抑制骨质疏松的治疗剂的制作方法
【专利说明】抑制骨质疏松的治疗剂
[0001] 本发明提供用于抑制或治疗骨质疏松症的方法和组合物。
[0002] 骨质疏松症是导致骨结构退化的低骨量疾病。这种退化可以将骨衰弱至几乎无创 伤骨折这样的程度，导致生活质量差且预期寿命可能减少。在骨质疏松症中，骨矿物质密度 (BMD)下降，骨微结构恶化和骨中蛋白质的量和种类改变。
[0003] 主要由胶原蛋白和磷酸钙组成的骨组织在成骨细胞和破骨细胞介导的过程中发 生不断的破坏和再合成（即骨重建），成骨细胞产生新骨，而破骨细胞破坏骨。这些细胞的 活性由大量细胞因子和生长因子调节。在所有骨质疏松症病例中基本机制在于骨质吸收与 骨形成之间失衡。因为重整和再吸收骨的模式因患者与患者的不同而改变，所以认为几个 不同因素导致了这一问题。影响细胞生长的重要化学物质（例如雌激素、睾酮、甲状旁腺素 和维生素D)和血液因子牵涉该过程。任意这些因素水平的改变可以在骨质疏松症发生中 起作用。
[0004] 近来，已经确定，肠源性5-羟色胺（⑶S)在指导骨重建中起作用。约90%的人体 总5-羟色胺由肠中称作肠嗜铬细胞的专门内分泌细胞合成。一旦从肠嗜铬细胞中释放，则 GDS在血清中循环。肠源性5-羟色胺（GDS)是成骨细胞增殖和骨形成的强有力抑制剂，其 不影响骨质吸收。因此，改变GDS水平是改变骨重建中平衡的潜在方式，由此提供用于抑制 或治疗骨质疏松症的方式。
[0005] 总体而言，在50个人中的3位女性中有1位将因骨质疏松症而患有骨折（这一数 字增加至在60个人中的2位女性中有1位），而50个人中的5位男性中有1位将因骨质疏 松症而患有骨折（这一数字增加至在60个中的3位男性中有1位）。根据世界卫生组织 (World Health Organization) (WHO)的通告，骨质疏松症仅次于心血管疾病而成为全球健 康问题。由于骨质疏松症影响正在增长中的中老年人群，所以它将给卫生保健系统提供了 更大的负担。
[0006]目前用于骨质疏松症的治疗方法包括生活方式改变，例如膳食和锻炼，以及药物， 包括钙、维生素D、二膦酸盐和激素替代疗法。然而，现存的治疗方法与不良副作用相关。因 此，本领域中仍然需要用于抑制或治疗骨质疏松症的新药剂。
[0007] 本发明解决了这一需求，其解决了上述的一个或多个问题。
[0008] 发明概述
[0009] 本发明通过提供用于抑制或治疗受试者（例如患者）的骨质疏松症的融合蛋白解 决了上述的一个或多个问题，所述融合蛋白包含：
[0010] ⑴非细胞毒性蛋白酶，该蛋白酶能够裂解肠嗜铬细胞中的SNARE蛋白；
[0011] (ii)能够结合到肠嗜络细胞上的结合位点的祀向部分（TM)，所述结合位点能够 进行胞吞作用以并入肠嗜铬细胞内的内体，且其中所述肠嗜铬细胞表达所述SNARE蛋白； 和
[0012] (iii)能够使所述蛋白酶从内体内易位、通过内体膜并且进入肠嗜铬细胞胞液 (cytosol)的易位结构域；
[0013] 条件是所述多肽不是梭菌神经毒素（全毒素）分子。
[0014] 第一个方面还包括用于抑制或治疗骨质疏松症的相应方法，该方法包含对患者施 用治疗有效量的本发明的多肽。
[0015] 发明详述
[0016] 本发明的多肽不是天然存在的梭菌神经毒素分子（也称作梭菌全毒素）。梭菌全 毒素是已知对人最致命性的神经毒素之一，且照此作为治疗分子存在明显限制。此外，在抑 制骨质疏松症的环境中，梭菌全毒素与不期望的脱靶向位点相关，即靶向非-5-羟色胺分 泌细胞。
[0017] 在应用中，本发明的多肽结合肠嗜铬细胞。此后，易位成分实现蛋白酶成分转运 入肠嗜铬细胞的胞液。最终，一旦在内部，则蛋白酶通过裂解存在于肠嗜铬细胞胞液中的 SNARE蛋白抑制肠嗜铬细胞的细胞外融合过程。因此，通过使肠嗜铬细胞的细胞外融合器失 活，本发明的多肽抑制5-羟色胺从其中分泌。因此，本发明的多肽降低血清5-羟色胺水平 且由此能够抑制或治疗骨质疏松症。
[0018] 本发明的多肽类提供超过其它治疗剂的显著优点在于它们具有抑制5-羟色胺从 特异性靶细胞即肠嗜铬细胞中分泌的潜能。相反，其它提出的治疗剂寻求通过尝试非特异 性阻断5-羟色胺合成或使用介导5-羟色胺作用的5-羟色胺受体的拮抗剂来降低血清 5-羟色胺水平。然而，本发明提供特异性阻断5-羟色胺从其产生位点分泌的方式。
[0019] 本发明的主要靶细胞是肠嗜铬细胞。肠嗜铬细胞位于十二指肠中并且是血清 5-羟色胺来源。
[0020] 本发明的融合蛋白在与相应'游离' TM(即分离的TM本身）比较时一般显示对靶 细胞减少的结合亲和力（在至多100-倍的区间内）。然而，尽管存在这一观察结果，但是本 发明的融合蛋白令人意外地显示良好的效能。这可以归因于两个主要特征。首先，非细胞 毒性蛋白酶成分是催化的-因此，几种这样的分子的治疗作用在靶细胞内被快速放大。其 次，存在于靶细胞上的受体仅需要作为治疗剂进入的入口起作用，而不一定被刺激至实现 配体-受体介导的药理学响应所需的水平。因此，可以以低于用于其它类型治疗分子所使 用的剂量，其典型地以高微克至毫克（甚至高至几百毫克）用量施用，施用本发明的融合蛋 白。相反，本发明的融合蛋白可以以远低于其的剂量施用，典型地至少低于其10-倍，且更 典型地低于其100-倍。
[0021] 非细胞毒性蛋白酶
[0022] 本发明的TSI多肽类的生物活性成分是非细胞毒性蛋白酶。因此，一旦递送入靶 细胞的胞液，则非细胞毒性蛋白酶成分在需要的靶细胞内实现SNARE裂解。由于SNARE蛋 白是哺乳动物靶细胞内分泌过程的必需成分，所以其蛋白水解失活抑制/压制从所述靶细 胞中分泌。
[0023] 非细胞毒性蛋白酶是不杀伤细胞的离散类分子；反而它们通过抑制蛋白质合成以 外的细胞过程起作用。非细胞毒性蛋白酶由各种高级生物体产生（例如植物和动物）_这 样的高级生物体的实例是巴西全蝎。此外，非细胞毒性蛋白酶由各种微生物产生，特别是细 菌，例如梭菌属（Clostridium sp.)和奈瑟球菌属（Neisseria sp.)。
[0024] 梭菌神经毒素代表主要的一组非细胞毒性分子，且包含两个通过二硫键彼此连接 的多肽链。两个链中具有约IOOkDa分子量的称作重链（H-链）和具有约50kDa分子量的 称作轻链（L-链）。L-链具有蛋白酶功能且显示对囊泡和/或牵涉细胞外过程的质膜相关 (SNARE)蛋白（例如突触泡蛋白、突触融合蛋白、SNAP和/或VAMP)具有高度底物特异性。 这些底物是细胞分泌器的重要成分。
[0025] 最特别地来自淋病奈瑟氏球菌（N.gonorrhoeae)种类的奈瑟球菌属产生功能 类似的非细胞毒性的毒素分子。这样的非细胞毒性蛋白酶的实例是IgA蛋白酶（参 见TO99/58571)。类似的IgA蛋白酶由链球菌属（streptococci)、例如肺炎链球菌 (Streptococcus pneumoniae)产生。
[0026] 因此，在一个实施方案中，本发明的非细胞毒性蛋白酶可以是梭菌神经毒素蛋白 酶或IgA蛋白酶（参见，例如WO 99/032272)。非细胞毒性蛋白酶的另一个实例是蝎子 毒液蛋白酶，例如来自巴西全蝎巴西钳蝎（Tityus serrulatus)的毒液的那些或蛋白酶 antarease (参见，例如 WO 2011/022357) 〇
[0027] 靶向部分（TM)
[0028] 现在转到本发明的靶向部分（TM)成分。这种成分使本发明的多肽结合肠嗜铬细 胞。TM优选是肽。TM典型地包含最多50个氨基酸残基，例如最多40个氨基酸残基或最多 30个氨基酸残基或最大20个氨基酸残基。
[0029] 如上所述，已经确定，血清5-羟色胺水平升高导致骨量减少，从而造成骨质疏松 症。十二指肠的肠嗜铬细胞是血清5-羟色胺的来源。
[0030] 在应用中，本发明的多肽结合肠嗜铬细胞。此后，易位成分将蛋白酶成分转运入肠 嗜铬细胞的胞液。最终，一旦在内部，则蛋白酶通过裂解存在于肠嗜铬细胞胞液中的SNARE 蛋白抑制肠嗜铬细胞的细胞外融合过程。因此，通过使肠嗜铬细胞的细胞外融合器失活，本 发明的多肽抑制5-羟色胺从其中分泌。因此，本发明的多肽降低血清5-羟色胺水平且由 此能够抑制或治疗骨质疏松症。
[0031] TM结合肠嗜铬细胞上的结合位点，由此提供所述多肽对这一种类的靶细胞超过其 它细胞的选择性。在这方面，本发明优选的TM实施方案包括抗体（例如单克隆抗体、抗体 片段例如Fab、F(ab) ' 2、Fv、ScFv等和抗体结构域肽类）和结合如下鉴定的受体的结合骨 架。因此，本发明的多肽类可以包括商购抗体或结合骨架，它们被设计以实现对所述靶细胞 或受体的特异性结合。或者，优选的TMs包括肽配体，例如细胞因子、生长因子、神经肽类和 外源凝集素类。
[0032] 本发明的TM结合肠嗜铬细胞上的受体。作为实例，本发明多肽的TM结合肠嗜铬 细胞上的下组受体，其选自：IL13受体（例如IL13Ra 1);生长抑素受体（例如SSTR2或 SSTR5) ;VPAC 受体（例如 VPAC1S VPAC 2) ;TGF 0 I 受体（例如 TGF 0 RI 或 TGF 0 RII);速激 肽受体（例如TAC1S TAC 2) ; y -氨基丁酸（GABA)受体（例如GABAa受体，特别是a 6或 P 2);表皮生长因子（EGF)受体（例如EGFr);成纤维细胞生长因子受体（例如FGFJ);或 肽YY (PYY)受体（例如神经肽Y受体Y1SY2K所有这些受体均在肠嗜铬细胞上被表达。
[0033] 在一个实施方案中，TM选自：IL13受体配体（例如IL13);生长抑素受体配体（例 如生长抑素）；VPAC受体配体；TGF P I受体配体（例如TGF P I);速激肽受体配体（例如物 质P) ; y -氨基丁酸（GABA)受体配体；表皮生长因子（EGF)受体配体（例如EFG ;TGF a、 肝素结合EGF-样生长因子（HB-EGF)、双调蛋白（AR)、0细胞生长因子（BTC)、表皮调节素 (EPR)或epigen);成纤维细胞生长因子受体配体（例如FGF);或肽YY (PYY)受体配体（例 如肽YY);及其截短物和肽类似物。
[0034] 在一个实施方案中，本发明多肽的TM结合肠嗜铬细胞上的下组受体，其选自： ILl 3R aUsstp^strSJPAC1、VPAC2、TGF P RI、TGFP RIIJAC1JACrGABAa 受体 a 6、GABAa 受体0 2、EGFr、FGFJ、神经肽Y受体Y1S神经肽Y受体Y 2。所有这些受体均在肠嗜铬细胞 上被表达。
[0035] 在一个实施方案中，TM选自：IL13肽，生长抑素肽、VPAC肽、TGFP I肽、物质P肽、 EGF肽、TGFa肽、肝素结合EGF-样生长因子（HB-EGF)肽、双调蛋白（AR)肽、P细胞生长 因子（BTC)肽、表皮调节素（EPR)肽、epigen肽、成纤维细胞生长因子（FGF)肽或肽YY ;及 其截短物和肽类似物。
[0036] 在一个实施方案中，本发明多肽的TM结合IL13受体，优选IL13Ra 1。这样的TMs 适合的实例包括：IL13肽类，例如全长IL13肽（例如IL13146)及其截短物和肽类似物。
[0037] 在一个实施方案中，本发明多肽的TM结合生长抑素（SST)受体。作为实例，适合 的TMs包括：SST肽类和皮质抑制素（CST)-肽类及其肽类似物，例如D-Phe-Phe-Phe-D-Tr P-Lys-Thr-Phe-Thr-NH 2 (BIM 23052)nD-Phe-Phe-Tyr-D-Trp-Lys-Val-Phe-D-Nal-NH2 (BIM 23056)或 c [Cys-Phe-Phe-D-Trp-Lys-Thr-Phe-Cys]-NH2 (B頂-23268)。其它实例包括 SST 肽类SST-14和SST-28 ;以及肽和肽类似物，例如：奥曲肽、兰瑞肽、B頂23027、伐普肽、司格 列肽和S0M230。这些TMs是优选结合SST受体、特别是结合SST R2和SSTR5受体的TMs。
[0038] 在一个实施方案中，本发明的TM结合VPAC受体，优选VPAC1S VPAC 2。这样的TMs 适合的实例包括PACAP (1-27)或其截短物或肽类似物，包括类似物TP3805、类似物[Arg15'2 0' 21Leu17]-PACAP-Gly-Lys-Arg-NH2 和类似物 R3P66[HSDAVFTDNYTRLRKQVAAKKYLQSIKNKRY]。 这样的TMs适合的其它实例包括VIP-I和VIP-2肽类，例如VIP (1-28)或其截短物或肽类 似物，包括VIP类似物TP3939、TP4200、TP3982。这些TMs显示选择性结合VPAC 1。或者，可 以使用选择性结合VPACj^ TM，例如mROM (参见Yu等人，P印tides 27 (6) pl359-66 (2006)， 将该文献引入本文参考）。
[0039] 在一个实施方案中，本发明的TM结合TGF I受体，优选TGF RI或TGF RII。这 样的TMs适合的其它实例包括TGF P肽类，优选TGF P I肽及其截短物或肽类似物。
[0040] 在一个实施方案中，本发明的TM结合速激肽受体，优选TAC1S TAC 2。这样的TMs 的适合的实例包括物质P、其截短物或肽类似物，包括Glu5, MePhe8, Sar9]-SP5 n (DlMe_C7)、 唾液腺十一肽相关肽（ERP)和（D-pro4，D-trp7' 9)SP(4-ll)。其它适合的使TSI结合速激肽 受体的TMs详细描述在W02011/020114中，将该文献完整地引入本文参考。
[0041] 在一个实施方案中，本发明的TM结合y -氨基丁酸（GABA)受体，优选GABA受体 a 6或P 2。这样的TMs的适合的实例包括Y _氨基丁酸（GABA)、地西泮结合抑制剂（DBI) 肽、苯二氮杂卓、GABA类似物、DBI类似物。
[0042] 在一个实施方案中，本发明的TM结合表皮生长因子（EGF)受体，优选EGF r。这样 的TMs的适合的实例括表皮生长因子（EGF) ;TGF a、肝素结合EGF-样生长因子（HB-EGF)、 双调蛋白（AR)细胞生长因子（BTC)、表皮调节