专利名称：埃本膦酸钠作为预防和治疗骨质疏松症的药物的有效成分的应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及埃本膦酸钠(1-羟基-3-(N-甲基-N-正戊基)氨基亚丙基二膦酸单钠盐一水合物)作为预防和治疗骨质疏松症的药物的有效成分的应用。
背景技术：
骨质疏松症是常见的老年病之一，它是以骨量减少，骨组织微结构破坏、骨骼强度降低和骨折发生危险性增加为特征的疾病，是严重危害老年人健康、致残地重要原因。故尽早防治骨质疏松症于国于民至关重要。
双膦酸盐是目前治疗骨质疏松症药物研究和开发的热点。它是一类人工合成的P-C-P为基本骨架的化合物，其抑制骨吸收的作用早在六十年代末期就有报道。双膦酸盐在体内主要集积在活性骨的表面，与羟基磷灰石有强的结合作用，在体内和体外均显示强的抑制骨吸收的作用。双膦酸盐开始主要用于治疗骨吸收亢进的疾病，如Paget’s病、恶性肿瘤转移性高钙血症、异位钙化(骨化)等。后来发展用于骨折疏松症的治疗，第一个双膦酸盐化合物羟乙膦酸钠(etidronatedisodium)在七十年代上市应用于临床，已收载于美国药典和Martindate Extra Pharmacopia，它是一种应用最广泛的双膦酸盐。此后Clodronate(芬兰Leiras药厂生产，1986年首次上市，商品名为Bonefos)、Pamidronate(瑞士Giba-Geigy公司开发，1989年首次上市，商品名为Aredia)、Alendronate(美国Merk公司开发，商品名Fosamax)等相继应用于临床。上述药物中的大部分均已实现国产化并且在临床上推广应用。
埃本膦酸钠(Ibandronate)属于第三代双膦酸盐，化学名称为1-羟基-3-(N-甲基-N-正戊基)氨基亚丙基二膦酸单钠盐一水合物，由Mühlbauer等于1991年首次报道。在中国专利申请00105782.0中公开了其制备方法。实验发现埃本膦酸钠对骨吸收的抑制作用分别为Clodronate、Pamidronate、Alendronate的500倍、50倍、10倍，并且没有发现其对骨矿化有抑制作用。此外，已有多篇关于埃本膦酸钠治疗肿瘤骨转移引起的高钙血症、疼痛、Paget’s病的实验和临床报道。
发明内容
本发明的目的是提供埃本膦酸钠(1-羟基-3-(N-甲基-N-正戊基)氨基亚丙基二膦酸单钠盐一水合物)作为预防和治疗骨质疏松症的药物的有效成分的应用。
本发明埃本膦酸钠的具有下面的结构式
本发明根据动物实验发现，卵巢切除大鼠可因雌激素缺乏导致高骨转换率，出现明显骨量丢失和骨质吸收的征象，诱发并导致骨质疏松症。埃本膦酸钠可有效地降低该类大鼠的高骨转换率，改善其骨代谢的负钙平衡，使其骨矿物质的丢失和骨基质的分解得以有效的抑制。且随用药时间的延长，可建立新的骨代谢正钙平衡，骨形成相对活跃，骨量增加，从而对卵巢切除大鼠骨量的丢失起到良好的预防及明显的治疗作用，尤其是对含松质骨成分较多的椎骨骨量丢失的防治作用更为显著。这对以松质骨丢失为主要特点的绝经后妇女骨质疏松症的防治将有重要的临床意义。
破骨细胞骨吸收功能抑制是防治骨质疏松症等代谢性骨病的主要途径之一。本发明还通过体外破骨细胞实验，全面地评价了埃本膦酸钠对破骨细胞吸收功能抑制作用，从细胞学基础表明埃本膦酸钠对骨质疏松症具有防治作用。
本发明的埃本膦酸钠可以采用口服的给药方法，能以各种药物制剂如片剂、胶囊和药学可接受组合物的形式使用。
根据本发明的药物组合物，可以含有一定量的埃本膦酸钠作为活性成分，也可含有药学可接受的载体，这些药学可接受的载体可以是在现有技术中广泛用于药物中的各种载体，如赋形剂。本发明的药物组合物可以按现有技术中已知的方法如混合、制粒、压片来制备。本发明药物组合物还可以包括各种药学使用的任选组分，如香味剂、着色剂、甜味剂等。
下列说明试验测试方法及其结果以支持本发明提供的化合物的医疗效果。
I、埃本膦酸钠对卵巢切除骨质疏松症预防作用的研究
本研究通过给卵巢切除大鼠埃本膦酸钠用药，观察该药物对雌激素缺乏大鼠骨代谢指标及骨组织形态计量方面的影响，为这一新型双膦酸盐药物预防骨质疏松症提供实验药效依据。
试验方法
1、实验分组
取SD大鼠，雌性，10-12月龄，体重267-392克，以100mg/kg体重氯胺酮腹腔麻醉，背侧切块腹腔，随机分为6组(A、B、C、D、E、F)，每组10只。
A、假手术对照组切除小块脂肪组织，不切除卵巢。次日开始灌注生理盐水，1ml/只，每日1次，共90天。
B、去势模型对照组作双侧卵巢切除。次日起灌注生理盐水，1ml/只，每日1次，共90天。
C、埃本膦酸钠低剂量组作双侧卵巢切除。次日起按0.25mg/kg剂量，以生理盐水溶解灌服，1ml/只，每日1次，共90天。
D、埃本膦酸钠中剂量组作双侧卵巢切除，次日起按0.5mg/kg剂量，以生理盐水溶解灌服，1ml每只，每日1次，共90天。
E、埃本膦酸钠高剂量组作双侧卵巢切除，次日起按1mg/kg剂量，以生理盐水溶解灌服，1ml/只，每目1次，共90天。
F、尼尔雌醇组作双侧卵巢切除，手术后第三天起按1mg/kg剂量尼尔雌醇，以生理盐水溶解灌服，1ml/只，每周1次，共90天。
各组大鼠均在相同环境条件下饲养，喂以标准颗粒饲料和自由饮用自来水，标准饲料含钙1.01％，磷0.78％，Vit.D3IU/g。
2、标本的采集
a、尿标本行卵巢切除前及灌药90天后，用代谢笼分别留取24小时尿液，-20℃保存待测。
b、血标本实验结束后，以10％乌拉坦(1ml/100g体重)腹腔麻醉动物，颈动脉插管取血，离心分离血清，-20℃保存待测。
c、骨标本动物取血后，作全身骨密度测量，然后分离左右侧股骨、腰椎锥体、左侧胫骨标本进行相应的处理及各项指标的检测。
3、检测指标
a、骨干重、灰重和钙含量测定
取左侧股骨，去除附着的肌肉和结缔组织，在股骨上端和骨干骺端分别穿孔，双蒸水冲洗骨髓。置120℃烘箱1小时，按阿基米德原理测量股骨体积(cm3)。随后以2份三氯甲烷加1份甲醇混合液，脱脂72小时，置120℃烘箱6小时，立即置干燥器内冷却后称干重(g)，然后标本置瓷坩埚中，置800℃马福炉内灰化6小时，干燥器内冷却后称灰重(g)。
骨钙含量测定精密称量0.1g的灰化股骨，以4mol/L盐酸溶解，并以0.2％的硝酸镧溶液稀释1000倍后用PE-3110型原子吸收分光光度计测定吸收度(波长422.7nm，狭缝0.7nm)，同时测定试样空白溶液的吸收度，单位g/cm3。
b、取右侧股骨，去除附着的肌肉和结缔组织，置有机玻璃盒支架上固定位置，内装蒸馏水，以全长的1/2交界处为测量点，用单光子骨密度仪测定。
c、全身骨密度测定
颈动脉取血后，每组随机取6只大鼠用DPX-L型骨密度仪作整体骨密度测定，并应用动物全身骨密度软件进行全身扫描，单位g/cm3。
d、抗弯力测定
取右侧股骨作骨密度测定后，应用AG-2020KNA型万能材料试验机进行抗弯力测定。置标本于跨距为22mm的支架上，以2mm/min速度作三点完全试验，记录股骨断裂载荷，单位为牛顿(N)。
e、血、尿其它指标测定
尿钙测定采用EDTA滴定法尿肌酐测定采用苦味酸法；尿OHPr测定采用改良血尿羟脯氨酸测定法；血清AKP测定采用酶动力学法，E2测定采用125I-E2放免测定试剂盒进行放免测定。
f、椎骨骨小梁电镜扫描观察
腰椎中间松质骨部位取材后，用2.5％戊二醛和1％锇酸双重固定，系列酒精脱水，醋酸正戊酯置换，CO2临界点干燥，离子溅射仪喷金，然后用S-520扫描电镜观察拍照。
g、椎骨及胫骨骨组织切片显微形态计量。
各组随机取3只大鼠腰椎锥体和左胫骨上段，然后腰椎取中间部分，胫骨取上1/3处，10％中性甲醛固定。常规脱钙、包埋、切片成6μ厚，HE染色。锥体标本横切面，胫骨标本为纵切面，双盲法进行病理形态学观察和计量。采用TJTY-300VIO显微形态计量仪，每个标本随机取3个视野的形态计量指标，每组共取9个视野计算平均值。由于标本中的骨髓腔和骨小梁形态不规则，有的不连接，宽窄度差别很大，很难准确测量骨小梁骨髓腔的腔的宽度和作骨小梁计数，因此取一固定视野，先测出固定视野的面积(μ2)，然后测量固定视野中骨髓腔面积的总和(μ2)，两者相减即得骨小梁的面积，单位为μ2/视野。
各项观测指标以平均值±SD来表示，统计学处理采用样本均数差别的t检验。
结果
一、各组大鼠体重比较(表1-1)
随机分组时，去势前及去势用药90天后(处死前)各组大鼠间体重比较结果的差异无显著意义(P＞0.05)。
表1-1各组大鼠体重(g，x±s)
二、子宫湿重及血清E2值的改变(表1-2)
卵巢切除后的B、C、D、E各组的子宫湿重和血清E2值均明显低于A组(P＜0.01或P＜0.001)。F组子宫湿重明显高于卵巢切除的其它各组。
表1-2 子宫湿重和血清E2测定结果(x±s)
三、骨干重、灰重和钙含量的改变(表1-3)
B组骨干重、灰重和钙含量均明显低于A组，C、D、E、F各组明显高于B组，E组与F组之间差异无显著意义。其中D组骨干重、灰重和钙含量高于其它组，差异有显著或极显著意义(P＜0.01或P＜0.001)。
表1-3骨干重、灰重和骨钙含量测定结果(x+s，g/cm3)
四、股骨骨密度、抗弯力及全身骨密度的改变(表1-4)
B组股骨骨密度水平明显低于A组，C、D、E、F各组明显高于B组(P＞0.05、P＜0.01或P＜0.001)。其中D组股骨骨密度水平高于其它各组，较为显著。
股骨抗弯力，B组低于A、C、D、E组(但P＞0.05)。其中D组抗弯力较其它各组略高。E组与B组比较全身骨密度分别增加0.9％、9.9％和3.6％。
表1-4股骨骨密度、抗弯力及全身骨密度测定结果(x±s)
五、各组大鼠尿OHPr/Cr比值的变化(表1-5)
卵巢切除前各组间尿OHPr/Cr比值差异均无显著意义(P＞0.05)，用药后尿OHPr/Cr比值B组明显高于A组，C、D、E、F组低于B组，差异均有极显著意义(P＜0.01或P＜0.02)。
表1-5 各组大鼠尿OHPr/Cr比值(x±s)
去势前各组间P值均大于0.05
用药后各组间P值
A∶B C∶B D∶B E∶B F∶B E∶F
＜0.01＜0.01＜0.02＜0.01＜0.01＞0.05
六、各组大鼠尿Ca/Cr比值的变化(表1-6)
尿Ca/Cr比值，去势前各组比较P＞0.05。用药后B组明显高于A组，C、D、E、F组低于B组，虽差异无显著意义(P＞0.05)，但均呈降低趋势。
表1-6 各组大鼠尿Ca/Cr比值(x±s)
P值均＞0.05。
七、各组大鼠血清AKP的变化(表1-7)
B组血清AKP的水平明显高于A组，C、D、E组低于B组，虽差异无显著意义(P＞0.05)，但均呈降低趋势。
表1-7 各组大鼠血清AKP测量结果(x±s)
P值均＞0.05
八、各组大鼠椎骨、胫骨骨小梁面积的改变(表1-8)
B组椎骨骨小梁面积较A、C、D、E、F组均见程度不同的减少，与A、C、E三组比较差异有显著意义(P＜0.01及P＜0.05)。胫骨骨小梁面积B组亦程度不同地低于其它各组。
表1-8各组大鼠椎骨、胫骨骨小梁面积测量结果(n，x±s，μ2/视野)
椎骨骨小梁
P值A∶BC∶B D∶B E∶B F∶B E∶F
＜0.01 ＜0.05＞0.05＜0.05＞0.05＞0.05
胫骨骨小梁
P值均＞0.05
九、各组大鼠椎骨电镜扫描骨小梁的改变
B组骨小梁数目明显低于A组，且体积缩小，出现明显骨质吸收的现象，而C、D、E、F组骨小梁数目及体积明显好于B组。
II、埃本膦酸钠对卵巢切除大鼠骨质疏松症治疗作用的研究
本研究应用国内合成的埃本膦酸钠给骨质疏松症动物模型大鼠用药，观察该药对卵巢切除大鼠骨质疏松症的治疗作用，为埃本膦酸钠尽早应用于骨质疏松症的治疗提供实验药效依据。
试验方法
1、实验分组
SD大鼠、雌性、10-12月龄，体重270-380g，按体重随机分为4组(A、B、C、D)，每组9只，各组平均体重差异无显著意义(P＞0.05，见表2-1)。
A、假手术对照组
以100mg/kg体重氯胺酮腹腔麻醉，背侧切块腹腔，切除小块脂肪组织，不切除卵巢。手术3个月后开始灌注生理盐水，1ml/只，每日1次，共90天。
B、OP模型对照组
麻醉方法同A组，背侧切块腹腔，作双侧卵巢切除。手术后3个月开始灌服生理盐水，1ml/只，每目1次，共90天。
C、OP模型+埃本膦酸钠组
同B组方法作双侧卵巢切除，手术3个月后开始灌服埃本膦酸钠，0.5mg/kg，加生理盐水溶解，1ml/只，每日1次，共90天。
D、OP模型+尼尔雌醇组
同B组方法，作双侧卵巢切除，手术3个月后灌服尼尔雌醇，1ml/kg，加生理盐水溶解，1ml/只，术后第一周灌药2次，以后每周1次，共90天。
各组大鼠均在相同环境下饲养，喂以标准颗粒饲料和自由饮用自来水，标准饲料含钙1.01％，磷0.78％，Vit.D3IU/g。
2、标本的收集及指标检测同前
各项观测指标以平均值±SD来表示，统计学处理采用样本均数差别的t检验。
结果
一、各组大鼠体重比较(表2-1)
随机分组时、去势前及实验结束后(处死前)，各组大鼠间体重比较结果的差异无显著意义(P＞0.05)。
表2-1 各组大鼠体重(g，x±s)
二、子宫湿重及血清E2值的改变(表2-2)
子宫湿重B、C两组低于A、D两组，差异均有显著意义(P＜0.02或P＜0.001)血清E2的水平A组高于B、C、D组，差异亦有显著意义(P＜0.05)。
表2-2子宫湿重和血清E2测定结果(x±s)
P值 A∶BA∶CA∶D
子宫湿重P＜0.02 P＜0.05 P＞0.05
E2 P＜0.05 P＜0.05 P＜0.05
三、骨干重、灰重和钙含量的改变(表2-3)
B组骨干重、灰重和钙含量均明显低于A组，而C、D两组明显高于B组(P均＜0.001)。其中C组骨干重、灰重和钙含量高于A组，差异有极显著意义。
表2-3 骨干重、灰重和骨钙含量测定结果(x±s，g/cm3)
干重 灰重 钙含量P值A∶BP＜0.001 P＜0.001
B∶CP＜0.001 P＜0.001 P＜0.001
B∶DP＜0.001 P＜0.001 P＜0.001
C∶D P＞0.05 P＞0.05P＞0.05四、股骨骨密度、抗弯力及全身骨密度的改变(表2-4)
B组股骨骨密度低于其它各组，差异均有显著意义(P＜0.01或P＜0.02)，其中C组的水平相对较高。
抗弯力测试，B组较A、C、D组的水平略低，但组间比较差异无显著意义(P＞0.05)。
全身骨密度测定，B组低于A、C、D组，差异有显著意义(P＜0.05或P＜0.001)。C组及D组全身骨密度的水平较B组分别增加8.7％和0.9％。
表2-4 各组股骨骨密度、抗弯力及全身骨密度测定结果(x±s)
股骨骨密度 抗弯力 全身骨密度
P值A∶B P＜0.02 P＞0.05 P＜0.01
C∶B P＜0.01 P＞0.05 P＜0.05
D∶B P＜0.01 P＞0.05 P＜0.05
C∶D P＞0.05 P＞0.05 P＞0.05
五、各种大鼠尿Ca/Cr、OHPr/Cr比值的改变(表2-5)
B组尿Ca/Cr比值高于A、C、D组，而且与C、D组比较，差异均有显著意义(P＜0.01)。
尿OHPr/Cr比值，C、D两组低于B组，差异虽未有显著意义(P＞0.05)，但较B组均有下降趋势。
表2-5 各组大鼠尿Ca/Cr、OHPr/Cr比值(x±s)
Ca/CrA∶B B∶C B∶DC∶D
P＞0.05 P＜0.001 P＜0.001P＞0.05
OHPr/Cr P均＞0.05
六、各组大鼠血清AKP的变化(表2-6)
B组血清AKP的水平明显高于A、C、D组，C、D两组与B组比较虽差异无显著意义(P＞0.05)，但均呈降低趋势。
表2-6 各组大鼠血清AKP测量结果(x±s，IU/L)
P值A∶BC∶BD∶B C∶D
＞0.05 ＞0.05 ＞0.05＞0.05
七、各组大鼠椎骨、胫骨骨小梁面积的改变(表2-7)
B组椎骨、胫骨骨小梁的面积低于A、C、D三组，差异均有显著意义(P＜0.01或P＜0.001)，B组椎骨骨小梁面积百分比值(62.8％)明显低于C、D两组(84.2％和85.3％)。B组胫骨骨小梁面积百分比值(66.6％)亦低于C、D两组(83.1％及91.8％)。
表2-7各组大鼠椎骨、胫骨骨小梁面积测量结果(n＝9，x±s，μ2/视野)
P值
椎骨 A∶B C∶B D∶B C∶D
＜0.001＜0.01＜0.01＞0.05 胫骨 A∶B C∶B D∶B C∶D
＜0.001＜0.01＜0.01＜0.05
八、各组大鼠椎骨电镜扫描骨小梁的改变
B组骨小梁数目较A组明显减少，厚度变薄，个别骨小梁出现断裂现象，C、D两组骨小梁数目及体积明显优于B组。
III、埃本膦酸钠对破骨细胞抑制作用的研究
骨质疏松症等代谢性骨病的发生与破骨细胞性骨吸收增强有关，因而在细胞水平上观察药物对破骨细胞功能的影响是评价骨质疏松症防治药物的方法之一。本发明埃本膦酸钠整体药效研究结果表明其有减少骨量丢失，明显增加去势大鼠骨密度的作用。在此基础上，本实验应用体外培养破骨细胞观察埃本膦酸钠对破骨细胞生存率、骨吸收功能和凋亡的作用。
试验方法
1、细胞培养新生(24h内)SD大鼠(清洁级标准，第02-22-2号)消毒后，在无菌条件下取四肢长骨，机械分离破骨细胞，以5×104/cm2的密度接种于牛皮质骨薄切片(5×5mm2)，培养液15％FCS-MEN，置37℃、5％CO2培养箱中培养。
2、观察指标
A、TRAP(+)多核细胞
5小时后加入药物或培养液(MEN，15％FCS)。培养3天取出骨片经TRAP(抗酒石酸酸性磷酸酶)组化染色，光镜下作吸收陷窝计数，结果与对照组比较。
C、凋亡百分数
破骨细胞分离方法同上。在玻片(5×5mm2)培养4小时，加入不同浓度的埃本膦酸钠，继续培养5小时，取出玻片，PBS清洗，荧光(丫啶橙)染色5-10分钟后在荧光显微镜下观察，并计算橙红色荧光的破骨细胞百分数。结果与对照组比较。
各项观测指标以平均值±SD来表示，统计学处理采用样本均数差别的t检验。
结果
一埃本膦酸钠对破骨细胞数目的影响(表3-1)
药物组TRAP(+)多核细胞数目减少，并呈剂量相关，10-8M抑制率为71.3％。表明埃本膦酸钠有抑制破骨细胞成熟的作用。
表3-1 骨片TRAP(+)多核细胞计数结果
注n＝4 *P＜0.01
二、埃本膦酸钠对破骨细胞吸收功能的抑制作用(表3-2，表3-3)
药物组吸收陷窝明显减少，并呈剂量相关(P＜0.01)，表明埃本膦酸钠对破骨细胞吸收功能有显著抑制作用，其作用强度优于Alendronate和Pamidronate。
表3-2 骨片吸收陷窝计数结果
注n＝4
表3-3 与其它国产双膦酸盐药物的吸收抑制率比较(％)
抑制率(％)＝(对照-药物)/对照×100％
三、对破骨细胞凋亡的诱导作用
高浓度埃本膦酸钠(＞10-8M)增加破骨细胞凋亡百分数，并随剂量的增加有增高的趋势。表明埃本膦酸钠对破骨细胞凋亡有一定的诱导作用。
从试验I、II和III的结果可以看出，本发明的埃本膦酸钠具有预防和治疗卵巢切除大鼠骨质疏松的作用以及具有显著的抑制破骨细胞的作用，从而证实了本发明埃本膦酸钠具有作为预防和治疗骨质疏松症的药物的有效成分的用途。
以下面的配方为例来说明含有本发明药物的组合物的制备方法
配方
每片
埃本膦酸钠2.25mg
乳糖 114.75mg
微晶纤维素80.0mg
硬脂酸镁 1.0mg
羧甲基淀粉2.0mg
将埃本膦酸钠过100目筛；微晶纤维素75℃烘干4小时，过80目筛；硬脂酸镁过100目筛；羧甲基淀粉过100目筛。然后，取埃本膦酸钠2.25g与1/2量乳糖、1/3量微晶纤维素置于混合搅拌器中以20rpm转速搅拌5分钟，再加入剩余1/2量乳糖，2/3量微晶纤维素，以20rpm转速搅拌10分钟，然后加入羧甲基淀粉，以20rpm搅拌5分钟，最后加入硬脂酸镁，以20rpm转速搅拌3分钟。将混匀的原料置压片机中，用8.0mm浅圆冲压片，即得埃本膦酸钠片。
权利要求
1、一种预防骨质疏松症的药物，其特征在于它含有下面结构式的埃本膦酸钠作为有效成分
2、一种治疗骨质疏松症的药物，其特征在于它含有下面结构式的埃本膦酸钠作为有效成分
全文摘要
本发明涉及含有埃本膦酸钠(1－羟基－3－(N－甲基－N－正戊基)氨基亚丙基二膦酸单钠盐一水合物)作为预防和治疗骨质疏松症的药物的有效成分的应用。经动物试验证明，本发明的埃本膦酸钠可有效地降低卵巢切除大鼠的高骨转换率，改善其骨代谢的负钙平衡，使其骨矿物质的丢失和骨基质的分解得以有效的抑制。本发明还通过体外破骨细胞实验，全面地评价了埃本膦酸钠对破骨细胞吸收功能抑制作用，从细胞学基础表明埃本膦酸钠对骨质疏松症具有防治作用。
文档编号A61P19/10GK1404836SQ01142150
公开日2003年3月26日 申请日期2001年9月14日 优先权日2001年9月14日
发明者王博诚, 王洪复, 胡启杨, 刘谦, 刘德惠, 包志宏 申请人:中生北方生物工程开发研究所, 江苏省原子医学研究所