本文参考。
[0227] 作为实例，适合的有利于易位的结构域包括包膜病毒融合肽结构域，例如适合的 融合肽结构域包括流感病毒属A型融合肽结构域（例如23个氨基酸的流感病毒A型融合 肽结构域）、甲病毒属（alphavirus)融合肽结构域（例如26个氨基酸的西门利克森林病毒 融合肽结构域）、水疱病毒属（vesiculovirus)融合肽结构域（例如21个氨基酸的水疱性 口炎病毒融合肽结构域）、呼吸系病毒融合肽结构域（例如25个氨基酸的仙台病毒融合肽 结构域）、麻疹病毒属（morbiliivirus)融合肽结构域（例如25个氨基酸的犬痕热病毒融 合肽结构域）、禽副黏液病毒属（avulavirus)融合肽结构域（例如25个氨基酸的新城疫病 毒融合肽结构域）、亨尼波病毒融合肽结构域（例如25个氨基酸的亨德拉病毒融合肽结构 域）、偏肺病毒融合肽结构域（例如25个氨基酸的人类偏肺病毒融合肽结构域）或泡沫病 毒属（spumavirus)融合肽结构域，例如猴泡沫病毒融合肽结构域；或其片段或变体。
[0228] 作为另一个实例，有利于易位的结构域可以包括梭菌属毒素1^结构域或其片段 或变体。更具体地，有利于梭菌属毒素H eN易位的结构域可以具有至少200个氨基酸、至少 225个氨基酸、至少250个氨基酸、至少275个氨基酸的长度。在这方面，有利于梭菌属毒 素H eN易位的结构域优选具有至多200个氨基酸、至多225个氨基酸、至多250个氨基酸或 至多275个氨基酸的长度。具体（参比）实例包括：
[0229] 肉毒菌毒素A型神经毒素-氨基酸残基（872-1110)
[0230] 肉毒菌毒素B型神经毒素-氨基酸残基（859-1097)
[0231] 肉毒菌毒素C型神经毒素-氨基酸残基（867-1111)
[0232] 肉毒菌毒素D型神经毒素-氨基酸残基（863-1098)
[0233] 肉毒菌毒素E型神经毒素-氨基酸残基（846-1085)
[0234] 肉毒菌毒素F型神经毒素-氨基酸残基（865-1105)
[0235] 肉毒菌毒素G型神经毒素-氨基酸残基（864-1105)
[0236] 破伤风神经毒素 -氨基酸残基（880-1127)
[0237] 上述序列位置根据血清型/亚型的不同可以有微小变化，且适合的（参比）梭菌 属毒素H eN结构域的另外的实例包括：
[0238] 肉毒菌毒素A型神经毒素-氨基酸残基（874-1110)
[0239] 肉毒菌毒素B型神经毒素-氨基酸残基（861-1097)
[0240] 肉毒菌毒素C型神经毒素-氨基酸残基（869-1111)
[0241] 肉毒菌毒素D型神经毒素-氨基酸残基（865-1098)
[0242] 肉毒菌毒素E型神经毒素-氨基酸残基（848-1085)
[0243] 肉毒菌毒素F型神经毒素-氨基酸残基（867-1105)
[0244] 肉毒菌毒素G型神经毒素-氨基酸残基（866-1105)
[0245] 破伤风神经毒素 -氨基酸残基（882-1127)
[0246] 任意上述有利的结构域可以与任意上述适用于本发明的易位结构域肽类组合。因 此，作为实例，非梭菌属有利性结构域可以与非梭菌属易位结构域肽或与梭菌属易位结构 域肽组合。或者，有利于梭菌属毒素H eNS位的结构域可以与非梭菌属易位结构域肽组合。 或者。有利于梭菌属毒素HeN的结构域可以组合或与梭菌属易位结构域肽组合，其实例包 括：
[0247] 肉毒菌毒素A型神经毒素-氨基酸残基（449-1110)
[0248] 肉毒菌毒素B型神经毒素-氨基酸残基（442-1097)
[0249] 肉毒菌毒素C型神经毒素-氨基酸残基（450-1111)
[0250] 肉毒菌毒素D型神经毒素-氨基酸残基（446-1098)
[0251] 肉毒菌毒素E型神经毒素-氨基酸残基（423-1085)
[0252] 肉毒菌毒素F型神经毒素-氨基酸残基（440-1105)
[0253] 肉毒菌毒素G型神经毒素-氨基酸残基（447-1105)
[0254] 破伤风神经毒素 -氨基酸残基（458-1127)
[0255] 序列同源性
[0256] 任意各种序列对比方法可以用于测定同一性百分比，包括、但不限于通用方法、局 限性方法和杂交方法，例如，片段接近法。用于测定同一性百分比的方案是本领域技术人 员范围内的常规方法。通用方法从分子的开始到结束对比序列并且通过合计各残基对的 评分并且通过利用空位罚分确定最佳排列。非限制性方法包括，例如，CLUSTAL W，参见，例 如，Julie D. Thompson 等人，CLUSTAL W: Improving the Sensitivity of Progressive Multiple Sequence Alignment Through Sequence Weighting, Position-Specific Gap Penalties and Weight Matrix Choice, 22 (22)Nucleic Acids Research 4673-4680(1994);和反复精制，参见，例如，Osamu Gotoh，Significant Improvement in Accuracy of Multiple Protein. Sequence Alignments by Iterative Refinement as Assessed by Reference to Structural Alignments，264(4)J. Mol. Biol. 823-838(1996) 〇 局限性方法通过鉴定一个或多个被所有输入序列共有的保守基元进行序列对 比。非限制性方法包括，例如，Match-box，参见，例如，Eric Depiereux and Ernest Feytmans, Match-Box:A Fundamentally New Algorithm for the Simultaneous Alignment of Several Protein Sequences，8(5)CABI0S 501-509(1992) ;Gibbs 采样，参见，例如， C. E. Lawrence 等人，Detecting Subtle Sequence Signals:A Gibbs Sampling Strategy for Multiple Alignment，262 (5131) Science 208-214(1993) ;Align-M，参见，例如， Ivo Van WaIIe 等人，Align-M-A New Algorithm for Multiple Alignment of Highly Divergent Sequences，20 (9)Bioinformatics:1428-1435(2004)〇
[0257] 因此，通过常规方法测定序列同一性百分比。参见，例如，Altschul等 人，Bull. Math. Bio. 48:603-16, 1986 以及 Henikoff 和 Henikoff，Proc. Natl. Acad. Sci. USA89:10915-19, 1992。简言之，对两种氨基酸序列进行序列对比，使用空位开放罚分10、空 位伸展罚分1和如下所示的Henikoff和Henikoff (同上）的〃blosum 62〃评分矩阵（通 过标准单字母密码指示氨基酸）以优化序列对比评分。
[0258] 用于测定序列同一性的序列对比评分
[0259]
[0262] 基本上同源的多肽类的特征为具有一个或多个氨基酸取代、缺失或添加。这些改 变优选具有：最小的属性，即保守氨基酸取代（参见下文）且其它取代不会显著地影响所述 多肽的折叠或活性；小的缺失，典型地1 一约30个氨基酸；和小的氨基-或羧基-末端延 伸，例如氨基-末端甲硫氨酸残基、至多约20-25个残基的小的连接肽或亲合标记。
[0263] 保守氨基酸取代
[0264] 碱性：精氨酸
[0265] 赖氨酸
[0266] 组氨酸
[0267] 酸性：谷氨酸
[0268] 天冬氨酸
[0269] 极性：谷氨酰胺
[0270] 天冬酰胺
[0271] 疏水性：亮氨酸
[0272] 异亮氨酸
[0273] 缬氨酸
[0274] 芳族：苯丙氨酸
[0275] 色氨酸
[0276] 酪氨酸
[0277] 小：甘氨酸
[0278] 丙氨酸
[0279] 丝氨酸
[0280] 苏氨酸
[0281] 甲硫氨酸
[0282] 除20个标准氨基酸外，非标准氨基酸（例如4-羟基脯氨酸、6-N-甲基赖氨酸、 2_氨基异丁酸、异缬氨酸和a _甲基丝氨酸）可以用于取代本发明多肽类的氨基酸残基。 有限数量的非保守氨基酸、未被遗传密码编码的氨基酸和非天氨基酸可以用于取代梭菌属 多肽氨酸残基。本发明的多肽类还可以包括非天然存在的氨基酸残基。
[0283] 非天然存在的氨基酸包括、但不限于反式-3-甲基脯氨酸、2, 4-亚甲基-脯氨 酸、顺式-4-羟基脯氨酸、反式-4-羟基-脯氨酸、N-甲基甘氨酸、别-苏氨酸、甲基-苏 氨酸、羟基-乙基半胱氨酸、羟基乙基高半胱氨酸、硝基-谷氨酰胺、高谷氨酰胺、哌可酸、 叔亮氨酸、正缬氨酸、2-氮杂苯丙氨酸、3-氮杂苯丙氨酸、4-氮杂苯丙氨酸和4-氟苯丙 氨酸。用于将非天然存在的氨基酸残基并入蛋白质的几种方法是本领域公知的。例如， 可以使用体外系统，其中使用化学氨基酰化抑制剂tRNAs抑制无义突变。用于合成氨基 酸和氨基酰化tRNA的方法是本领域公知的。在包含大肠杆菌（E. coli)S30提取物和商 购酶和其它试剂的无细胞系统中进行包含无义突变的质粒的转录和翻译。通过色谱法 纯化蛋白质。参见，例如，Robertson 等人，J. Am. Chem. Soc. 113:2722, 1991 ;Ellman 等 人，Methods Enzymol. 202:301，1991 ;Chung 等人，Science259:806_9, 1993 ;and Chung 等人，Proc. Natl. Acad. Sci. USA90:10145-9, 1993)。在第二种方法中，在爪蟾卵中通过显 微注射突变的mRNA和化学氨基酰化的抑制剂tRNAs进行翻译（Turcatti等人，J. Biol. Chem. 271:19991-8, 1996)。在第三种方法中，在没有将被替代的天然氨基酸（例如苯丙氨 酸）的存在下和在有期望的非天然存在的氨基酸（例如2-氮杂苯丙氨酸、3-氮杂苯丙氨 酸、4-氮杂苯丙氨酸或4-氟苯丙氨酸）的存在下培养大肠杆菌细胞。将非天然存在的氨基 酸并入所述多肽以替代其天然对应物。参见，Koide等人，Biochem. 33:7470-6,1994。可以 通过体外化学修饰将天然存在的氨基酸残基转化成非天然存在的种类。可以将化学修饰与 定点诱变组合以进一步扩展取代范围（Wynn和Richards, Protein Sci. 2:395-403, 1993)。
[0284] 有限数量的非保守氨基酸、不被遗传密码编码的氨基酸、非天然存在的氨基酸和 非天然氨基酸可以用于取代本发明多肽的氨基酸残基。
[0285] 可以根据本领域公知的方法鉴定本发明多肽类中的必需氨基酸，例如定点诱变 或丙氨酸-扫描诱变（Cunningham和Wells, Science244:1081_5, 1989)。还可以通过 对结构进行物理分析确定生物相互作用位点，正如通过核磁共振、晶体学、电子衍射或 光亲和标记这样的技术结合推定接触位点氨基酸突变所测定的。参见，例如，de Vos等 人，Science255:306-12, 1992 ;Smith 等人，J. Mol. Biol. 224:899-904, 1992 ;Wlodaver 等 人，FEBS Lett. 309:59-64,1992。还可以根据与本发明多肽类的相关成分（例如易位或蛋 白酶成分）的同源性分析推断必需氨基酸的身份。
[0286] 可以使用已知的诱变和筛选方法、例如由Reidhaar-Olson和 Sauer(Science241:53_7，1988)或 Bowie 和 Sauer(Proc. Natl. Acad. Sci. USA86:2152-6，1989)公开的那些方法进行和测试多氨基酸取代。简言之，这些作者公开了 用于同时随机选择多肽中的一个或多个位置、选择功能性多肽且然后对诱变的多肽类进行 测序的方法，以便确定每个位置上的可取代的范围。可以使用的其它方法包括噬菌体展示 (例如，Lowman 等人，Biochem. 30:10832-7, 1991 ;Ladner 等人，美国专利 US 5, 223, 409 ; Huse, WIPO[0287] 可以使用已知的诱变和筛选方法、例如由Reidhaar-Olson和 Sauer(Science241:53_7，1988)或 Bowie 和 Sauer(Proc. Natl. Acad. Sci. USA86:2152-6，1989)公开的那些方法进行和测试多氨基酸取代。简言之，这些作者公开了 用于同时随机选择多肽中的一个或多个位置、选择功能性多肽且然后对诱变的多肽类进行 测序的方法，以便确定每个位置上的可取代的范围。可以使用的其它方法包括噬菌体展示 (例如，Lowman 等人，Biochem. 30:10832-7, 1991 ;Ladner 等人，美国专利 US 5, 223, 409 ; Huse, WIPO[0288] 在一个实施方案中，TM基本上不结合VIP受体和/或CRH受体。
[0289] 在一个实施方案中，TM不是PACAP (1-38)或VIP肽或CRH肽。
[0290] 如下是附图简述，其示例本发明的方面和/或实施方案。 实施例
[0291]制备施用于患有骨质疏松症的患者的多肽，提供用于抑制或治疗骨质疏松症的方 法。如本发明中定义的，制备的多肽的靶向部分（TM)成分（特异性地）结合存在于肠嗜铬 细胞上的受体。此后，易位成分促使多肽的非细胞毒性蛋白酶成分转运，一旦在肠嗜铬细胞 内部，则其抑制5-羟色胺从其中分