rhDSL重组蛋白及其制备方法

专利名称：rhDSL重组蛋白及其制备方法
技术领域：
本发明涉及一种生物工程技术领域的蛋白及其制备方法，具体涉及一种 rhDSL重组蛋白及其制备方法。
背景技术：
Notch信号传导通路广泛存在于脊椎和非脊椎动物中，是影响细胞决定的重 要通路之一，在进化上具有高度的保守性。Notch信号传导通路由Notch受体、 配体及其下游的信号传导共同组成。相邻细胞间通过Notch受体传递信号可以 调节包括干细胞在内的多种细胞的分化、增殖和凋亡，影响器官形成和形态发 生。目前己经发现的人的Notch配体有Jaggedl、 Jagged2、 Deltal、 Delta3、 Delta4。 Notch配体的胞外区含有数量不等的EGF样重复序列以及N端保守的 DSL (Delta/ Serrate/ Lag2)结构域，该DSL结构域在结合与活化Notch受体 的过程中起关键作用。
来自于野生Notch配体的重组蛋白或者多肽被认为是有效的Notch激活剂。 体外实验已经证明，从Jaggedl、Deltal中衍生而来的重组蛋白及多肽具有Notch 激活特性(Shimizu K, et al. J Biol Chem， 1999, 274(46): 32961~32969)。 Han等(Blood, 2000， 95(5): 1616~1625)通过对人类Deltal蛋白结构的功 能域的研究，成功的选出了具有Notch受体激活功能的Deltal最小功能蛋白序 列，包括进化中的保守结构区DSL和与之相邻的N-端的50个氨基酸，克隆并表 达纯化出具有GST(谷胱甘肽-S-转移酶)标签的重组融合蛋白，命名为hDlir"。 经对现有技术的文献检索发现，中国专利公开号为CN101063127A，专利名称为 "GST-hDSL重组蛋白的制备方法"，该专利中介绍的制备方法步骤为"第一步， 构建重组表达质粒pGEX-2T-hDSL ;第二步，诱导表达重组表达质粒 pGEX-2T-hDSL;第三步，将表达产物依次经变性，复性，离心，冲洗，洗脱后 纯化得到GST—hDSL重组蛋白的。"该方法虽然可以得到较高浓度(0.5mg/mL以 上)和纯度(95%以上)的GST-hDSL重组蛋白，但是所得到的重组蛋白分子量较大、结构较为复杂，不利于生产中成本的节约及相关体内外研究中的运用。

发明内容
本发明的目的在于针对现有技术的不足，提供一种rhDSL重组蛋白及其制 备方法，使其进一步简化了hDllf"L重组蛋白的结构，首次构建了含6XHis(组 氨酸)标签的重组rhDSL蛋白，rhDSL是一种新的结构简单、分子量较小的Notch 配体衍生多肽。
本发明是通过以下技术方案实现的
本发明所涉及的rhDSL重组蛋白，为含有6XHis(组氨酸)标签的Notch配 体Delta-like-1的衍生多肽。
所述的衍生多肽，由含有进化中的保守结构区DSL和与之相邻的N-端的50 个氨基酸构成，共99个氨基酸，其氨基酸序列为(Blood, 2000， 95(5): 1616 162):
LHTDSPDDLATENPERLISRLATQ朋LTVGEEWSQDLHSSGRTDLKYSYRFVCDEHYYGEGCSV FCRPRDDAFGHFTCGERGEKVCNPGWKGPYCTEPI。
所述rhDSL重组蛋白以pQE30为表达载体构建重组表达质粒pQE30-hDSL， 以大肠杆菌DH5a为宿主进行重组蛋白的表达，在大肠杆菌中表达后以包涵体 形式存在。
本发明所涉及的rhDSL重组蛋白的制备方法，包括如下步骤
第一步，构建rhDSL的重组表达质粒pQE30-hDSL;
第二步，以大肠杆菌DH5d为宿主表达rhDSL重组蛋白；
第三步，采用Q S印harose阴离子交换层析与金属离子(Ni2+)亲和层析相 结合的纯化方法进行rhDSL重组蛋白的纯化，得到高纯度(纯度>9 9%)低内毒 素含量的rhDSL重组蛋白。
所述构建rhDSL的重组表达质粒pQE30-hDSL,是指以重组质粒pGEX-2T/hDSL (林小娟等，现代生物医学进展，2008， 8 (4): 612)为模板，PCR的方法扩增 hDSL基因片段，包括进化中的保守结构区DSL和与之相邻的N-端的50个氨基酸， 共99个氨基酸，共298bp。割胶回收后的PCR目的产物和原核表达质粒pQE30 (含 6XHis标签)经限制性内切酶Hindm、 BamH I双酶切。连接割胶回收后的酶切 产物，并将连接产物转化到预先制备的DH5ci感受态细胞中，挑选阳性克隆，经
5测序证实无突变且读框正确。(以上为常规技术和条件，可以重复实施)
所述以大肠杆菌DH5(i为宿主表达rhDSL重组蛋白，是指挑取pQE30-hDSL 质粒的DH5a的单菌落，25~30 mL LB培养基(含100ixg/mL Amp)， 37。C振荡 培养过夜；次日将过夜菌液按2呢的接种量转接到1L 2L的LB培养基(含 100ug/mL Amp)内，转接后37。C培养2. 5 3. Oh左右，待00600=0. 6 0. 8的时 候停止培养，加入IPTG至终浓度为lmM，诱导表达4h,收集菌体。Western-blot 鉴定所表达蛋白为rhDSL重组蛋白。
所述rhDSL重组蛋白的纯化，是指收集的菌体经超声裂解和溶菌酶裂解细 菌后，高速离心，收集沉淀包涵体(表达产物以包涵体形式存在)。包涵体经8M 尿素变性后，用稀释法缓慢复性。取复性后的上清液经Q S印harose阴离子交换 层析，得到初步纯化的rhDSL重组蛋白。将阴离子交换层析后所得蛋白溶液进一 步通过金属离子(Ni2+)亲和层析并透析，得到高纯度(纯度〉99%)低内毒素 含量(鲎试剂测定内毒素含量为O. 117 EU/ug)的rhDSL重组蛋白。
本发明在构建rhDSL的原核表达载体pQE30-hDSL基础上，以大肠杆菌DH5 a 为宿主表达了 rhDSL并采用Q S印harose阴离子交换层析与金属离子(Ni2+) 亲和层析相结合的方法，纯化出高纯度(纯度>99%)、低内毒素含量的rhDSL重 组蛋白。rhDSL是一种新的结构简单、分子量较小的Notch配体衍生多肽。
本发明制备的rhDSL重组蛋白衍生自Notch配体Delta-like-1，可通过与 细胞表面的Notch受体相结合，激活Notch信号传导通路，从而应用于与Notch 信号通路活化相关领域的研究。研究表明，C2成肌细胞可以表达包括Notch-1， Notch-2， Notch-3在内的至少三种Notch受体(Jarriault S, Mol Cell Biol. 1998，18(12)7423~7431)。本发明用纯化后的rhDSL培养C2成肌细胞，17h后, 收集C2成肌细胞，以RT-PCR的方法检测Notch信号下游靶基因Hes-1表达水-平。结果发现，Hes-l表达水平提高，说明rhDSL重组蛋白活化了 Notch信号传 导通路。


图1为本发明实施例中重组表达质粒pQE30-hDSL图谱；
其中下划线部分为引物。反向引物中包含终止密码子"TM"。
图2为本发明实施例中rhDSL重组蛋白的表达与包涵体的分离示意图；其中
(A) rhDSL在大肠杆菌DH5 a内的表达。M:蛋白标志物；1， 2:未诱导的菌
体；3， 4: IPTG诱导4h的菌体；5:超声离心后的上清；6:超声离心后的沉淀。
(B) rhDSL重组蛋白的western-blot检测(anti-6XHis antibody)。 M:蛋 白标志物；1:未经诱导的菌体；2: IPTG诱导4h的菌体。
图3为本发明实施例中rhDSL重组蛋白的纯化示意其中-
(A) Q S印harose FF阴离子交换纯化rhDSL。
M:蛋白标志物；1:洗脱液；
(B) 离子交换层析后rhDSL的亲和纯化M:蛋白标志物；1:洗脱液；
(C) 阴离子交换层析与亲和层析纯化后蛋白的银染检测M:蛋白标志物；1:
纯化后的rhDSL。
图4为本发明实施例中以rhDSL重组蛋白培养C2成肌细胞的结果示意图； 其中经rhDSL培养17 h后，C2成肌细胞内Hes-1表达水平的RT-PCR检
测(以看家基因GAPDH为对照)。1:经rhDSL培养的C2成肌细胞；2:未经rhDSL
培养的C2成肌细胞。
具体实施例方式
下面结合附图对本发明的实施例作详细说明本实施例在以本发明技术方
案为前提下进行实施，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，但本发明的
保护范围不限于下述的实施例。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通
常按照试验手册或者常规条件，所用的试剂均可以在市场上购买。 设备和试剂
质粒
1)原核表达载体pQE30， Qiagene 酶和化学试剂
1) 限制性内切酶BamHI、Hindm， 10XBuffer (酶切)，T4DNA连接酶，10XT4 DNA Ligase Buffer, Ferments公司产品
2) 10XPCR Buffer, Mg2+ (25mM), dNTP (2mM)， Tag DNA聚合酶，上海生 工生物工程技术服务有限公司产品
3) NaCl，冰乙酸，EDTA，国药集团化学试剂有限公司产品
4) 蛋白胨，酵母膏，琼脂粉，琼脂糖，OXOID公司产品
75) 引物合成和序列测序由上海生工生物工程技术服务有限公司完成
6) 试剂盒华舜小量PCR产物纯化试剂盒；天为时代琼脂糖凝胶DNA回收 试剂盒；V-gene日常型质粒DNA小量快速制备试剂盒；
7) KH2P04，上海试剂四厂产品
8) Na2HP04 12H20，博大泰克产品
9) EDTA-Na2，上海美季生物技术有限公司产品
10) TritonX-100，甘氨酸，上海思吉生物制品有限公司产品
11) IPTG，丙烯酰胺，甲叉双丙烯酰胺，APS， TEMED， DTT， BSA，上海生工 生物工程技术服务有限公司产品
12) Tris碱，PMSF (苯甲基氟磺酰)，溶菌酶，考马斯亮蓝G-250,考马斯 亮蓝R-250，尿素，Amp，北京鼎国生物技术有限公司产品
13) 咪唑，中国医药(集团)上海化学试剂公司产品产品
14) 蛋白标志物北京莱博生物实验材料研究所，TIANGEN公司产品
15) NiS04 6H20，中国同济微量元素研究所产品
16) DAB， TIANGEN公司产品
17) Q Sepharose Fast Flow, Amersham产品
18) HIS—Select Nickel Affinity Gel， Sigma产品
实验仪器
1) 蛋白纯化分析仪(AKTA PURIFIER-10)， pharmacia公司产品
2) 超声波细胞粉碎仪(Sonipr印150)，三洋公司产品
3) 核酸蛋白电泳仪(Power pac Basic), Bio-Rad公司产品
4) 凝胶图像处理系统(TanonGIS-2008)，上海天能科技有限公司
溶液配制
1) LB液体培养基
称取胰蛋白胨10g (10%，W/V)，酵母提取物5g (5%，W/V)， NaCl 10g (10%, W/V)，加双蒸水800mL溶解，用5mol/L NaOH调至pH7. 4，定容至lOOOmL， 转移至三角烧瓶中，以12rC髙压灭菌20min。
8实施例1重组表达质粒pQE30-hDSL的构建
以克隆质粒pGEX-2T/hDSL为模板，通过PCR方法扩增目的片段hDSL (包括 进化中的保守结构区DSL和与之相邻的N-端的50个氨基酸，共99个氨基酸)。 PCR反应引物如下
Sense (27 mer): 5， - CG GGATCC CTC CAC ACA GAT TCT CCT G -3， Antisense (30 mer) : 5' - CG AAGCTT TTA GAT CGG CTC TGT GCA GTA G —3 sense端酶切位点为BamHI， antisense端酶切位点为HindIE (引物序列中 下划线部分为酶切位点)。 反应条件
1. 94。C 5min
2. 94。C 45sec
3. 55。C 45sec
4. 72'C lmin
5. Go To 2, 26 Cycles
6. 72 。C lOmin 扩增产物经琼脂糖凝胶电泳鉴定，条带大小为与理论相符。将质粒pQE30(含
6XHis标签)和目的片段经限制性内切酶Hindin、 BamH I双酶切，割胶回收， 经T4 DNA连接酶16'C连接过夜，构建原核表达质粒pQE30-hDSL。连接产物转 化大肠杆菌DH5a，挑选阳性克隆，经质粒提取、酶切鉴定后测序。重组表达质 粒pQE30-hDSL的示意图见图1。经Hindm、 BamH I双酶切的质粒pQE30及目的 片段经连接酶连接后构建出原核表达质粒pQE30-hDSL。其中质粒pQE30含 6XHis标签，目的片段下划线部分为引物。反向引物中包含终止密码子"TM"。 重组表达质粒pQE30-hDSL图谱见图1。
实施例2 rhDSL重组蛋白的表达与包涵体的分离
1) 挑取平板上的单菌落接种至25~30 mL LB培养基(含100u g/mL Amp)， 37'C振荡培养过夜；
2) 次日将过夜菌液按2%的接种量转接到1L 2L的LB培养基(含100 u g/mL Amp)内，转接后37'C培养2. 5 3. 0h左右，待OD600=0. 6 0. 8的时候停止培3) 在该1L菌液内加500 mM IPTG 2mL，使IPTG终浓度达到lmM，之后 37'C培养4小时(每瓶取l mL菌液，收集菌体作为对照)；Western Blot免疫
印迹法检测目标蛋白的表达(一抗兔抗6Xhis Tag多克隆抗体；二抗山
羊抗兔IgG)
4) 用250mL的大离心管收集菌体，室温离心5000 rpmX20 min，收集菌体；
5) 用30 mL预冷IXPBS洗涤菌体先将菌体用PBS充分悬浮，之后将菌 液合并至1个50 mL灭菌离心管内，10000 rpmX3 min离心，再收集菌体；
6) 将洗涤后的菌体用30 mL预冷Sonicate buffer(PBS， 1 mM EDTA, 5 mM DTT， 0.1 mM PMSF， pH 7. 3)重悬；
7) 超声破菌中等程度超声，每次超声30 sec、停30 sec，共20次；
8) 4。C高速离心，15000 rpmX20 min;
9) 用15 mL预冷1XPBS重悬超声并离心后的沉淀；
10) 加150uL溶菌酶(10 mg/mL)，置于冰上20 min，偶尔搅拌混合一下；
11) 37。C温育10 min;
12) 取一洁净50 mL离心管，空管称重，把加毕溶菌酶的1XPBS (pH=8.5) 悬浮液移到该管内，4'C高速离心10000 rpmX5 min;
13) 离心后去上清，尽量沥干将沥干上清后的离心管称重，根据空管的重量 计算出沉淀重量；
14) 每g沉淀用18 mL Pellet Wash Buffer (PBS, 1% Triton X-100， 10 mM EDTA， 50 mM NaCl, pH 7. 3)重悬(加1/1000的100 mM PMSF)，充分悬浮，离 心10000 rpmX5 min，去上清；
15) 重复步骤15， 2次；
16) 将上清沥干，再次称重，计算此时的沉淀重量。
如图2所示，(A)泳道1-4为pQE30-hDSL/DH5 a经IPTG诱导前后，所表达 蛋白的变化状况，由图可见经IPTG诱导后，在15KD处出现一表达量明显增加 的蛋白。泳道5-6为包涵体分离的结果。将IPTG诱导4h的pQE30-hDSL/DH5 a 收集，超声离心后分别取上清进行SDS-PAGE分析，结果表明rhDSL重组蛋白主 要以包涵体的形式存在。(B)为rhDSL重组蛋白的western-blot检测。以
10anti-6XHis antibody为一抗，进行western-blot检测，结果表明所表达蛋白 为目标产物rhDSL重组蛋白。
实施例3 rhDSL重组蛋白的纯化
1) 蛋白的变性
(1) 每g包涵体沉淀加9 mL Buffer/ Urea (8 M urea, 50 mM Tris—HC1， 1 mM EDTA, 50 mM NaCl， 0. 1 mM PMSF， pH 8. 5)重悬；
(2) 置于摇床上缓慢振摇1小时(室温)；
(3) 4。C高速离心10000 rpmX15 min。
2) 蛋白的复性
(1) 小心把上清转移至一洁净的离心管(50 mL或15 mL离心管)中；
(2) 用流动泵将上清缓慢加入到10倍于Buffer/Urea体积的Alkaline Buffer A (50 mM NaH2P04， 0.1 mM PMSF, pH 10. 7)内，要持续检测溶液的pH 值(稀释过程中pH值会变小)，使之维持稀释以前的pH 10.7溶液pH值，边加 边搅拌；
(3) 按照l:l的比例，用流动泵加稀释液(20 mM Tris-HCl， 0.1 mM PMSF, pH 8.0)到步骤(2)得到的溶液内稀释(稀释完毕后尿素浓度为0.36 M)。
3) Q S印harose FF阴离子交换层析对hDSL重组蛋白的纯化
(1) 将复性后的溶液调节至pH9.0，并调节样品中NaCl浓度为20mM/L;
(2) 将变性-复性后的蛋白溶液小心封好，4'C静置过夜，待过柱纯化；
(3) 次日将4。C静置的蛋白溶液离心18000 rpmX30 min，收集上清；
(4) Q S印harose FF柱先用ddH20清洗4个柱体积；
(5) Wash Buffe (20 mM Tris-HCl, pH 9. 1)平衡4个柱体积；
(6) 将步骤(2)得到的上清上柱；
(7) Wash Buffer C洗涤2个柱体积；
(8) 洗涤完毕，用elution buffer (20 mM Tris-HCl, 1 M NaCl， pH 9. 1) 梯度洗脱蛋白；(9) 每4mL收集一管，峰值蛋白每2mL收集一管，直至将蛋白峰收集完毕;
(10) Bradford法检测蛋白浓度；
(U)根据蛋白浓度测定结果，用SDS-PAGE凝胶电泳检纯化结果。
4)亲和层析分离纯化hDSL蛋白
(1) 将离子交换层析纯化得到的各管蛋白混合；
(2) 每10mL蛋白溶液加入1. 43mL 8 XHis-Tag咪唑补充液(0. 4 M imidazole, 20 mM Tris， pH 8. 5),使蛋白样品中咪唑的终浓度为50rnM，并调节溶液pH为 8.5;
(3) 4'C高速离心10000 rpmX15 min，收集上清；
(4) 取10mL无菌针筒一只，将其倒置并垂直固定于支架上；
(5) 剪切两块与针筒内径大小一致的滤纸膜，将其重叠至于针筒底部；
(6) 取5mL His-Select Nickel Affinity Gel介质置于针筒内部；
(7) 用ddH20清洗4个柱体积；
(8) 用lXHis-Tag Charge Buffer (0.4M NiS04)平衡4个柱体积，使介 质镍合；
(9) 用lXHis-Tag Binding Buffer (0. 05 M imidazole, 0. 5 M NaCl, 20 mM Tri s， pH 8. 5)平衡4个柱体积；
(10) 将步骤(3)得到的上清上柱；
(11) 1 XHis-Tag Binding Buffer洗涤2个柱体积；
(12) lXHis-Tag Wash Buffer (0. 06 M imidazole, 0. 5MNaCl， 20mMTris， pH 8.5)洗涤2个柱体积；
(13) 1 XHis-Tag Elution Buffer (0. 2 M imidazole, 0. 5MNaCl， 20mMTris， pH 8.5)洗脱目的蛋白，3个柱体积；
(14) 每lmL收集一管；
(15) Bradford法检测收集的蛋白浓度；根据蛋白浓度测定结果，用SDS-PAGE 凝胶电泳纯化结果，银染法检测蛋白纯度，显色基质鲎试剂测蛋白内毒素含量。 纯化的rhDSL蛋白的内毒素含量为0. 117EU/u g,可应用于相关的体内外研究。
如图3所示。(A)为Q S印harose FF阴离子交换纯化后的结果，可见纯化后的蛋白液中含有杂蛋白。(B)为离子交换层析后再经亲和纯化的结果，可见 rhDSL纯度较高，未见杂蛋白。(C)为阴离子交换层析与亲和层析纯化后蛋白的 银染检测，蛋白上样量为100 ng，未见杂带。因银染检测蛋白的灵敏度为0. 3 ng， 因此纯化后rhDSL重组蛋白的纯度〉99%。
实施例4 rhDSL重组蛋白对Notch信号传导通路的活化
(1) 1. 3 X106C2成肌细胞转接至10 cm培养皿中，于DMEM/10%FBS培养基中 贴壁培养24 h;
(2) 更换培养基，加入纯化的rhDSL重组蛋白，使其终浓度为1.5 u g/ml;
(3) 17 h后，收集细胞，Trizol抽提总RNA;
(4) 取2ug总RNA逆转录合成cDNA;
(5) 以cDNA为模板，PCR反应扩增目的基因Hes-1及对照的看家基因GAPDH， 引物为
Hes-l:
forward primer, 5' -GM AGA TAG CTC CCG GCAT-3'; reverse primer, 5' -GTC ACC TCG TTC ATG CAC T-3'. GAPDH:
forward primer, 5' -GGG CTC ATG ACC ACA GTC-3'; reverse primer, 5' -GTT CAG CTC TGG GAT GAC-3'.
(6) 琼脂糖凝胶电泳检测目的条带的含量。
如图4所示。经rhDSL重组蛋白培养后的C2成肌细胞，其Notch信号下游 靶基因Hes-1的表达量增高，说明rhDSL重组蛋白活化了 Notch信号传导通路。
13本发明涉及的rhDSL序列及记号分列如下:<110>上海交通大学<120> rhDSL重组蛋白及其制备方法<210> 1<211> 105<212> PRT<213>人(Ho迈o sp. <400> 1His His His His His His Leu His Thr Asp Ser Pro Asp510Ala Thr Glu Asn Pro Glu Arg Leu lie Ser Arg Leu Ala2025Arg His Leu Thr Val Gly Glu Glu Trp Ser Gin Asp Leu3540Ser Gly Arg Thr Asp Leu Lys Tyr Ser Tyr Arg Phe Val5055Glu His Tyr Tyr Gly Glu Gly Cys Ser Val Phe Cys Arg6570Asp Asp Ala Phe Gly His Phe Thr Cys Gly Glu Arg Gly8085Val Cys Asn Pro Gly Trp Lys Gly Pro Tyi: Cys Thr Glu95100Asp Leu15 Thr Gin30 His Ser45 Cys Asp60 Pi:o Arg75 Glu Lys90 Pro lie1051权利要求
1、一种rhDSL重组蛋白，其特征在于为含有6×His组氨酸标签的Notch配体Delta-like-1的衍生多肽，所述衍生多肽由含有进化中的保守结构区DSL和与之相邻的N-端的50个氨基酸构成，共99个氨基酸，其氨基酸序列为LHTDSPDDLATENPERLISRLATQRHLTVGEEWSQDLHSSGRTDLKYSYRFVCDEHYYGEGCSVFCRPRDDAFGHFTCGERGEKVCNPGWKGPYCTEPI。
2、 根据权利要求l所述的rhDSL重组蛋白，其特征是，所述rhDSL重组蛋 白，以pQE30为表达载体构建表达质粒pQE30-hDSL。
3、 根据权利要求l或2所述的rhDSL重组蛋白，其特征是，所述rhDSL重 组蛋白，以大肠杆菌DH5ci为载体进行重组蛋白的表达。
4、 根据权利要求1或2所述的rhDSL重组蛋白，其特征是，所述rhDSL重 组蛋白，在大肠杆菌中表达后以包涵体形式存在。
5、 一种如权利要求l所述的rhDSL重组蛋白的制备方法，其特征在于，包 括如下步骤第一步，构建rhDSL的重组表达质粒pQE30-hDSL; 第二步，以大肠杆菌DH5a为宿主表达rhDSL重组蛋白； 第三步，采用Q S印harose阴离子交换层析与金属离子附2+亲和层析相结合 的纯化方法进行rhDSL重组蛋白的纯化，得到rhDSL重组蛋白。
6、 如权利要求5所述的rhDSL重组蛋白的制备方法，其特征是，所述构建rhDSL 的重组表达质粒pQE30-hDSL，是指以重组质粒pGEX-2T/hDSL为模板，PCR的方 法扩增hDSL基因片段，包括进化中的保守结构区DSL和与之相邻的N-端的50个氨 基酸，共99个氨基酸，共298bp;割胶回收后的PCR目的产物和原核表达质粒pQE30 经限制性内切酶Hindm、 BamH I双酶切，连接割胶回收后的酶切产物，并将连 接产物转化到预先制备的DH5ci感受态细胞中，挑选阳性克隆，经测序证实无突 变且读框正确。
7、 如权利要求6所述的rhDSL重组蛋白的制备方法，其特征是，所述原核表 达质粒pQE30含6 X Hi s标签。
8、 如权利要求5所述的rhDSL重组蛋白的制备方法，其特征是，所述以大肠杆菌DH5a为宿主表达rhDSL重组蛋白，是指挑取pQE30-hDSL质粒的DH5 a的单 菌落，25~30 mL LB培养基37'C振荡培养过夜，次日将过夜菌液按2%的接种量 转接到1L 2L的LB培养基内，转接后37'C培养2.5 3.0h左右，待00600=0. 6 0.8的时候停止培养，加入IPTG至终浓度为O. 1 mmol/L，诱导表达4 h，收集菌 体。
9、 如权利要求8所述的rhDSL重组蛋白的制备方法，其特征是，所述LB培养 基含100w g/mL Amp。
10、 如权利要求5所述的rhDSL重组蛋白的制备方法，其特征是，所述rhDSL 重组蛋白的纯化，是指收集的菌体经超声裂解和溶菌酶裂解细菌后，离心， 收集沉淀包涵体，包涵体经8M尿素变性后，用稀释法缓慢复性，取复性后的上 清液经Q S印harose阴离子交换层析，得到初步纯化的rhDSL重组蛋白，将阴离子交换层析后所得蛋白溶液进一步通过金属离子Ni2+亲和层析并透析，得到rhDSL重组蛋白。
全文摘要
本发明公开一种生物工程技术领域的rhDSL重组蛋白及其制备方法，该rhDSL含有6×His标签的Notch配体Delta-like-1的衍生多肽，衍生多肽含有进化中的保守结构区DSL和与之相邻的N-端的50个氨基酸，氨基酸序列为LHTDSPDDLATENPERLISRLATQRHLTVGEEWSQDLHSSGRTDLKYSYRFVCDEHYYGEGCSVFCRPRDDAFGHFTCGERGEKVCNPGWKGPYCTEPI。本发明在构建rhDSL的原核表达载体pQE30-hDSL基础上，以大肠杆菌DH5α为宿主表达了rhDSL并采用Q Sepharose阴离子交换层析与金属离子Ni²⁺亲和层析相结合纯化出rhDSL重组蛋白。rhDSL是一种新的结构简单、分子量小的Notch配体衍生多肽。
文档编号C07K1/18GK101503470SQ20081020066
公开日2009年8月12日 申请日期2008年9月27日 优先权日2008年9月27日
发明者梅 赵, 伟 韩 申请人:上海交通大学