一种体外培养破骨细胞的培养基的制作方法
【技术领域】
[0001]本发明属于生物技术领域的一种动物细胞体外培养的培养基，具体涉及的是一种体外培养破骨细胞的培养基。
【背景技术】
[0002]由于许多因素的影响，骨组织结构、功能及骨代谢等方面的研究直接通过人体来进行受到限制，因此体外培养破骨细胞，作为常用的体外实验模型，成为研究骨生理、病理及修复组织工程的基础。
[0003]破骨细胞来自于CD34+的骨髓造血干细胞，为终末细胞，不能进行传代培养。破骨细胞培养方法主要有:机械分离法、酶消化法、骨髓单核细胞诱导培养法和脾脏造血干细胞培养法。
[0004]这些方法采用的培养基多为基础培养基加一定比例的胎牛血清制成的培养液。一般情况下，从骨组织中游离的破骨细胞接种于培养瓶后，需要2-3周之后才能达到融合，而且融合成多核细胞的比率较小，而且胎牛血清的体积含量比较高，一般会达到20%以上，胎牛血清的消耗比较大。因此，希望能够提供一种破骨细胞的培养基，能够促进破骨细胞的贴壁生长，且能减少血清的使用量。
[0005]巨卩蜜细胞移动抑制因子(macrophagemigrat1n inhibitory factor，MIF)是集细胞因子、生长因子、激素和酶特性于一身的多效能蛋白分子。巨噬细胞移动抑制因子通过上调覆盖于骨质表面的类骨质层上的多种基质金属蛋白酶，使得钙化骨基质暴露，促进附着于骨组织表面的破骨细胞分离，刺激活化破骨细胞。但目前没将巨噬细胞移动抑制因子用于分离和体外培养破骨细胞。
【发明内容】
[0006]发明目的
[0007]本发明提供一种体外培养破骨细胞的培养基，能够促进破骨细胞从骨组织表面分离，加快破骨细胞体外贴壁融合生长，且能减少血清的使用量。
[0008]技术方案
[0009]—种体外培养破骨细胞的培养基:包括基础培养基15.0-17.0g/L，巨噬细胞移动抑制因子100-300ng/L，聚乙二醇20-50g，血清8-10%体积分数，适量碳酸氢钠调pH值为7.2-7.4，加水定容至比;所述的基础培养基为1^]?，01^]\1，1^]\0-1640，？12，]\1199，01^]\0712;所述的聚乙二醇分子量为200-800;所述的血清为胎牛血清、小牛血清、人血清、马血清和羊血清;本发明的培养基用于分离和体外培养破骨细胞。
[0010]有益效果
[0011]本发明特异性用于破骨细胞的体外培养。试验结果表明，本发明能用于机械分离法、酶消化法、骨髓单核细胞诱导培养法和脾脏造血干细胞培养法制备的破骨细胞，能够促进破骨细胞从骨组织中分离，加快破骨细胞体外贴壁融合生长，且能减少血清的使用量。
【具体实施方式】
[0012]实施例1
[0013]高糖DMEM培养基15.0g(Gibco)，巨噬细胞移动抑制因子100ng/L，20g聚乙二醇200，小牛血清1 %体积分数，适量碳酸氢钠调pH值为7.2，加水定容至1L。
[0014]实施例2
[0015]M199培养基17.(^(6丨1^0)，巨噬细胞移动抑制因子200即/1，2(^聚乙二醇800，胎牛血清8 %体积分数，适量碳酸氢钠调pH值为7.4，加水定容至1L。
[0016]实施例3
[00?7]鼠破骨细胞分离、培养:取2周龄昆明系小鼠，拉颈处死，75%酒精浸泡1miη；分离四肢，置于冷磷酸缓冲液中；用剪刀和镊子分离出四肢骨，剔除骨周的组织和骨端;将分离出的骨骼置于冷的实施例1培养基中，用剪刀分成两半;轻轻刮取骨髓，直至骨髓腔内表面变成白色；用实施例1培养基吹打骨碎片，使更多的细胞脱落;静置，待骨碎片沉淀后，收集细胞混合液接种于培养板中，再置细胞培养箱内培养30min(5 % CO2，37°C)；收集未贴壁细胞即骨髓单核细胞，重新接种到培养基上，用实施例1培养基培养；以后隔2天换液50%，培养约7天后达到融合。经HE、Giemsa染色光镜形态观察鉴定:得到的细胞含多个核，为破骨细胞。
[0018]实施例4
[0019]兔破骨细胞分离、培养:出生24小时的新生兔用断头术将其处死，分离出四肢骨，去除表面附着的软组织和软骨骺，骨干在含2ml HEPES缓冲液的的培养皿中纵行剖开，吸管吸实施例2培养基反复多次吸吹骨髓腔和骨干内表面，使附着在骨片上的细胞游离出来。最后，让碎骨片沉降10秒后，收集细胞混合液接种于培养板中置⑶2孵育箱中，37°C培养30min后，在实施例2培养基中轻振荡，洗未贴壁的细胞，重新接种到培养基上，用实施例2培养基培养；以后隔2天换液50%，培养约7天后达到融合。经HE、Giemsa染色光镜形态观察鉴定:得到的细胞含多个核，为破骨细胞。
[0020]实施例5
[0021]破骨细胞的抗酒石酸酸性磷酸酶(TRAP)染色鉴定:将实施例3和实施例4得到的细胞爬片置于37°C烘箱中5min，烘干，再于体积分数为2.5%的戊二醛固定液中41固定lOmin，同时温育孵育液(六偶氮副品红Iml，0.2mol/L醋酸缓冲液18ml，萘酚AS-BI磷酸盐20mg，50mmol酒石酸钾钠，pH5.0)至37°C。取出细胞爬片，双蒸水洗3次，苏木素(SIGMA公司)复染2min，蒸馏水冲洗至核成蓝色，晾干，二甲苯透明，DPX封固，光镜观察。结果显示:实施例3和实施例4得到的细胞抗酒石酸酸性磷酸酶呈强阳性，鉴定为破骨细胞。
【主权项】
1.一种体外培养破骨细胞的培养基:其特征在于:包括基础培养基15.0-17.0g/L，巨噬细胞移动抑制因子100-300ng/L，聚乙二醇20-50g，血清8-10%体积分数，适量碳酸氢钠调pH值为7.2-7.4，加水定容至I L。2.根据权利要求1所述的体外培养基，其特征在于:所述的基础培养基为MEM，DMEM，RPM1-1640，F12，M199，DMEM/F12。3.根据权利要求1所述的体外培养基，其特征在于:所述的聚乙二醇分子量为200-800。4.根据权利要求1所述的体外培养基，其特征在于:所述的血清为胎牛血清、小牛血清、人血清、马血清和羊血清。5.根据权利要求1-4任一所述的体外培养基，其特征在于:用于分离和体外培养破骨细胞。
【专利摘要】本发明公开了一种体外培养破骨细胞的培养基。其特征在于：包括基础培养基15.0-17.0g/L，巨噬细胞移动抑制因子100-300ng/L，聚乙二醇20-50g，血清8-10%体积分数，适量碳酸氢钠调pH值为7.2-7.4，加水定容至1L；所述的基础培养基为MEM，DMEM，RPMI-1640，F12，M199，DMEM/F12；所述的聚乙二醇分子量为200-800；所述的血清为胎牛血清、小牛血清、人血清、马血清和羊血清；本发明的培养基用于分离和体外培养破骨细胞。本发明的有益效果在于能够促进破骨细胞从骨组织表面分离，加快破骨细胞体外贴壁融合生长，且能减少血清的使用量。
【IPC分类】C12N5/077
【公开号】CN105505864
【申请号】CN201610065979
【发明人】罗瑞雪
【申请人】苏州普罗达生物科技有限公司
【公开日】2016年4月20日
【申请日】2016年1月30日