。
[0068]第17天向培养瓶中加入10ng/ml的TNFa刺激DC细胞成熟，刺激时间为24小时。 [0069] 第18天将DC细胞和K562细胞进行共培养，48小时后即可收获DC细胞成品。
[0070]实施例2 DC细胞培养 [0071]培养基配方：
[0072]组分 1: RPMI1640培养基 500ml 牛血清白蛋白 20mg/m丨
[0073]白介素 4 ( IL-4 ) 5ng/ml GM-CSF 8ng/ml SCF (干细跑生长因子） 6 ng/ ml;
[0074] 组分 2: RPMI1.64.0 培养基 500ml 牛血清白蛋白 20irtg/m丨 白介素丨4 (IL-14) lOng/ml
[0075] A 士 自介素 2 (IL-2 ) 80u /ml 白介素 4 (IL-4) 80u/ml GM-CSF (粒细胞集落刺激生物因子)6ng/ml;
[0076] 组分 3: RPM11640培养基 500ml
[0077] 牛血清白蛋白 20mg/'ml CD40L 7ng/ml
[0078] GM-CSF 5ng/ml 白介素 4 (IL-4) 80u/mL
[0079] 培养方法：
[0080] 第0天抽取20ml外周血，用ficoll法分离其中的PBMC，将分离出来的PBMC用组分1 重悬至密度为5X 105-1 X 106/ml，放入培养瓶中培养箱中37°C，5%C02培养48小时。
[0081 ] 第2天向培养基中添加35ng/ml白介素14和50ng/ml白介素2。
[0082]第4天计算细胞数，按照5 X 105-1 X 106/ml的密度向培养瓶补加组分2。之后每3天 按照5X 105-1 X 106/ml的密度向培养瓶补加组分2,到第10天。
[0083] 第10天向培养基中加入15ng/ml的⑶40L，之后每3天按照5X105-lX106/ml的密度 向培养瓶补加组分3,到第16天。
[0084]第17天向培养瓶中加入10ng/ml的TNFa刺激DC细胞成熟，刺激时间为24小时。 [0085] 第18天将DC细胞和K562细胞进行共培养，48小时后即可收获DC细胞成品。
[0086] 实施例3 DC细胞培养
[0087] 培养基配方：
[0088] 组分 1: R PM I丨640培养基 500m I 牛血清白蛋白 80mg/ml
[0089] 白介素4 (IL-4 ) 50ng/ml GM-CSF 45ng/ml SCF (干细胞生长因子） 35 ng/ ml;
[0090] 组分 2: RPMI1640培养基 500ml
[0091] 牛血清白蛋白 70mg/ml 白介素丨4 (II 14) 90ng/ml 白介素2 (丨L-2 ) 500u /ml
[0092] 白介素4 ( IL-4 ) 400u /ml GM-CSF (粒细胞集落刺激生物因子）30ng/ml;
[0093] 组分 3: RPMI1640培养基 500ml 牛血清白蛋白 90mg/m丨
[0094] CD40L 45ng/ml GM-CSF 60ng/ml 白介素4 (IL-4) 600u/ml。
[0095] 培养方法：
[0096] 第0天抽取20ml外周血，用ficoll法分离其中的PBMC，将分离出来的PBMC用组分1 重悬至密度为5X 105-1 X 106/ml，放入培养瓶中培养箱中37°C，5%C02培养48小时。
[0097] 第2天向培养基中添加35ng/ml白介素14和50ng/ml白介素2。
[0098]第4天计算细胞数，按照5 X 105-1 X 106/ml的密度向培养瓶补加组分2。之后每3天 按照5X 105-1 X 106/ml的密度向培养瓶补加组分2,到第10天。
[0099] 第10天向培养基中加入15ng/ml的CD40L，之后每3天按照5X105-lX106/ml的密度 向培养瓶补加组分3,到第16天。
[0100]第17天向培养瓶中加入10ng/ml的TNFa刺激DC细胞成熟，刺激时间为24小时。
[0101] 第18天将DC细胞和K562细胞进行共培养，48小时后即可收获DC细胞成品。
[0102] 对比例
[0103] 第0天抽取20ml外周血，用ficoll法分离其中的PBMC，将分离出来的PBMC用 RPMI1640培养基重悬至密度为5X 105-1 X 106/ml，放入培养瓶中培养箱中37°C，5%C02培养 3小时。
[0104] 弃去非贴壁细胞，将贴壁细胞用含有10%FBS、500U/ml的GM-CSF和500U/ml IL-4 的RPMI1640培养基培养6天。
[0105] 再加入20ng/mL的TNF-α刺激DC细胞成熟2天。
[0106] 将DC细胞和K562细胞进行共培养，48小时后即可收获DC细胞成品。
[0107]实施例4 CIK细胞培养
[0108] 抽取20ml外周血用含有10%FBS的RPMI1640培养基重悬，按照lX106/ml的密度接 种在细胞培养瓶中，并加入500-1500U/mL IFN-λ，在37 °C、5 % C02的培养箱诱导培养CIK细 胞；
[0109] 第 2 天补加 50-150U/mL 的 IL-la、10-50ng/ml 的 0KT-3 以及 100-1000U/ml 的 IL-2 溶 液继续培养；
[0110] 之后每3天补充含有10%FBS和1000U/ml IL-2的RPMI1640培养基，保持细胞密度 在5X105/ml。直到第20天。
[0111] 试验例：
[0112] 检测实施例1-3及对比例收获的DC细胞的流式数据和增殖倍数。结果见表1和表2。
[0113] 然后分别取第21天收获的实施例1-3及对比例DC细胞和实施例4收获的CIK细胞混 合放置24小时。检测DC细胞和CIK细胞的混合液的细胞杀伤数据。结果见表3。
[0114] 表1流式数据对比
[0115]
[0116] 表2细胞增殖倍数比较
[0117]
[0118] CD86+和⑶1 lc+是存在于DC细胞的表面标志物，它们在细胞中的比例说明了DC细 胞含量的多少。表1结果显示实施例1-3培养获得的DC细胞中⑶86+CD11C+的比例明显高于 对比例。而表2结果显示实施例1-3培养获得的DC细胞增殖倍数要远远高于对比例，表明本 发明所述培养基对于DC细胞的增殖有着较强的促进作用。
[0119] 表3对靶细胞杀伤数据对比
[0120]
'[0121] 杀伤数据是测量混合后的免疫细胞对于肿瘤细胞的杀伤能力，杀伤百分比越高/ 说明免疫细胞对肿瘤细胞的杀伤效果越好，细胞质量越好。表3结果显示实施例1-3培养获 得的DC细胞对肿瘤细胞的杀伤效果要远远高于对比例。采用本发明所述培养基培养DCDC细 胞抗原提呈能力更强，对T细胞的致敏能力更强。
【主权项】
1. 一种培养DC的培养基，包括组分1、组分2和组分3;所述组分1为含有牛血清白蛋白、 白介素4、GM-CSF和干细胞生长因子SCF的RPMI1640培养基；所述组分2为含有牛血清白蛋 白、白介素14、白介素2、白介素4和GM-CSF的RPMI1640培养基;所述组分3为含有牛血清白蛋 白、CD40UGM-CSF和白介素4的RPMI1640培养基。2. 根据权利要求1所述的培养基，其特征在于， 所述组分1的RPMI 1640培养基中各成分含量为： 牛血清白蛋白 20mg,/m!-80 mg/'m! 白介素4 5ng/iT!l-50 ing/ml GM-CSF 8ng/ml-45 ng/ml 干细胞生长因子SCF 6 ng/ ml-35 ng/ ml; 所述组分2的RPMI 1640培养基中各成分含量为： 牛血清白蛋白20 mg/ml -70mg/ml 白介素 14 10 ng/m! -90ng/ml 白介素2 80 u /ml -500 u /ml 白介素4 80 u /ml -400 u /ml GM-CSF 6 ng/ml -30ng/ml; 所述组分3的RPMI 1640培养基中各成分含量为： 牛血清白蛋白20 mgZmI -90mg/mI CD40L 7 ng/ml -45ng/ml GM-CSF 5 ng/ml -60ng/ml 白介素4 80 u/ml-600 u/ml。3. 根据权利要求1所述的培养基，其特征在于， 所述组分1的RPMI 1640培养基中各成分含量为： 牛血清白蛋白 50mg/'rnl 白介素4 20ng/ml GM-CSF 20ng/ml 平细胞生长因子SCF 15 i-ig/ ml; 所述组分2的RPMI 1640培养基中各成分含量为： 牛血清白蛋白50mg/m 1 白介素 14 35ng/iiil 白介素2 200 U /rn! 白介素4 200 U /rn! GM-CSF 20ng/ml; 所述组分3的RPMI1640培养基中各成分含量为： 牛血清白蛋白50mg/ml CD40L 15ng/ml GM-CSF 20ng/m! 白介素4 200 u /ml4. 根据权利要求1所述的培养基，其特征在于，所述组分1的RPMI1640培养基中各成分 含量为： 牛血清白蛋白 20mg/ml 白介素4 5ng/ml GM-CSF 8ng/ml 干细胞生长罔子S邸6 ng/ml; 所述组分2的RPMI 1640培养基中各成分含量为： 牛血清白蛋白20mg/m I 白介素 I4 lOng/ml 白介素2 80u ,/m! 白介素4 80 U /ml GM-CSF 6 ng/m!; 所述组分3的RPMI 1640培养基中各成分含量为： 牛血清旬齊自2Qmg/ml CD4QL 7ng/ml GM-CSF 5ng/ml 島命秦4 80u/ml。5. 根据权利要求1所述的培养基，其特征在于，所述组分1的RPMI1640培养基中各成分 含量为： 牛血清白蛋白 80mg/m I 白介素4 50ng/iiil GM-CSF 45ng/ml 平细胞生长因子SCF 35ng/ml; 所述组分2的RPMI1640培养基中各成分含量为： 牛血清白蛋白70m g/m I 白介素14 90ng/ml 白介素2 500 U /rnl 白介素4 400 U /rnl GM-CSF 30ng/ml; 所述组分3的RPMI 1640培养基中各成分含量为： 牛血清白蛋白90m g/ml CD40L 45iig/ml GM-CSF 60ng/ml 白个素4 600 u/m!。6. -种DC的培养方法，其特征在于，包括W下步骤： 1) 第0天将单个核细胞用权利要求1所述培养基的组分1重悬，37°C，5%C02培养48小时； 2) 第2天向培养基中添加白介素14和白介素2继续培养； 3) 第4天补加权利要求1所述培养基的组分2,之后每3天补加权利要求1所述培养基的 组分2,到第10天； 4) 第10天向培养基中加入CD40L，之后每3天补加权利要求1所述培养基的组分3,到第 16天； 5) 第17天加入TN化培养24小时； 6) 第18天加入K562细胞共培养48小时，收获DC细胞。7. 根据权利要求6所述的方法，其特征在于，步骤1)所述重悬后的细胞密度为5 X 105个/ ml-1 X 106个/ml;步骤巧h加权利要求1所述培养基的组分2后的细胞密度为5 X 105个/πα-1 X 106个/ml;步骤4补加权利要求1所述培养基的组分3后的细胞密度为5 X 105个/ml-1 X 1〇6 个/ml。8. 根据权利要求6所述的方法，其特征在于，步骤2)添加白介素14至终浓度35ng/ml，添 加白介素2至终浓度50ng/ml。9. 根据权利要求6所述的方法，其特征在于，步骤4)添加 CD40L至终浓度15ng/ml。10. 根据权利要求6所述的方法，其特征在于，步骤5)添加 TN化至终浓度lOng/ml。
【文档编号】C12N5/0784GK106085960SQ201610615525
【公开日】2016年11月9日
【申请日】2016年7月28日 公开号201610615525.5, CN 106085960 A, CN 106085960A, CN 201610615525, CN-A-106085960, CN106085960 A, CN106085960A, CN201610615525, CN201610615525.5
【发明人】陈海佳, 王一飞, 葛啸虎, 万桦, 张维敏
【申请人】广州赛莱拉干细胞科技股份有限公司