专利名称：：腺病毒载体禽流感重组疫苗的制作方法
技术领域：
：本发明属于生物
技术领域：
，更具体地，本发明涉及一种腺病毒载体禽流感重组疫苗。
背景技术：
：禽流感(AvianInfluenza,AI)是由A型流感病毒引起的禽类(家禽和野禽)的一种从呼吸系统到严重全身性败血症等的多种疾病综合症。该病被世界动物卫生组织(OIE)规定为A类传染病，也被中国列为一类动物疾病。自该病1878年在意大利的鸡群中首次暴发，其后在世界各地，包括北美、南美、北非、中东、远东、英国和前苏联等地都有暴发流行的报导，尤其是2003年底以来，H5N1亚型高致病性禽流感病毒引起的禽流感先后在亚洲的越南、泰国、韩国、日本、中国等国家的禽类中出现大面积流行，2004、2005年高致病性禽流感病毒H5N1发生更大面积扩散，发展蔓延到中东、欧洲、非洲地区20多个国家，已经造成30亿美元的直接经济损失，受到禽流感疫情的影响，造成了巨大损失。中国目前禽类年存栏量在140亿只，一旦禽流感大流行，将给中国造成高达870亿美元的经济损失。在某次暴发流行中，在越南和泰国再次出现H5N1禽流感病毒(AIV)直接感染人并导致几十人死亡，引起了世界各国的高度重视，如果禽流感病毒突破禽人的种属障碍直接由禽类传染给人，将造成非常严重的后果。因此预防禽流感意义非常重大。目前预防高致病性禽流感H5N1的疫苗主要有以下几种灭活疫苗，国际上多采用弱毒禽流感H5N2病毒株作为疫苗毒株，而中国目前采用的是反向遗传技术的H5N1重组株作为疫苗株；弱毒活疫苗，中国采用的是新城疫禽流感重组二价苗。由于所有的灭活疫苗无论是使用弱毒禽流感H5N2作为疫苗株，还是利用重组的H5N1作为疫苗株，生产过程都需要繁殖活病毒，客观上存在散毒的可能性；弱毒新城疫禽流感重组二价苗在实际应用中受到免疫程序的限制，推广应用遇到一定的困难。综上，本领域还需要进一步研制免疫效果良好，安全可靠，且制备和使用方便、易于推广应用的禽流感疫苗。
发明内容本发明的目的在于提供一种具有良好的免疫效果、安全可靠的腺病毒载体禽流感重组疫苗。在本发明的第一方面，提供一种分离的融合蛋白，所述的融合蛋白具有(a)禽流感血凝素抗原(HA)序列；(b)热休克蛋白70(Hsp70)序列；和(c)位于(a)和(b)之间的由0-20个(较佳地0-10个；更佳地0-5个)氨基酸构成的连接肽。在另一优选例中，(a)和(b)之间是由3个氨基酸(IleLysLeu)构成的连接肽。在另一优选例中，所述的融合蛋白序列中，所述的禽流感血凝素抗原序列位于氨基端，所述的热休克蛋白70序列位于羧基端。在另一优选例中，所述的禽流感血凝素抗原(HA)具有SEQIDNO:2所示的氨基酸序列中第3-571位的序列；或所述的热休克蛋白70具有SEQIDNO:2中第575-l175位所示的氨基酸序列(即与全长Hsp70相比，在羧基端缺失24个氨基酸)。在另一优选例中，所述的融合蛋白基本上由(a)、(c)、(b)相连接而构成。更佳地，所述的融合蛋白由(a)、(c)、(b)相连接而构成。在本发明的第二方面，提供一种分离的核酸分子，所述的核酸分子编码所述的融合蛋白。在另一优选例中，所述的核酸分子具有SEQIDNO:1所示的核苷酸序列。在本发明的第三方面，提供一种重组腺病毒载体，所述的重组腺病毒载体中含有所述的核酸分子。在另一优选例中，所述的核酸分子可操作性地连接于重组腺病毒载体中启动子(如CMV启动子)区域的下游。在另一优选例中，所述的重组腺病毒载体的骨架质粒是复制缺陷型腺病毒载体。在另一优选例中，所述的腺病毒载体是Ad-Easy系列载体(例如Ad-Easyl、Ad-Easy2、pAd/CMV/V5-DEST)。在本发明的第四方面，提供一种由所述的重组腺病毒载体包装获得的重组腺病毒。在另一优选例中，所述的重组腺病毒是复制缺陷型重组腺病毒。在另一优选例中，所述的重组腺病毒载体经转染宿主细胞、在宿主细胞中包装获得的所述的重组腺病毒。在另一优选例中，所述的宿主细胞是293细胞。在另一优选例中，提供所述的重组腺病毒载体的用途，用于制备预防禽流感的药物组合物。在本发明的第四方面，提供一种预防禽流感的药物组合物，所述的药物组合物含有有效量的所述的重组腺病毒；和药学上可接受的载体。在本发明的第四方面，提供一种预防禽流感的药盒，所述的药盒中含有所述的组合物，或所述的重组腺病毒。本发明的其它方面由于本文的公开内容，对本领域的技术人员而言是显而易见的。图l.重组腺病毒中HA基因的鉴定。其中，泳道M:DNAMarker;泳道l:293细胞PCR扩增产物；泳道2:rAd-GFPPCR扩增产物；泳道3:rAd-HAhsp70PCR扩增产物；泳道4:rAd-HAPCR扩增产物。图2.重组腺病毒中HA蛋白的表达鉴定。其中，泳道M:分子量标准；泳道1:293细胞表达蛋白；泳道2:rAd-HAhsp70表达重组蛋白；泳道3:rAd-GFP表达重组蛋白。图3.不同疫苗免疫动物后的抗体表达。图4.疫苗免疫动物后的抗体曲线。具体实施例方式本发明人经过广泛的研究，以高致病性禽流感H5N1的血凝素抗原基因(HA)为主要的保护性抗原基因，并将该基因与热休克蛋白(Heatshockprotein,Hsp)编码基因融合，此融合基因在被转入到腺病毒载体获得重组腺病毒并给予动物后，可在动物体内表达HA与Hsp70的融合蛋白，产生高效价的抗HA抗体，且能够在动物体内长期(大于300天)保持高的抗体效价。如本文所用，"分离的"是指物质从其原始环境中分离出来(如果是天然的物质，原始环境即是天然环境)。如活体细胞内的天然状态下的多聚核苷酸和多肽是没有分离纯化的，但同样的多聚核苷酸或多肽如从天然状态中同存在的其他物质中分开，则为分离纯化的。如本文所用，"本发明的融合基因"、"HAhsp70"、"HAhsp"等可互换使用，都指由HA和Hsp70融合而成的基因，其中在HA和Hsp70之间可以有或者没有连接序列。如本文所用，"操作性相连"或"可操作地连于"指这样一种状况，即线性DNA序列的某些部分能够影响同一线性DNA序列其它部分的活性。例如，如果启动子控制以编码序列的转录，那么它就是可操作地连于编码序列。如本文所用，所述的"含有"，"具有"或"包括"包括了"包含"、"主要由......构成"、"基本上由......构成"、和"由......构成"；"主要由......构成"、"基本上由......构成"和"由......构成"属于"含有"，"具有"或"包括"的下位概念。融合基因本发明人研究发现，单纯以HA基因来制备疫苗，只能发挥局限性的作用，诱导产生的抗体效价不够高。经过反复研究比较，本发明人意外地发现同时利用HA与Hsp70建立融合基因，克隆入腺病毒载体并制备重组腺病毒后，该重组腺病毒在体内可稳定地表达融合蛋白，诱导产生高效价的抗体，且可长期保持高的抗体效价。也即由于热休克蛋白的介入，增强HA抗原的免疫原性并大大延长了抗原刺激动物体产生抗体的时间。因此，本发明提供一种融合蛋白，该蛋白包含禽流感H5N1的HA抗原和Hsp70，该分子在动物体(特别是禽类)内被表达后，能够在体内诱导抗HA的抗体产生。HA蛋白是来源于H5N1流感病毒的蛋白。H5N1流感病毒的染色体基因组是由分子量不同的8个单链RNA片段组成，每个片段分别转录和复制不同的蛋白质。该病毒颗粒呈球形、杆状或长丝状，为多形性，其直径约80-120nm，表面有一层棒状和蘑菇状的纤突(Spike)，对红细胞有凝集性，称血凝素(HA)。单一的HA蛋白没有任何病毒活性，不会导致动物感染或发病，但可以诱导动物机体产生良好的免疫反应。本发明中，除了在末端将终止密码子修改为非终止的密码子以实现与Hsp70融合表达外，所述的HA蛋白采用全长序列的HA蛋白，从而完整地保留该蛋白的抗原性。作为本发明的优选方式，所述的HA蛋白具有SEQIDN0:2所示的氨基酸序列中第3-571位的序列。Hsp70来源于热休克蛋白家族，较佳地其是分枝结核杆菌热休克蛋白。Hsp70蛋白是免疫原较强的细胞内抗原，不仅能诱导特异性Thl型细胞反应，还可直接参与和促进抗原的提呈与识别，参与信号传递。Hsp70作为载体分子，具有明显的佐剂效应，参与特异性和非特异性免疫，尤其是能提高抗原特异性CD8+T细胞反应的快速性和持久性，亦可激活NK细胞，从而进一步增强免疫效果。作为本发明的优选方式，所述的Hsp70蛋白是C末端缺少了24个氨基酸的Hsp70蛋白，本发明人经过反复试验发现，相对于全长形式的Hsp70蛋白，在C末端缺失若干氨基酸后，不仅更有利于融合蛋白的表达，更重要的是，还有利于充分发挥和显著强化Hsp70基因的分子佐剂的作用较佳地，所述Hsp70具有SEQIDNO:2中第575-l175位所示的氨基酸序列。所述的HA抗原、Hsp70之间可以直接相连接，或者通过多肽连接子(连接肽)连接。所述的连接子例如包括0-20个氨基酸；较佳地为0-10个氨基酸；更佳地为0-5个氨基酸。本发明还提供了编码所述的融合蛋白的分离的核酸(即融合基因)，也可以是其互补链。任何编码所述的融合蛋白的核酸都适用于本发明，碱基密码子的简并性是本领域人员所了解的。下文实例中提及的序列都适用于本发明的方法。编码HA抗原的核酸中，将终止密码子修改为非终止密码子，以实现HA抗原与Hsp70融合表达，例如由终止密码子TGA突变成为TCT。优选地，所述的融合基因中，编码HA抗原的核酸具有SEQIDNO:1中第7-1713位所示的核苷酸序列。优选地，编码Hsp70的核酸具有SEQIDNO:1中第1723-3528位所示的核苷酸序列。本发明融合蛋白的编码序列，可以全序列人工合成，也可用PCR扩增的方法分别获得编码HA抗原和Hsp70的DNA序列，然后将其拼接起来，形成编码本发明融合蛋白的DNA序列；或者可采用例如重叠PCR的方式合成。重组腺病毒本发明提供了一种重组腺病毒载体，所述的载体含有本发明所述的融合基因序列。所述的核酸分子可操作性地连接于重组腺病毒载体中启动子区域的下游。腺病毒载体是在腺病毒的基础上经过人工改造而得到的具有良好携带表达外源基因能力的病毒载体。本领域人员一般都清楚如何制备或选择适合的腺病毒载体。腺病毒的基因组长约36kb，可分为编码区和非编码区，编码区又可分为早期转录区和晚期转录区两种，前者有E1、E2、E3、E4四个区，编码病毒的调节蛋白，后者有L1、L2、L3、L4、L5五个区，编码病毒的结构蛋白；非编码区含有病毒进行复制和包装等功能所必需的顺式作用元件。除E3区外，其余的编码区及顺式作用元件均为病毒复制所必需。腺病毒衣壳(capsid)呈规则的20面体结构，直径约80-I10nm。第1代腺病毒载体是由去除腺病毒基因组的El和P或E3两个区而获得，其复制必须在由5型腺病毒转化的可组成性表达E1蛋白的宿主细胞(如293细胞)中完成，其主要优点为在体外有很高的繁殖滴度(10H10"PFU/ml);易感的宿主细胞范围广，既能感染增殖细胞，又能感染非增殖细胞；病毒基因组存在于细胞染色体外，避免了因整合引起的细胞突变，该种腺病毒载体带有部分腺病毒的结构蛋白，可以激发宿主针对腺病毒的细胞和体液免疫，可以提高免疫动物的基础免疫水平，使该载体在重组疫苗的用上具有明显的优势。本发明人的研究表明，腺病毒载体在禽流感疫苗的应用中表现出很好的应用前景。腺病毒载体因为可以很好地诱导机体的免疫应答，从而为携带基因的免疫奠定较高的非特异性免疫基础，这是某些病毒载体所不具备的。正因如此，腺病毒载体是一个重组疫苗的理想载体。另外，目前应用的鸡胚培养禽流感全病毒疫苗采用鸡胚培养，周期长、安全性差、原材料受限、占用厂区大等明显弱点，腺病毒载体禽流感疫苗完全可以避免了上述缺点，在疫苗的产业化上具有极大的优势。而腺病毒自身毒力较弱，并且缺失了复制基因，安全性非常好。同时由于腺病毒本身的免疫原性好，可以作为一种天然的免疫佐剂，起到免疫促进作用。多种腺病毒骨架质粒都可用于构建本发明的重组腺病毒载体，较佳地，所述的腺病毒载体的骨架质粒是复制缺陷型的，例如可以采用Ad-Easyl、Ad-Easy2、pAd/CMV/V5-DEST类的腺病毒骨架质粒，所述的骨架质粒可以通过商购的方式方便地获得。作为本发明的优选实例，所述的腺病毒载体的骨架质粒是Ad-Easyl。重组腺病毒的大量制备以及纯化是本领域人员已知的技术。在构建了所述的重组腺病毒载体后，可将其转入宿主细胞中，从而大量地生产重组腺病毒。优选地，可通过磷酸钙法转染将质粒DNA转入293细胞中，完成重组腺病毒的生产后，再经过高速离心方法纯化，得到高纯度的携带所述融合基因的重组腺病毒，作为疫苗使用。293细胞可以适应悬浮培养，从而可使病毒大量扩增。293细胞可在规模生产的生物反应器(如120L体积)中表达重组蛋白。本发明还提供了所述的重组腺病毒疫苗的用途，用于制备预防禽流感的药物组合物。本发明的重组腺病毒疫苗可以用于任何禽流感宿主，包括但不限于禽类(如鸡、鸭、鹅等)、哺乳动物。由于该疫苗具有安全性高、保护性好的优点，可以完全取代目前用鸡胚生产的全病毒灭活疫苗。由于腺病毒的宿主广泛，对哺乳动物有较好地感染性，所以该产品在猪等动物上同样有好的应用效果；最为重要的是，如果禽流感病毒突破宿主屏障而在人群大流行，该产品也是预防人感染禽流感的主要选择之一。本发明的重组腺病毒疫苗可刺激机体免疫反应，它与灭活疫苗等蛋白疫苗产品相比，具有以下非常显著的特点无感染危险、诱发针对天然蛋白质表位的抗体、诱发特异性细胞毒T细胞免疫反应、长期持续的免疫反应、稳定性不受温度影响、纯化容易，生产成本低。药物组合物本发明还提供一种防治禽流感的组合物，所述组合物是指将本发明的重组腺病毒和药学上可接受的载体混合后获得的可用于防治(特别是预防)禽流感的组合物。所述"有效量"是指可对人和/或动物产生功能或活性的且可被人和/或动物所接受的量。所述"药学上可接受的载体"指用于治疗剂给药的载体，包括各种赋形剂和稀释剂。该术语指这样一些药剂载体它们本身并不是必要的活性成分，且施用后没有过分的毒性。合适的载体是本领域普通技术人员所熟知的。在组合物中药学上可接受的载体可含有液体，如水、盐水、缓冲液。另外，这些载体中还可能存在辅助性的物质，如填充剂、润滑剂、助流剂、润湿剂或乳化剂、pH缓冲物质等。所述的载体中还可以含有细胞转染试剂。对于疫苗，所述的药学上可接受的载体例如可包括佐剂。在用于给药时，活性成分(重组腺病毒)通常在ixioMxio^病毒颗粒(vp)/kg动物体重，较佳地在5X10、5X10"病毒颗粒(vp)/kg动物体重。例如，当用于21-35日龄的鸡时，5X107—5X10"病毒颗粒(vp)/只鸡，较佳的5X1()8病毒颗粒(vp)/只鸡是适合的；优选的可进行多次给药，以产生良好的免疫效果，例如可间隔l-3周进行重复给药。在进行给药时，多种给药方式都是可用的。例如，所述的重组腺病毒或其组合物可以通过肌肉注射，皮内或皮下注射，胚内注射的方式给予；或者可进行滴鼻免疫。本发明还提供了一种防治禽流感的药盒，其中含有所述的组合物，或所述的重组载体。此外，为了方便给药，所述的药盒中还可含有注射用的针，和/或药学上可接受的载体，和/或使用说明书。本发明的主要优点在于本发明提供了一种仅一次注射、长期表达、免疫力高效持久具有坚强免疫效果的高致病性禽流感基因工程疫苗。该疫苗是在经过了反复筛选和优化组合的基础上获得的，其对H5N1禽流感有100%的预防保护作用，而且抗体水平可维持1年或更长时间。本发明人在构建融合基因的过程中，对融合基因的编码序列进行了优化，并选择性的去除了Hsp70的C端的部分编码序列，从而使得融合基因在制备成重组腺病毒疫苗后，在机体内能够良好地表达并且免疫效果更优异。经过本发明人的表达优化，加之使用腺病毒作为载体，构成了强大的免疫原，且可长期在动物体内表达而无毒副作用，具有广阔的应用前景。下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如Sambrook等人，分子克隆实验室指南(NewYork:ColdSpringHarborLaboratoryPress,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数按重量计算。实施例l.构建和生产编码整合hsp的HA抗原基因的重组腺病毒设计并合成(通过常规的PCR的方法获得HA和hsp基因，然后经过再克隆在载体中重组后形成)以下序列(SEQIDNO:1):tcaaatgtc卿aacatttacgacaaggtccgELCtacagcttagggataatgcaaaggagctgggtaatggttgtUcgagttctatcacaa其中，HA的起始位点(ATG)之前加了6个碱基GCCACC(Kazark序列)，从而有利于加强HA蛋白的表达。第7-1713位为HA全长序列，相对于HA天然序列，该序列中第1284位作了点突变由A突变成G，第1287位的C突变为T，从而改变酶切位点，但不改变相应的氨基酸序列；并且第1711-1713位的终止密码由TGA突变成为TCT。第1723-3528位为Hsp70的部分序列，相对于Hsp70天然序列，该序列缺少3'端的72个碱基，也即编码的Hsp70蛋白少了C端的24个氨基酸，从而有利于融合基因的表达和强化Hsp70基因分子佐剂的作用(本发明人发现缺失了尾端24个氨基酸的Hsp70有异乎寻常地增强免疫的效果)。该序列即为融合基因HAhsp70的序列。将上述融合基因序列克隆入穿梭质粒pShuttle-CMV(购自美国Stratagene公司)中位于CMV启动子下游的BglII/Xho1酶切位点内，获得携带融合基因的重组穿梭质粒。同时将HA编码基因全序列克隆入穿梭质粒pShuttle-CMV中位于CMV启动子下游的BglII/Xho1酶切位点内，获得携带HA基因的重组穿梭质粒。将上述构建的携带融合基因的重组穿梭质粒与腺病毒骨架质粒Ad-Easyl(购自美国Stratagene公司)共转入大肠杆菌BJ5183(购自Stratagene公司)中，在大肠杆菌中发生源重组，获得携带HAhsp70融合基因的腺病毒载体质粒，该质粒用特异pmel酶切后转染293细胞，用PCR鉴定得到阳性蚀斑，得到的重组腺病毒(rAd-HAhsp70)可以表达特异的血凝素抗原HA蛋白与hsp70的融合体，其中HAhsp70(不包括Kazark序列)位于重组腺病毒载体Ad-Easyl中970至4491位点)。同时，将携带HA基因的重组穿梭质粒与腺病毒骨架质粒Ad-Easyl(购自美国Stratagene公司)共转入大肠杆菌BJ5183中，在大肠杆菌中发生源重组，获得携带HA基因的腺病毒载体质粒(rAd-HA)，该质粒用特异Pacl酶切后转染293细胞，用PCR鉴定得到阳性蚀斑，得到的重组腺病毒(rAd-HA)可以表达特异的血凝素抗原HA蛋白，作为对照。实施例2.重组腺病毒中特异性目的HA基因的鉴定用重组的腺病毒rAd-HAhsp70或rAd-HA感染生长好的293细胞(购自ATCC)，待细胞出现典型、均一的病变后，收集细胞经处理后提取DNA,用特异性引物进行扩增，等到相应的片段，结果如图l所示。特异性引物如下HAF:5，-aaggatccgccaccatggagaaaatagtgct-3,(SEQIDNO:3);HAR:5'-gtcaagcttttaaatgcaaattctgcatt-3，(SEQIDNO:4)。其中，用于构建重组rAd-GFP的穿梭质粒pShuttle-IRES-hrGFP-1和骨架质粒Ad-Easyl都购自美国Stratagene公司，先用Pmel酶切穿梭质粒后与骨架质粒Ad-Easyl共转染大肠杆菌BJ5183中，获得携带GFP的腺病毒质粒，然后用Pacl酶切该质粒后转染293细胞，从而获得用于对照的rAd-GFP病毒。实施例3.Westernblot分析腺病毒介导的HAhsp70在293细胞中表达为了确定本发明人所构建的HAhsp70基因能否通过腺病毒载体在细胞内表达，将重组rAd-HAhsp70病毒颗粒感染293细胞。两天后提取细胞中的蛋白质，HAhsp70融合基因的表达通过Westernblot来分析，用于鉴定的抗体是鸡源多克隆抗体(购自哈尔滨兽医研究所)。结果如图2，H5N1HA(第2道)表达了相应的蛋白。实施例4.以编码HAhsp的重组腺病毒疫苗免疫动物的抗体表达将重组rAd-HAhsp70病毒、rAd-HA病毒和禽流感灭活疫苗(H5亚型Re-l，购自青岛易邦生物工程有限公司)、rAd-GFP分别免疫(用量为5"08病毒颗粒(vp)/只鸡)21日龄鸡，以293细胞裂解物免疫作为空白对照，分别在免疫后第7、14、21、28天采血和收集血清，采用常规的血凝抑制方法检测抗体效价。结果表明(见图3)，携带HA基因的腺病毒和禽流感灭活疫苗免疫组鸡都产生特异抗体，且在第14天rAd-HAhsp70、禽流感灭活疫苗(H5亚型Re-l)抗体产生水平均达到国家标准(6.0)，在第21天重组病毒免疫组鸡抗体水平达到峰值。rAd-HAhsp70组抗体水平比rAd-HA高，rAd-HAhsp70和禽流感灭活疫苗(H5亚型Re-l)产生的抗体水平基本相当。携带GFP的腺病毒rAd-GFP和293细胞空白对照组不产生特异性抗体。实施例5.重组腺病毒载体疫苗免疫SPF鸡的攻毒试验用21日龄SPF鸡做免疫保护试验，共5组每组20只鸡；分别是rAd-HAhsp70组、rAd-HA组、禽流感灭活疫苗(H5亚型Re-l)、rAd-GFP组和293细胞裂解物空白对照组。疫苗免疫鸡28天后，用高致病性禽流感分离株H5N1(由国家禽流感参考实验室提供)进行攻毒试验，按照国家标准观察记录结果，空白对照组和rAd-GFP组全部死亡，保护率为0%。其他疫苗组产生不同程度的免疫保护。对抗高致病性禽流感H5N1感染产生的免疫保护率rAd-HAhsp70组和禽流感灭活疫苗(H5亚型Re-l)组均达到100%,rAd-HA组为95%。如表1所示。表1不同疫苗免疫对鸡感染高致病性禽流感H5N1的免疫保护率<table>tableseeoriginaldocumentpage14</column></row><table>实施例6.重组腺病毒载体疫苗免疫SPF鸡后的抗体曲线将重组rAd-HAhsp70、rAd-HA和禽流感灭活疫苗(H5亚型Re-l)、rAd-GFP分别免疫21日龄鸡，每周采血和收集血清，常规的血凝抑制方法检测抗体效价，检验每组抗体曲线和持续时间。结果表明(图4)，两组重组病毒rAd-HAhsp70、rAd-HA免疫鸡均能持续维持较高特异性抗体水平，rAd-HAhsp70组鸡在免疫后300天的抗体产生水平仍然能达到国家标准(6.0)，而禽流感灭活疫苗(H5亚型Re-l)免疫组鸡的抗体水平在91天即降为5.2，且在203天后，不能检测到免疫鸡抗体的产生。rAd-HAhsp70免疫鸡组抗体效价在同一时间点均显著高于rAd-HA。实施例7.有无hsp基因的重组腺病毒表达HA抗原免疫动物的差异对比rAd-HAhsp70、rAd-HA两组的免疫效果，带有hsp70基因的融合基因HAhsp70在腺病毒载体的表现比仅HA单个基因有非常好明显的优势免疫动物后，抗体效价比后者显著更高；强毒攻毒试验结果rAd-HAhsp70组为100%，而rAd-HA组为95%;抗体峰值持续时间长。如表2所示。表2rAd-HAhsp70、rAd-HA两种重组疫苗的对比<table>tableseeoriginaldocumentpage15</column></row><table>实施例8.全长及缺失C端24个氨基酸的hsp70的分子佐剂效果差异为达到最好的免疫效果，对免疫分子佐剂hsp70的C端缺失了24个氨基酸(即在本发明中前述使用的rAd-HAhsp70，如实施例1所制备)，同时按照如实施例1中相似的操作方法将hsp70的全基因(全长序列参见GenBank登录号CP000717.1所示序列中第422915至424792位)按照完全相同的策略和步骤将全基因hsp70与HA相融合并克隆到腺病毒载体中，获得rAd-HAhsp70(全长)，然后免疫小鼠进行对比试验，发现缺失24个氨基酸的腺病毒免疫效果优于全基因hsp70。见表3。表3是否缺失C端24个氨基酸的hsp70的分子佐剂效果比较<table>tableseeoriginaldocumentpage16</column></row><table>在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。<formula>formulaseeoriginaldocumentpage17</formula>accgcgccggagatcagcgcccgcattctgatgaagctgaagcgcgacgccgaggcctac2040ctcggtgaggacattaccgacgcggttatcacgacgcccgcctacttcaatgacgcccag2100cgtcaggccacca邓gacgccggccagatcgccggcctcaacgtgctgcggatcgtcaac2160gagccgaccgcggccgcgctggcctacggcctcgacaagggcgag鄉gagcagcgaatc2220ctggtcttcgacttgggtggtggcactttcgacgtttccctgctggagatcggcgagggt2280gtggttgaggtccgtgccacttcgggtgacaaccacctcggcggcgacgactgggaccag2340cgggtcgtcgattggctggtggacaagttcaagggcaccagcggcatcgatctgaccaag2400gaca鄉tggcgatgc邓cggctgcggg犯gccgccgagaaggcaaagatcgagctgagt2460tcgagtcagtccacctcgatcaacctgccctacatcaccgtcgacgccgacaagaacccg2520ttgttcttagacgagcagctgacccgcgcggagttccaacggatcactcaggacctgctg2580gaccgcactcgcaagccgttccagtcggtgatcgctgacaccggcatttcggtgtcggag2640atcgatcacgttgtgctcgtgggtggttcgacccggatgcccgcggtgaccgatctggtc2700aaggaactcaccggcggcaagg33CCC幼Caagggcgtcaaccccgstgaggttgtcgcg2760gtgggagccgctctgcaggccggcgtcctcaagggcgaggtgaaagacgttctgctgctt2820gatgttaccccgctgagcctggtatcgagaccaagggcgggggtgatgaccaggctcatc2卿gagcgcaacaccacgatccccaccaagcggtcggagactttcaccaccgccgacgacaac2940caaccgtcggtgcagatccaggtctatcagggggagcgtgagatcgccgcgcacaacaag3000ttgctcgggtccttcgagctgaccggcatcccgccggcgccgcgggggattccgcagatc3060gaggtcactttcgacatcgacgccaacggcattgtgcacgtcaccgccaaggac犯gggc3120accggc幼ggagaacacgatccgaatccaggaaggctcgggcctgtccaaggaagacatt3180gaccgcatgatcaaggacgccgaagcgcacgccgaggaggatcgcaagcgtcgcgaggag3240gccgatgttcgtaatcaagccgagacattggtctaccagacggag卿ttcgtc幼ag犯3300cagcgtgaggccgagggtggcctgaagacaggttgatgcc3360gcggtggcggaagcgaaggcggcacttggcggatcggatatttcggccatcaagtcggcg3420atggag犯gctgggccaggagtcgcaggctctggggcaagcgatctacgaagc3gctcag3480gctgcgtcacaggccactggcgctgcccaccccggctcggctgattga3528<210〉2<211〉1175<212〉PRT<213〉融合蛋白<400〉2AlaThrMetGluLyslie15LysSerAspGinlieCys20GinValAspThrlieMet35AsplieLeuGluArgThr50ValLysProLeulieLeu6570GlyAsnProMetCysAsp85lieAlaGluLysAlaSer100PheAsnAspTyrGluGlu115PheGluLyslieGinlieVallieGluHis55ArgGluProLeulieLeuGlyLys40AsnAspPheAlaLys120ProLeuTyr25AsnGlyCysThrAsn105HisLys10HisValLysSerAsn90AspLeuSerAlalieAlaAsnThrVslLeuCys60ValAla75ValProLeuCysLeuSerSerTrpValAsnThr45AspGlyGluTyrArg125SerSerSer30HisteuTrpTrpPro110HeAsnLeu15ThrAlaAsnLeuSer95GlyAsnHisValGluGinGlyLeu80TyrAspHisAsp130AlaSer145PhePheThrlieLeuTrpTyrGin210GinArg225SefGlylieAsnLyslieTyrGly290SerSer305ProLysAsnThrAlalie135SerGlyValSerSer150ArgAsnValValTrp165LysArgSerTyrAsn180lieHisHisPro140AlaCysProHisHis155LeulieLysLysAsn170AsnGinGluGly195AsnLeuArgPheVal275AsnMetTyrProAla355GlyProThrThrTyr215lieProGlulie230lieGluPhePhe245GluSerAsnGly260LysLysGlyAspCysAsnThrLys295ProPheHisAsn310ValLysSerAsn325GinArgGluArg340GlyCyslieGluAsnThr185AsnAsp200lieSerAlaThrTrpThrAsnPhe265SerAla280CysGinlieHisArgLeuArgArg345GlyGly360AsnGluTrpTyrGlyTyrHisHisSer370375AspLysGluSerThrGinLysAlalie385390AsnSerlielieAspLysMetAsnThr405GluPheAsnAsnLeuGluArgArglie420425GluA印GlyPheLeuAspValTrpThr435440LeuMetGluAsnGluArgThrLeuAsp450455AsnlieTyrAspLysValArgLeuGin465470LeuGlyAsnGlyCysPheGluPheTyr485MetGluSerValLysAsnGlyThrTyr500505GluAlaArgLeuAsnArgGluGlulie515520MetGlyThrTyrGinlieLeuSerlieAlaAlaGluValGlyThr220ArgProLys235lieLeuLys250lieAlaProlieMetLysThrProMet300ProLeuThr315ValLeuAla330GinLysArgTrpGinGlyGinGlySer380AspGlyVal395GinPheGlu410GluSerLeuGlySerAspGin205SerValProGluSer285GlylieThrGlyMet365GlyThrAlaAsnTyrAsnAlaGlu445PheHisAspSer柳LeuArgAspAsn475HisLysCysAsp490AspTyrProGinSerGlyValLys525TyrSerThrValLysThrLeu190ThrThrAsnAsnTyr270GluAlaGlyGlyLeu350ValTyrAsnValLys430LeuAsnSerSer160TyrPro175LeuValtysteuLeuAsnGlyGin240AspAla255AlaTyrLeuGlulieAsnGluCys320LeuArg335PheGlyAspGlyAlaAlaLysVal400GlyArg415LysMetLeuValValLysAlaLysGlu480AsnGluCys495TyrSerGlu510LeuGluSerAlaSerSer530535540Leu545AsnArgLeuThrGly625ArgGlyLeuValLys705GluGluSerGlyTrp785AsplieThrArgLys865lieThrValValLeuAlaGlyAlaGluThr610GinSerLysLyslie690AspProGinLeuAsp770LeuLysGluValAla850ProAspAspAsnLeu930SerLeuSerValGly595ProProValLysArg675ThrAlaThrArgLeu755AsnValMetl一euAsp835GluPheHisLeuPro915LysLeuAlaLeuGly580GlySerAlaLysTyr660AspThrGlyAlalie740GluHisAspAlaSer820AlaPheGinValVal卿AspGlyVallieGin565lieAsplieLysArg645ThrAlaProGinAla725LeulieLeuLysMet805SerAspGinSerVal885LysGluGluSerMet550CysAspProValAsn630HisAlaGluAlalie710AlaValGlyGlyPhe790GinSerLysArgVal870teuGluValValArgValArgI>euValAla615GinMetProAlaTyr695AlaLeuPheGluGly775LysArgGinAsnlie855lieValLeuValLys935ProAlalieGlyVal600PheAlaGlyGluTyr680PheGlyAlaAspGly760AspGlyLeuSerPro840ThrGlyCysThr585ValAlaValSerlie665LeuAsnLeuTyrLeu745ValAspThrArgThr825LeuGinAlaAspGlyGlyThrGly905AlaVal920AspValLeulie570ThrAlaArgThrAsp650SerGlyAspAsnGly730GlyValTrpSerGlu810SerPheAspThrSer890GlySer555SerAsnAsnAsnAsn635TrpAlaGluAlaVal715LeuGlyGluAspGly795AlalieleuLeuGly875ThrLeulieSerSerGly620ValSerArgAspGin700LeuAspGlyValGin780lieAlaAsnAspLeu860lieGlyLeuArgAlaGlyArgLysGluAlaAlaLeuLeu940ValMetTrpLysValGlu605GluAsplielielie685ArgArgLysThrArg765ArgAspGluLeuGlu845AspSerMetProLeu925AspThrMetLeuVal590GlyValArgGluLeu670ThrGinlieGlyPhe750AlaValLeuLysPro830GinArgValProAsn910GinValArgCysMet575SerSerLeuThrlie655MetAspAlaValGlu735AspThrValThrAla815TyrLeuThrSerAla895LysAlaThrLeuSer560AlaValArgValVal640AspLysAlaThrAsn720LysValSerAspLys800LyslieThrArgGlu880ValGlyGlyProlie945950955960GluArgAsnThrThrlieProThrLysArgSerGluThrPheThrThr965970975AlaAspAspAsnGinProSerValGinlieGinValTyrGinGlyGlu980985990ArgGlulieAlaAlaHisAsnLysLeuLeuGlySerPheGluLeuThr99510001005GlylieProProAlsProArgGlylieProGinlieGluValThr101010151020PheAsplieAspAlaAsnGlylieValHisValThrAlaLysAsp102510301035tysGlyThrGlyLysGluAsnThrlieArglieGinGluGlySer104010451050GlyLeuSerLysGluAsplieAspArgMetlieLysAspAlaGlu105510601065AlaHisAlaGluGluAspArgLysArgArgGluGluAlaAspVal107010751080ArgAsnGinAlaGluThrLeuValTyrGinThrGluLysPheVal108510901095LysGluGinArgGluAlaGluGlyGlySerLysValProGluAsp11001105moThrLeuAsnLysValAspAlaAlaValAlaGluAlaLysAlaAla111511201125LeuGlyGlySerAsplieSerAlaIeLysSerAlaMetGluLys113011351140LeuGlyGinGluSerGinAlaLeuGlyGinAlalieTyrGluAla114511501155AlaGinAlaAlaSerGinAlaThrGlyAlaAlaHisProGlySer116011651170AlaAsp1175<210>3〈211〉31<212〉DNA<213〉引物<400>3aaggatccgccaccatggagaaaatagtgct31<210>4<211>29<212>DNA<213>引物<400>4gtcaagcttttaaatgcaaattctgcatt29权利要求1.一种分离的融合蛋白，其特征在于，所述的融合蛋白具有(a)禽流感血凝素抗原序列；(b)热休克蛋白70序列；和(c)位于(a)和(b)之间的由0-20个氨基酸构成的连接肽。2.如权利要求l所述的融合蛋白，其特征在于，所述的融合蛋白序列中，所述的禽流感血凝素抗原序列位于氨基端，所述的热休克蛋白70序列位于羧基4山顺o3.如权利要求l所述的融合蛋白，其特征在于，所述的禽流感血凝素抗原具有SEQIDNO:2所示的氨基酸序列中第3-571位的序列；或所述的热休克蛋白70具有SEQIDNO:2中第575-l175位所示的氨基酸序列。4.一种分离的核酸分子，其特征在于，所述的核酸分子编码权利要求1-3中任一所述的融合蛋白。5.如权利要求4所述的核酸分子，其特征还在于，所述的核酸分子具有SEQIDNO:1所示的核苷酸序列。6.—种重组腺病毒载体，其特征在于，所述的重组腺病毒载体中含有权利要求4或5所述的核酸分子。7.如权利要求6所述的重组腺病毒载体，其特征在于，所述的重组腺病毒载体的骨架质粒是复制缺陷型腺病毒载体。8.—种由权利要求6或7所述的重组腺病毒载体包装获得的重组腺病毒。9.一种预防禽流感的药物组合物，其特征在于，所述的药物组合物含有有效量的权利要求8所述的重组腺病毒；和药学上可接受的载体。10.—种预防禽流感的药盒，其特征在于，所述的药盒中含有权利要求9所述的组合物，或权利要求8所述的重组腺病毒。全文摘要本发明公开了一种腺病毒载体禽流感重组疫苗。本发明以高致病性禽流感H5N1的血凝素抗原基因为主要的保护性抗原基因，并将该基因与分枝结核杆菌热休克蛋白编码基因融合，该融合基因在被转入到腺病毒载体获得重组腺病毒并免疫动物后，可在动物体内产生高效价的抗血凝素抗原HA的抗体，且能够在动物体内长期保持高的抗体效价。文档编号C07K19/00GK101475641SQ20081020078公开日2009年7月8日申请日期2008年10月6日优先权日2008年10月6日发明者周立桥申请人:浙江易邦生物技术有限公司;周立桥