Lin28a基因过表达腺相关病毒在促进创伤修复中的应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于生物医学领域，具体涉及一种Lin28a基因过表达腺相关病毒在促进创 伤修复中的应用。
【背景技术】
[0002] 目前，各种创伤、烧伤、手术切口的愈合仍然是临床存在的一大难题，尤其是局部 放疗伤口的愈合、糖尿病人伤口的愈合、大面积烧伤或褥疮等难愈合伤口的愈合，给患者造 成巨大痛苦，也给医疗工作带来巨大负担。创伤修复是个复杂而渐进的过程，而以往的研究 基本停留在等待伤口自愈阶段，而缺乏促进创伤修复的积极措施。
[0003] Lin28是存在于高等真核生物中的一种保守RNA结合蛋白，它是可以将人类体细胞 重新编程为多潜能干细胞的四种多能性因子之一，在调节细胞生长分化、新陈代谢以及细 胞多能性等方面起重要作用。在哺乳动物基因组中，存在两个同源基因 Lin28a与Lin28b，两 者序列相似度高达76%。1^1128&与Lin28b虽然在核酸序列上具有极高的相似性，但其在细胞 中的定位及具体功能却有差异。在人类基因组中Lin28a定位于染色体1ρ36.11，蛋白质编码 区含有209个氨基酸残基，其同源蛋白基因 Lin28b定位于染色体6p21，编码一个含有250个 氨基酸残基的小分子蛋白质。由于Lin28a与Lin28b在功能上存在一定的差异，导致表达细 胞的类型也具有一定的特异性:Lin28b与多种癌症的触发、转移相关，并在多种癌细胞系中 呈现出高表达状态，提示其可能成为癌症发生预测的标志性分子;Lin28a的主要功能是调 控细胞的分化过程，因此广泛表达于胚胎干细胞与早期胚胎形成时的细胞中，Lin28a基因 可通过调控糖酵解和氧化磷酸化反应加强葡萄糖氧化代谢，能激活胶原蛋白，新生的胶原 蛋白能重新建立起胶原支架，提示Lin28a基因具有促进创伤修复能力。
[0004] 腺相关病毒(AAV)是一类微小、无被膜及具有二十面体结构的细小单链DNA病毒。 近年来用AAV作基因转移载体已成为基因治疗研究的热点。这是由于AAV具有以下特点：（1) 安全性好:迄今从未发现野生型AAV对人体致病;重组AAV去除了野生型AAV基因组的96%，进 一步保证了安全性；（2)宿主范围广：不仅可转导分裂细胞，而且可转导静止期细胞；（3)野 生型AAV可整合到人基因组19号染色体q臂的特定位置，利用这一特点，有可能研制出具有 特异性整合功能的AAV载体；（4)AAV-2的基因组仅4681个核苷酸，便于用常规的重组DNA技 术进行操作；（5)物理性质稳定:在60° C不能被灭活，能抗氯仿；（6)重组AAV(rAAV)可长期稳 定地表达外源基因。腺相关病毒对许多哺乳动物细胞都比较易感，能够转染的细胞种类也 比较多，无论是细胞系，还是原代培养的贴壁细胞，亦或是常规转染试剂难以转染的细胞类 型，腺相关病毒都有很好的转染效率，与质粒转染相比，具有瞬时转染基因转移效率更高的 优点。
【发明内容】
[0005] 本发明的目的在于提供携带Lin28a基因的重组腺相关病毒（AAV_Lin28a)，将 Lin28a基因构建入腺相关病毒载体，用于Lin28a基因的过表达，该AAV-Lin28a能促进创伤 修复。
[0006] 本发明提供的Lin28a基因过表达腺相关病毒在促进创伤修复中的应用，通过以下 技术方案来实现： 1. 人工合成Lin28a全基因组； 2. 将Lin28a基因插入到腺相关病毒载体上，利用pHelper质粒包装系统共转染细胞，获 得重组腺相关病毒AAV_Lin28a，进一步得到病毒浓缩液； 3. 建立皮肤表面创伤动物模型和合适的基因转移方法，证明AAV-Lin28a可促进皮肤创 伤愈合； 4. 建立猶度烧伤动物模型和合适的基因转移方法，证明AAV-Lin28a可促进深度烧伤 的真皮再生，并能抑制皮肤瘢痕形成； 5. 建立骨损伤动物模型和合适的基因转移方法，证明AAV-Lin28a可促进骨损伤修复； 6. 建立软组织损伤动物模型和合适的基因转移方法，证明AAV-Lin28a可促进软组织损 伤修复。
[0007] 本发明的有益效果在于:本发明将Lin28a基因插入到腺相关病毒载体上，获得一 携带Lin28a基因的重组腺相关病毒。该重组腺相关病毒制备方法简单，能有效促进皮肤创 伤的愈合，能显著促进部分深度烧伤的真皮再生，能促进骨损伤和软组织损伤修复，并能抑 制瘢痕形成。
【附图说明】
[0008] 附图1为三组动物皮肤创伤愈合率的变化趋势图。
[0009] 附图2 为皮肤HE染色效果图（A:AAV-Lin28a;B:AAV-MCS;C:PBS)。
【具体实施方式】
[0010] 下面给出实施例以对本发明作更详细的说明，有必要指出的是以下实施例不能理 解为对本发明保护范围的限制，该领域的技术熟练人员根据上述本
【发明内容】
对本发明作出 的一些非本质的改进和调整仍属本发明的保护范围。 实施例
[0011] 实施例1重组腺相关病毒的制备。
[0012] 构建重组腺相关病毒载体。
[0013]由上海生物工程有限公司全基因合成Lin28a基因，构建到PUC57载体中，得到 pUC57-Lin28a质粒（测序结果见SEQ ID N0.1)。
[0014] 采用限制性内切酶EcoRI和BamHI (购自Takara公司）双酶切pUC57-Lin28a和pAAV-MCS腺相关病毒载体(购自Stratagene公司），酶切体系为:pAAV-MCS/pUC57-Lin28a质粒： IOul，EcoRI :3ul，BamHI :3ul ,buffer :4ul，H2〇:20ul。37°C水浴30min，琼脂糖凝胶电泳检测 酶切产物，回收Lin28a基因片段和pAAV-MCS载体骨架(操作步骤参照Takara琼脂糖核酸纯 化回收试剂盒说明书）。
[0015] 将Lin28a基因插入酶切回收pAAV-MCS载体中（具体步骤参照Takara公司DNA Ligation Kit Ver. 2.1试剂盒说明书），连接体系为:Lin28a回收产物:2.5ul，pAAV-MCS 回收产物：2 · 5ul，Solution 1: 5ul。16°C孵育30min，取连接产物IOul加入IOOul DH5a感受 态细胞(购自Takara公司）中吹打均匀，冰上静置20min，再放入42°C水浴90s，迅速置于冰 中，静置3min，加入500ul LB液体培养基，180rpm、37°C振荡培养lh，取菌液IOOul均匀涂布 于LB固体培养基(含1/1000氨苄青霉素），37°C培养过夜。挑取单克隆菌落于5ml LB培养基 (含1/1000氨苄青霉素）中，180rpm 37°C培养12h后提取质粒(操作步骤参照Takara质粒提 取试剂盒说明书）。
[0016]取样送至上海生物工程有限公司测序验证确认正确。将构建的质粒命名为PAAV-Lin28a〇
[0017]细胞株293FT的复苏与培养。
[0018]取液氮冻存的293FT细胞株(购自Clontech公司），迅速放于37°C水浴中解冻，期间 不断晃动使离心管内溶液尽量受热均匀；解冻后迅速加入7 m L体积分数为10 %胎牛血清的 DMEM培养液中（DMEM培养液需要提前预热至37°C)，枪头轻轻吹打至无细胞团存在，然后在 1300rpm条件下离心6min，弃去上清;再向离心管中加2 mL提前预热至37°C体积分数为10% 胎牛血清的DMEM培养液，吹打细胞使其悬浮，按照5 X IO4个细胞将细胞接种于培养皿，并于 37°C、含5%的CO2培养箱中培养24h，然后换液，以后每隔2天换液至细胞密度达90%时传代。 [00 19] 病毒包装。
[0020]转染前一天，按照每瓶4 X IO5个293FT细胞接种到培养瓶中，培养24 h后细胞约有 70%融合，转染前4h，用无双抗PBS清洗2次细胞，将含血清的培养液换为无双抗、无血清的优 化培养液0pti_MEM(2 mL/瓶）；LipofectamineTM2000(购自 Invitrogen公司）作为转染试剂 将Lin28a转染至293FT细胞，具体步骤依照说明书进行，转染体系为:卩!161?61' :10耶，？4八￥-RC：10ug, pAAV-Lin28a ：IOug,Lipofectamine 2000：60ug, Opti-MEM：2ml〇 [0021 ] 病毒收毒。
[0022]病毒颗粒同时存在于包装细胞和培养上清中。可以将细胞和培养上清都收集下来 以获得最好的收率： 1) 准备一个干冰乙醇浴(将乙醇倾入装有干冰的泡沫盒即可，也可用液氮替代干冰乙 醇浴)和37° C水浴； 2) 将产毒的细胞连同培养基一同收集到一个15ml的离心管中。收集细胞时，将培养盘 倾斜一定角度将细胞刮到培养基中； 3) lOOOrpm/min，离心3分钟，分离细胞和上清，将上清液另外存放，细胞用Iml PBS重 悬； 4) 将细胞悬浮液在干冰乙醇浴和37° C水浴中反复转移，冻融四次。每次融解后稍加震 荡。注意:每次凝固和解冻大概需要十分钟的时间。
[0023] 病毒浓缩 1) 10，OOOg离心去除细胞碎片，将离心上清液转移到一个新离心管中； 2) 将两次收集的上清混合在一起，用0.45um滤器过滤除杂质； 3) 加入1/2体积的IM NaCl，10% PEG8000溶液，混合均匀，4°C过夜； 4) 12，OOOrpm离心2h，弃上清，病毒沉淀用适量的PBS溶液溶解，待完全溶解后用0.22um 滤器过滤除菌； 5) 加入Benzonase核酸酶消化去除残留的质粒DNA(终浓度为50U/ml)。合上管盖，颠倒 几次以充分混合。在37°C孵育30分钟； 6)用0.45μπι过滤头过滤，取滤出液，即为浓缩的AAV病毒。
[0024] 病毒包装滴度测定(采用Q-PCR法） 1) 取20ul浓缩病毒液，加入Iul RN