前列腺癌相关基因和多肽的制作方法

专利名称：前列腺癌相关基因和多肽的制作方法
技术领域：
本发明涉及生物科学领域，更具体地，涉及癌症研究领域。本发明具体涉及与前列腺癌相关的新基因A5736(MICAL2-PV)和D4493(PCOTH)所编码的新的多肽。另外，本发明涉及新基因A5736(MICAL2-PV)。本发明的基因和多肽可用于，例如诊断前列腺癌、作为研发抗该疾病药物的靶分子以及减弱前列腺癌的细胞生长。
背景技术：
前列腺癌是西方国家男性中最常见的癌症之一(Gronberg，Lancet 361859-64(2003))。发达国家的前列腺癌发生率稳步增加，这是由于西式饮食的流行以及老年人数目的增加。通过检测血清中前列腺特异性抗原(PSA)进行的早期诊断提供了外科治疗的机会，并且显著改善了前列腺癌的预后。然而，经根治性前列腺切除术(radical prostatectomy)治疗的患者中，有30％的患者复发了癌症(Han等，J Urol 166416-9(2001))。多数复发的或晚期癌症对雄性激素削减疗法(androgen ablation therapy)有反应，因为前列腺癌在初始阶段的生长是雄性激素依赖性的。但是，多数用该疗法治疗的患者最终发展为雄性激素非依赖性疾病，因此对该疗法不再有反应。前列腺癌最严重的临床问题是雄性激素非依赖性的前列腺癌对任何其它疗法都没有反应(Gronberg，Lancet 361859-64(2003))。因此，建立一种不同于雄性激素削减疗法的新前列腺癌疗法是治疗前列腺癌的迫切问题。
cDNA微阵列技术使得能获得正常细胞和恶性细胞中基因表达的分布图，并能比较恶性细胞和相应正常细胞中的基因表达(Okabe等，Cancer Res612129-37(2001)；Kitahara等，Cancer Res 613544-9(2001)；Lin等，Oncogene 214120-8(2002)；Hasegawa等，Cancer Res 627012-7(2002))。这种方法能揭示癌细胞的复杂性质，有助于理解致癌机制。鉴别出肿瘤中不受调节的基因能对受试者癌症进行更精密和更准确的诊断，能发展新的治疗靶位(Bienz and Clevers，Cell 103311-20(2000))。为了从基因组水平揭示肿瘤的机理，以及发现用于诊断和研发新治疗药物的靶分子，本发明人利用含23040个基因的cDNA微阵列分析了肿瘤细胞的表达分布图(Okabe等，Cancer Res 612129-37(2001)；Kitahara等，Cancer Res 613544-9(2001)；Lin等，Oncogene 214120-8(2002)；Hasegawa等，Cancer Res 627012-7(2002))。
设计用来揭示致癌机制的研究已经促进了抗肿瘤试剂分子靶的鉴定。例如，法尼酰转移酶(famexyltransferase)(FTI)抑制剂用于在动物模型中有效治疗Ras依赖性肿瘤，而它最初是被研制用于抑制Ras相关的生长信号通路，Ras的激活依赖于翻译后的法尼基化(posttranslational farnesylation)(He等，Cell 99335-45(1999))。已对人体进行临床试验用抗肿瘤药物和抗HER2单克隆抗体曲妥单抗的组合物来拮抗原癌基因受体HER2/neu，并明显改善了临床反应和乳腺癌患者的总存活率(Lin等，Cancer Res 616345-9(2001))。选择性灭活bcr-abl融合蛋白的酪氨酸激酶抑制剂STI-157，被研制用来治疗慢性髓细胞性白血病，该疾病中bcr-abl酪氨酸激酶的组成型活化对白细胞的转移起决定性作用。这些类型的试剂被设计用来抑制特定基因产物的致癌活性(Fujita等，Cancer Res 617722-6(2001))。因此，在癌性细胞中通常上调的基因产物可作为研发新的抗癌试剂的潜在靶点。事实上，已证实针对异常表达的、导致癌症生长和发展的分子的新药物对某些类型的癌症有效。这种药物包括治疗乳腺癌的赫赛汀(Herceptin)，治疗CML的Glivec(STI571)和治疗非小细胞型肺癌的Iressa(ZD1839)。
已知一些分子在前列腺癌中过量表达并被确定为前列腺癌的治疗靶点或标志物(Xu等，Cancer Res 606568-72(2000)；Luo等，Cancer Res 622220-6(2002))。然而，它们中的大多数在其它主要器官中同样高表达。因此，靶向这些分子的试剂对癌细胞有毒，但对其它器官的正常生长细胞同样有不利的影响。
已证明CD8+细胞毒T淋巴细胞(CTL)识别来自MHC I类分子呈递的肿瘤相关抗原(TAA)的表位肽，并溶解肿瘤细胞。自从发现MAGE家族作为TAA的第一个实例，用免疫学方法已发现了许多其它的TAA(Boon，Int JCancer 54177-80(1993)；Boon and van der Bruggen，J Exp Med 183725-9(1996)；van der Bruggen等，Science 2541643-7(1991)；Brichard等，J ExpMed 178489-95(1993)；Kawakami等，J Exp Med 180347-52(1994))。一些已经发现的TAA目前正处于作为免疫治疗靶点的临床开发阶段。迄今为止已经发现的TAA包括MAGE(van der Bruggen等，Science 2541643-7(1991))，gp100(Kawakami等，J Exp Med 180347-52(1994))，SART(Shichijo等，J Exp Med 187277-88(1998))和NY-ESO-1(Chen等，Proc Natl Acad SciUSA 941914-8(1997))。另一方面，已证实的在肿瘤细胞中尤其过表达的基因产物可作为诱导细胞免疫反应的靶点而被识别。这种基因产物包括p53(Umano等，Brit J Cancer 841052-7(2001))，HER2/neu(Tanaka等，Brit JCancer 8494-9(2001))，CEA(Nukaya等，Int J Cancer 8092-7(1999))等等。
尽管在关于TAA的基础和临床研究中取得了重要的进展(Rosenbeg等，Nature Med 4321-7(1998)；Mukherji等，Proc Natl Acad Sci USA 928078-82(1995)；Hu等，Cancer Res 562479-83(1996))，只有有限数量的候选TAA能治疗腺癌，包括结肠直肠癌。在癌细胞中大量的表达，同时其表达限制在癌细胞内的TAA是有希望的免疫治疗靶点的候选物(candidate)。此外，对诱导有效且特异性抗肿瘤免疫反应的新型TAA的鉴定被预期能够促进肽接种策略在多种类型癌中的临床使用(Boon and can der Bruggen，J Exp Med 183725-9(1996)；van der Bruggen等，Science 2541643-7(1991)；Brichard等，JExp Med 178489-95(1993)；Kawakami等，J Exp Med 180347-52(1994)；Shichijo等，J Exp Med 187277-88(1998)；Chen等，Proc Natl Acad Sci USA941914-8(1997)；Harris，J Natl Cancer Inst 881442-5(1996)；Butterfield等，Cancer Res 593134-42(1999)；Vissers等，Cancer Res 595554-9(1999)；vander Burg等，J Immunol 1563308-14(1996)；Tanaka等，Cancer Res 574465-8(1997)；Fujie等，Int J Cancer 80169-72(1999)；Kikuchi等，Int J Cancer 81459-66(1999)；Oiso等，Int J Cancer 81387-94(1999))。
已有报道重复指出，来自具体健康供体的肽刺激的外周血单核细胞(PBMC)对该肽产生响应而产生显著水平的IFN-γ，但在铬-51释放试验中几乎不以HLA-A24或-A0201限制性图谱发挥针对肿瘤细胞的细胞毒作用(Kawano等，Cance Res 603550-8(2000)；Nishizaka等，Cancer Res 604830-7(2000)；Tamura等，Jpn J Cancer Res 92762-7(2001))。但是，HLA-A24和HLA-A0201均为一种在日本人以及高加索人中常见的HLA等位基因(Date等，Tissue Antigens 4793-101(1996)；Kondo等，J Immunol 1554307-12(1995)；Kubo等，J Immunol 1523913-24(1994)；Imanishi等，Proceeding of the eleventh International Hictocompatibility Workshop andConference Oxford University Press，Oxford，1065(1992)；Williams等，TissueAntigen 49129(1997))。因此，由这些HLA所呈递的癌抗原肽特别适用于治疗日本人和高加索人中的癌症。此外，已知在体外诱导低亲和力CTL通常是使用高浓度肽的结果，所述高浓度肽的使用在抗原呈递细胞(APC)上生成高水平特异性肽/MHC复合物，所述复合物将有效激活这些CTL(Alexander-Miller等，Proc Natl Acad Sci USA 934102-7(1996))。
发明概述为揭示前列腺癌的机理、鉴定新的诊断标志物和/或药物靶点以治疗这些肿瘤，本发明人联合利用全基因组cDNA微阵列以及激光微束显微解剖技术分析了前列腺癌中的基因表达分布图。从药理学角度来说，实践中抑制致癌信号以激活肿瘤抑制效应物更容易。因此，本发明人搜索在前列腺癌细胞中过表达的基因。
结果，鉴定了2种在前列腺癌细胞中过表达的具体基因PCOTH和MICAL2-PV。而且，通过转染小干扰RNA(siRNA)降低PCOTH(前列腺胶原三螺旋(prostate collagen triple helix)或MICAL2-PV(MICAL2(与CasL相互作用的分子2(Molecule Interacting with CasL 2))前列腺癌变体)的表达抑制了前列腺癌细胞的生长。
PCOTH编码一个100个氨基酸的蛋白质，所述蛋白质包含一个胶原三螺旋重复，且其外源性产物位于细胞膜上。Northern印迹分析显示，PCOTH的表达局限在睾丸和前列腺中。
另外，MICAL2-PV的表达也局限于睾丸中。MICAL2-PV编码的蛋白包含与calponin结构域同源的结构域，calponin是肌动蛋白结合结构域，它重复(in duplicate)存在于包括抗肌萎缩蛋白(dystrophin)和α-辅肌动蛋白(actinin)在内的血影蛋白样蛋白(spectrin-like protein)的N末端。因此，预计MICAL2-PV编码的蛋白与肌动蛋白或其它微管相互作用。这些结构域使肌动蛋白丝交联成束或网。有报道另一家族成员MICAL1与波形蛋白(vimentin)(Suzuki等，J Biol Chem 27714933-41(2002))和rabl(Weide等，Biochem Biophys Res Commun 30679-86(2003))结合，后两者是作为支架蛋白连接细胞内不同成分的中间丝(intermediated filament)及细胞骨架(cytoskelton)的主要成分。预期MICAL2-PV与前列腺癌细胞中细胞骨架构建以及细胞形态有关。
许多抗癌药物不仅对癌细胞有毒性，对正常生长的细胞也有毒性。然而抑制MICAL2-PV或PCOTH表达的试剂可能不会对其它器官有不良的影响，这是由于正常MICAL2-PV的表达局限于睾丸，PCOTH局限于睾丸和前列腺，因此对于治疗或预防前列腺癌有重要意义。
因此，本发明提供了分离的基因MICAL2-PV和PCOTH作为前列腺癌的候选诊断标志物以及有希望的潜在靶点，来研发诊断新策略及有效抗癌试剂。此外，本发明还提供了这些基因编码的多肽，所述多肽的制备方法及其应用。更具体，本发明提供了下述内容本申请提供了新的人类多肽MICAL2-PV和PCOTH，或其功能等价物，所述多肽或其功能等价物的表达在前列腺癌细胞中提高。
一个优选实施方案中，MICAL2-PV多肽包括由SEQ ID NO3的开放阅读框编码的推定的976个氨基酸，或由SEQ ID NO5的开放阅读框编码的推定的955个氨基酸。MICAL2-PV多肽优选包括SEQ ID NO4或6所示的氨基酸序列。本申请还提供了分离的蛋白，它由至少一部分MICAL2-P多核苷酸序列编码，或由与SEQ ID NO3或5所示序列至少15％更优选至少25％互补的多核苷酸序列编码。
另一方面，一个优选实施例中，PCOTH多肽含SEQ ID NO2(GenBank登录号AB113650)所示的推定的100个氨基酸。PCOTH由SEQ ID NO1的开放阅读框编码并包含胶原三螺旋重复(

图1(C))。本申请还提供了分离的蛋白，由至少一部分PCOTH多核苷酸序列编码，或由与SEQ ID NO1(LOC221179(XP_167955))所示序列至少30％更优选至少40％互补的多核苷酸序列编码。
本发明还提供了新的人类基因MICAL2-PV，其在大多数前列腺癌中的表达相对于其在相应非癌性前列腺导管上皮(duct epithelium)细胞中的表达显著提高。分离的MICAL2-PV基因包括SEQ ID NO3或5所示的多核苷酸序列。具体地，MICAL2-PVcDNA包括含有2928个核苷酸的开放阋读框的6805个核苷酸(SEQ ID NO3)，或含有2865个核苷酸的开放阅读框的6742个核苷酸(SEQ ID NO5)。本发明还包括与SEQ ID NO3或5所示的多核苷酸序列杂交、并与所述序列的至少30％、更优选至少40％互补的多核苷酸，使得它们编码MICAL2-PV蛋白或其功能等价物。这种多核苷酸的实例为SEQ ID NO3或5所示序列编码的MICAL2-PV的简并变体和等位基因突变体。
此外，本发明提供了分离的、编码新的人类蛋白PCOTH的多核苷酸，它在大多数前列腺癌中的表达相对于其在相应的非癌性前列腺导管上皮细胞中的表达也显著提高。该分离的多核苷酸编码由SEQ ID NO2所示的100个氨基酸组成的多肽。更具体地，该分离的多核苷酸包含SEQ ID NO1所示核苷酸序列的332-631核苷酸。本发明还包括与SEQ ID NO1所示的多核苷酸序列杂交并与所述序列的至少30％、更优选至少40％互补的多核苷酸，使得它们编码PCTOH蛋白或其功能等价物。这种多核苷酸的实例为SEQ ID NO1所示序列的简并变体和等位基因突变体。
本文中，分离的基因指多核苷酸，其结构与任何天然存在的多核苷酸不相同，或与任何天然存在基因组多核苷酸的跨3个或3个以上分隔基因的片段不相同。因此，该术语包括，例如(a)DNA，它具有生物体基因组中天然存在的天然基因组DNA分子的部分序列，其中所述DNA天然存在于所述生物体中；(b)插入载体或插入原核或真核生物基因组DNA中的多核苷酸，该插入方式使获得的分子与任何天然存在的载体或基因组DNA不相同；(c)分离的分子，如cDNA、基因组片段、聚合酶链式反应(PCR)产生的片段或限制性酶切片段；和(d)重组核苷酸序列，其为杂合基因(即编码融合蛋白的基因)的一部分。
因此，一方面，本发明提供了编码本文所述多肽或其片段的分离的多核苷酸。优选，该分离的多核苷酸包括与SEQ ID NO1，3或5所示核苷酸序列至少60％相同的核苷酸序列。更优选，该分离的核酸分子与SEQ ID NO1，3或5所示核苷酸序列的同一性为至少65％，70％，75％，80％，85％，90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％，99％或更高。当分离的多核苷酸比参照序列(例如SEQ ID NO1，3或5)的长度更长或者相同时，所述比较是以参照序列的全长进行的。当分离的多核苷酸比参照序列(例如SEQ ID NO1，3或5)短，所述比较是以参照序列的相同长度的片段进行的(排除同源性计算所需的任何环(loop))。
本发明还提供了制备蛋白质的方法，其通过用编码MICAL2-PV或PCOTH蛋白的多核苷酸序列转染或转化宿主细胞，并表达该多核苷酸序列来进行。另外，本发明还提供了含有编码MICAL2-PV或PCOTH蛋白的核苷酸序列的载体，以及含有编码MICAL2-PV或PCOTH蛋白的多核苷酸的宿主细胞。这种载体和宿主细胞可用于制备MICAL2-PV或PCOTH蛋白。
本申请还提供了识别MICAL2-PV蛋白的抗体。还部分地提供了MICL2-PV或PCOTH基因的反义多核苷酸(例如反义DNA)，核酶，和siRNA(小干扰RNA)。
本发明还提供了诊断前列腺癌的方法，包括以下步骤确定受试者生物样品中的基因表达水平，并将MICAL2-PV或PCOTH基因的表达水平与正常样品中的比较，以及确定样品中MICAL2-PV或PCOTH的高表达水平指示该受试者患有或将可能患有前列腺癌。
此外，本发明提供了筛选用于治疗或预防前列腺癌的化合物的方法。该方法包括将MICAL2-PV或PCOTH多肽与受试化合物接触，筛选与MICAL2-PV或PCOTH多肽结合或改变其生物活性的受试分子。
本发明还提供了筛选用于治疗或预防前列腺癌的化合物的方法，其中该方法包括将受试化合物与表达MICAL2-PV或PCOTH多肽的细胞接触，或将受试化合物与导入了载体的细胞接触，该载体包含位于报道基因上游的MICAL2-PV或PCOTH的转录调节区域，并且筛选抑制MICAL2-PV或PCOTH多肽表达水平的受试化合物。
另外，本发明提供了筛选用于治疗或预防前列腺癌的化合物的方法，其中该方法包括在受试化合物存在的情况下，将MICAL2-PV与肌动蛋白接触，筛选抑制MICAL2-PV与肌动蛋白结合的受试化合物。
本发明还提供了治疗或预防前列腺癌的药物组合物。该药物组合物可以是，例如抗癌剂。该药物组合物可描述为分别针对MICAL2-PV或PCOTH多核苷酸序列的反义S-寡核苷酸，siRNA或核酶的至少一部分，其分别在SEQ ID NO3和5或1中显示并描述。适合的siRNA靶向选自SEQ ID NO23和27的序列。MICAL2-PVsiRNA的靶序列包含SEQ ID NO27的核苷酸序列，PCOTH siRNA的靶序列包含SEQ ID NO23的核苷酸序列。它们都优选作为本发明治疗或预防前列腺癌的靶点。药物组合物还可以是包含化合物的组合物，所述化合物用本发明筛选治疗或预防细胞增生性疾病如前列腺癌的化合物的方法选出。
需要药物组合物的起效过程来抑制癌性细胞如前列腺癌细胞的生长。该药物组合物可施用于包括人和家养哺乳动物的哺乳动物。
本发明还提供了一种用本发明提供的药物组合物治疗或预防前列腺癌的方法。
另外，本发明还提供了治疗或预防前列腺癌的方法，包括给予MICAL2-PV或PCOTH多肽的步骤。预期通过给予MICAL2-PV或PCOTH多肽诱导抗肿瘤免疫性。因此，本发明还提供了一种诱导抗肿瘤免疫性的方法，包括给予MICAL2-PV或PCOTH多肽，以及含有MICAL2-PV或PCOTH多肽的、用于治疗或预防癌症的药物组合物的步骤。
应当理解上述发明概述以及下述发明的详细描述都是本发明的优选实施方案，并不限制本发明及其它替代实方案。
附图简要说明图1(A)是照片，显示通过RT-PCR得到的D4493(PCOTH)在前列腺癌细胞中过表达的结果。来自同一受试者的正常前列腺导管上皮细胞(N)和前列腺癌细胞(T)的显微切片通过半定量RT-PCR进行比较。用ACTB使结果规范化。(B)是照片，显示正常人多种组织的Northern印迹分析结果。检测出在睾丸和前列腺中的表达较高且局限化，在心脏和骨髓中表达较少。(C)是D4493(PCOTH)产物的氨基酸序列。该产物由100个氨基酸组成并具有以G-X-X基序重复为特征的胶原三螺旋重复结构。G是甘氨酸，X优选脯氨酸。
图2(A)是照片，显示通过RT-PCR得到的A5736(MICAL2-PV)在前列腺癌细胞中过表达的结果。来自同一受试者的正常前列腺导管上皮细胞(N)和前列腺癌细胞(T)的显微切片通过半定量RT-PCR进行比较。用ACTB使结果规范化。(B)是照片，显示正常人多种组织和前列腺癌细胞系的Northern印迹分析的结果。对应MICAL2-PV的约7kb的转录物在睾丸和前列腺癌细胞系(LNCaP，PC3和DU145)中高表达，而对应原始MICAL2的约4kb的转录物在心脏，脑，肝中表达，但不在前列腺癌细胞系中表达。(C)说明了MICAL2(KIAA0750)和MICAL2-PV外显子的比对。MICAL2(KIAA0750)是3.8kb的转录物，含有28个外显子；MICAL2-PV是6.8kb的转录物，它的数个外显子被删除，并含有长期保持(longlast)的外显子。MICAL2-PV有2个同种型长型(登录号AB110785)和短型(登录号AB110785)，其中长型中一个外显子被删除。预计该长型将产生976个氨基酸的蛋白质，其COOH区域与MICAL2(KIAA0750)蛋白不同。
图3是照片，显示外源性PCOTH蛋白(A)和MICAL2-PV蛋白(B)在COS7细胞中的亚定位。外源性PCOTH蛋白位于COS7细胞的细胞膜，而外源性MICAL2-PV蛋白位于COS7细胞的细胞质中。
图4(A)是照片，显示用siRNA在前列腺癌细胞系中敲除PCOTH的效果。用数个U6-启动子-siRNA构建体转染PC3(si1-4靶向PCOTH，一个靶向EGFP)。RT-PCR结果说明用si3转染的PC3细胞中敲除PCOTH能获得明显(drastic)的效果。(B)是照片，显示用U6-启动子-siRNA构建体转染PC3之后的集落形成试验(colony formation assay)的结果。集落数目与si3对PCOTH的敲除效果相一致。(C)是用siRNA敲除PCOTH后，三种前列腺癌细胞系(LNCaP，DU145和PC3)的MTT试验结果。细胞生长同样与si3对PCOTH的敲除效果相一致。(D)是照片，显示用siRNA在前列腺癌细胞系中敲除MICAL2-PV的效果。用数个U6-启动子-siRNA构建体转染PC3(si1-3靶向MICAL2-PV，一个靶向EGFP)。RT-PCR结果说明用si2转染PC3细胞来敲除PCOTH能获得明显的效果。(E)是照片，显示用U6-启动子-siRNA构建体转染PC3之后的集落形成试验的结果。集落数目与si2对MICAL2-PV的敲除效果相一致。
发明详述本文中“一个”、“一种”、“该”和“所述”指“至少一种”，除非另有特别说明。
为揭示前列腺癌的机理、鉴定新的诊断标志物和/或药物靶点以治疗这些肿瘤，本发明人利用全基因组cDNA微阵列联合激光微束显微解剖术分析了前列腺癌的基因表达分布图。结果，鉴定了2个在前列腺癌细胞中尤其过表达的基因PCOTH和MICAL2-PV。另外，用小干扰RNA(siRNA)抑制PCOTH或MICAL2-PV基因的表达导致了明显的癌性细胞生长抑制。这些发现暗示PCOTH和MICAL2-PV导致癌细胞的致癌活性，抑制这些蛋白的活性可能是治疗和预防增生性疾病如前列腺癌的有希望的策略。
MICAL2-PV如本发明所述，鉴定了两个具有相似序列的基因，它们编码由1124个氨基酸残基组成的MICAL2变体。这两个基因在前列腺癌中的表达相对于它们在相应的非癌性组织中的表达而言显著提高。鉴定的变体的3’末端编码区与MICAL2的编码区不同。因此，这两个新的人类基因都被称作“MICAL2前列腺癌变体(MICAL2-PV)”。6805个核苷酸组成的较长变体的eDNA包含2928个核苷酸的开放阅读框(SEQ ID NO3)，6742个核苷酸组成的较短变体包含2865个核苷酸的开放阅读框(SEQ ID NO5)。这些开放阅读框分别编码推定的976个氨基酸的蛋白和推定的955个氨基酸的蛋白。MICAL2-PV编码的蛋白包含与calponin结构域同源的结构域，肌动蛋白-结合结构域，所述肌动蛋白-结合结构域以相同的两个(in duplicate)存在于包括抗肌萎缩蛋白和α-辅肌动蛋白的血影蛋白样蛋白(spectrin-like proteins)的N末端。因此，预计MICAL2-PV编码的蛋白与肌动蛋白或其它微管相互作用。这些结构域使肌动蛋白丝交联成束或网。
因此，本发明提供了由这些基因编码的基本纯的多肽，包括含SEQ IDNO4或6所示氨基酸序列的多肽及其功能等价物，使得所述多肽及其功能等价物编码MICAL2-PV蛋白。MICAL2-PV功能等价多肽的例子包括，例如对应于人MICAL2-PV蛋白的其它生物体的同源蛋白，以及人MICAL2-PV蛋白的突变体。
本发明中，术语“功能等价(functionally equivalent)”指受试多肽与MICAL2-PV蛋白一样，具有促进细胞增生的活性以及赋予癌细胞致癌活性的活性。受试多肽是否具有细胞增生活性可如下所述进行判断将编码受试多肽的DNA导入表达各个多肽的宿主细胞，检测对细胞增生的促进作用或集落形成活性的增加。这种细胞包括，例如，LNCaP，PC3和DU145。或者，受试多肽是否是MICAL2-PV的功能等价物也可通过检测其与肌动蛋白的结合能力来判断。
制备指定蛋白的功能等价多肽的方法是本领域技术人员已知的，包括在蛋白中导入突变的已知方法。例如，本领域技术人员可通过定点诱变在这些蛋白质之一的氨基酸序列中导入合适的突变，来制备人类MICAL2-PV蛋白的功能等价多肽(Hashimoto-Gotoh等，Gene 152271-5(1995)；Zoller andSmith，Methods Enzymol 100468-500(1983)；Kramer等，Nucleic Acids Res.129441-9456(1984)；Kramer and Fritz，Methods Enzymol 154350-67(1987)；Kunkel，Proc Natl Acad Sci USA 82488-92(1985)；Kunkel，Methods Enzymol852763-6(1988))。氨基酸突变也会自然发生。本发明的多肽包括具有人类MICAL2-PV蛋白氨基酸序列的蛋白，其中一或多个氨基酸发生突变，产生的突变多肽与人类MICAL2-PV蛋白功能等价。这种突变体中突变氨基酸的数量通常是10个或更少，优选6个或更少，最优选3个或更少。
已知突变或修饰的蛋白保持原来的生物活性，所述蛋白为具有通过对具体氨基酸序列的一或多个氨基酸残基进行取代，缺失，插入和/或添加修饰而成的氨基酸序列的蛋白(Mark等，Proc Natl Acad Sci USA 815662-6(1984)；Zoller and Smith，Nucleic Acids Res 106487-500(1982)；Dalbadie-McFarland等，Proc Natl Acad Sci USA 796409-13(1982))。
被突变的氨基酸残基优选突变为不同的氨基酸，其氨基酸侧链的性质是保守的(即保守氨基酸取代过程)。氨基酸侧链的性质例如疏水性氨基酸(A，I，L，M，F，P，W，Y，V)，亲水性氨基酸(R，D，N，C，E，Q，G，H，K，S，T)，以及侧链带有下述功能基团或具有共有性质脂肪族侧链(G，A，V，L，I，P)；含有羟基的侧链(S，T，Y)；含有硫原子的侧链(C，M)；含有羧酸和酰胺的侧链(D，N，E，Q)；含碱基的侧链(R，K，H)；含芳香基的侧链(H，F，Y，W)。注意，括号中的字母是指氨基酸的单字母密码。
在人MICAL2-PV蛋白的氨基酸序列中添加了一或多个氨基酸残基的多肽的例子是包含人MICAL2-PV蛋白的融合蛋白。融合蛋白是人MICAL2-PV蛋白与其它肽或蛋白的融合体，并且包括在本发明的范围。可用本领域技术人员熟知的技术制备融合蛋白，如将编码本发明人MICAL2-PV蛋白的DNA与编码其它肽或蛋白的DNA连接，使编码框匹配，将该融合DNA插入表达载体并在宿主细胞中表达。对于与本发明蛋白融合的肽或蛋白没有限制。
可用作与本发明蛋白进行融合的已知的肽包括，例如FLAG (Hopp等，Biotechnology 61204-10(1988))，含6个His(组氨酸)残基的6×His，10×His，流感血凝素(Influenza agglutinin)(HA)，人c-myc片段，VSP-GP片段，p18HIV片段，T7-标记，HSV-标记，E-标记，SV40抗原片段，lck标记，α-微管蛋白片段，B-标记，蛋白C片段及类似物。可与本发明蛋白融合的蛋白包括例如GST(谷胱甘肽-S-转移酶)，流感血凝素(HA)，免疫球蛋白恒定区，β-半乳糖苷酶，MBP(麦芽糖结合蛋白)等。
融合蛋白可如下制备将编码上述融合肽或蛋白的可购得DNA，与编码本发明多肽的DNA融合，并表达制备的融合DNA。
本领域中已知另一分离功能等价多肽的方法是例如，使用杂交技术的方法(Sambrook等，Molecular Cloning 2nd ed.9.47-9.58，Cold Spring HarborLab.Press(1989))。本领域技术人员可以很容易地分离与编码人MICAL2-PV蛋白的全部或部分DNA序列(即SEQ ID NO3或5)高度同源的DNA，并从分离的DNA中分离人MICAL2-PV蛋白的功能等价多肽。本发明的多肽包括由这样的DNA所编码的多肽，所述NDA与编码人MICAL2-PV蛋白的DNA序列的全部或部分杂交，并且本发明多肽与人MICAL2-PV蛋白的功能等价。这些多肽包括与衍生自人的蛋白对应的哺乳动物同源物(例如，猴，鼠，兔和牛基因编码的多肽)。当从动物分离与编码人MICAL2-PV蛋白DNA高度同源的cDNA时，具体优选使用来自睾丸的组织。
本领域技术人员可以常规选择用来分离编码人MICAL2-PV蛋白功能等价多肽的DNA的杂交条件。例如，杂交如下进行用“Rapid-hyb缓冲液”在68℃预杂交30min或更长，加入标记探针，68℃保温1h或更长。随后的洗涤步骤可在例如低严谨条件进行。低严谨条件是，例如42℃，2×SSC，0.1％SDS，或优选50℃，2×SSC，0.1％SDS。更优选，采用高严谨条件。高严谨条件是，例如室温、于2×SSC，0.01％SDS中洗涤3次每次20min，随后37℃，于1×SSC，0.1％SDS中洗涤3次每次20min，然后50℃，于1×SSC，0.1％SDS洗涤2次每次20min。虽然一些因素如温度和盐浓度会影响杂交的严谨性，本领域技术人员可以适当的选择这些因素以获得必要的严谨度。
可利用基因扩增方法如聚合酶链式反应(PCR)代替杂交，来分离编码人MICAL2-PV蛋白功能等价多肽的DNA，使用根据编码该蛋白的DNA的序列信息(SEQ ID NO3或5)合成的引物。
通过上述杂交技术或基因扩增技术分离的DNA编码的人MICAL2-PV蛋白的功能等价多肽通常与人MICAL2-PV蛋白的氨基酸序列高度同源。“高度同源”通常指40％同源性或更高，优选60％或更高，更优选80％或更高，甚至优选95％或更高。多肽的同源性可用“Wilbur and Lipman，ProcNatl Acad Sci USA 80726-30(1983)”的算法确定。
本发明多肽的氨基酸序列，分子量，等电点，糖链的存在或缺失，或形态可能发生变异，这取决于制备该多肽所使用的细胞或宿主或使用的纯化方法。不过，只要它的功能等同于本发明的人MICAL2-PV蛋白，它就属于本发明的范围。
可用本领域技术人员熟知的方法以重组蛋白或天然蛋白的形式制备本发明的多肽。重组蛋白如下制备将编码本发明多肽的DNA(例如，含SEQID NO3或5的核苷酸序列的DNA)插入合适的表达载体，将该载体导入合适的宿主细胞，获得提取物，使用其上固定有抗本发明蛋白抗体的柱或联合使用多个上述柱，对该提取物进行层析从而纯化所述多肽，所述层析如离子交换层析，反相层析，凝胶过滤或亲和层析。
当本发明多肽在宿主细胞(例如动物细胞和大肠杆菌)中被表达为与谷胱甘肽-S-转移酶蛋白融合的融合蛋白或附加了多个组氨酸的重组蛋白时，该表达的重组蛋白可用谷胱甘肽柱或镍柱纯化。或者，当本发明的多肽被表达为c-myc、多组氨酸或FLAG标记的蛋白时，其可分别使用抗c-myc、His或FLAG抗体检测和纯化。
纯化该融合蛋白后，还可能通过按需切除凝血酶或因子Xa除去与受试多肽不同的区域。
分离天然蛋白可采用本领域技术人员已知的方法，例如与亲和柱接触，其中与下述MICAL2-PV蛋白结合的抗体与表达本发明多肽的组织或细胞的提取物相结合。所述抗体可以是多克隆抗体或单克隆抗体。
本发明还包括本发明多肽的部分肽。该部分肽含有本发明多肽的特异性氨基酸序列，并由至少7个氨基酸，优选8个或更多氨基酸，更优选9个或更多氨基酸组成。所述部分肽可用于，例如制备抗本发明多肽的抗体，筛选与本发明多肽结合的化合物，筛选本发明多肽的促进剂(accelerator)或抑制剂。
可通过基因工程方法，已知的肽合成方法，或用合适的肽酶消化本发明多肽来制备本发明的部分肽。对于肽合成，可使用例如固相肽合成或液相肽合成。
本发明进一步提供了编码上述MICAL2-PV多肽的多核苷酸。本发明的多核苷酸可用于在体内或体外制备上述本发明的多肽，或者应用于疾病的基因治疗，所述疾病归因于编码本发明多肽的基因的遗传异常。可利用本发明多核苷酸的任意一种形式，只要它编码本发明的多肽，所述多核苷酸的形式包括mRNA，RNA，cDNA，基因组DNA，化学合成的多核苷酸。本发明的多核苷酸包括含有给定核苷酸序列的DNA及其简并序列，只要形成的DNA编码本发明的多肽。
可用本领域技术人员已知的方法制备本发明的多核苷酸。例如，本发明的多核苷酸可如下制备从表达本法明多肽的细胞中制备cDNA文库，用本发明DNA的部分序列(如SEQ ID NO3或5)作为探针进行杂交。cDNA文库可依照Sambrook等，Molecular Cloning，Cold Spring Harbor LaboratoryPress(1989)描述的方法制备；或者也可以使用可购得的cDNA文库。cDNA文库还可如下制备从表达本发明多肽的细胞中提取RNA，根据本发明DNA序列(如SEQ ID NO3或5)合成寡DNA，以该寡DNA为引物进行PCR，扩增编码本发明蛋白的cDNA。
另外，通过测序获得的cDNA的核苷酸序列，可以常规的确定cDNA编码的翻译区，也就可以容易地获得本发明多肽的氨基酸序列。而且，用获得的cDNA或其部分作为探针筛选基因组DNA文库，可以分离基因组DNA。
更具体地，可以首先从表达本发明目的多肽的细胞，组织或器官(例如睾丸)中制备mRNA。用已知的方法分离mRNA；例如用胍超速离心(guanidine ultracentrifugation)(Chirgwin等，Biochemistry 185294-9(1979))或AGPC方法(Chomczynski and Sacchi，Anal Biochem 162156-9(1987))制备总RNA。另外，用mRNA纯化试剂盒(Pharmacia)从总RNA中纯化mRNA。或者，用QuickPrep mRNA纯化试剂盒(Pharmacia)直接纯化mRNA。
利用逆转录酶从获得的mRNA合成cDNA。cDNA的合成可使用可购得的试剂盒，如AMV逆转录酶第一链cDNA合成试剂盒(Seikagaku Kogyo)。或者，用5’-RACE方法合成并扩增cDNA(Frohman等，Proc Natl Acad SciUSA 858998-9002(1988)；Belyavsky等，Nucleic Acids Res 172919-32(1989))，其中使用本文所述的引物，5’-Ampli FINDER RACE试剂盒(Clontech)以及聚合酶链式反应(PCR)。
从PCR产物制备所需的DNA片段并与载体DNA连接。重组载体用于转化大肠杆菌等，并从选出的集落中制备所需的重组载体。通过常规方法验证所需的DNA的核苷酸序列，例如双脱氧核苷酸链终止法(dideoxynucleotide chain termination)。
考虑到用于表达的宿主细胞中的密码子利用频率，设计本发明多核苷酸的核苷酸序列，使其更有效地表达(Grantham等，Nucleic Acids Res 943-74(1981))。可用商品化试剂盒或常规方法改变本发明多核苷酸的序列。例如，可用限制酶消化，插入合成的寡核苷酸或合适的多核苷酸片段，增加接头，或插入起始密码子(ATG)和/或终止密码子(TAA，TGA或标记)来改变所述序列。
具体地，本发明的多核苷酸包括含有SEQ ID NO3或5的核苷酸序列的DNA。
另外，本发明提供了多核苷酸，其在严谨条件下与具有SEQ ID NO3或5所示核苷酸序列的多核苷酸杂交，并编码上述与本发明MICAL2-PV蛋白功能等价的多肽。本领域技术人员可以适当选择严谨条件。例如，可采用低严谨条件。更优选，可采用高严谨条件。这些条件与前文所述条件相同。上述用于杂交的DNA优选cDNA或染色体DNA。
本发明还提供了与编码人MICAL2-PV蛋白的多核苷酸(SEQ ID NO3或5)或其互补链互补的多核苷酸，其包括至少15个核苷酸。本发明的多核苷酸优选与编码本发明MICAL2-PV蛋白的DNA特异性杂交。本文术语“特异性杂交”指在通常的杂交条件、优选严谨杂交条件下，与编码其它蛋白的DNA不发生明显的交叉杂交。这种多核苷酸包括探针，引物，核苷酸及核苷酸衍生物(例如，反义寡核苷酸和核酶)，它们与编码本发明多肽的DNA或其互补链特异性杂交。而且，这种多核苷酸可用于制备DNA芯片。
PCOTH如本发明所述，还鉴定了另一基因PCOTH，其在前列腺癌细胞中相对于相应的非癌性组织中尤其过表达。该鉴定的基因与LOC221179(XP_167955)同源。然而，发现PCOTH基因编码SEQ ID NO2(GenBank登录号AB113650)所示的100个氨基酸的蛋白，其由SEQ ID NO1所示的300个核苷酸组成的开放阅读框编码，所述开放阅读框与LOC221179(XP_167955)已知的阅读框不同。显示PCOTH含有胶原三螺旋重复，且其外源性产物位于细胞膜(图1)。因此，该基因称为“前列腺胶原三螺旋”。
因此，本发明提供了该基因编码的基本纯的多肽，包括含有SEQ ID NO2所示氨基酸序列的多肽及其功能等价体，使得它们编码PCOTH蛋白，并预计这种功能等价体比已知的LOC221179(XP_167955)编码的全长氨基酸序列短。PCOTH的功能等价多肽包括，例如对应于人PCOTH蛋白的其它生物体的同源蛋白以及人PCOTH蛋白的突变体。优选的PCOTH蛋白突变体包括含有SEQ ID NO2所示氨基酸序列的蛋白，其中一或多个氨基酸被取代和/或缺失。
本发明中，术语“功能等价”指受试多肽与PCOTH蛋白一样具有促进细胞增生的活性，并赋予癌细胞致癌活性的活性。受试多肽是否具有细胞增生活性可如下所述进行判断将编码受试多肽的DNA导入表达各个多肽的细胞，检测所述细胞的促进作用或集落形成活性的增加。这种细胞包括，例如，LNCaP，PC3和DU145。
在上述“MICAL2-PV”项中描述的相同的方法也可用于制备PCOTH蛋白及其功能等价体，其中使用SEQ ID NO1和2所述的序列信息。
本发明进一步提供了编码上述PCOTH多肽的多核苷酸。本发明的多核苷酸可用于在体内或体外制备上述本发明的多肽，或者应用于疾病的基因治疗，所述疾病归因于编码本发明多肽的基因的遗传异常。可利用本发明多核苷酸的任意一种形式，只要它编码本发明的多肽，所述多核苷酸的形式包括mRNA，RNA，cDNA，基因组DNA，化学合成的多核苷酸。本发明的多核苷酸包括含有给定核苷酸序列的DNA及其简并序列，只要形成的DNA编码本发明的多肽。这种多核苷酸也可以用“MICAL2-PV”项中描述的相似的方法制备，其中使用SEQ ID NO1和2所述的序列信息。
与MICAL2-PV相比，在睾丸和前列腺中检测到正常的PCOTH表达。因此，为制备PCOTH或其功能等价体、或PCOTH的mRNA，除了使用睾丸组织，还可以利用来自前列腺的组织。
载体和宿主细胞本发明还提供了其中导入了本发明多核苷酸的载体和宿主细胞。本发明的载体用于在宿主细胞中保留本发明的多核苷酸具体是DNA、用于表达本发明的多肽，或用于给予本发明的多核苷酸进行基因治疗。
当以大肠杆菌作为宿主细胞并在大肠杆菌中(例如JM109，DH5α，HB101或XL1Blue)大量的扩增和生产载体时，该载体应当具有在大肠杆菌中扩增的“复制起始点ori”，以及用于筛选转化的大肠杆菌的标记基因(例如，通过例如氨卡青霉素，四环素，卡那霉素，氯霉素等药物进行筛选的抗药基因)。例如，可使用M13系列载体，pUC系列载体，pBR322，pBluescript，pCR-Script等等。另外，也可使用pGEM-T，pDIRECT和pT7来进行亚克隆及提取cDNA和上述载体。当利用载体制备本发明的蛋白时，表达载体特别有用。例如，在大肠杆菌中表达的表达载体应当具备上述性质以便在大肠杆菌中扩增。当以大肠杆菌如JM109，DH5α，HB101或XL1Blue作为宿主细胞时，载体应当具有启动子，如lacZ启动子(Ward等，Nature 341544-6(1989)；FASEB J 62422-7(1992))，arab启动子(Better等，Science 2401041-3(1988))，T7启动子等，它们能在大肠杆菌中有效的表达所需的基因。在这方面，可使用例如pGEX-5X-1(Pharmacia)，“QIAexpress system”(Qiagen)，pEGFP和pET(在这种情况中，宿主优选表达T7 RNA聚合酶的BL21)代替上述载体。另外，该载体还可包含多肽分泌的信号肽序列。指导多肽分泌到大肠杆菌周质的信号肽序列的实例是pelB信号序列(Lei等，JBacteriol 1694379(1987))。将所述载体导入靶宿主细胞的方法包括，例如氯化钙法和电穿孔法。
除了大肠杆菌，还可利用例如哺乳动物表达载体(如pcDNA3(Invitrogen)和pEGF-BOS(Nucleic Acids Res 18(17)5322(1990))，pEF，pCDM8)，昆虫细胞表达载体(如“Bac-to-BAC杆状病毒表达系统”(GIBCO BRL)，pBacPAK8)，植物表达载体(如pMH1，pMH2)，动物病毒表达载体(如pHSV，pMV，pAdexLcw)，逆转录病毒表达载体(如pZIpneo)，酵母表达载体(毕赤酵母(如“Pichia)表达试剂盒”(Invitrogen)，pNV11，SP-Q01)，枯草杆菌(Bacillus subtilis)表达载体(如pPL608，pKTH50)制备本发明的多肽。
为了在动物细胞如CHO，COS或NIH3T3细胞中表达所述载体，该载体应当具有在这些细胞中表达所必需的启动子，例如SV40启动子(Mulligan等，Nature 277108(1979))，MMLV-LTR启动子，EF1α启动子(Mizushima等，NucleicAcids Res 185322(1990))，CMV启动子等，并优选具有用于筛选转化体的标记基因(如，经药物(例如新霉素，G418)选出的抗药基因)。已知具备这些性质的载体包括，例如pMAM，pDR2，pBK-RSV，pBK-CMV，pOPRSV和pOP13。
制备多肽本发明还提供了制备本发明多肽的方法。可通过培养宿主细胞来制备所述多肽，所述宿主细胞含有包含编码所述多肽的基因的表达载体。根据需要采用方法使所述基因稳定表达，同时增加细胞中该基因的拷贝数。例如，将含有互补DHFR基因的载体(如pCHO I)导入核酸合成途径被缺失的CHO细胞，然后由甲氨蝶呤(MTX)进行扩增。另外，当瞬时表达基因时，可采用下述方法将含有SV40复制起始点的载体(pcD等)转化入COS细胞，该细胞染色体包含SV40T抗原表达基因。
如上所述获得的本发明多肽可以从宿主细胞内或外(如培养基)分离，并纯化为基本纯的均质的多肽。本文给定多肽所用的术语“基本纯”是指该多肽基本上与其它生物大分子分离。基本纯的多肽指干重至少75％(如至少80，85，95，或99％)是纯的。用合适的标准方法测定纯度，所述方法例如柱层析，聚丙烯酰胺凝胶电泳或HPLC分析。多肽分离纯化的方法并不限于任何具体方法；事实上，可采用任何标准方法。
例如，可以适当选择并联合使用柱层析，过滤，超滤，盐沉淀，溶剂沉淀，溶剂提取，蒸馏，免疫沉淀，SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳，等电点电泳，透析和重结晶以分离纯化所述多肽。
层析的实例包括，例如亲和层析，离子交换层析，疏水层析，凝胶过滤，反相层析，吸附层析等(Strategies for Protein Purification andCharacterizationA Laboratory Course Manual.Ed.Daniel R.Marshak等，ColdSpring Harbor Laboratory Press(1996))。这些层析法可以液相层析如HPLC和FPLC进行。因此，本发明提供了上述方法制备的高纯度的多肽。
在纯化之前或之后用合适的蛋白修饰酶处理本发明的多肽，可任选修饰或部分缺失所述多肽。有用的蛋白修饰酶包括、但不限于胰蛋白酶，糜蛋白酶，赖氨酰内肽酶，蛋白激酶，糖苷酶等等。
抗体本发明提供了与本发明多肽结合的抗体。本发明的抗体可以任意形式如单克隆抗体或多克隆抗体进行使用，并且包括用本发明多肽免疫动物如兔获得的抗血清，所有类型的多克隆和单克隆抗体，人抗体以及通过基因重组制备的人源化抗体。
以本发明多肽作为抗原可以从任何动物种系获得抗体，但优选从哺乳动物诸如人、小鼠或大鼠，更优选从人获得抗体。来自人的多肽可从本文所述的核苷酸或氨基酸序列获得。如本发明所述，用作免疫抗原的多肽可以是完整的蛋白或蛋白的部分肽。部分肽包括，例如本发明多肽的氨基端(N)或羧基端(C)片段。
本文中，抗体定义为与本发明多肽的全长或其片段反应的蛋白。
将编码本发明多肽或其片段的基因插入到已知的表达载体，然后用该载体转化本文所述的宿主细胞。用任意标准方法从宿主细胞内或外回收所需多肽或其片段，并随后将所述多肽或其片段用作抗原。或者，以表达该多肽的整个细胞或其裂解物或化学合成多肽作为抗原。
用所述抗原免疫任意哺乳动物，但优选考虑与用于细胞融合的亲本细胞的相容性。通常使用啮齿目(Rodentia)，兔类(Lagomorpha)或灵长类(Primates)的动物。啮齿目动物包括，如小鼠，大鼠和仓鼠。兔类动物包括兔。灵长类动物包括，例如狭鼻猿(Catarrhini)(东半球猴(old world monkey))如Macaca fascicularis，恒河猴(rhesus monkey)，狒狒(sacred baboon)和黑猩猩(chimpanzee)。
用抗原免疫动物的方法是本领域中已知的。腹腔注射或皮下注射抗原是免疫动物的标准方法。更具体地，可以用适量的磷酸盐缓冲液(PBS)，生理盐水等稀释和悬浮抗原。如果需要，将抗原悬液与适量的标准佐剂如福氏(Freund’s)完全佐剂混合，形成乳液，然后给予哺乳动物。优选，将与适量福氏完全佐剂混合的抗原每4至21天给药数次。也可使用合适的载体进行免疫。上所述免疫后，用标准方法检验血清中所需的抗体数量的增加。
本发明多肽的多克隆抗体可如下制备从经免疫的动物(该动物经检测其血清中所需的抗体增加)收集血液，用任意常规的方法从所述血液中分离血清。多克隆抗体包括含多克隆抗体的血清且可从所述血清中分离含有该多克隆抗体的级分。利用例如与本发明多肽偶联的亲和层析柱，从仅识别本发明多肽的级分制备免疫球蛋白G或M，随后进一步用蛋白A或蛋白G柱纯化该级分。
为制备单克隆抗体，从用所述抗原免疫、并且如上述经检测血清中所需抗体水平增高的动物中收集免疫细胞，并进行细胞融合。用于细胞融合的免疫细胞优选获自脾。其它待与上述免疫细胞融合的优选亲本细胞包括，例如哺乳动物骨髓瘤细胞，更优选具备获得的特性以便用药物筛选融合细胞的骨髓瘤细胞。
根据已知的方法。如Milstein等(Galfre and Milstein，Methods Enzymol 733-46(1981))的方法将上述免疫细胞与骨髓瘤细胞融合。
通过在标准选择性培养基诸如HAT培养基(含次黄嘌呤，氨基蝶呤和胸苷的培养基)等中进行培养来选择细胞融合所得的杂交瘤。通常，细胞培养物在HAT培养基中连续培养数天至数周，该时间要足以使除了所需的杂交瘤细胞之外的所有其它细胞(非融合的细胞)死亡。然后，以标准有限稀释法筛选并克隆生产所需抗体的杂交瘤细胞。
除了上述以抗原免疫非人动物制备杂交瘤的方法外，人淋巴细胞诸如EB病毒感染的淋巴细胞也可在体外用多肽，表达多肽的细胞或其裂解物进行免疫。然后，被免疫的淋巴细胞与能模糊分裂的(indefinite dividing)、人来源的骨髓瘤细胞诸如U266融合，以获得产生与所述多肽结合的所需人抗体的杂交瘤细胞(未审查的日本专利申请(Unexamined Published JapanesePatent Application No.)(JP-A)Sho 63-17688)。
获得的杂交瘤细胞随后移植到小鼠的腹腔，并抽提腹水。获得的单克隆抗体可通过，例如硫酸铵沉淀、蛋白A或蛋白G柱、DEAE离子交换层析或偶联了本发明多肽的亲和柱进行纯化。本发明的抗体不仅可以用于纯化和检测本发明的多肽，还可以作为本发明多肽的候选激动剂和拮抗剂。另外，该抗体可应用于本发明多肽相关疾病的抗体治疗。当将获得的抗体给予人体(抗体治疗)时，优选人抗体或人源化抗体以降低免疫原性。
例如，用选自多肽，表达多肽的细胞或其裂解物的抗原来免疫具有人抗体基因库的转基因动物。然后从该动物收集产生抗体的细胞，将其与骨髓瘤细胞融合获得杂交瘤，从该杂交瘤制备抗所述多肽的人抗体(参见WO92-03918，WO93-2227，WO94-02602，WO94-25585，WO96-33735和WO96-34096)。
或者，用癌基因使产生抗体的免疫细胞如经免疫的淋巴细胞永生化，用于制备单克隆抗体。
如此获得的单克隆抗体也可以利用基因工程技术通过重组方法制备(参见，如Borrebaeck and Larrick，Therapeutic Monoclonal Antibodies，published in the United Kingdom by MacMillan Publishers LTD(1990))。例如，可从免疫细胞，如产生抗体的杂交瘤或经免疫的淋巴细胞来克隆编码该抗体的DNA，将该DNA插入合适的载体，并转入宿主细胞制备重组抗体。本发明还提供了如上所述制备的重组抗体。
另外，本发明的抗体可以是抗体片段或修饰的抗体，只要它结合一或多种本发明的多肽。例如，所述抗体片段可以是Fab，F(ab’)2，Fv或单链Fv(scFv)，其中H链和L链的Fv片段通过合适的接头连接(Huston等，Proc NatlAcad Sci USA 855879-83(1988))。更具体地，抗体片段可用酶如木瓜蛋白酶或胃蛋白酶处理抗体而生成。或者可构建编码该抗体片段的基因，将其插入合适的表达载体，并在适合的宿主细胞中表达(参见，如Co等，JImmunol 1522968-76(1994)；Better and Horwitz，Methods Enzymol 178476-96(1989)；Pluckthun and Skerra，Methods Enzymol 178497-515(1989)；Lamoyi，Methods Enzymol 121652-63(1986)；Rousseaux等，MethodsEnzymol 121663-9(1986)；Bird and Walker，Trends Biotechnol 9132-7(1991))。
抗体可通过与各种分子，如聚乙二醇(PEG)连接进行修饰。本发明提供了这种修饰的抗体。也可通过化学修饰抗体而获得修饰的抗体。这些修饰方法是本领域常规的。
或者，本发明的抗体可作为嵌合抗体而获得，所述嵌合抗体可变区来自非人抗体而恒定区来自人抗体；或者作为人源化抗体而获得，所述人源化抗体包括来自非人抗体的互补决定区(CDR)，来自人抗体的框架区(FR)以及恒定区。根据已知技术制备这种抗体。
如上所述获得的抗体可以纯化成均质的。例如，以用于普通蛋白的分离纯化方法进行抗体的分离纯化。例如，抗体可通过适当地选择并联合使用柱层析来分离及纯化，所述层析诸如亲和层析，过滤，超滤，盐析，透析，SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳及等电聚焦(AntibodiesA Laboratory Manual.Ed Harlow and David Lane，Cold Spring Harbor Laboratory(1988))等，但不限于此。蛋白A柱和蛋白G柱可用作亲和柱。可利用的示例性蛋白A柱包括，如Hyper D，POROS和Sepharose F.F.(Pharmacia)。
除了亲和层析，层析的实例还包括，如离子交换层析，疏水层析，凝胶过滤，反相层析，吸附层析等(Strategies for Protein Purification andCharacterizationA Laboratory Course Manual.Ed.Daniel R.Marshak等，ColdSpring Harbor Laboratory Press(1996))。层析过程可以通过液相层析诸如HPLC和FPLC等实施。
例如，通过测定吸光度，酶联免疫吸附分析(ELISA)，酶免疫分析(EIA)，放射免疫分析(RIA)和/或免疫荧光来测定本发明抗体的抗原结合活性。ELISA中，本发明的抗体固定在平板上，本发明的多肽施加于平板上，然后施加含有所需抗体的样品(诸如产生抗体的细胞的培养上清或纯化的抗体)。接着施加识别第一抗体并用酶诸如碱性磷酸酶标记的第二抗体，温育所述平板。洗涤后，向平板添加酶底物如磷酸对硝基苯酯，测定吸光度以评价样品的抗原结合活性。多肽片段，如C末端或N末端片段也可用作抗原来评价抗体的结合活性。根据本发明，可用BIAcore(Pharmacia)评价抗体的活性。
上述方法可以检测或测定本发明的多肽，这是通过将本发明的抗体暴露于假设含有本发明多肽的样品，检测或测定抗体和多肽形成的免疫复合物。
因为本发明所述的检测或测量多肽的方法可以特异性的检测或测量多肽，所以该方法能用于各种使用了多肽的实验。
反义多核苷酸，小干扰RNA和核酶本发明包括与SEQ ID NO1，3或5的核苷酸序列的任意位点杂交的反义寡核苷酸。该反义寡核苷酸优选针对SEQ ID NO1，3或5的核苷酸序列的至少15个连续的核苷酸。在上述至少15个连续的核苷酸中包含起始密码子的上述反义寡核苷酸是更优选的。
反义寡核苷酸的衍生物或修饰的产物也可作为反义寡核苷酸。这种修饰的产物包括低级烷基膦酸盐/酯修饰，如甲基膦酸盐型或乙基膦酸盐型，硫代磷酸酯(phosphorothioate)修饰以及氨基磷酸盐(phosphoroamidate)修饰。
本文所用的术语“反义寡核苷酸”不仅指其中对应于组成DNA或mRNA具体区域的核苷酸完全互补的寡核苷酸，还指包含一或多种错配核苷酸的寡核苷酸，条件是所述DNA或mRNA以及反义寡核苷酸能特异性的与SEQ ID NO1，3或5的核苷酸序列杂交。
这种多核苷酸包括在“至少15个连续核苷酸序列区域”中有至少70％同或70％以上、优选80％或80％以上、更优选90％或90％以上、甚至最优选95％或95％以上同源性的多核苷酸。本文所述的运算规则可用于确定同源性。本领域中已知的运算规则也可用于确定同源性。另外，所述反义寡核苷酸的衍生物或修饰产物也可作为本发明的反义寡核苷酸。这种修饰产物包括低级烷基膦酸盐/酯修饰，如甲基膦酸盐型或乙基膦酸盐型，硫代磷酸酯修饰以及氨基磷酸盐修饰。
这种反义多核苷酸可作为探针以分离或检测编码本发明多肽的DNA、或作为引物用于扩增。
本发明反义寡核苷酸的衍生物通过与编码多肽的DNA或mRNA结合作用于产生本发明多肽的细胞，抑制其转录或翻译，促进所述mRNA的降解，抑制本发明多肽的表达，因此抑制所述多肽的功能。
本发明还包括小干扰RNA(siRNA)，其含有SEQ ID NO1，3或5核苷酸序列的有义链核酸和反义链核酸的组合。更具体地，这种抑制MICAL2-PV表达的siRNA包括靶向SEQ ID NO27所示核苷酸序列的siRNA。或者，抑制PCOTH表达的siRNA包括靶向SEQ ID NO23所示核苷酸序列的siRNA。
术语“siRNA”意指可阻止靶mRNA翻译的双链RNA分子。可以采用标准技术将siRNA导入细胞，包括其中DNA是RNA转录模板的那些技术。所述siRNA包含编码人MICAL2-PV或PCOTH蛋白(SEQ ID NO1，3或5)的多核苷酸的有义核酸序列和反义核酸序列。所述siRNA被构建使得单个转录产物(双链RNA)具有靶基因例如发夹结构的有义序列和互补反义序列。
用Ambion网站(http//www.ambion.com/techlib/misc/siRNAfinder.html)的siRNA设计程序设计siRNA的核苷酸序列。根据下述方案由计算机程序选择si.RNA的核苷酸序列siRNA靶位点的选择1.从目标转录物的AUG起始密码开始，向下游扫描寻找AA双核苷酸序列。记录每个AA的出现，临近3′的19个核苷酸作为可能的siRNA靶位点。Tuschl等反对针对5′和3′非翻译区(UTR)和邻近起始密码子的区域(75个碱基之内)设计siRNA，因为上述区域可能较为富含调节性蛋白质结合位点。UTR结合蛋白质和/或翻译起始复合物可干扰与siRNA内切核酸酶复合物的结合的。
2.将所述潜在靶位与人类基因组数据库进行比较，不考虑与其它编码序列显著同源的任何靶序列。利用BLAST进行同源搜索，BLAST可在NCBI服务器找到，网址是www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/。
3.选择合格的靶序列用于合成。在Ambion，优选沿该基因选择数个靶序列进行评估。
本发明的反义寡核苷酸或siRNA抑制本发明多肽的表达，因此可用于抑制本发明多肽的生物活性。反义寡核苷酸和siRNA的长度是至少10个核苷酸，也可与天然转录物一样长。优选，反义寡核苷酸和siRNA有19-25个核苷酸。更优选，反义寡核苷酸和siRNA的长度少于75，50，25个核苷酸。
同样，含有本发明反义寡核苷酸或siRNA的表达抑制剂在抑制本发明多肽的生物活性方面是有用的。因此，含有本发明反义寡核苷酸或siRNA的组合物可用于治疗细胞增生性疾病，如前列腺癌。
另外，本发明提供了抑制本发明MICAL2-PV或PCOTH多肽表达的核酶。
通常，核酶分为大核酶和小核酶。大核酶是裂解核酸磷酸酯键的酶。与大核酶反应后，反应位点由5’-磷酸基团和3’-羟基基团组成。大核酶进一步分为(1)催化鸟苷在5’-剪接位点的酯基转移作用的组I内含子RNA；(2)催化经由套索样(lariat-like)结构经过两步反应自我剪接的组II内含子RNA；和(3)通过水解在5’位点切割tRNA前体的核糖核酸酶P的RNA组件。另一方面，小核酶与大核酶相比较较小(约40bp)，并且小核酶切割RNA产生5’-羟基和2’-3’环状磷酸酯。锤头型核酶(Koizumi等，FEBS LErr 228225(1988))和发夹型核酶(Buzayan，Nature 323349(1986)；Kikuchi and Sasaki，NucleicAcids Res 196751(1992))都包括在小核酶中。设计和构建核酶的方法是本领域中已知的(参见Koizumi等，FEBS Lett 228225(1988)；Koizumi等，Nucleic Acids Res 177059(1989)；Kikuchi and Sasaki，Nucleic Acids Res 196751(1992))。因此，也可以根据其序列信息(SEQ ID NO1，3或5)和这些常规方法来构建抑制本发明多肽表达的核酶。
针对MICAL2-PV或PCOTH基因的核酶抑制MICAL2-PV或PCOTH蛋白的过表达，因此有利于抑制蛋白的生物活性。所以核酶可用于治疗或预防前列腺癌。
诊断前列腺癌本发明还提供利用本发明多肽的表达水平作为诊断标志，诊断细胞增生性疾病如前列腺癌的方法。
该诊断方法包括下述步骤(a)检测本发明MICAL2-PV或PCOTH基因的表达水平；和(b)将所述表达水平的提高与前列腺癌相联系。
生物样品中MICAL2-PV或PCOTH基因的表达水平可以通过定量MICAL2-PV或PCOTH基因相应的mRNA或MICAL2-PV或PCOTH基因编码的蛋白来估计。mRNA的定量方法是本领域技术人员已知的。例如，与MICAL2-PV或PCOTH基因相应的mRNA的水平可通过Northern印迹或RT-PCR估计。因为MICAL2-PV或PCOTH基因的全长核苷酸序列如SEQ IDNO1，3或5所示，任何本领域技术人员都能够设计用于定量MICAL2-PV或PCOTH基因的探针或引物的核苷酸序列。
MICAL2-PV或PCOTH基因的表达水平也可以根据所述基因编码的蛋白的活性或量来分析。测定MICAL2-PV或PCOTH蛋白的量的方法如下。例如，免疫分析法可用于检测生物材料中的蛋白质。任何生物材料都可以作为生物样品以测定蛋白或其活性，只要标记基因(MICAL2-PV或PCOTH基因)在前列腺癌患者的样品中表达。例如，前列腺导管上皮就可作为这种生物样品。然而，也可以分析体液，如血液和尿液。另一方面，应根据待分析的每种蛋白的活性选择合适的方法来测定MICAL2-PV或PCOTH基因所编码蛋白的活性。
估计生物样品中MICAL2-PV或PCOTH基因的表达水平，并将其与正常样品(非患病受试者的样品)中所述基因的表达水平比较。当这种比较显示靶基因的表达水平高于正常样品中的时，则判断该受试者患前列腺癌。可以在同一时间测定正常受试者以及待诊断受试者的生物样品中MICAL2-PV或PCOTH基因的表达水平。或者所述表达水平的正常范围可通过统计方法确定，所述方法基于分析先前从对照组收集的样品中所述基因的表达水平所得的结果。将受试者的样品与所述正常范围进行比较获得结果，当该结果没有落入正常范围，则判断该受试者患有或易患前列腺癌。
本发明中，也提供了诊断细胞增生性疾病如前列腺癌的诊断试剂。本发明的诊断试剂包括与本发明的多核苷酸或多肽相结合的化合物。优选，将与本发明多核苷酸杂交的寡核苷酸或与本发明多肽结合的抗体用作这样的化合物。
本发明诊断前列腺癌的方法也应用于评价治疗受试者的前列腺癌的有效性。根据该方法，从接受前列腺癌治疗的受试者获得生物样品，如受试细胞。评价方法可根据传统的前列腺癌诊断方法进行。
如有需要，在治疗前，治疗过程中或治疗后的各个时间点从所述受试者获取生物样品。然后，测定生物样品中MICAL2-PV或PCOTH基因的表达水平，并与对照水平相比较，该对照水平来自例如包括其前列腺癌状态(即癌性细胞(cancerous cell)或非癌性细胞)已知的细胞的参照细胞群。所述对照水平在从没有暴露于治疗的生物样品中测定。
如果对照水平来自不含癌性细胞的生物样品，受试者生物样品中的表达水平与对照水平的相似性表示治疗是有效的。受试者生物样品中MICAL2-PV或PCOTH基因的表达水平与对照水平有差异，表示较不良好的临床结果或预后。
术语“有效”指治疗导致受试者中病理性上调的基因(MICAL2-PV或PCOTH基因)的表达降低，或受试者前列腺癌细胞的大小，患病率或增生的可能性减小。当进行预防性治疗时，“有效”指所述治疗延缓或阻止前列腺癌的发生。利用标准临床方案评估前列腺癌。此外，可联合任意已知的诊断或治疗前列腺癌的方法确定治疗的有效性。
此外，本发明诊断前列腺癌的方法也应用于评价患前列腺癌受试者的预后，其通过将患者来源的生物样品诸如受试细胞群中的MICAL2-PV或PCOTH基因的表达水平与对照水平比较来进行的。或者，可在疾病各阶段测定患者来源的生物样品中MICAL2-PV或PCOTH基因的表达水平，来评价患者的预后。
与正常对照水平相比，MICAL2-PV或PCOTH基因表达水平的增加表示预后较不良好。MICAL2-PV或PCOTH基因表达水平的降低表示患者的预后较好。
筛选化合物利用MICAL2-PV或PCOTH基因，所述基因或其转录调节区编码的蛋白，筛选改变该基因表达或改变该基因所编码多肽的生物活性的化合物。期望这种化合物能作为治疗或预防前列腺癌的药物。
因此，本发明提供了利用本发明多肽筛选用于治疗或预防前列腺癌的化合物的方法。这种筛选方法的实施方案包括以下步骤(a)将受试化合物与本发明多肽接触；(b)检测本发明多肽与受试化合物的结合活性；和(c)选择与本发明多肽结合的化合物。
用于筛选的本发明多肽可以是重组多肽或者天然来源的蛋白质或其部分肽。将与受试化合物接触的本发明多肽可以是，例如纯化的多肽，可溶性蛋白，与载体结合的形式或与其它多肽相融合的融合蛋白。
本领域技术人员熟知的许多方法都可作为利用本发明多肽筛选例如与本发明多肽结合的蛋白的方法。这种筛选通过，例如免疫沉淀方法进行，具体地以下述方式进行。将编码本发明多肽的基因插入外源基因表达载体诸如pSV2neo，pcDNA I，pcDNA3.1，pCAGGS和pCD8等，在动物细胞等中表达所述基因。用于表达的启动子是通常使用的任意启动子，包括，例如SV40早期启动子(Rigby in Williamson(ed.)，Genetic Engineering，vol.3.Academic Press，London，83-141(1982))，EF-α启动子(Kim等，Gene 91217-23(1990))，CAG启动子(Niwa等，Gene 108193-200(1991))，RSV LTR启动子(Cullen，Methods in Enzymology 152684-704(1987))，SRc启动子(Takebe等，Mol Cell Biol 8466(1988))，CMV立即早期启动子(Seed andAruffo，Proc Natl Acad Sci USA 843365-9(1987))，SV40晚期启动子(Gheysen and Fiers，J Mol Appl Genet 1385-94(1982))，腺病毒晚期启动子(Kaufman等，Mol Cell Biol 9946(1989))，HSV TK启动子等等。将基因导入动物细胞以表达外源基因可采用任意方法，例如电穿孔法(Chu等，NucleicAcids Res 151311-26(1987))，磷酸钙法(Chen and Okayama，Mol Cell Biol 72745-52(1987))，DEAE葡聚糖法(Lopata等，Nucleic Acids Res 125707-17(1984)；Sussman and Milman，Mol Cell Biol 41642-3(1985))，脂质体转染法(Derijard，B Cell 71025-37(1994)；Lamb等，Nature Genetics 522-30(1993)Rabindran等，Science 259230-4(1993))等等。本发明多肽也以融合蛋白的形式表达，所述融合蛋白包含单克隆抗体识别位点(表位)，所述位点通过将特异性已知的单克隆抗体的表位导入本发明多肽的N-或C-末端获得。可利用可购得的表位-抗体系统(Experimental Medicine 1385-90(1995))。利用其多克隆位点表达与，例如β-半乳糖苷酶，麦芽糖结合蛋白，谷胱甘肽-S-转移酶，绿色荧光蛋白(GFP)等融合的融合蛋白的载体是可购得的。
还报道了通过仅导入小表位而制备的融合蛋白，该小抗原表位包含几个至十几个氨基酸因而并不改变本发明融合多肽的性质。表位，如聚组氨酸(His-标记)，流感凝集素HA，人c-myc，FLAG，水泡性口膜炎病毒(Vesicularstomatitis virus)糖蛋白(VSV-GP)，T7基因10蛋白(T7-标记)，人单纯疱疹病毒(simple herpes virus)糖蛋白(HSV-标记)，E-标记(单克隆噬菌体的表位)等，以及识别它们的单克隆抗体都可以作为表位-抗体系统来筛选与本发明多肽结合的蛋白(Experimental Medicine 1385-90(1995))。
免疫沉淀法中，通过在用合适的洗涤剂制备的细胞裂解物中添加这些抗体形成免疫复合物。免疫复合物含有本发明的多肽，具有与所述多肽结合的能力的多肽以及抗体。除了使用如上所述制备的、针对上述表位的抗体，免疫沉淀法中还可以使用抗本发明多肽的抗体实施。
当抗体是小鼠IgG抗体时，可例如用蛋白A琼脂糖或蛋白G琼脂糖沉淀免疫复合物。如果本发明多肽制备成与表位如GST融合的融合蛋白形式，使用与这些抗原表位特异性结合的物质诸如谷胱甘肽琼脂糖4B等形成免疫复合物的方式可与使用抗本发明多肽的抗体时一样。
免疫沉淀法可根据例如文献记载的方法进行(Harlow and Lane，Antibodies，511-52，Cold Spring Harbor Laboratory publications，New York(1988))。
SDS-PAGE经常用来分析经免疫沉淀的蛋白，并且以合适浓度的凝胶根据蛋白的分子量也可以分析结合蛋白。因为与本发明多肽结合的蛋白很难用普通染色方法如考马斯染色或银染来检测，该蛋白的检测灵敏度可如下改进用含有放射性同位素35S-甲硫氨酸或35S-半胱氨酸的培养基培养细胞，标记细胞中的蛋白并检测该蛋白。当蛋白的分子量已知时，靶蛋白可以经SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳直接纯化并确定其序列。
例如West-Western印迹分析(Skolnik等，Cell 6583-90(1991))可作为利用多肽筛选与本发明多肽结合的蛋白的方法。具体地，与本发明多肽结合的蛋白可如下获得从细胞，组织，器官(例如，组织诸如睾丸等用于MICAL2-PV，睾丸和前列腺用于PCOTH)，或者培养的细胞(例如LNCaP，PC3，DU145)制备cDNA文库，其中预计利用噬菌体载体(如ZAP)表达与本发明多肽结合的蛋白；在LB琼脂糖中表达蛋白；将表达的蛋白固定在滤膜上；经纯化和标记的本发明多肽与上述滤膜反应；根据标记检测表达与本发明多肽结合的蛋白的噬斑。本发明多肽的标记可利用生物素和抗生物素蛋白之间的结合，或利用特异性与本发明多肽结合的抗体，或与本发明多肽融合的肽或多肽(如GST)。也可以采用放射性同位素或荧光法等方法。
或者，本发明筛选方法的另一个实施方案中，采用了利用细胞的双杂交系统(two-hybrid system)(“MATCHMAKER双杂交系统”，“哺乳动物MATCHMAKER双杂交试验试剂盒”，“MATCHMAKER单杂交(one-hybrid)系统”(Clontech)；“HybriZAP双杂交载体系统”(Stra标记ene)；参考文献“Dalton and Treisman，Cell 68597-612(1992)”，“Fields and Sternglanz，TrendsGenet 10286-92(1994)”)。
双杂交系统中，本发明多肽与SRF-结合区或GAL4-结合区融合并在酵母细胞中表达。从预计表达与本发明多肽结合的蛋白的细胞中制备cDNA文库，使得当所述文库表达时，即与VPl6或GAL4的转录激活区融合。然后将该cDNA文库导入上述酵母细胞，从检测的阳性克隆中分离来自该文库的cDNA(当与本发明多肽结合的蛋白在酵母细胞中表达时，两者的结合激活报告基因，使得阳性克隆可以检测到)。将上述分离的cDNA导入大肠杆菌并表达该蛋白从而制备该cDNA编码的蛋白。
除了HIS3基因，例如Ade2基因，lacZ基因，CAT基因，萤光素酶基因等也可用作报告基因。
与本发明多肽结合的化合物也可利用亲和层析进行筛选。例如，将本发明多肽固定在亲和层析柱的载体上，并将含有能与本发明多肽结合的蛋白的受试化合物施加于层析柱。本文的受试化合物可以是，例如细胞提取物，细胞裂解物等。装载该受试化合物后，洗涤柱，制备与本发明多肽结合的化合物。
当受试化合物是蛋白质时，分析所得蛋白的氨基酸序列，根据该序列合成寡DNA，用该寡DNA作为探针筛选cDNA文库获得编码该蛋白的DNA。
利用表面胞质团共振现象的生物传感器可作为检测或定量本发明结合的化合物的一种方法。当使用这种生物传感器时，本发明多肽和受试化合物之间的相互作用可作为表面胞质团共振信号而被实时观察，仅仅使用极少量的多肽并且不需要标记(例如BIAcore，Pharmacia)。因此，有可能利用生物传感器如BIAcore评估本发明多肽和受试分子之间的结合。
筛选当本发明固定化的多肽暴露于合成化合物、或天然物质库、或随机噬菌体肽展示文库时发生结合的分子的方法，以及根据组合化学技术(Wrighton等，Science 273458-64(1996)；Verdine，Nature 38411-13(1996)；Hogan，Nature 38417-9(1996))利用高通量分离与本发明蛋白(包括激动剂和拮抗剂)结合的蛋白以及化合物的筛选方法是本领域技术人员熟知的。
另外，本发明提供了一种利用本发明多肽筛选用于治疗或预防前列腺癌的化合物的方法，包括以下步骤(a)将受试化合物与本发明多肽接触；(b)检测步骤(a)中多肽的生物活性；和(c)选择抑制所述多肽的生物活性化合物，所述生物活性是与没有受试化合物时检测到的多肽生物活性相比。
因为本发明MICAL2-PV和PCOTH蛋白具有促进前列腺癌细胞增生的活性，所以用这种活性作为指标可以筛选化合物，所述化合物促进或抑制本发明蛋白之一的这种活性。
可用任何多肽进行筛选只要它们有MICAL2-PV或PCOTH蛋白的生物活性。这种生物活性包括人MICAL2-PV或PCOTH蛋白的细胞增生活性，MICAL2-PV与肌动蛋白结合的活性。例如，也可使用人MICAL2-PV或PCOTH蛋白及其功能等价多肽。这种多肽可由细胞内源性或外源性表达。
通过这种筛选分离的化合物是本发明多肽的激动剂或拮抗剂。术语“激动剂“指通过与其结合活化本发明多肽的功能的分子。同样，“拮抗剂”指通过与其结合抑制本发明多肽功能的分子。而且，通过这种筛选分离的化合物是抑制本发明多肽与分子(包括DNA和蛋白质)在体内的相互作用的候选化合物。
当本发明方法中所检测的生物活性是细胞增生时，可例如下述进行检测制备表达本发明多肽的细胞，在存在受试化合物的情况下培养所述细胞，测定细胞增生速度，测量细胞周期等，以及如实施例所述测量集落形成活性。
另一实施方案中，本发明提供了筛选用于治疗或预防前列腺癌的化合物的方法。如前文所详细讨论的，通过控制MICAL2-PV或PCOTH的表达水平，我们可以控制前列腺癌的发病和进程。因此，通过以MICAL2-PV或PCOTH表达水平作为标志进行筛选可鉴定用于治疗或预防前列腺癌的化合物。在本发明的上下文中，这种筛选包括，例如下述步骤将受试化合物与表达MICAL2-PV或PCOTH的细胞接触；和筛选与没有该受试化合物时检测到的MICAL2-PV或PCOTH表达水平相比降低MICAL2-PV或PCOTH表达水平的化合物。
表达至少一种MICAL2-PV或PCOTH的细胞包括，例如从前列腺癌建立的细胞系；这种细胞可用于本发明上述的筛选方法(例如LNCaP，PC3，DU145)。根据本领域技术人员熟知的方法估计所述表达水平。筛选方法中，选择降低至少一种MICAL2-PV或PCOTH表达水平的化合物作为治疗或预防前列腺癌的候选试剂。
或者，本发明筛选方法包括以下步骤a)使受试化合物与导入了载体的细胞接触，该载体含有一或多种标记基因的转录调节区以及在该转录调节区控制下表达的报道基因，其中一或多种标记基因是MICAL2-PV和PCOTH，b)测定所述报道基因的活性；和c)选择与对照相比降低所述报道基因表达水平的化合物。
适合的报道基因和宿主细胞是本领域已知的。筛选所需的报道构建体可利用标记基因的转录调节区来制备。如果标记基因的转录调节区是本领域技术人员已知的，可利用前面的序列信息制备报道构建体。当标记基因的转录调节区是未确定的，可根据该标记基因的核苷酸序列信息从基因组文库分离含有转录调节区的核苷酸片段。
本发明筛选用于治疗或预防前列腺癌的化合物的方法的另一个实施方案中，该方法利用了MICAL2-PV与肌动蛋白的结合能力。发现本发明的MICAL2-PV蛋白包括与calponin(肌动蛋白结合结构域)同源的结构域。因此，预计MICAL2-PV编码的蛋白与肌动蛋白或其它微管蛋白相互作用。这些结构域使肌动蛋白丝交联成束或网。这些发现暗示本发明MICAL2-PV蛋白经由与分子如肌动蛋白或其它微管蛋白结合而发挥细胞增生的功能。因此，期望抑制MICAL2-PV蛋白和肌动蛋白以及其它微管蛋白之间的结合能抑制细胞增生，并且抑制这种结合的化合物可作为治疗或预防前列腺癌的药物。
该筛选方法包括以下步骤(a)在受试化合物存在的情况下，将本发明MICAL-PV多肽与肌动蛋白接触；(b)检测所述多肽与肌动蛋白的结合；和(c)筛选抑制所述多肽与肌动蛋白结合的化合物。
用于筛选的本发明MICAL-PV多肽和肌动蛋白可以是重组多肽或天然来源的蛋白或它们的部分肽，只要它们保持彼此结合的能力。用于筛选的本发明MICAL-PV多肽和肌动蛋白可以是，例如纯化的多肽，可溶性多肽，与载体结合的形式或与其它多肽融合的融合蛋白。
本领域技术人员熟知的许多方法都可以作为筛选可抑制MICAL-PV蛋白与肌动蛋白之间结合的化合物的方法。这种筛选可以在体外实验系统，如细胞体系中进行。更具体地，首先，MICAL-PV多肽或肌动蛋白的其中之一结合在支持物上，再加入另一种蛋白和受试化合物。接着，温育混合物，洗涤，检测和/或测定结合在支持物上的另一种蛋白。
结合蛋白所用的支持物包括不溶性多糖，如琼脂糖，纤维素和葡聚糖；以及合成树脂，如聚丙烯酰胺，聚苯乙烯和硅胶；优选使用上述材料制备的商品化珠或板(例如，多孔板，生物传感器芯片等)。当使用珠时，将其装填在柱中。
蛋白与支持物的结合可根据常规方法进行，如化学结合和物理吸收。或者，经由特异性识别蛋白的抗体将该蛋白与支持物结合。另外，也可通过抗生物素蛋白和生物素连接蛋白与支持物。
蛋白之间的结合在缓冲液中进行，例如但不限于磷酸盐缓冲液和Tris缓冲液，只要缓冲液不抑制蛋白之间的结合。
本发明中，利用表面胞质团共振现象的生物传感器可作为检测或定量结合蛋白的一种方法。当使用这种生物传感器时，蛋白之间的相互作用可作为表面胞质团共振信号而进行实时观察，仅仅使用极少量的多肽并且不需要标记(例如BIAcore，Pharmacia)。因此，有可能利用生物传感器，如BIAcore评估MICAL2-PV多肽和肌动蛋白之间的结合。
或者，标记MICAL-PV多肽或肌动蛋白之一，结合的蛋白的标记可用于检测或测定结合蛋白。具体地，预先标记其中一种蛋白之后，在受试化合物存在的情况下，使标记蛋白与另一种蛋白接触，洗涤，并根据所述标记检测或测定结合蛋白。
标记物质，如放射性同位素(即3H，14C，32P，33P，35S，125I，131I)，酶(即碱性磷酸酶，辣根过氧化物酶，β-半乳糖苷酶，β-葡萄糖苷酶)，荧光物质(即异硫氰酸荧光素(fluorescein isothiosyanete)(FITC)，若丹明)和生物素/抗生物素蛋白都可用于本发明方法中来标记蛋白。当以放射性同位素标记蛋白时，用液体闪烁法进行检测或测定。或者，用酶标记的蛋白的检测或测定可通过添加酶底物，检测底物的酶学变化，如用比色剂检测颜色的产生来进行。另外，当荧光物质用作标记的情况，用荧光光度计检测或测定结合蛋白。
此外，MICAL2-PV多肽和肌动蛋白的结合也可以用MICAL2-PV多肽和肌动蛋白的抗体检测或测定。例如，固定在支持物上的MICAL2-PV多肽与受试化合物和肌动蛋白接触后，温育混合物，洗涤，用抗肌动蛋白的抗体进行检测或测定。或者，将肌动蛋白固定在支持物上，以MICAL2-PV抗体作为检测抗体。
本发明筛选中使用抗体时，该抗体优选用上述标记物质之一标记，并根据该标记物质检测或测定。或者，MICAL2-PV多肽或肌动蛋白抗体作为第一抗体，其可用经过标记物质标记的第二抗体检测。另外，本发明筛选方法中与蛋白结合的抗体可用蛋白G或蛋白A柱检测。
另外，本发明筛选方法的另一个实施方案中，采用了利用细胞的双杂交系统(“MATCHMAKER双杂交系统”，“哺乳动物MATCHMAKER双杂交试验试剂盒”，“MATCHMAKER单杂交系统”(Clontech)；“HybriZAP双杂交载体系统”(Stratagene)；参考文献“Dalton and Treisman，Cell 68597-612(1992)”，“Fields and Sternglanz，Trends Genet 10286-92(1994)”)。
双杂交系统中，本发明MICAL2-PV多肽与SRF-结合域或GAL4-结合域融合并在酵母细胞中表达。与本发明MICAL2-PV多肽结合的肌动蛋白与VP16或GAL4的转录激活区融合，并且在有受试化合物存在的情况下也在酵母细胞中表达。当受试化合物不抑制MICAL2-PV多肽和肌动蛋白的之间的结合时，两者的结合激活报告基因，使阳性克隆能被检测到。
除了HIS3基因，Ade2基因，lacZ基因，CAT基因，萤光素酶基因等也可作为报告基因。
任何受试化合物，例如，细胞提取物，细胞培养上清液，微生物发酵产物，海洋生物提取物，植物提取物，纯化的或粗制的蛋白，肽，非肽化合物，合成的小分子化合物以及天然化合物都可用在本发明的筛选方法中。本发明受试化合物可使用本领域已知的组合文库中的多种方法之一获得，所述文库包括(1)生物学文库，(2)空间定位平行固相或液相文库(spatiallyaddressable parallel solid phase or solution phase libraries)(3)需要重叠合法(deconvolution)的合成文库法，(4)“一珠一化合物(one bead one compound)”文库法和(5)使用亲和层析筛选的合成文库法。使用亲和层析筛选的生物学文库法仅限于肽文库，而其它四种方法适用于肽，非肽寡聚体或化合物小分子文库(Lam(1997)Anticancer Drug Des.12145)。合成分子文库的方法的举例见于下述文献(DeWitt等(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 906909；Erb等(1994)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 9111422；Zuckermann等(1994)J.Med.Chem.372678；Cho等(1993)Science 2611303；Carell等(1994)Angew.Chem.Int.Ed.Engl.332059；Carell等(1994)Angew.Chem.Int.Ed.Engl.332061；Gallop等(1994)J.Med.Chem.371233)。化合物文库可存在于溶液(参见Houghten(1992)Bio/Techniques 13412)或珠(Lam(1991)Nature 35482)，芯片(Fodor(1993)Nature 364555)，细菌(美国专利5,223,409)，孢子(美国专利5,571,698；5,403,484，and 5,223,409)，质粒(Cull等(1992)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 891865)或噬菌体(Scott and Smith(1990)Science 249386；Delvin(1990)Science 249404；Cwirla等(1990)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 876378；Felici(1991)J.Mol.Biol.222301；美国专利申请2002103360)。
由本发明筛选方法分离的化合物是促进或抑制本发明多肽活性的候选药物，其用于治疗或预防由于例如细胞增生而导致的疾病如前列腺癌。由由本发明筛选方法获得的化合物还包括这样的化合物，其中由本发明筛选方法获得的化合物的部分结构经添加，缺失和/或取代修饰而改变。
治疗或预防前列腺癌的药物组合物本发明提供了用于治疗或预防前列腺癌的组合物，包含由本发明筛选方法选出的任意化合物。
当通过本发明筛选方法分离的化合物作为药物而施用于人类和其它哺乳动物诸如小鼠、大鼠、豚鼠、兔、猫、犬、绵羊、猪、牛、猴、狒狒以及猩猩来治疗细胞增生性疾病(例如前列腺癌)时，该分离的化合物可被直接施用或可采用已知的药物制备方法而被制成剂型。例如，根据需要，该药物可作为糖衣片剂，胶囊剂，酏剂和微囊剂而口服，或以水或任何其它可药用的液体的无菌溶液或悬浮液的注射液形式以非口服方式施用。例如，该化合物可与可药用的载体或介质以通常可接受的药物制备方法所需的单位剂型进行混合，所述载体或介质具体而言为无菌水，生理盐水，植物油，乳化剂，悬浮剂，表面活性剂，稳定剂，调味剂，赋形剂，载体，防腐剂，粘合剂等。这些制剂中活性成分的量为所述范围内的适宜剂量。
可混合至片剂和胶囊的添加剂的实例是，粘合剂诸如明胶，玉米淀粉，黄蓍胶和阿拉伯胶；赋形剂诸如微晶纤维素；溶胀剂诸如玉米淀粉，明胶和海藻酸；润滑剂诸如硬脂酸镁；增甜剂诸如蔗糖，乳糖或糖精；以及调味剂诸如薄荷，Gaultheria adenothrix油和樱桃红(cherry)。当单位剂型是胶囊时，液体载体诸如油，也可进一步包括在上述成份中。用于注射的无菌组合物可按照标准的药物制备方法采用载体诸如用于注射的蒸馏水进行制备。
生理盐水，葡萄糖，以及包含佐剂诸如D-山梨糖醇、D-甘露糖、D-甘露醇和氯化钠的其它等张液可被用作注射用含水溶液。其可与适宜的增溶剂，诸如醇，具体地乙醇，多元醇诸如丙二醇和聚乙二醇，非离子表面活性剂，诸如聚山梨醇酯(Polysorbate)80(TM)和HCO-50联合使用。
麻油或大豆油可用作油性液体，其可与以下物质联合使用用作增溶剂的苯甲酸苄酯或苯甲醇，可采用缓冲液诸如磷酸盐缓冲液和醋酸钠缓冲液进行配制；止痛药，诸如盐酸普鲁卡因；稳定剂，诸如苯甲醇和苯酚；和抗氧化剂。可将制备的注射剂装于适宜的安瓿中。
可采用本领域技术人员众所周知的方法将本发明的药物组合物给药患者，例如以动脉内，静脉内，或经皮注射的方式，也可以经鼻内、经支气管、经肌内或口服投药。施用的剂量和方法根据患者的体重和年龄以及施用方法而改变；然而，本领域技术人员可常规地选择适宜的施用方法。如果所述化合物可由DNA编码，可将该DNA插入用于基因治疗的载体中，并施用该载体来实施治疗。施用的剂量和方法根据患者的体重，年龄和症状而改变但本领域技术人员能适当地对其进行选择。
例如，不同症状适宜的剂量不同，但经口服施用于正常成年受试者(体重60kg)时，与本发明多肽结合并调节其活性的化合物的剂量为约0.1mg-约100mg/日，优选约1.0mg-约50mg/日且更优选约1.0mg-约20mg/日。
当经胃肠外以注射剂方式施用于正常成年受试者(体重60kg)时，虽然根据患者、靶器官、症状和施用方法而存在一些差异，适于静脉内注射的剂量是约0.01mg-约30mg/日，优选约0.1-约20mg/日且更优选约0.1-约10mg/日。而且，当用于其它动物时，可以施用按60kg体重转换的量。
另外，本发明提供了治疗或预防前列腺癌的药物组合物，含有抑制MICAL2-PV或PCOTH基因表达的活性成分。这种活性成分包括抗MICAL2-PV或PCOTH基因的反义聚核苷酸，siRNA或核酶或其衍生物，如所述反义多核苷酸，siRNA或核酶的表达载体。
这些活性成分可与合适的，相对于衍生物无活性的基质混合制成外用制剂，如涂敷膏药(liniment)或敷剂(poultice)。同样，如果需要，通过添加赋形剂，等张剂，助溶剂，稳定剂，防腐剂，止痛药等，这些活性成分可制成片剂，粉剂，颗粒剂，胶囊，脂质体胶囊，注射剂，溶液剂，滴鼻剂以及冻干剂。依照常规方法制备这些制剂。
给予患者这些活性成分可以通过直接将这些活性成分施用在患病部位或通过将其注射入血管使其到达患病部位。还可以使用封固剂以增加耐久性和膜通透性。封固剂的实例包括脂质体，聚-L-赖氨酸，脂质、胆固醇，脂转染剂或其衍生物。
根据患者的情况适当调整本发明组合物的剂量并以所需用量使用。例如，给药剂量范围为0.1至100mg/kg，优选0.1至50mg/kg。
本发明另一个实施方案中，治疗或预防前列腺癌的组合物包含抗MICAL2-PV或PCOTH基因编码多肽的抗体或与该多肽结合的该抗体的片段。
虽然不同症状的适宜剂量不同，当口服给予普通成年人(体重60kg)时，治疗或预防前列腺癌的抗体或其片段的剂量是约0.1mg至约100mg/天，优选约1.0mg至约50mg/天，更优选约1.0mg至约20mg/天。
当以胃肠外注射形式给予普通成年人(体重60kg)药物时，虽然根据患者的情况，疾病的症状以及给药方式存在一些不同，静脉注射的适宜剂量是约0.01mg至约30mg/天，优选约0.1mg至约20mg/天，更优选约0.1mg至约10mg/天。对于其它动物，以根据60kg体重换算的剂量给药。
治疗或预防前列腺癌的方法本发明提供了一种治疗或预防受试者前列腺癌的方法。对患有或易患(或疑似患有)前列腺癌的受试者预防性或治疗性地给予治疗化合物。这种受试者可以用标准临床方法或通过检测MICAL2-PV或PCOTH的异常表达水平或活性进行鉴定。在显现出明显的疾病临床症状之前可预防性给药，从而预防疾病或病症或者延缓其进展。
治疗方法包括降低MICAl2-PV或PCOTH基因的表达或/和功能。这些方法中，用治疗有效量的化合物治疗受试者，该化合物减少受试者中过表达的MICAL2-PV和/或PCOTH基因。可以全身给药或局部给药。治疗性化合物包括降低内源性存在于前列腺癌细胞的基因的表达水平的化合物(即，下调所述过表达基因的表达的化合物)。给予这种治疗性化合物能抵消目的细胞中异常过表达的基因的影响，并预计能改善受试者的临床状况。这种化合物可由上述本发明筛选方法获得。
MICAL2-PV或PCOTH的表达也可以用本领域已知的一些方法中的任意方法来抑制，包括给予受试者抑制或拮抗所述基因表达的核酸。破坏该基因表达的反义寡核苷酸，siRNA或核酶都可用于抑制该基因的表达。
如上所述，对应于MICAL2-PV或PCOTH基因的核苷酸序列的反义寡核苷酸可用于降低MICAL2-PV或PCOTH基因的表达水平。具体地，本发明的反义寡核苷酸通过与MICAL2-PV或PCOTH基因或其相应mRNA编码的任意多肽结合而发挥作用，因此抑制所述基因的转录或翻译，促进所述mRNA的降解，和/或抑制所述基因所编码蛋白的表达，最终抑制MICAL2-PV或PCOTH蛋白的功能。
反义寡核苷酸及其衍生物可通过与合适的、相对于所述衍生物无活性的基质混合制成外用制剂，如涂敷膏药或敷剂，并用在本发明治疗或预防前列腺癌的方法中。
抑制过表达基因的一或多种基因产物的核酸还包括小干扰RNA(siRNA)，它含有MICAL2-PV或PCOTH基因核苷酸序列的有义链核酸和反义链核酸的组合。将siRNA导入细胞的标准技术可用于本发明所述的治疗或预防，包括其中以用于转录RNA的DNA为模板的那些技术。所述siRNA被构建成单个转录产物具有来自靶基因例如发夹结构的的有义序列和互补反义序列。
所述方法用于抑制MICAL2-PV或PCOTH基因的表达上调的细胞的基因表达。靶细胞中siRNA与MICAL2-PV或PCOTH基因转录物的结合导致细胞中产生的MICAL2-PV或PCOTH蛋白减少。
抑制过表达基因的一或多种基因产物的核酸还包括抗过表达基因(MICAL2-PV或PCOTH基因)的核酶。
另外，本发明提供了一种用抗本发明多肽的抗体治疗或预防细胞增生性疾病诸如前列腺癌的方法。根据该方法，给予药物有效量的抗本发明多肽的抗体。因为前列腺癌细胞中MICAL2-PV和PCOTH蛋白的表达上调，并且抑制这些蛋白的表达能降低细胞增生活性，所以预计将所述抗体与这些蛋白结合可以治疗或预防细胞增生性疾病。因此，抗本发明多肽的抗体以足以降低本发明蛋白的活性的剂量给药，该剂量是约0.1至约250mg/天。成年人的剂量范围通常从约5mg至约17.5g/天，优选约5mg至约10g/天，最优选100mg至约3g/天。
另外，用与肿瘤细胞特异性细胞表面标志物结合的抗体作为药物递送工具。例如，以足以杀伤肿瘤细胞的剂量给予与细胞毒剂偶联的抗体。
本发明还涉及诱导抗肿瘤免疫的方法，包括给予MICAL2-PV或PCOTH蛋白或其免疫活性片段，或编码所述蛋白或其片段的多核苷酸的步骤。MICAL2-PV或PCOTH蛋白或其免疫活性片段可用作抗细胞增生性疾病诸如前列腺癌等的疫苗。一些情况中，蛋白或其片段以结合于T细胞受体(TCR)的形式或由抗原呈递细胞(APC)如巨噬细胞，树突细胞(DC)或B细胞呈递的形式给予。由于DC细胞的强抗原呈递活性，APC中最优选使用DC细胞。
本发明中，抗细胞增生性疾病的疫苗指具有一经接种到动物便具有抗肿瘤免疫的物质。通常，抗肿瘤免疫包括下述免疫反应-诱导抗肿瘤的细胞毒淋巴细胞，-诱导识别肿瘤的抗体，和-诱导抗肿瘤细胞因子的产生。
因此，当某种蛋白在接种动物中诱导这些免疫反应的任意一种时，则确定该蛋白具备抗肿瘤免疫诱导效应。通过在体内或体外观察宿主免疫系统对蛋白的反应检测蛋白对抗肿瘤免疫的诱导。
例如，检测诱导细胞毒T淋巴细胞的方法是已知的。进入活体的外来物质经过抗原呈递细胞(APC)的作用呈递到T细胞和B细胞。对APC以抗原特异性方式呈递的抗原有反应的T细胞由于受到该抗原的刺激，分化成细胞毒T细胞(或细胞毒T淋巴细胞，CTL)，随后进行增殖(本文中称为T细胞激活)。因此，具体肽对CTL的诱导可通过由APC将肽呈递到T细胞来评估，并检测对CTL的诱导。另外，APC能激活CD4+T细胞，CD8+T细胞，巨噬细胞，嗜酸性粒细胞和NK细胞。因为CD4+T细胞和CD8+T细胞对抗肿瘤免疫也很重要，所以肽的抗肿瘤免疫诱导作用可利用这些细胞的活化效应作为指示物进行评价。
用树突细胞(DC)作为APC评价对CTL的诱导作用的方法是本领域已知的。DC是一种代表性APC，它的CTL诱导活性在APC中最强。在本方法中，受试多肽首先与DC接触，然后该DC与T细胞接触。与DC接触后若检测到T细胞对感兴趣的细胞有细胞毒效应，则说明受试多肽具有诱导细胞毒T细胞的活性。CTL的抗肿瘤活性可利用例如，51Cr-标记的肿瘤细胞的溶解作为指示进行检测。或者，利用3H-胸苷吸收活性或LDH(乳糖脱氢酶)-释放作为指示物，评价肿瘤细胞损伤程度的方法也是本领域已知的。
除了DC，外周血单核细胞(PBMC)也可作为APC。有报道当存在GM-CSF和IL-4时培养PBMC能促进CTL的诱导。类似地，当存在匙孔血蓝蛋白(keyhole limpet hemocyanin)(KLH)和IL-7时培养PBMC也能诱导CTL。
经这些方法证实具有CTL诱导活性的受试多肽是具备DC活化效应以及随后的CTL诱导活性的多肽。因此，诱导抗肿瘤细胞CTL的多肽可用作抗肿瘤的疫苗。另外，通过与该多肽接触而获得了诱导抗肿瘤CTL能力的APC也可用作抗肿瘤的疫苗。此外，由于APC对多肽抗原的呈递而获得了细胞毒性的CTL也可作为抗肿瘤的疫苗。这种利用由APC和CTL造成的抗肿瘤免疫治疗肿瘤的方法称作细胞免疫疗法。
通常，当使用多肽进行细胞免疫疗法时，已知联合使用具有不同结构的多种多肽并将它们与DC接触可以增加CTL诱导的效率。因此，当用蛋白片段刺激DC时，使用多种类型片段的混合物是有利的。
或者，多肽的抗肿瘤免疫诱导作用可通过观察到诱导抗肿瘤抗体的产生而证实。例如，当在用多肽免疫的实验室动物中诱导了抗多肽的抗体时，以及肿瘤细胞的生长被这些抗体抑制时，则确定该多肽具有诱导抗肿瘤免疫的能力。
通过给予本发明的疫苗诱导抗肿瘤免疫，并且抗肿瘤免疫的诱导使得可以治疗和预防细胞增生性疾病诸如前列腺癌等。治疗癌症或预防癌症发病包括下述任意步骤，诸如抑制癌性细胞的生长，癌症的退化以及抑制癌症的发生。降低癌症患者受试者的死亡率，减少血液中的肿瘤标志物，减轻伴随癌症的可检测的症状等，都包括在治疗或预防癌症的效果中。这种治疗或预防效果优选是统计学上显著的。例如，在观察中，显著性水平是5％或更低时，将抗细胞增生性疾病的疫苗的治疗或预防效果与不给予疫苗的对照组进行比较。如，Student’s t-检验，曼-惠特尼U-检验或ANOVA都可用来进行统计分析。
上述具有免疫活性的蛋白或编码该蛋白的载体可与佐剂联合。佐剂指当与具有免疫活性的蛋白同时给予(或相继给予)时，能促进针对该蛋白的免疫反应的化合物。佐剂包括霍乱毒素，沙门氏菌毒素，铝等，但并不限于这些。此外，本发明疫苗可与适当的可药用载体联合。这种载体例如无菌水，生理盐水，磷酸盐缓冲液，培养液等。而且，如果必要，疫苗可包含稳定剂，混悬剂，防腐剂，表面活性剂等。疫苗全身性或局部给药。给予疫苗可以是单次给药或通过多次给药进行强化。
当使用APC或CTL作为本发明的疫苗，可例如通过体外方法治疗或预防肿瘤。更具体地，收集正接受治疗或预防疗法的受试者的PBMC，在离体条件下将该细胞与所述多肽接触，诱导APC或CTL之后，再将该细胞给予受试者。也可通过在离体条件下将编码所述多肽的载体导入PBMC从而诱导APC。可在给药之前克隆在体外诱导的APC或CTL。通过克隆对靶细胞有高损伤活性的细胞并使其生长，细胞免疫疗法可以更加有效地进行。另外，以这种方式分离的APC和CTL可用于细胞免疫疗法，所述疗法不仅针对所述细胞来源的受试者，也针对其它受试者相似类型的肿瘤。
另外，提供了治疗和预防细胞增生性疾病，诸如前列腺癌等的药物组合物，其包含治疗有效量的MICAL2-PV或PCOTH多肽。该药物组合物可用于激发抗肿瘤免疫。正常的MICAL2-PV表达局限于睾丸，而PCOTH的表达局限于睾丸和前列腺。因此，抑制这些基因的表达不会对其它器官造成不利影响。所以，优选MICAL2-PV和PCOTH多肽治疗细胞增生性疾病，具体是前列腺癌。此外，因为发现在癌性细胞中特异性表达的蛋白的肽片段能诱导抗肿瘤免疫反应，所以MICAL2-PV或PCOTH的肽片段也可以用在治疗或预防细胞增生性疾病诸如前列腺癌等的药物组合物中。本发明中，以足以诱导抗肿瘤免疫的剂量给药所述多肽或其片段，该剂量范围是0.1mg至10mg，优选0.3mg至5mg，更优选0.8mg至1.5mg。给药是重复进行的。例如，1mg所述肽或其片段可每2周给予4次以诱导抗肿瘤免疫。
另外，编码MICAL2-PV或PCOTH，或其片段的多核苷酸也可用来激发抗肿瘤免疫。这种多核苷酸可掺入表达载体中，从而在接受治疗的受试者中表达MICAL2-PV或PCOTH或其片段。因此，本发明包括诱导抗肿瘤免疫的方法，该方法中将编码MICAL2-PV或PCOTH或其片段的多核苷酸给予患有或可能患细胞增生性疾病诸如前列腺癌等的受试者。
下述实施例用来解释本发明，并帮助本领域普通技术人员实施本发明。所述实施例并不意图限制本发明的范围。
除非另有定义，本文所有技术和科学术语与本发明所属领域的普通技术人员通常理解的意义相同。虽然与本文所述的相同或相似的方法和材料也可用来实现或验证本发明，但适宜的方法和材料如下所述。本文引用的任何专利，专利申请和出版物都包含在本文中作为参考。
本发明最佳实施方式通过下述实施例详细说明本发明，但本发明不限于这些实施例。
1.材料和方法(1)细胞系和临床材料人前列腺癌细胞LNCaP，PC3和DU145购自美国典型培养物保藏中心(ATCC，Rockville，MD)。用RPMI-1640(Sigma，St.Louis，MO)培养LNCap，Dulbecco改良Eagle培养基(Invitrogen，Carlsbad，CA)培养DU145，F12营养混合物(Invitrogen，Carlsbad，CA)培养PC3，每种培养基都添加10％胎牛血清和1％抗生素/抗菌素溶液(Sigma)。
(2)用cDNA微阵列分离两个新的人类基因已经描述了cDNA微阵列载片的构建(Ono等，Cancer Res 605007-11(2000))。对于每一次表达分布图的分析，本发明人制备了两组相同的含23,040cDNA点的cDNA微阵列载片，以减小试验波动。简言之，从20例前列腺癌组织显微解剖所得的前列腺癌细胞以及正常的前列腺导管上皮细胞纯化总RNA。进行基于T7的RNA扩增以获得足够的RNA进行微阵列试验。从前列腺癌细胞和正常导管上皮细胞扩增的RNA的等分试样分别用Cy5-dCTP和Cy3-dCTP通过反转录进行标记(Amersham Biosciences，Buckinghamshire，UK)。如上文所述进行杂交，洗涤和检测(Ono等，CancerRes 605007-11(2000))。随后，在所有上调的基因中，焦点集中在内部标识号为D4493和A5736的两个基因，因为在超过50％的提供信息的(informative)前列腺癌中，这两个基因的表达率大于5.0，而根据发明人对29例正常人组织的基因表达所获得的先前的数据(Saito-Hisaminato等，DNARes 935-45(2002))，这两个基因在正常的主要生命器官中的表达水平相对较低。
(3)Northern-印迹分析使人多个组织的Northern印迹(Clontech，Palo Alto，CA)与D4493和A5736的[α-32P]dCTP标记的PCR产物杂交。该PCR产物是利用下述引物经RT-PCR制备的对D4493，5’-CCGACACTCTGGG标记GAGA-3’(SEQ.ID.NO.7)和5’-TACGTGAGCTCTGAGGACCA-3’(SEQ.ID.NO.8)；对A5736，5’-TGAAGCAACAAAGAGAGGAGGAG-3_(SEQ.ID.NO.9)和5-CCGTGTGGCACTGTAAATGATTA-3’(SEQ.ID.NO.10)。根据提供商的推荐进行预杂交，杂交和洗涤。在-80℃，所述印迹用增光屏放射自显影7天。
(4)半定量RT-PCR分析根据制造商的方案，用TRIzol试剂(Invitrogen)从培养细胞和临床样品提取总RNA。提取的RNA用DNAe I(Roche)处理，并用寡(dT)16引物和Superscript II逆转录酶(Roche)逆转录成单链cDNA。适当的稀释每个单链cDNA以进行随后的PCR扩增，所述扩增是通过监测作为定量对照的β-肌动蛋白(ACTB)进行的。引物序列是对ACTB，5’-CATCCACGAAACTACCTTCAACT-3’(SEQ.ID.NO.11)和5’-TCTCCT标记AGAGAAGTGGGGTG-3’(SEQ.ID.NO.12)；对D4493，5’-CCGACACTCTGGG标记GAGA-3’(SEQ.ID.NO.13)和5’-TACGTGAGCTCTGAGGACCA-3’(SEQ.ID.NO.14)；对A5736，5’-GCAGGGATATCTTTGAGAAA-3’(SEQ.ID.NO.15)和5’-CCAGGATCTGCACAAATACA-3’(SEQ.ID.NO.16)。所有反应包括94℃初始变性2min，然后在94℃、30s，58℃、30s，72℃、1min进行21个循环(对ACTB)或35个循环(对D4493和A5736)，所述反应均在GeneAmp PCR系统9700(PE Applied Biosystems)进行。
(5)表达载体的构建用下述引物经RT-PCR扩增D4493 cDNA的全长编码序列5’-CGTGGATCCC AGACCGTGCA TCATGGGCAC ATCTGAAGAAGGAAACTTGC-3’(SEQ.ID.NO.17)(D4493-正向)和5’-AATCTCGAGTCAGGGGCAGA AGGGGAATAA GG-3’(SEQ.ID.NO.18)(D4493-反向)。严物经钝化处理后插入pCAGGS neo载体的EcoRI位点。为检测D4493蛋白的表达，将HA标记融合到D4493蛋白的NH2或COOH末端。同样，用下述引物经RT-PCR扩增A5736 cDNA的整个编码序列5’-CCCAAGCTTATGGGGGAAAA CGAGGATGA-3’(SEQ.ID.NO.19)(A5736-正向)和5’-TTTTCCTTTT GCGGCCGCGC GGAGCTTGACTGGGAAGC-3’(SEQ.ID.NO.20)(D5736-反向)。扩增产物被插入pcDNA3.1(+)/myc-His(Invitrogen)的Hind III和Not I位点。通过DNA测序确定这些构建体。
(6)免疫细胞化学染色根据制造商的说明，利用FuGENE 6(Roche)用pCAGGS neo-D4493和pcDNA3.1(-)-A5736-myc-His瞬时转染COS7细胞，所述COS7细胞随后用4％低聚甲醛固定，并在室温用含0.2％Triton X-100的PBS通透化3min。接着，室温用封闭液(含0.2％Triton X-100的3％BSA/PBS)覆盖所述细胞30min，并在室温、封闭液中与大鼠抗HA抗体(Roche)或大鼠抗myc抗体一同温育60min。用PBS洗涤后，细胞用FITC-偶联的抗大鼠第二抗体(Organonteknika)和若丹明-偶联的抗小鼠第二抗体(ICN Biomedicals)在室温染色60min。用含4’，6’-联脒(diamidine)-2’-苯基吲哚二氢氯化物(phenylindolendihydrochrolide)(DAPI)的VECTASHIELD(VECTORLaboratories，Inc，Burlingame，CA)包埋样品并用光谱同焦扫描系统(SpectralConfocal Scanning Systems)(Leica)显像。
(7)siRNA表达载体以及转染到前列腺癌细胞用siRNA表达载体(psiU6BX)评价RNAi对靶基因的影响。将U6启动子克隆到基因特异性序列(来自靶转录物的19nt序列，其通过短间隔序列TTCAAGAGA与相同序列的反向互补序列分离)的上游，以5个胸苷作为终止信号，并且还整合入neo盒以提供对遗传霉素(Sigma)的抗性。D4493的靶序列分别是5’-TAGGGCCCATGGGGCCCGG-3’(SEQ.ID.NO.21)(si1)，
5’-ACCAGTTGGGCCCAAAGGC-3’(SEQ.ID.NO.22)(si2)，5’-AGGCCCAATGTTGCCCCTT-3’(SEQ.ID.NO.23)(si3)，5’-TGTTGCCCCTTGGCCCCTC-3’(SEQ.ID.NO.24)(si4)，和5’-GAAGCAGCACGACTTCTTC-3’(SEQ.ID.NO.25)(EGFP)。A5736的靶序列是5’-GCTGCTGGCCTCCATATCA-3’(SEQ.ID.NO.26)(si1)，5’-TGCTTACAACTACTGCTAC-3’(SEQ.ID.NO.27)(si2)，和5’-CTACTGCTACATGTACGAG-3’(SEQ.ID.NO.28)(si3)。人前列腺癌细胞系LNCaP，PC3和DU145铺在1℃m的皿中(5×105细胞/皿)，并按照制造商的说明，用Lipofectamine 2000(Invitrogen)将含EGFP靶序列的psiU6BX(psiU6BX-EGFP)以及含有靶序列的psiH1BX(psiU6BX-si1～4(D4493)或si1～3(A5733))转染所述细胞。用500mg/ml遗传霉素处理一周筛选细胞，收获经初步筛选的细胞(preliminary cell)用于所述靶基因的表达分析，并用RT-PCR进行分析。RT-PCR的引物与上文所述相同。这些细胞也可用姬姆萨溶液染色和进行MTT试验。
2.结果(1)鉴定PCOTH以及MICAL2的前列腺癌变体(MICAL2-PV)为前列腺癌细胞中上调的基因用代表23,040个人基因的cDNA微阵列分析从20例前列腺癌中纯化的癌细胞的基因表达分布图。结果，鉴定出在前列腺癌细胞中通常上调的88个基因。在这些被鉴定的基因中，焦点集中在内部代码为D4493的基因，它在超过50％的前列腺癌中显著上调，并且经RT-PCR证实了它在前列腺癌细胞中的过表达模式(图1)。D4493与两个来自前列腺癌cDNA文库的EST(BC015452和BG178505)重叠，并发现它与LOC221179(XP 167955)相同。比较小鼠/大鼠的基因组序列，确定了一个新的LOC221179编码区，它编码100个氨基酸的蛋白质。Northern印迹分析显示LOC221179在前列腺和睾丸中高度且局限化的表达(图1B)。这个产物有一个特征结构域即胶原三螺旋重复(图1C)，这是胶原超家族的特征。因此，该基因称作“PCOTH(前列腺胶原三螺旋)”。
关注另一个基因A5736，它同样在超过50％的前列腺癌中显著上调，并且经RT-PCR证实了它在前列腺癌细胞中的过表达模式(图2A)。该基因与MICAL2(与CasL相互作用的分子2(Molecule Interacting with CasL 2))重叠。用A5736的序列作为探针进行的Northern印迹分析显示约7.5kb的转录物在睾丸和前列腺癌细胞系中大量表达。然而，已证实MICAL 2的正常转录物大小为3.8kb(图2B)。为了解释这种大小的差异，周RACE来确定未知的经转录的区域。利用睾丸cDNA进行RACE，结果鉴定了7.5kb的新MICAL2变体。该鉴定的变体的3’末端编码区不同于MICAL2，并编码976个氨基酸残基，而正常MICAL2蛋白有1124个氨基酸残基(图2C)。如本发明所述，本发明人发现了两种新的MICAL2变体，一种是长型变体(登录号AB110785)，一种是短型变体(登录号AB110786)，其中长型变体中删除了一个外显子。本文中，变体统称为“MICAL2-PV(MICAL2前列腺癌变体)”。
(2)亚细胞定位为进一步研究PCOTH和MICAL2-PV蛋白的亚细胞定位，将这些蛋白与标记连接，并在COS7细胞中瞬时过表达以进行免疫细胞化学染色。如图3所示，外源性PCOTH-HA蛋白位于细胞膜或亚膜(图3A)，外源性MICAL2-PV-Myc蛋白位于COS7细胞的细胞质中(图3B)。
(3)前列腺癌细胞系中siRNA介导的生长抑制为了研究这些基因的过表达对前列腺癌细胞的生长或存活的影响，用基于哺乳动物载体的RNA干扰(RNAi)技术特异性敲除这些基因的内源性表达。转染产siRNA载体导致内源性表达的降低，所述载体含一些为PCOTH(图4A)和MICAL2-PV(图4D)设计的siRNA。siRNA对PCOTH转录物的敲除效应导致集落形式实验和MTT实验中强烈的生长抑制(图4B和4C)。siRNA对MICAL2-PV转录物的敲除效应同样导致集落形式实验中的生长抑制(图4E)。这些发现有力证明了前列腺癌细胞中PCOTH和MICAL2-PV的过表达与癌细胞的生长相关联，并且这些基因或其编码的蛋白是治疗前列腺癌的有希望的分子靶，在治疗中这些基因被封闭或敲除。
工业实用性与非癌性前列腺导管上皮细胞相比，人MICAL2-PV和PCOTH基因在前列腺癌中的表达显著提高。因此，这些基因可作为前列腺癌的诊断标志，其编码的蛋白可用于前列腺癌的诊断实验。
本发明还指出新蛋白MICAL2-PV或PCOTH的表达促进细胞生长，而对应于MICAL2-PV或PCOTH基因的小干扰RNA抑制细胞生长。这些发现提示MICAL2-PV和PCOTH蛋白都刺激致癌活性。因此，这些新的癌蛋白都是研发抗癌药物的有用靶。例如，阻断MICAL2-PV或PCOTH表达或抑制其活性的药剂可用作抗癌药剂，具体地用作治疗前列腺癌的抗癌药剂。这种药剂的实例包括抗MICAL2-PV或PCOTH基因的反义寡核苷酸，小干扰RNA和核酶，以及识别MICAL2-PV或PCOTH的抗体。
已经详细描述了本发明并以具体实施例作为参考，不偏离本发明精神和范畴进行的各种改变和修饰对本领域技术人员是显而易见的。
序列表<110>肿瘤疗法科学股份有限公司(ONCOTHERAPY SCIENCE，INC.)JAPAN AS REPRESENTED BY THE PRESIDENT OF THE UNIVERSITY OF TOKYO<120>前列腺癌相关基因和多肽<130>ONC-A0216P2<150>US 60/414,873<151>2002-09-30<160>28<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>826<212>DNA<213>人(Homo sapiens)<220>
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Phe Tyr Gly Lys Phe Cys Ala Gly Ser Ile Asp His Ile Ser Ile Arg145 150 155 160Gln Leu Gln Leu Ile Leu Phe Lys Val Ala Leu Met Leu Gly Val Glu165 170 175Ile His Val Asn Val Glu Phe Val Lys Val Leu Glu Pro Pro Glu Asp180 185 190Gln Glu Asn Gln Lys lle Gly Trp Arg Ala Glu Phe Leu Pro Thr Asp195 200 205His Ser Leu Ser Glu Phe Glu Phe Asp Val Ile Ile Gly Ala Asp Gly210 215 220Arg Arg Asn Thr Leu Glu Gly Phe Arg Arg Lys Glu Phe Arg Gly Lys225 230 235 240Leu Ala Ile Ala Ile Thr Ala Asn Phe Ile Asn Arg Asn Ser Thr Ala245 250 255Glu Ala Lys Val Glu Glu Ile Ser Gly Val Ala Phe Ile Phe Asn Gln260 265 270Lys Phe Phe Gln Asp Leu Lys Glu Glu Thr Gly Ile Asp Leu Glu Asn275 280 285Ile Val Tyr Tyr Lys Asp Cys Thr His Tyr Phe Val Met Thr Ala Lys290 295 300Lys Gln Ser Leu Leu Asp Lys Gly Val Ile Ile Asn Asp Tyr Ile Asp305 310 315 320Thr Glu Met Leu Leu Cys Ala Glu Asn Val Asn Gln Asp Asn Leu Leu325 330 335Ser Tyr Ala Arg Glu Ala Ala Asp Phe Ala Thr Asn Tyr Gln Leu Pro340 345 350Ser Leu Asp Phe Ala Met Asn His Tyr Gly Gln Pro Asp Val Ala Met355 360 365Phe Asp Phe Thr Cys Met Tyr Ala Ser Glu Asn Ala Ala Leu Val Arg370 375 380
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610 615 620Pro Leu Arg Pro Val Asp Ser Trp Arg Lys Asn Tyr Gly Glu Asn Ala625 630 635 640Asp Leu Ser Leu Ala Lys Ser Ser Ile Ser Asn Asn Tyr Leu Asn Leu645 650 655Thr Phe Pro Arg Lys Arg Thr Pro Arg Val Asp Gly Gln Thr Gly Glu660 665 670Asn Asp Met Asn Lys Arg Arg Arg Lys Gly Phe Thr Asn Leu Asp Glu675 680 685Pro Ser Asn Phe Ser Ser Arg Ser Leu Gly Ser Asn Gln Glu Cys Gly690 695 700Ser Ser Lys Glu Gly Gly Asn Gln Asn Lys Val Lys Ser Met Ala Asn705 710 715 720Gln Leu Leu Ala Lys Phe Glu Glu Ser Thr Arg Asn Pro Ser Leu Met725 730 735Lys Gln Glu Ser Met Arg Lys Ser Phe Pro Leu Asn Leu Gly Gly Ser740 745 750Asp Thr Cys Tyr Phe Cys Lys Lys Arg Val Tyr Val Met Glu Arg Leu755 760 765Ser Ala Glu Gly His Phe Phe His Arg Glu Cys Phe Arg Cys Ser Ile770 775 780Cys Ala Thr Thr Leu Arg Leu Ala Ala Tyr Thr Phe Asp Cys Asp Glu785 790 795 800Gly Lys Phe Tyr Cys Lys Pro His Phe Ile His Cys Lys Thr Asn Ser805 810 815Lys Gln Arg Lys Arg Arg Ala Glu Leu Lys Gln Gln Arg Glu Glu Glu820 825 830Ala Thr Trp Gln Glu Gln Glu Ala Pro Arg Arg Asp Thr Pro Thr Glu835 840 845
Ser Ser Cys Ala Val Ala Ala Ile Gly Thr Leu Glu Gly Ser Pro Pro850 855 860Gly Ile Ser Thr Ser Phe Phe Arg Lys Val Leu Gly Trp Pro Leu Arg865 870 875 880Leu Pro Arg Asp Leu Cys Asn Trp Met Gln Gly Leu Leu Gln Ala Ala885 890 895Gly Leu His Ile Arg Asp Asn Ala Tyr Asn Tyr Cys Tyr Met Tyr Glu900 905 910Leu Leu Ser Leu Gly Leu Pro Leu Leu Trp Ala Phe Ser Glu Val Leu915 920 925Ala Ala Met Tyr Arg Glu Ser Glu Gly Ser Leu Glu Ser Ile Cys Asn930 935 940Trp Val Leu Arg Cys Phe Pro Val Lys Leu Arg945 950 955<210>7<211>20<212>DNA<213>人工<220>
<223>用于RT-PCR的人工合成引物序列<400>7ccgacactct gggtaggaga 20<210>8<211>20<212>DNA<213>人工<220>
<223>用于RT-PCR的人工合成引物序列<400>8
tacgtgagct ctgaggacca20<210>9<211>23<212>DNA<213>人工<220>
<223>用于RT-PCR的人工合成引物序列<400>9tgaagcaaca aagagaggag gag23<210>10<211>23<212>DNA<213>人工<220>
<223>用于RT-PCR的人工合成引物序列<400>10ccgtgtggca ctgtaaatga tta23<210>11<211>23<212>DNA<213>人工<220>
<223>用于RT-PCR的人工合成引物序列<400>11catccacgaa actaccttca act23<210>12<211>23<212>DNA<213>人工
<220>
<223>用于RT-PCR的人工合成引物序列<400>12tctccttaga gagaagtggg gtg23<210>13<211>20<212>DNA<213>人工<220>
<223>用于RT-PCR的人工合成引物序列<400>13ccgacactct gggtaggaga20<210>14<211>20<212>DNA<213>人工<220>
<223>用于RT-PCR的人工合成引物序列<400>14tacgtgagct ctgaggacca 20<210>15<211>20<212>DNA<213>人工<220>
<223>用于RT-PCR的人工合成引物序列<400>15gcagggatat ctttgagaaa 20<210>16
<211>20<212>DNA<213>人工<220>
<223>用于RT-PCR的人工合成引物序列<400>16ccaggatctg cacaaataca20<210>17<211>50<212>DNA<213>人工<220>
<223>用于RT-PCR的人工合成引物序列<400>17cgtggatccc agaccgtgca tcatgggcac atctgaagaa ggaaacttgc 50<210>18<211>32<212>DNA<213>人工<220>
<223>用于RT-PCR的人工合成引物序列<400>18aatctcgagt caggggcaga aggggaataa gg 32<210>19<211>29<212>DNA<213>人工<220>
<223>用于RT-PCR的人工合成引物序列<400>19
cccaagctta tgggggaaaa cgaggatga29<210>20<211>38<212>DNA<213>人工<220>
<223>用于RT-PCR的人工合成引物序列<400>20ttttcctttt gcggccgcgc ggagcttgac tgggaagc 38<210>21<211>19<212>DNA<213>人工<220>
<223>用于SiRNA的人工合成靶序列<400>21tagggcccat ggggcccgg 19<210>22<211>19<212>DNA<213>人工<220>
<223>用于SiRNA的人工合成靶序列<400>22accagttggg cccaaaggc 19<210>23<211>19<212>DNA<213>人工
<220>
<223>用于SiRNA的人工合成靶序列<400>23aggcccaatg ttgcccctt19<210>24<211>19<212>DNA<213>人工<220>
<223>用于SiRNA的人工合成靶序列<400>24tgttgcccct tggcccctc19<210>25<211>19<212>DNA<213>人工<220>
<223>用于SiRNA的人工合成靶序列<400>25gaagcagcac gacttcttc19<210>26<211>19<212>DNA<213>人工<220>
<223>用于SiRNA的人工合成靶序列<400>26gctgctggcc tccatatca19<210>27
<211>19<212>DNA<213>人工<220>
<223>用于SiRNA的人工合成靶序列<400>27tgcttacaac tactgctac19<210>28<211>19<212>DNA<213>人工<220>
<223>用于SiRNA的人工合成靶序列<400>28ctactgctac atgtacgag19
权利要求
1.选自以下组的基本纯的多肽(a)含有SEQ ID NO4或6所示氨基酸序列的多肽；(b)含有SEQ ID NO4或6所示氨基酸序列的多肽，所述多肽中的一或多个氨基酸被取代、缺失、插入和/或添加，并且该多肽具有与由SEQ IDNO4或6所示氨基酸序列组成的蛋白等同的生物活性；和(c)多核苷酸编码的多肽，所述多核苷酸在严谨条件下与由SEQ ID NO3或5所示核苷酸序列组成的多核苷酸杂交，其中所述多肽具有与由SEQ IDNO4或6所示任一氨基酸序列组成的多肽等同的生物活性。
2.选自以下组的基本纯的多肽(a)由SEQ ID NO2所示氨基酸序列组成的多肽；和(b)由SEQ ID NO2所示氨基酸序列组成的多肽，所述多肽中一或多个氨基酸被取代和/或缺失，并且该多肽具有与由SEQ ID NO2所示氨基酸序列组成的蛋白等同的生物活性。
3.分离的多核苷酸，其编码权利要求1或2所述多肽。
4.载体，其含有权利要求3所述多核苷酸。
5.宿主细胞，其含有权利要求3所述多核苷酸或权利要求4所述载体。
6.制备权利要求1或2所述多肽的方法，所述方法包括以下步骤(a)培养权利要求5的宿主细胞；(b)使该宿主细胞表达所述多肽；和(c)收集表达的多肽。
7.抗体，其与权利要求1所述多肽结合。
8.多核苷酸，所述多核苷酸与编码权利要求1所述多肽的多核苷酸或其互补链互补，并且包含至少15个核苷酸。
9.反义多核苷酸或小干扰RNA，其为编码权利要求1所述多肽的多核苷酸的反义多核苷酸或小干扰RNA。
10.权利要求9所述的小干扰RNA，其有义链是SEQ ID NO27所示的核苷酸序列。
11.诊断前列腺癌的方法，所述方法包括以下步骤(a)检测生物样品中基因的表达水平，所述基因编码SEQ ID NO2，4或6所示氨基酸序列；和(b)使所述表达水平的提高与所述疾病相关联。
12.权利要求11的方法，其中以选自以下组的任意一种方法检测所述表达水平(a)检测编码SEQ ID NO2，4或6所示氨基酸序列的mRNA，(b)检测含有SEQ ID NO2，4或6所示氨基酸序列的蛋白质，和(c)检测含有SEQ ID NO2，4或6所示氨基酸序列的蛋白质的生物活性。
13.筛选用于治疗或预防前列腺癌的化合物的方法，所述方法包括以下步骤(a)使受试化合物与选自以下组的多肽接触(1)含有SEQ ID NO2，4或6所示氨基酸序列的多肽；(2)含有SEQ ID NO2，4或6所示氨基酸序列的多肽，所述多肽中一或多个氨基酸被取代、缺失、插入和/或添加，并且该多肽具有与由SEQ ID NO2，4或6所示氨基酸序列组成的蛋白等同的生物活性；和(3)多核苷酸编码的多肽，所述多核苷酸在严谨条件下与由SEQ IDNO1，3或5所示核苷酸序列组成的多核苷酸杂交，其中所述多肽具有与由SEQ ID NO2，4或6所示氨基酸序列组成的多肽等同的生物活性；(b)检测所述多肽和受试化合物之间的结合活性；和(c)选择与所述多肽结合的化合物。
14.筛选用于治疗或预防前列腺癌的化合物的方法，所述方法包括以下步骤(a)使受试化合物与选自以下组的多肽接触(1)含有SEQ ID NO2，4或6所示氨基酸序列的多肽；(2)含有SEQ ID NO2，4或6所示氨基酸序列的多肽，所述多肽中一或多个氨基酸被取代、缺失、插入和/或添加，并且该多肽具有与由SEQ ID NO2，4或6所示氨基酸序列组成的蛋白等同的生物活性；和(3)多核苷酸编码的多肽，所述多核苷酸在严谨条件下与由SEQ IDNO1，3或5所示核苷酸序列组成的多核苷酸杂交，其中所述多肽具有与由SEQ ID NO2，4或6所示氨基酸序列组成的多肽等同的生物活性；(b)检测步骤(a)的多肽的生物活性；和(c)选出抑制所述多肽的生物活性的化合物，所述生物活性是与没有该受试化合物时检测到的生物活性相比。
15.权利要求14的方法，其中所述生物活性是细胞增生活性。
16.筛选用于治疗或预防前列腺癌的化合物的方法，所述方法包括以下步骤(a)使受试化合物与细胞接触，所述细胞表达一或多种含SEQ ID NO1，3或5所示核苷酸序列的多核苷酸；和(b)选出降低一或多种含SEQ ID NO1，3或5所示核苷酸序列的多核苷酸的表达水平的化合物，所述表达水平是与没有该受试化合物时检测到的表达水平相比。
17.权利要求16的方法，其中所述细胞是前列腺癌细胞。
18.筛选用于治疗或预防前列腺癌的化合物的方法，所述方法包括以下步骤(a)将受试化合物与导入了载体的细胞接触，所述载体包含一或多种标记基因的转录调节区以及在该转录调节区控制下表达的报告基因，其中所述一或多种标记基因包含选自SEQ IDNO 1，3或5之一的核苷酸序列，(b)测定所述报告基因的活性；和(c)选择与对照相比降低所述报告基因的表达水平的化合物。
19.筛选用于治疗或预防前列腺癌的化合物的方法，所述方法包括以下步骤(a)在存在受试化合物的情况下，使选自以下组的多肽与肌动蛋白接触(1)含有SEQ ID NO2，4或6所示氨基酸序列的多肽；(2)含有SEQ ID NO2，4或6所示氨基酸序列的多肽，所述多肽中一或多个氨基酸被取代、缺失、插入和/或添加，并且该多肽具有与由SEQ ID NO2，4或6所示氨基酸序列组成的蛋白等同的生物活性；和(3)多核苷酸编码的多肽，所述多核苷酸在严谨条件下与由SEQ IDNO1，3或5所示核苷酸序列组成的多核苷酸杂交，其中所述多肽具有与由SEQ ID NO2，4或6所示氨基酸序列组成的多肽等同的生物活性；(b)检测所述多肽与肌动蛋白之间的结合；和(c)选择抑制所述多肽与肌动蛋白之间结合的受试化合物。
20.一种用于治疗或预防前列腺癌的组合物，所述组合物包含药物有效量的活性成分以及可药用的载体，其中所述活性成分为编码下组多肽之一的多核苷酸的反义多核苷酸或小干扰RNA(a)含有SEQ ID NO2，4或6所示氨基酸序列的多肽；(b)含有SEQ ID NO2，4或6所示氨基酸序列的多肽，所述多肽中一或多个氨基酸被取代、缺失、插入和/或添加，并且该多肽具有与由SEQ IDNO2，4或6所示氨基酸序列组成的蛋白等同的生物活性；和(c)多核苷酸编码的多肽，所述多核苷酸在严谨条件下与由SEQ IDNO1，3或5所示核苷酸序列组成的多核苷酸杂交，其中所述多肽具有与由SEQ ID NO2，4或6所示氨基酸序列组成的多肽等同的生物活性。
21.权利要求20的组合物，其中所述小干扰RNA的有义链是SEQ IDNO23或27所示的核苷酸序列。
22.一种用于治疗或预防前列腺癌的组合物，所述组合物包含药物有效量的的抗多肽抗体作为活性成分并含有可药用载体，其中所述多肽选自(a)含有SEQ ID NO2，4或6所示氨基酸序列的多肽；(b)含有SEQ ID NO2，4或6所示氨基酸序列的多肽，所述多肽中一或多个氨基酸被取代、缺失、插入和/或添加，并且该多肽具有与由SEQ IDNO2，4或6所示氨基酸序列组成的蛋白等同的生物活性；和(c)多核苷酸编码的多肽，所述多核苷酸在严谨条件下与由SEQ IDNO1，3或5所示核苷酸序列组成的多核苷酸杂交，其中所述多肽具有与由SEQ ID NO2，4或6所示氨基酸序列组成的多肽等同的生物活性。
23.一种用于治疗或预防前列腺癌的组合物，所述组合物包含药物有效量的活性成分以及可药用的载体，所述活性成分为通过权利要求13-19任意一种方法选出的化合物。
24.治疗或预防前列腺癌的方法，所述方法包括给予药物有效量的反义多核苷酸或小干扰RNA的步骤，该反义多核苷酸或小干扰RNA针对编码选自下组的多肽的多核苷酸(1)含有SEQ ID NO2，4或6所示氨基酸序列的多肽；(2)含有SEQ ID NO2，4或6所示氨基酸序列的多肽，所述多肽中一或多个氨基酸被取代、缺失、插入和/或添加，并且该多肽具有与由SEQ IDNO2，4或6所示氨基酸序列组成的蛋白等同的生物活性；和(3)多核苷酸编码的多肽，所述多核苷酸在严谨条件下与由SEQ IDNO1，3或5所示核苷酸序列组成的多核苷酸杂交，其中所述多肽具有与由SEQ ID NO2，4或6所示氨基酸序列组成的多肽等同的生物活性。
25.权利要求24的方法，其中所述小干扰RNA的有义链是SEQ IDNO23或27所示的核苷酸序列。
26.治疗或预防前列腺癌的方法，所述方法包括给予药物有效量的抗多肽抗体的步骤，所述多肽选自(a)含有SEQ ID NO2，4或6所示氨基酸序列的多肽；(b)含有SEQ ID NO2，4或6所示氨基酸序列的多肽，所述多肽中一或多个氨基酸被取代、缺失、插入和/或添加，并且该多肽具有与由SEQ IDNO2，4或6所示氨基酸序列组成的蛋白等同的生物活性；和(c)多核苷酸编码的多肽，所述多核苷酸在严谨条件下与由SEQ IDNO1，3或5所示核苷酸序列组成的多核苷酸杂交，其中所述多肽具有与由SEQ ID NO2，4或6所示氨基酸序列组成的多肽等同的生物活性。
27.治疗或预防前列腺癌的方法，所述方法包括给予药物有效量的化合物的步骤，所述化合物通过权利要求13-19任意一种方法选出。
28.治疗或预防前列腺癌的方法，所述方法包括给予药物有效量的多肽或编码该多肽的多核苷酸的步骤，所述多肽选自(a)-(c)之一(a)含有SEQ ID NO2，4或6所示氨基酸序列的多肽或其片段；(b)含有SEQ ID NO2，4或6所示氨基酸序列的多肽或其片段，所述多肽中一或多个氨基酸被取代、缺失、插入和/或添加，并且该多肽具有与由SEQ ID NO2，4或6所示氨基酸序列组成的蛋白等同的生物活性；和(c)多核苷酸编码的多肽或其片段，所述多核苷酸在严谨条件下与由SEQ ID NO1，3或5所示核苷酸序列组成的多核苷酸杂交，其中所述多肽具有与由SEQ ID NO2，4或6所示氨基酸序列组成的多肽等同的生物活性。
29.诱导抗肿瘤免疫的方法，所述方法包括将选自(a)-(c)之一的多肽与抗原呈递细胞接触，或将编码所述多肽的多核苷酸或含有该多核苷酸的载体导入抗原呈递细胞的步骤(a)含有SEQ ID NO2，4或6所示氨基酸序列的多肽或其片段；(b)含有SEQ ID NO2，4或6所示氨基酸序列的多肽或其片段，所述多肽中一或多个氨基酸被取代、缺失、插入和/或添加，并且该多肽具有与由SEQ ID NO2，4或6所示氨基酸序列组成的蛋白等同的生物活性；和(c)多核苷酸编码的多肽或其片段，所述多核苷酸在严谨条件下与由SEQ ID NO1，3或5所示核苷酸序列组成的多核苷酸杂交，其中所述多肽具有与由SEQ ID NO2，4或6所示氨基酸序列组成的多肽等同的生物活性。
30.权利要求29的诱导抗肿瘤免疫的方法，其中该方法进一步包括将所述抗原呈递细胞给予受试者的步骤。
31.治疗或预防癌的药物组合物，所述组合物包含药物有效量的活性成分以及可药用的载体，其中所述活性成分为选自(a)-(c)的多肽或编码所述多肽的多核苷酸(a)含有SEQ ID NO2，4或6所示氨基酸序列的多肽或其片段；(b)含有SEQ ID NO2，4或6所示氨基酸序列的多肽或其片段，所述多肽中一或多个氨基酸被取代、缺失、插入和/或添加，并且该多肽具有与由SEQ ID NO2，4或6所示氨基酸序列组成的蛋白等同的生物活性；和(c)多核苷酸编码的多肽或其片段，所述多核苷酸在严谨条件下与由SEQ ID NO1，3或5所示核苷酸序列组成的多核苷酸杂交，其中所述多肽具有与由SEQ ID NO2，4或6所示氨基酸序列组成的多肽等同的生物活性。
32.权利要求31的药物组合物，其中所述多核苷酸掺入到表达载体中。
33.一种诊断试剂，其包含与编码权利要求1所述多肽的多核苷酸杂交的寡核苷酸或与权利要求1所述多肽结合的抗体。
全文摘要
本申请提供了新的人基因MICAL2－PV，它在前列腺癌中的表达显著提高。另外，本申请提供了该基因编码的多肽以及PCOTH编码的多肽，发现PCOTH编码的多肽在前列腺癌中的表达也提高。这些基因及其编码的多肽可用于，例如，诊断前列腺癌，作为研发抗病药物的靶分子，以及减少前列腺癌细胞的生长。
文档编号C12Q1/68GK1701078SQ0382534
公开日2005年11月23日 申请日期2003年9月22日 优先权日2002年9月30日
发明者中村佑辅, 片桐丰雅, 中川英刀, 中鹤修一 申请人:肿瘤疗法科学股份有限公司, 国立大学法人东京大学