专利名称：抑制破骨细胞形成的融合蛋白、其制备方法及药物组合物的制作方法
技术领域：
本发明属于生物医药领域，具体涉及融合蛋白制备的生物技术，更具体地涉及用
于治疗骨质疏松症和肿瘤引起的骨吸收的融合蛋白及其药物组合物。
背景技术：
骨形成和骨吸收是正常骨新陈代谢过程中密切相关的两个过程。骨质疏松症患 者因破骨细胞活性增加，骨吸收率超过骨形成率，导致骨质疾病，其中并无骨矿物质缺陷。 骨骼也是通常的肿瘤转移侵袭部位，多发性骨髓瘤、乳腺癌、前列腺癌和肺癌都常转移至骨 骼。肿瘤细胞和成骨细胞相互作用，从而剌激骨髓内前体细胞分化成破骨细胞，因此，骨骼 内肿瘤转移部位常见破骨细胞数量增加，破骨细胞性的骨吸收也相应地增加。总体上，破骨 细胞(Osteoclast)的过多形成是造成骨质疏松和肿瘤引起的骨吸收(Bone resorption) 的主要原因。人体破骨细胞来自于分化的单核细胞(Monocyte)/巨噬细胞(Macrophage)。 骨质疏松容易导致骨折，根据中国2000年第五次人口普查骨质疏松症的结果及预测，中国 60岁以上的老人在2050年将达到4. 1亿，占中国总人口的27. 4%。随着老年人口的迅速 增加，骨质疏松易患人群也迅速增加。美国有2，800万骨质疏松病人，其中150万人因为 骨质疏松而发生骨折(70万人脊椎骨折，25万人胯骨骨折)。世界卫生组织将2000年至 2010年列为"骨与关节疾病十年"。根据世界卫生组织资料，近年来全世界因为骨质疏松而 引起的骨折增加了 4倍，肿瘤转移致使破骨细胞活跃而引起的溶骨病变也不断增加。美国 有50万病人因肿瘤转移引起骨吸收而造成骨折，最常见的是多发性骨髓瘤、乳腺癌、前列 腺癌、肺癌等引起的骨破坏。不管是妇女停经后引起的绝经期骨质疏松，还是肿瘤转移引起 的骨吸收，原因都是人体内的破骨细胞过多而形成骨质疏松。为了解决骨质疏松的病理状 况，全世界生物医学界都在寻找一种有效的方法去抑制破骨细胞形成和其活性。美国辉瑞 (Pfizer Inc.)正在申求美国食品和药品管理局批准其用以治疗绝经后女性患者骨质疏松 症新药Fablyn的上市，Fablyn工作机理与荷尔蒙雌性激素类似，这类药物被称作选择性雌 激素受体调节剂。2005、2006年，美国食品和药品管理局两次拒绝辉瑞申求的理由都是担心 该药存在导致患者罹患子宫内膜癌的风险。辉瑞在2007年底再次递交了 Fablyn作为骨质 疏松症治疗药物的上市请求，并提交了全新的数据。美国Amgen生物医药公司正在开发骨 保护素(Osteoprotegerin，OPG)的蛋白药物来抑制核因子k B受体配体活化剂(Rec印tor Activator forNuclear Factor k B Ligand) (RANKL)的活性，以期控制破骨细胞的过量形 成。同时，美国洛杉矶的骨髓瘤/骨肿瘤研究所也正在研究发展一种减少破骨细胞形成的 生物制齐U _月中瘤坏死因子受体关联因子6 (tumor necrosis factorrec印tor—associated factor (TRAF) 6)抑制性多肽(TRAF6dn)。 RANKL属于TNF家族。它的晶体结构显示其分子结构中含有一独特部分，可激活破 骨前体细胞表面的受体RANK。 RANKL是破骨细胞分化所必需的。当肿瘤细胞转移至骨骼部 位后，RANKL是破骨细胞形成的主要生理调节子，可由肿瘤细胞直接分泌，无需基质细胞支 持直接剌激破骨细胞形成。RANK受体表达于单核巨噬细胞，软骨细胞和破骨细胞前体，它是调节破骨细胞分化的主要受体。 自从发现RANKL/RANK信号通路，调节破骨细胞形成和激活的分子机理研究取得 了快速进展。RANKL与RANK受体结合，使ITAM酪氨酸磷酸化，从而激活DAP12或FcR y ，以 及共受体TREM2和OSCAR介导共激活通路。酪氨酸激酶ZAP70或Syk的磷酸化导致PLC y 和钙离子移动，进一步激活NFATcl促使破骨细胞分化。 破骨细胞是由多个单核前体细胞通过胞浆融合而形成的骨吸收细胞。破骨细胞的 形成需要RANKL和M-CSF共剌激以及ITAM信号。但是，人单核巨噬细胞也表达一个IgG的 抑制受体Fc y RIIb，该受体胞浆末端含有ITIM结构，属于抑制性受体超级家族，通过上调 胞浆内去磷酸化酶SHP-1， SHP-1进一步下调Syc-BCR阻断PI3K信号通路，实现下调节ITAM 和抑制骨吸收。 交联Fc y RIIb与含有ITAM的受体可抑制ITAM激活钙离子移动和细胞增生。基于 信号传导通路中ITAM和ITIM平衡，本发明者设计一个RANKL-Fc y融合蛋白用于交联RANK 和Fc YRIIb受体，诱导ITIM信号，从而抑制破骨细胞形成和骨吸收。 RANKL作为一种细胞因子结合到单核/巨噬细胞上的RANKL受体(RANK)从而激 活基于免疫受体酪氨酸的激活基序(Imm皿orec印tor tyrosine-based activationmotif， ITAM)的信号传导系统。该系统经过一系列活性蛋白的磷酸化，使单核/巨噬细胞分 化成破骨细胞。然而，ITAM的信息传导系统受到了基于免疫受体酪氨酸的抑制基序 (I匪norec印tor tyrosine-based inhibitory motif ， ITM)的抑制。ITM作为抑制性 信息传导系统通过含SH2域的肌醇多磷酸5'磷酸酶(SHIP)1(SH2 domain-containing inositol polyphosphate 5'phosphatase)和含SH2域的蛋白酪氨酸磷酸酶(SHP1/2) (SH2 domain-containing proteintyrosine phosphatase)的激活来平衡ITAM的信息传导系统。 本发明者通过基因克隆技术来合成一种RANKL-Fc y融合蛋白，称之为RIG，该融合蛋白RIG 通过激活细胞内ITIM的信息传导系统来抑制ITAM的信息传导，达到减少破骨细胞形成的 目的。 因此，本发明的第一个目的是提供一种抑制破骨细胞形成的融合蛋白RIG的编码 基因。 本发明的第二个目的是提供抑制破骨细胞形成的融合蛋白RIG。
本发明的第三个目的是提供构建所述编码基因用的合成引物。
本发明的第四个目的是提供制备融合蛋白RIG用的表达质粒。
本发明的第五个目的是提供含上述表达质粒基因工程重组细胞。
本发明的第六个目的是提供融合蛋白RIG的制备方法。
本发明的第七个目的是提供包含融合蛋白RIG的药物组合物。
发明内容
本发明提供的抑制破骨细胞形成的融合蛋白RIG的编码基因具有由1656bp组成 的如下核苷酸序列(SEQ ID N0:1): 1 ATGCGCCGCG CCAGCAGAGA CTACACCAAG TACCTGCGTG GCTCGGAGGA GATGGGCGGC
61 GGCCCCGGAG CCCCGCACGA GGGCCCCCTG CACGCCCCGC CGCCGCCTGC GCCGCACCAG
121 CCCCCCGCCG CCTCCCGCTC CATGTTCGTG GCCCTCCTGG GGCTGGGGCT GGGCCAGGTT
本发明所提供的融合蛋白具有如下氨基酸序列(SEQ ID NO :2):
1 MRRASRDYTK YLRGSEEMGG GPGAPHEGPL HAPPPPAPHQ PPAASRSMFV ALLGLGLGQV
61 VCSVALFFYF RAQMDPNRIS EDGTHCIYRI LRLHENADFQ DTTLESQDTK LIPDSCRRIK
121 QAFQGAVQKE LQHIVGSQHI RAEKAMVDGS WLDLAKRSKL EAQPFAHLTI NATDIPSGSH
181 KVSLSSWYHD RGWAKISNMT FSNGKLIVNQ DGFYYLYANI CFRHHETSGD LATEYLQLMV
241 YVTKTSIKIP SSHTLMKGGS TKYWSGNSEF HFYS頂VGGF FKLRSGEEIS IEVSNPSLLD
RIG的氨基酸残基序列是由551个氨基酸残基组成的蛋白质。RIG的结构如
图1所示，它由三部分组成A区(RANKL)(自氨基端第1-317位氨基酸残基)，B区(Fc-y )(自氨基端第335-551位氨基酸残基)和C区(hinge)(自氨基端第318-334位氨基酸残基)。
181 GTCTGCAGCG TCGCCCTGTT CTTCTATTTC AGAGCGCAGA TGGATCCTAA TAGAATATCA241 GAAGATGGCA CTCACTGCAT TTATAGAATT TTGAGACTCC ATGAAAATGC AGATTTTCAA301 GACACAACTC TGGAGAGTCA AGATACAAAA TTAATACCTG ATTCATGTAG GAGAATTAAA361 CAGGCCTTTC AAGGAGCTGT GCAAAAGGAA TTACAACATA TCGTTGGATC ACAGCACATC421 AGAGCAGAGA AAGCGATGGT GGATGGCTCA TGGTTAGATC TGGCCAAGAG GAGCAAGCTT481 GAAGCTCAGC CTTTTGCTCA TCTCACTATT AATGCCACCG ACATCCCATC TGGTTCCCAT541 AAAGTGAGTC TGTCCTCTTG GTACCATGAT CGGGGTTGGG CCAAGATCTC CAACATGACT601 TTTAGCAATG GAAAACTAAT AGTTAATCAG GATGGCTTTT ATTACCTGTA TGCCAACATT661 TGCTTTCGAC ATCATGAAAC TTCAGGAGAC CTAGCTACAG AGTATCTTCA ACTAATGGTG721 TACGTCACTA MACCAGCAT CAAAATCCCA AGTTCTCATA CCCTGATGAA AGGAGGAAGCGGTCAGGGAA TTCTGAATTCGGTCTGGAGA GGAAATCAGCATGCAACATA CTTTGGGGCTTGACAAMCT CACACATGCCTCTTCCTCTT CCCCCCAAAACATGCGTGGT GGTGGACGTGACGGCGTGGA GGTGCATAATACCGTGTGGT CAGCGTCCTCAGTGCAAGGT CTCCAACAAAMGGGCAGCC CCGAGMCCAAGAACCAGGT CAGCCTGACCAGTGGGAGAG CAATGGGCAGCCGACGGCTC CTTCTTCCTCGGAACGTCTT CTCATGCTCC
78184190196110211081114112011261132113811441150115611621
ACCAAGTATTTTTAAGTTACCCGGATCAGGCCCAATATTGGGACCGTCAGCCTGAGGTCATGGTACGTGGAACAGCACGTAAGGAGTACATCCAAAGCCAGAGCTGACCAATCGCCGTGGGTGCTGGACTTGGCAGCAGGACGCAGAAGA
CATTTTTATTATCGAGGTCTTTTAMGTTCCACCGCTGCCCCCAAGGACAAGCCACGAAGGCCAAGACAAACCGTCCTGCGCCCTCCCAGCAGGTGTACATGCCTGGTCACCGGAGAACATACAGCAAGCGTGATGCATG
CCATAMCGTCCAACCCCTCGAGATATAGACAGCACCTGACCCTCATGATACCCTGAGGTAGCCGCGGGAACCAGGACTGCCCCCATCGACCCTGCCCCCAAGGCTTCTAACTACAAGACTCACCGTGGAAGGCTCTGCA
TGGTGGATTTCTTACTGGATTGGATCCGAGACTCCTGGGGCTCCCGGACCCAAGTTCAACGGAGCAGTACGCTGAATGGCGAAMCCATCATCCCGGGATTCCCAGCGACCACGCCTCCCCAAGAGCAGGCAACCACTAC
GCCTCTCCCT GTCTCCGGGT AAATAA
1MRRASRDYTK
61VCSVALFFYF
121QAFQGAVQKE
181KVSLSSWYHD
241YVTKTSIKIP
301PDQDATYFGA
361PEVTCVV丽
421KEYKCKVSNK
481IAVEWESNGQ
541TQKSLSLSPG其中，A区来源于人的RANKL，具有与RANK结合的部位；B区来源于人的IgG免疫球蛋白，具有与IgG受体Fc,RII结合的部位；C区来源于人的免疫球蛋白的绞链区序列，为绞连结构。
本发明所提供的融合蛋白RIG的制备方法包括如下步骤(l)构建融合蛋白RIG的编码基因(SEQ ID N0:1) ;(2)构建质粒pSecTagRIG ;(3)将质粒pSecTagRIG转化到SP2/0细胞中；(4)培养阳性克隆并分离纯化RIG蛋白。 本发明首先合成了如下特异性引物(SEQ ID N0:3-SEQ ID NO :6):RANKL (Sfi I) :5' -GGCCCCGAGGGCCATGCGCCGCGCCAGCAGAGAC-3';RANKL2(BamH I) :5， -GGATCCGATCTATATCTCGAACTTTAAAAGC_3，；P3(FcyBamH I) :5' -GGATCCGAGCCCAAATCTTGTGAC-3';P4(Fc y Not I) :5' -GCGGCCGCTCATTTACCCGGAGACAGGGAGAG—3'。 选用上述引物对RANKL和Fcy基因进行RT-PCR扩增，将PCR产物分别克隆至
pCR4-T0P0质粒(INVITROGEN， CA)，得到pRANKL和pFc- y ，经序列测定后将RANKL和Fc y
连接到表达载体pSecTag得到质粒pSecTagRIG,将此质粒转染至小鼠骨髓瘤SP2/0细胞，筛
选得到高表达RIG(其氨基酸序列如序列表中的序列2)的克隆，培养阳性克隆并分离纯化
RIG蛋白。 本发明还提供一种抑制破骨细胞形成的药物组合物，包含治疗有效量的融合蛋白RIG，及药学上可接受的载体。 所述载体包括药学领域常规的稀释剂、赋形剂、填充剂、粘合剂、湿润剂、崩解剂、吸收促进剂、表面活性剂、吸附载体、润滑剂等，必要时还可以加入香味剂、甜味剂等。
本发明的药物组合物可以制成用于静脉注射等的注射剂，用于皮下注射、表皮外敷等的经皮吸收剂，用于喷鼻、喉、口腔、表皮、粘膜等的喷雾剂，用于滴鼻、眼、耳等的滴剂，用于肛肠等的栓剂，片剂，粉剂，粒剂，胶囊，口服液，膏剂，霜剂等多种形式。上述各种剂型的药物均可以按照药学领域的常规方法制备。 上述药物的用量一般为0. l-5mg/kg体重/周，疗程一般为10至30天。 附图的简要说明 图1为RIG的结构示意图。 图2为RIG的克隆和表达过程示意图。 图3为Fc y 1禾P RANKL DNA PCR扩增产物电泳图谱。 图4为RIG与RANKL的受体(RANK)结合能力鉴定结果。 图5为RIG与Fc y RII受体结合能力鉴定结果。 图6为RIG抑制破骨细胞形成实验结果。 图7为RIG抑制破骨细胞生物学活性实验结果。
实施例 下面用实施例对本发明作进一步阐述。应当理解，这些实施例仅用于说明本发明而非对本发明有任何限制。本领域技术人员在本说明书的启示下对本发明实施中所作的任
何变动都将落在权利要求书的范围内。
实施例1融合蛋白RIG的表达 融合蛋白RIG的表达过程如图l所示，具体包括以下步骤按照常规方法进行以下操作从人外周血中分离、纯化T淋巴细胞和B淋巴细胞，提取mRNA。 用特异性引物进行RANKL(T淋巴细胞)和Fc y (B淋巴细胞)基因的RT-PCR扩增，引物选自 SEQ ID NO :35， -GGCCCCGAGGGCCATGCGCCGCGCCAGCAGAGAC-3';
SEQ ID NO :45， -GGATCCGATCTATATCTCGAACTTTAAAAGC-3';
SEQ ID NO :55， -GGATCCGAGCCCAAATCTTGTGAC-3';
SEQ ID NO :65， -GCGGCCGCTCATTTACCCGGAGACAGGGAGAG—3，。 将RANKL和Fc Y基因的PCR产物进行1 %的琼脂糖凝胶电泳，电泳结果如图3所示，RANKL PCR扩增产物为970bp ;FcYDNA PCR扩增产物为714bp。将PCR产物分别克隆至CR4-T0P0质粒(INVITROGEN， CA)，经连接后，得到pRANKL和pFc- y ，进行核苷酸序列分析；在得到了 100%正确的核苷酸序列后，将RANKL和Fcy基因分别利用Sf i I-BamH I和BamHI-Not I限制性内切酶(NEW ENGLAND BIOLABS)进行酶切，并用相同的限制性内切酶SfiI-Not I酶切pSecTag(INVITROGEN，CA)表达载体，然后进行连接，得到质粒pSecTagRIG，对质粒pSecTag RIG进行核苷酸序列分析，表明插入的(三个)外源基因序列如序列表中的序列l所示。然后将此质粒利用常规电穿孔法转染至小鼠骨髓瘤SP2/0细胞，经ZE0CIN抗药性筛选及ELISA鉴定(用鼠抗人RANKL抗体包备ELISA平板，加入标本上清，然后加入羊抗人IgG酶标抗体)，得到高表达RIG(其氨基酸序列如序列表中的序列2)的克隆。
利用RPMI1640 (INVITROGEN， CA)培养基，在37°C ， 5% C02培养上述阳性克隆(含有质粒pSecTag RIG的小鼠骨髓瘤SP2/0细胞)15天，2000rpm离心后，收集上清，再用蛋白A亲和层析柱(PHARMACIA)分离纯化RIG蛋白。
实施例2RIG与RANKL的受体(RANK)结合实验 将1 X 106单核细胞分别培养于MCSF和RANKL培养基，72小时后与5微克实施例1中纯化的RIG蛋白在4。C反应1小时，加入5微升FITC标记的抗人RANKL抗体(CALTAG，CA)，用流式细胞仪检测细胞。结果如图4所示，表明RIG蛋白可与RANK结合，THP1细胞呈FITC阳性。图4中，SSC-H为细胞内颗粒数，FSC-H为细胞大小，FL2-H为PE，FL1-H为FITC。
实施例3RIG与Fc y RII受体结合实验 将IX 106HMC_1细胞与5微克实施例1中纯化的RIG蛋白在4"反应1小时，加入5微升FITC标记的抗人IgG FITC标记抗体(CALTAG， CA)，用流式细胞仪检测细胞。结果如图5所示，表明RIG蛋白可与FcyRII受体结合，HMC-1细胞呈FITC阳性。图5中，SSC-H为细胞内颗粒数，FSC-H为细胞大小，FL2-H为PE， FL1-H为FITC。
实施例4RIG抑制破骨细胞形成实验 利用抗CD14微球(Miltenyi Biotec， Auburn, CA)从多发性骨髓瘤病人的骨髓或PBMC中分离出CD14+细胞。用含有50ng/ml RANKL和20ng/ml M-CSF培养基细胞。三天后，将RIG融合蛋白和对照试剂加入到培养基中，14天培养后，收获细胞并固定，进行TRAP染色分析(TRAP-staining kit ;Sigma，St Louis，MO，USA)鉴定多核破骨细胞的数量，根据融合指数评价破骨细胞的频率。 本实施例证明RIG可阻断RANKL介导破骨细胞形成，并存在剂量依赖性。
实施例5RIG抑制破骨细胞的生物学活性 通过破骨细胞的骨吸收分析，我们进一步考察RIG对破骨细胞的生物学活性的抑制作用。简要地，用无菌水和超声波清洗直径为6mm、厚度为150um的猛犸象长牙牙质薄片，然后，在70%的乙醇中消毒，紫外照射过夜。从正常人的PBMC或骨髓分离得到CD14+细胞，将分别培养于MCSF和RANKL培养基的CD14+单核细胞(5X104)在上述牙质薄片上利用RIG融合蛋白剌激21天。为了考察骨吸收面积，首先使用蒸馏水洗去薄片上的分化细胞，然后对薄片脱水和风干。用Toluidine蓝染色，利用光学显微镜鉴别吸收坑和图象分析测量每个薄片上的腔隙性吸收面积。
工业实用性 破骨细胞是由多个前体单核细胞融合后得到的骨吸收多核细胞，对骨的再造具有重要意义。RANK是破骨细胞形成、存活和发挥生理功能的主要调节因子。RANKL的产生导致RANK的激活和单核细胞分化形成破骨细胞。在RANK诱导破骨细胞形成中，需要激活ITAM信号。在人的单核细胞和巨噬细胞表面表达有抑制性IgG受体FcrRII，该受体的胞内部分含有ITIM基序，ITIM可以通过SHIP来平衡ITAM的活化。本发明的RIG融合蛋白是一个新的RANK抑制剂，通过ITIM信号的激活来抑制破骨细胞的形成和骨损伤的发生发展。本发明的融合蛋白RIG组成成份全部来源于人源(human)性免疫球蛋白和RANKL，因此，作为一种药物进入人体，没有任何异体蛋白的免疫源性。该融合蛋白的C区(hinge)灵活，可转动，可将RANKL和FcY交联在一起，从而诱发细胞内的抑制信号，抑制RANK-ITAM反应的发生。本发明的RIG融合蛋白通过启动细胞内抑制信号传导系统ITIM，从而强有力地抑制了
破骨细胞形成，将在骨质疏松和肿瘤引起的骨吸收的治疗中发挥重要作用。 SEQUENCE LISTING 〈110〉上海富莼科芯生物技术有限公司 〈120〉抑制破骨细胞形成的融合蛋白、其制备方法及药物组合物 〈130>CN081119 〈160>6 〈170>PatentIn version 3. 3 〈210>1 〈211>1656 〈212>DNA 〈213>人工合成 〈400>1atgcgccgcgCC3gC3g3g3ctecaccaagtecctgcgtggctcgg郷agatgggcggc60ggccccggagccccgcacgagggccccctgcacgccccgccgccgcctgcgccgcaccag120ccccccgccgcctcccgctccatgttcgtggccctcctggggctggggctgggccaggtt180gtctgcagcgtcgccctgttcttctetttc3g3gCgC3g3tggatccteateg皿tetca240g^gatggcactcactgcatttetegaattttgagactccagattttcaa300gacacaactctgg卿gtratteatecctgattcatgteg360caggcctttc皿ggagctgtgc皿皿gg皿tcgttggatcacagcacatc420皿gcgatggtggatggctratggttegatctggcc皿gaggagc皿gctt■g皿gctcagccttttgctcatctcactettaatgccaccgacatcccatctggttcccat540tgtcctcttggteccatgatcggggttgggccaagatctccaacatgact600
tttagcaatg gaaaactaat agttaatcag gatggctttt attacctgta tgccaacatt 660
tgctttcgac atcatgaaac ttcaggagac ctagctacag agtatcttca actaatggtg 720
tacgtcacta aaaccagcat caaaatccca agttctcata ccctgatgaa aggaggaagc 780
ccggatcagg atgcaacata ctttggggct tttaaagttc gagatataga tggatccgag 960
cccaatattg tgacaaaact cacacatgcc caccgctgcc cagcacctga actcctgggg 1020
ggaccgtcag tcttcctctt CCCCCC3333 cccaaggaca ccctcatgat ctcccggacc 1080
cctgaggtca catgcgtggt ggtggacgtg agccacgaag accctgaggt caagttcaac l 140
tggtacgtgg acggcgtgga ggtgcataat gccaagacaa agccgcggga ggagcagtac 1 200
aacagcacgt accgtgtggt cagcgtcctc accgtcctgc accaggactg gctgaatggc 1 260
aaggagtaca agtgcaaggt ctccaacaaa gccctcccag cccccatcga gaaaaccatc 1 320
tccaaagcca aagggcagcc ccgagaacca caggtgtaca ccctgccccc atcccgggat 1 380
gtgctggact ccgacggctc cttcttcctc tacagcaagc tcaccgtgga caagagcagg 1 560
tggcagcagg ggaacgtctt ctcatgctcc gtgatgcatg aggctctgca C33CC3Ct3C 1620
acgcagaaga gcctctccct gtctccgggt aaataa1656
<210>2
<211>55l
<212>PRT
<213>人工合成
<400>2
Glu Met gly gly gly Pro gly Ala Pro HiS Glu gly Pro Leu HiS Ala
202530
Pro Pro Pro Pro Ala Pro HiS Gln Pro Pro Ala Ala Set Arg Set Met
354045
Phe Val Ala Leu Leu gly Leu gly Leu gly Gin Val Val Cys Set Val
505560
Ala Leu Phe Phe／yr Phe Arg Ala Gin Met Asp Pro Asn Arg Ile Set
65707580
Ala Asp Phe Gln Asp／hr／hr Leu Glu Set Gln Asp／hr Lys Leu Ile
100105110
Pro Asp Set Cys Arg Arg Ile hys Gln Ala Phe Gln Gly Ala Val Gln
1151201250156]LysGluLeuGinHislieValGlySerGinHislieArgAlaGluLys
0157]130135140
0158]AlaMetValAspGlySerTrpLeuAspLeuAlaLysArgSerLysLeu
0159]145150155160
0160]GluAlaGinProPheAlaHisLeuThrlieAsnAlaThrAspliePro
0161]165170175
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0163]180185190
0164]TrpAlaLyslieSerAsnMetThrPheSerAsnGlyLysLeulieVal
0165]195200205
0166]AsnGinAspGlyPheTyrTyrLeuTyrAlaAsnlieCysPheArgHis
0167]210215220
0168]HisGluThrSerGlyAspLeuAlaThrGluTyrLeuGinLeuMetVal
0169]225230235240
0170]TyrValThrLysThrSerlieLyslieProSerSerHisThrLeuMet
0171]245250255
0172]LysGlyGlySerThrLysTyrTrpSerGlyAsnSerGluPheHisPhe
0173]260265270
0174]TyrSerlieAsnValGlyGlyPhePheLysLeuArgSerGlyGluGlu
0175]275280285
0176]lieSerlieGluValSerAsnProSerLeuLeuAspProAspGinAsp
0177]290295300
0178]AlaThrTyrPheGlyAlaPheLysValArgAsplieAspGlySerGlu
0179]305310315320
0180]ProLysSerCysAspLysThrHisThrCysProProCysProAlaPro
0181]325330335
0182]GluLeuLeuGlyGlyProSerValPheLeuPheProProLysProLys
0183]340345350
0184]AspThrLeuMetlieSerAlaThrProGluValThrCysValValVal
0185]355360365
0186]AspValSerHisGluAspProGluValLysPheMetTrpTyrValAsp
0187]370375380
0188]GlyValGluValHisAsnAlaLysThrLysProAlaGluGluGinTyr
0189]385390395400
0190]AsnSerThrTyrAlaValValSerValLeuThrValLeuHisGinAsp
0191]405410415
0192]TrpLeuAsnGlyLysGluTyrLysCysLysValSerAsnLysAlaLeu
0193]420425430
0194]ProAlaProlieGluLysThrlieSerLysAlaLysGlyGinProAla435 440 445
Glu Pro Gin Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Tyr
450 455 460
Asn Gin Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp465 470 475 ■
lie Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gin Pro Glu Asn Asn Tyr Lys
485 490 495
Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser
500 505 510
Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gin Gin Gly Asn Val Phe Ser
515 520 525
Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gin Lys Ser
530 535 540
Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys545 550〈210>3〈211>34〈212>DNA〈213〉人工合成〈400>3
ggccccgagg gccatgcgcc gcgccagcag agac
〈210>4
〈211>31
〈212>DNA
〈213〉人工合成
〈400>4
ggatccgatc tatatctcga actttaa肌g c
〈210>5
〈211>24
〈212>DNA
〈213〉人工合成
〈400>5
ggatccg3gc ccaaatcttg tgac
〈210>6
〈211>32
〈212>DNA
〈213〉人工合成
〈400>6
gcggccgctc atttacccgg agacagggag ag
34
31
24
3权利要求
一种抑制破骨细胞形成的融合蛋白RIG的编码基因，其核苷酸序列是序列表中SEQ ID NO1所示序列。
2. —种抑制破骨细胞形成的融合蛋白RIG，其氨基酸序列是序列表中SEQIDNO :2所示 序列。
3. 合成引物，其核苷酸序列选自序列表中SEQ ID N0:3-SEQ ID N0:6所示序列。
4. 一种质粒pSecTagRIG，包含权利要求1所述基因。
5. —种基因工程重组细胞，包含权利要求4所述的质粒。质粒或整合于细胞的染色体 中，或游离于染色体外。
6. 权利要求2所述融合蛋白的制备方法，包括以下步骤(1) 克隆融合蛋白RIG的编码基因(SEQ ID NO :1);(2) 构建质粒pSecTagRIG ;(3) 将质粒pSecTagRIG转化到SP2/0细胞中；(4) 培养阳性克隆并分离纯化RIG蛋白。
7. —种抑制破骨细胞形成的药物组合物，包含治疗有效量的权利要求2所述融合蛋白 RIG和药学上可接受的载体。
全文摘要
本发明提供SEQ ID NO1所示核苷酸序列的编码基因、所述基因编码的抑制破骨细胞形成的融合蛋白RIG(SEQ ID NO2)及其制备方法，并提供所述方法中涉及的合成引物、质粒和宿主细胞，及包含所述融合蛋白RIG的药物组合物。本发明的融合蛋白RIG组成成份全部来源于人源性免疫球蛋白和RANKL，因此没有任何异体蛋白的免疫源性。该融合蛋白的C区可灵活转动，可将RANKL和Fcγ1交联在一起，诱发细胞内的抑制信号，抑制破骨细胞的形成。本发明提供的融合蛋白RIG能够在骨质疏松和肿瘤引起的骨吸收疾病的治疗中发挥重要作用。
文档编号C07K19/00GK101712964SQ20081020086
公开日2010年5月26日 申请日期2008年10月8日 优先权日2008年10月8日
发明者包骏, 祝道成, 陈海明 申请人:上海富莼科芯生物技术股份有限公司