专利名称：作为基因载体的多肽树状大分子及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及作为基因栽体的多肽树状大分子及其应用，目的在于提供 一种有效地介导治疗基因送递到靶细胞中的组合物，用来有效地进行
DNA送递的生物适合的组合物，从而导致非细胞毒性地转染到把细胞 中，这种可用于制备装栽治疗基因的树状多肽大分子栽体系统，由治疗基 因、树状多肽大分子或者具有连接有阳离子髙分子的树状多肽大分子组 成。树状多肽大分子的结构单元为天然的氨基酸，可以是单一的氨基酸， 也可以由不同的氨基酸组成.树状多肽大分子栽体系统，可以是药学可 接受的盐类化合物和癍类化合物。这种装栽治疗基因的树状多肽大分子栽 体系统可以治疗基因缺陷所致的遗传病、免疫缺陷或抑癌基因的失活所致 的肺瘤等疾病，
背景技术：
对疾病的预防和治疗来讲，基因治疗是一种有效和经济的方法。基因 治疔是将人的正常基因或有治疗作用的基因通过一定方式导入人体靶细 胞以纠正基因的缺陷或者发挥治疗作用，从而达到治疗疾病目的的生物医 学技术，基因治疗是当代医学和生物学一个新的研究领域。它试图M因 水平调控细胞中的缺陷基因表i^以正常基因矫正、替代缺陷基因，达到 治疗基因缺陷所致的遗传病、免疫缺陷或抑癌基因的失活所致的肿瘤等疾 病，
高效的基因转移和表达U因治疗的关键技术。目前常用的基因栽体 包括病毒栽体和非病毒栽体，临床试验中以上利用病毒为栽体来转运目的 基因.虽然病毒栽体具有较高的转染效率，但同时也存在着很多难以克服 的缺点，如具有免疫原性、细胞毒性、缺少组织特异性等等.因此对非病 毒栽体的研究受到人们的重视，寻找新的高效、安全、靶向的非病毒栽体成为目前的研究热点.
近年来，纳米栽体以其转染效率高、安全低毒、无免疫原性的特点引 M来越多关注，尤其是阳离子聚合物纳米基因栽体是最有前途的非病毒
基因导入栽体系统之一，例如聚-L-赖氛酸(PLL ) ( M. A. wolfert等人， "由DNA与合成的嵌段共聚物自组装形成的基因治疗栽体的特性描述" 《人类基因治疗》1996， 7, 2123-2133; AV Kabanov & VA Kabanov "于 将遣传材料送递到细胞中的具有聚阳离子的DNA复合体"，Bioconj. chem.l995，6:7-20)，
体或栽剂已经有报道R. Esfsndando， D. A. Tomalia ， DDT. 2001， 6:427-436; US5338532和5527524，特别是提出了树枝状聚合物的外表面
释放系统的新方法.树状大分子应用最活跃的一个领域是作为非病毒类基 因转染剂进行基因转染，聚胺类树状大分子如PAMAM和聚丙烯亚胺 (PPI)等巳经商品化，它们与DNA分子的复合也巳有研究，在pH7.4的 生理条件下，它们具有形成聚阳离子的趋势，因而被用于基因治疗. PolyFect是商品化的体外基因转染剂，由PAMAM树状大分子经部分化 学水解而得到.
多肽树枝状大分子是指在分子结构中包含有多肽的树枝状大分子，在 多肽树枝状大分子中，M酸或多肽作为引发核或者枝化单元，以共价鍵 形式连接在整个分子中.树枝状多肽大分子具有一般树枝状大分子的普遍 特性，同时又具有多肽的生物特性.树枝状多肽大分子的特性主要包括以 下几个方面(1)具有类蛋白的球状结构，能作为天然配体的受体；(2)多 价结构使其能同时与两个或多个配体发生相互作用或者连接众多的有用 基团；(3)生物相容性好，细胞毒性低；(4)水溶性好；(5)高支化度使其 不易被蛋白酶降解；(6)容易被细胞内吞，可用作治疗基因的传输栽体.由 于这些特性，使多肽树枝状大分子在生物、医药领域有着广泛的潜在应用，
发明内容
本发明涉及作为基因栽体的多肽树状大分子及其应用。这种可用于制 备装栽治疗基因的树状多肽大分子栽体系统，由治疗基因、树状多肽大分 子或者具有连接有阳离子高分子的树状多肽大分子組成.
树状多肽大分子的结构单元为天然的氨基酸，可以是单一的氣基酸，
也可以由不同的4M^酸組成，树状多肽大分子以天然氨基酸为结构单元， 优选的为甘氨酸、赖氨酸、谷氨酸、脯氨酸等氨基酸，树状多肽大分子可 以有同种Ai酸单元构建，也可以由不同种的氨基酸来构建.其合成方法 和传统树枝状大分子的相同，可分为发散法和收敛法两大类.发散法是一 种直接合成的方法，从引发核开始逐步生长，不断向外发散，形成树枝状 大分子.收敛法是一种间接合成的方法，先合成需要的功能基团，纯化后 以特定的化学方法连接到树状核心上。优选的采用发散法和收敛法相结合 的合成方法，首先用发散法合成扇形的树枝状多肽大分子片断，然后通过 收敛法与特定的核心键合，得到不同结构的球型、哑铃型树枝状多肽大分 子.无论发散法还是收敛法，都可以运用固相、液相或固，液结合方法合 成方法来实现，
用于制备装栽治疗基因的树状多肽大分子栽体系统中栽体系统可以 由连接有阳离子大分子树状多肽大分子构筑的纳米粒组成，阳离子大分子
优选自下列化合物壳聚糖、聚乙二醇(PEG)、聚乙烯亚胺等.例如树 状多肽大分子含有共价连接一定百分比的聚乙二醇单元，树状多肽大分子 与聚乙二醇单元之比可以通过改变^L^^来调整，这种合成的栽体(其 中树状多肽大分子中5-30 %的氨基与PEG缀合，而其余的4UM J保
持为未取代的游离基)能够与核酸一起形成穗定且可溶的复合体，其继而 能够有效地进行转染.与单独使用树状多肽大分子相比，这种接枝的PEG 部分使得核酸/栽体复合体的溶解性更好并且细胞毒性下降，
用于制备装栽治疗基因的树状多肽大分子栽体系统中树状多肽大分 子，可以是药学可接受的盐类化合物对于碱性树状多肽大分子栽体优选 的为氟化物、氯化物、溴化物、碘化物、疏酸盐、硝酸盐、磷酸盐、乙酸 盐、三氣乙酸盐、马来酸盐、富马酸盐、枸橼酸盐、草酸盐、琥珀酸盐、酒石酸盐、苹果酸盐、扁桃酸盐、甲磺酸盐或对甲苯磺酸盐；对于酸性树 状多肽大分子栽体基于碱金属和碱土金属的阳离子，如钠盐、锂盐、钾盐、 鈣盐、镁盐、招盐等，以及铵、季铵和胺阳离子，其中包括但不限于铵、 四甲基铵、四乙基铵、甲胺、二甲胺、三甲胺、三乙胺、乙胺等以及用于 形成碱加成盐的其它代表性有机胺包括二乙胺、乙二胺、乙醇胺、二乙醇 胺、旅唤等，
用于制备装栽治疗基因的树状多肽大分子栽体系统中树状多肽大分 子，可以是药学可接受的酯类化合物，指可在体内水解的酯，包括在人体 内降解释放出母体化合物或其盐的酯，合适的酯基团包括例如衍生自药 学上可接受的脂族羧酸或脂族族醇，尤其是链烷酸(醇)、链烯酸(醇)、 环烷酸(醇)和链烷二羧酸(二醇)的酯，其中优选的各烷基或烯基部分 少于6个碳原子.
用于制备装栽治疗基因的树状多肽大分子栽体系统中栽体与治疗基 因的比例为0.5 ~20:1,
用于制备装栽治疗基因的树状多肽大分子栽体系统中治疗基因含有 编码遗传标记的基因序列，所述的遗传标记选自萤光素酶基因、p —半乳 糖普酶基因、潮審素杭性基因和新審素杭性基因以及氯霉素乙餘转移酶基 因，选自低密度脂蛋白受体、凝固因子、肿瘤的基因抑制剂、主要组织相 容性蛋白、杭癌基因、P16 、 p53 、胸普激酶、IL2 、 IL4以及TNFa,
制备装栽治疗基因的树状多肽大分子栽体系统中所述治疗基因含有 编码病毒杭原的DNA序列，选自RNA 、反义RNA和核酶的RNA; 所述的核酸编码凝集素、甘露糖受体、唾液酸粘附素或逆转录病毒反式激 活因于(TAT ),
细胞与装栽治疗基因的树状多肽大分子栽体系统在一定的条件下接 触，其中在所述的M下所说的组合物iiX到所说的细胞中并且释放出所 说组合物的核酸.
本发明涉及带负电的治疗基因和带正电的树状多肽大分子之间形成 的栽体系统复合体，其中所述核酸和所述树状多肽大分子之间的关系本质 上是静电的.所说的带正电的装栽治疗基因栽体系统由树状多肽大分子或者具有连接有阳离子高分子的树状多肽大分子.在树状多肽大分子的jy^ 部分上加入阳离子大分子如聚乙二醇可以有效的防止了由栽体大分子与 核酸形成的复合体(或纳米颗粒)的沉淀和聚集，从而增加了复合体的溶 解度.如与树状多肽大分子连接的聚乙二醇还起到了融合细胞膜与防止 核酸蛋白酶解降解的作用，从而提高了转染率和定向效率.
本发明的树状多肽大分子栽体系统可以与治疗基因一起形成稳定且 可溶的复合体，它可以有效地转染哺乳动物的细胞，所述治疗基因可以在 下列物质中进行选择'.(i)基因标记，诸如萤光素酶基因、p —半乳糖 普酶基因、氯霉素乙酰转移酶基因、对抗生素(诸如潮審素或新霉素)具
有抗性的基因；(2)用于治疗目的的基因，如编码在血胆固醇过多的情 况下(肝脏)缺陷的低密度脂蛋白受体的基因、编码凝固因子的基因、肿 瘤的抑制基因、编码主要组织相容性蛋白的基因、抗癌基因、RNA和反 义RNA和编码核酶的基因；(3)具有疫苗目的的基因，如编码病毒抗 原的基因.
本发明所涉及装栽治疗基因的树状多肽大分子栽体系统用于转染的 细胞可以选自下列细胞造血细胞；肝细胞；骨骼肌细胞；皮肤细胞，如 成纤维细胞、角质细胞、树突细胞或黑素细胞；血管壁细胞，如内皮细胞 或平滑肌细胞；呼吸道的上皮细胞；中央神经系统的细胞；癌细胞；免疫 系统的细胞，诸知淋巴细胞、巨噬细胞、NK细胞等.
装栽治疗基因的树状多肽大分子栽体系统用于系统治疗基因缺陷所 致的遗传病、免疫缺陷或抑癌基因的失活所致的肿瘤等疾病，尤其是相关 的肺瘤疾病.
其中所述的肿瘤性疾病选自白血病(包括急性白血病、急性淋巴白血 病、急性號细胞性白血病、成號细胞白血病、前號细胞性白血病、粒-单 核细胞型白血病、单核细胞性白血病、红白血病、悵性白血病、慢性髄细 胞性白血病、慢性淋巴白血病)、真性红细胞增多、淋巴瘤、何杰金病、 非何杰金病、多发性骨號瘤、特发性巨球蛋白血症、实体瘤、肉瘤和癌、 纤维肉瘤、粘液肉瘤、脂肉瘤、软骨肉瘤、骨源性肉瘤、脊索瘤、血管肉
8瘤、内皮肉瘤、淋巴管肉瘤、淋巴管内皮肉瘤、滑膜瘤、间皮瘤、尤因瘤、 平滑肌肉瘤、橫紋肌肉瘤、结肠癌、胰腺癌、乳腺癌、卵巢癌、前列腺癌、 鳞状细胞癌、基底细胞癌、腺癌、汗腺癌、皮脂腺癌、乳头状癌、乳头腺 癌、囊腺癌、號样癌、支气管癌、肾细胞癌、肝癌、胆管癌、绒毛膜癌、 精原细胞瘤、胚胎癌、维尔姆斯肿瘤、子宫颈癌、子宫癌、睾丸肿瘤、肺 癌、小细胞肺癌、膀胱癌、上皮癌、神经胶质瘤、星形细胞瘤、成神经管 细胞瘤、颅咽管瘤、室管膜瘤、松果体瘤、成血管细胞瘤、听神经瘤、少 突神经胶质瘤、硬脑膜肉瘤、黑素瘤、神经母细胞瘤和视网膜神经细胞瘤 等，
具体实施例方式
下面用实施例具体说明本发明，公开和描述本发明用于基因送递的 組合物以及方法，并不限于本文所公开的具体的结构、方法步骤和氨基酸 单体，这是因为这样的结构、方法步骤和4Ut酸单体可以发生变化.本文 使用的术语仅仅是用于描述具体实施方案而不是进行限制，这是因为本发 明的范围将仅仅受到所附权利要求及其等同内容的限制.
本发明涉及一种能够与核酸形成稳定的、可溶的复合体的装栽治疗基 因的树状多肽大分子栽体系统及其制备方法，所述的组合物含有与聚乙二 醇等阳离子大分子单元共价连接的树状多肽大分子.在解离的过程中，该 栽体系统复合体能够释放出核酸以便转染几种类型的细胞，
下列实施例不应理解为任何意义上的对本发明的限制
实施例l赖氨^*#枝多肽大分子(1)的合成
赖氨酸是构建多肽树状大分子时使用最多的枝化单元，以二苯甲胺为
核，Boc保护的L-赖氨酸为枝化单元，DCC为偶联剂，三氟乙酸为脱保 护刑，反复进行偶联-脱保护的反应.合成过程中的每一代产物都需要用 柱层析法进行分离提纯，然后再进行下一代的合成，所以效率较低，但是 所得的产物的结构非常规整，理论分子量与质谦测试所得结果几乎一致。 这种树枝状多肽大分子的结构非常规整，外层氨基的数量可以准确控制，具有树枝状大分子的典型特征如分子结构内松外紧、分子尺寸单一、溶 液粘度小等,反应中采用的偶联剂是含砩缩合剂HBTU和HOBt.DCC的 反应中副反应多，杂质4iU舉除去而HBTU的反应中副反应少，杂质容易 除去，因此在多肽树状大分子的合成中常使用BOP或HBTU等含磷缩 合刑，HOBt的加入是为了进一步减少副反应，同时减少消^J1应，由常 M^iL应可以得到一代、二代到多代的赖氨^W枝状多肽大分子(1G-1、
2G-1.......7G-1 ),
实施例2赖氨酸基树状多肽大分子-聚乙二醇偶合物(l-PEG)的合
成
在氮气保护水水浴中，各种分子量范围的聚乙二醇0.042M溶解在0 . 5mL无水的DMF中.将溶于0.5mLNMF的IBCF ( 0.036M )逐滴添 加到上述溶液中，将该混合物在冰水浴中搅拌30分钟，然后逐滴地加入 到含有25 mg赖氨^^树枝状多肽大分子lHBr )和10fiL TEA的1 mL 无水的二甲亚矾(DMSO)中，然后在室温下再搅拌3小时.在100mL的 无水乙醚中沉淀产物，并将沉淀溶解在10mL蒸馏水中，将其在0.01M的 NaHC03溶液中透析(透析袋的MWCO为25,000 ),然后再在O，IM的 盐酸溶液中透析，之后再在蒸馏水中透析.最后冷冻干^it:析所得的产物. 通过力-NMR计算出nG-l-PEG中4U^的摩尔比，
nG-l-PEG的力-腿R分析
在水中进行由实施例1和2的步骤制得的l-PEG的^-NMR图诿 中，大约3.5ppm处的峰表明该组合物中存在着PEG.通过将 PEG(-CH2CH2- ，s， 3.4-3.7ppm)峰与1侧链(-CH2CH2CHr ，m， 1.1-1.8ppm) 峰相关联，从NMR谘中计算出PEG的含量，通过该方法证实了由本发 明制得的四种说明性的栽体組合物中PEG含量之比如下分別为 7(5G-1-PEG)， 11(4G-1-PEG)， 20(2G國1-PEG)和30(7G-1-PEG)摩尔％ 。
实施例3 ^*^#状多肽大分子(2)的合成
以L-谷氨酸乙酯和(Z)-L-g酸作为枝化单元，HBTU和HOBt作
为偶联剂利用^M目法合成扇形的树枝状多肽大分子片断，然后通过收敛法 与特定的核心^t合，得到不同结构的球型、哑铃型树枝状多肽大分子，由常规反应可以得到一代、二代到多代的谷氨酸基树枝状多肽大分子
(1G-2、 2G醫2.......7G-2),
实施例4^4M^树状多肽大分子-聚乙二醇偶合物(2-PEG)的合成 合成过程同反应实施例2,得到1G-2-PEG、 7G-2-PEG…… 7G-2-PEG.通过iH-NMR计算出nG-2-PEG中4RJ^的摩尔比， 实施例5脯氨⑩时状多肽大分子(3)的合成
脯氦酸由于分子中具有一个环状结构和亚胺，使其具有独特的空间化 学性质.脯氨酸寡聚物具有两种不同的构象.在有机溶剂中，聚脯氨酸呈
右旋螺旋链结构(PPI);在水溶液中，聚脯氨酸呈左旋螺旋链结构(PPII)。 基于这种特性，以寡聚脯氨酸来构建多肽树状大分子，有望开发出一种功 能性药物栽体.药物可以在有机溶刑中包衮在处于PPI构像的螺旋链中， 而当在人体环境中，寡聚脯氨酸的构象将从PPI向PPII转变，从而药物 得到释放.脯氨酸多肽树状大分子合成的有效策略是采用收敛固相合成 法.由常MA应可以得到一代、二代到多代的脯氨^fcW枝状多肽大分子
(lG-3、 2G画3.......7G-3),
实施例6谷氨^Lfc时状多肽大分子-聚乙二醇偶合物(3-PEG)的合成 合成过程同反应实施例2,得到1G-3-PEG、 7G-3-PEG…… 7G-3-PEG,通过iH-NMR计算出nG-3-PEG中4y^的摩尔比。
实施例7树状多肽大分子栽体-绿色荧光蛋白基因(pEGFP )复合体 的合成
取20^L浓度的树状多肽大分子纳米颗粒水悬液，加入6聘 pEGFP质粒DNA ，混合均匀，室温放置30分钟.由此可以得到nG-l-pEGFP , nG-2醫pEGFP , nG-3-pEGFP和nG-l-PEG-pEGFP ， nG國2-PEG-pEGFP, nG画3-PEG誦pEGFP的基因栽体复合物.
将得到的DNA-纳米颗粒复合物加入200^无血清培养基中，混匀， 放置60分钟.培养基逐滴加入培M人体乳腺癌细胞的培养亚中，共同 培养4-6个小时，然后再加入完全培养基共同培养，培养20 40小时后 在荧光显微镜下观察细胞的荧光，进行转基因的检测，同种方法可以制备树状多肽大分子栽体-红色色荧光蛋白基因复合体
实施例8树状多肽大分子栽体-绿色荧光蛋白基因体外转染实验 以昆虫细胞系Sfg为测试细胞系，细胞培养方法^Xt数生长期的细 胞，细胞汇合度达到卯％时，加入一定量的含有IO %胎牛血清的新鲜 Grace ， s昆虫细胞培养基.^Hfc细胞团块，分装到培养瓶中，放置于27 T 培养箱中培养.
参照实施例6的方法分别制备一系列不同质量比的树状多肽大分子 栽体-质粒DNA的复合物溶液.保证每种配比中被包覆质粒DNA质量 相同.
转染方法转染前24小时，以lx106个细胞/毫升的密度接种于24 孔板，使细胞汇合度达到75% 每孔加入1毫升含血清的Grace ， s昆虫 细胞培养基，转染当天，吸去原培养基，并用细胞培养基洗涤细胞一次， 然后将100微升上述栽体/质粒DNA复合物与400微升无血清培养基 混匀，并均匀地加入每孔中，27 "C培养5-8小时，吸去原培养基后加入 1毫升含血清的Grace ， s昆虫细胞培养基培养6-9天，然后用激光共聚 焦显微镜观察并拍照.转染效率结果显示，各种分子量的基因栽体，绿色 荧光蛋白基因表达的效率均髙于红色荧光蛋白基因.对比发现，转染效率 最高的为nG-2和nG-3-PEG样品，超过50 %.通过优化这些栽体的分 子量，其转染效率有望进一步提高
实施例9树状多肽大分子栽体-pSVl-p-gal基因栽体系统复合物的合
成
不同数量的树状多肽大分子栽体(O.l-lO吗)添加到2吗的质拉 DNA中，并在室温下培养30分钟.将凝胶电泳样品緩冲液加入到每个 样品中，然后采用电泳系统在100V下通过在1 % ( w/v )琼脂糖凝胶上 电泳卯分钟来分离样品.使用TBE(45mMTris-硼酸盐，lmMEDTA， pH 8.0)緩冲液作为电泳緩冲液.用澳化乙锭(1吗/ mL )对皿染色 30分钟并用紫外发光器照明以显示DNA的位置，采用由EcoRI消化的 入DNA ( Promega )作为DNA大小的标记物，由此可以得到nG-l画 pSVl画p-gal， nG國2-pSVl-p-gal， nG-3-pSVl-P-gal和nG画l-PEG-pSVl-p画
12gal， nG-2-PEG画pSVl-P-gal， nG-3-PEG-pSVl-P画gal的基因栽体复合物.
实施例9树状多肽大分子栽体-pSVl-p-gal的转染
采用Hep G2细胞系评价树状多肽大分子栽体-pSVl-P-gal的体外转 染率，在37T下，在5。/oC02培养箱中，在lmM丙酮酸钠和10。/。FBs 的MEM培养基中维持细胞，使用不含FBs的细胞培养基作为混合培养 基.体外转染通常进行如下，将H印GZ细胞以20xlO"个细胞/mL的密 度接种在96孔平底微量测定平板中，并且在加入质粒DNA /栽体复合 体或者单加入栽体之前培养24小时.通过在100^不含FBS的细胞培 养基中混合l吗的pSVl-卩-gal和不同数量的栽体来制备树状多肽大分子 栽体-pSVl-P-gal复合体.并在室温下培养30分钟.分别以10 % ( v / v ) 和100 的最终浓度添加FBs和氯奎.用IOOjiL的转染混合物替换 96孔平板中每个孔中的培养基.然后在37 r下在5 % C02培养箱中培 养细胞4小时.4个小时后，除去转染混合物并向每个孔中加入100pL含 有10。/。FBS的新鲜培养基.在37C下再培养细胞48小时.通过测量 由pSVl-P-gal引入细胞中的P-半乳糖普酶的活性来测定转染率.
实施例10树状多肽大分子栽体-pSVl-p-gal细胞毒性
树状多肽大分子栽体-pSVl-p-gal转染H叩G2细胞系，以96孔板 中每个孔3吗的浓度(细胞培养基中为30吗/mL)测试不同的基因栽 体.在37 "下4先基因栽体与细胞一起培养4小时，然后测定细胞的存 活，结果显示出针对H印G2细胞的合成栽体的细胞毒性.在有30呢/ mL 基因栽体存在的情况下培养Hep G2细胞4小时.对树状多肽大分子栽 体-pSVl-P-gal而言，在Hep G2细胞中没有观察到细胞毒性，而树状多 肽大分子则呈现出中等至高度的细胞毒性.PEG取代比例的不同并未在
细胞生存力方面带来显著的变化.这可以得到相差显m测的进一步支
持，即把树状多肽大分子栽体-pSVl-p-gal与Hep G2细胞一同培养并未 给细胞的生存力带来任何显著的影响.将树状多肽大分子栽体与细胞一起 培养4小时改变了细胞的形态，但是在相同的浓度和培养时间下树状多 肽大分子栽体-pSVl-P-gal并未显著地改变细胞的形态.
权利要求
1. 一种可用于制备装载治疗基因的树状多肽大分子载体系统，其特征在于由治疗基因、树状多肽大分子或者具有连接有阳离子高分子的树状多肽大分子组成。
2. 按权利要求1所述装栽治疗基因的树状多肽大分子栽体系统，其特 征在于所述栽体系统可以由树状多肽大分子纳米粒组成，其结构单元为天 然的氨基酸，可以是单一的氨基酸，也可以由不同的氨基酸组成，其中氛基酸优选自下列化合物赖氨酸、谷氨酸、脯氨酸和羟脯氨酸等;所述 树状多肽大分子为l-7代化合物，
3. 按权利要求1所述装栽治疗基因的树状多肽大分子栽体系统，其特 征在于所述栽体系统可以由连接有阳离子大分子树状多肽大分子构筑的 纳米粒组成，阳离子大分子优选自下列化合物壳彩瞎、聚乙二醇、聚乙 烯亚胺等.
4. 权利要求1至权利要求4中任一权利要求的树状多肽大分子栽体 系统，可以是药学可接受的盐类化合物和酯类化合物盐类化合物是对于 碱性树状多肽大分子栽体优选的为氣化物、氯化物、溴化物、碘化物、硫 酸盐、硝酸盐、磷酸盐、乙酸盐、三氣乙酸盐、马来酸盐、富马酸盐、枸 橼酸盐、草酸盐、琥珀酸盐、酒石酸盐、苹果酸盐、扁桃酸盐、甲磺酸盐 或对甲笨承酸盐；对于酸性树状多肽大分子栽体基于碱金属和碱土金属的阳离子，如钠盐、锂盐、钾盐、钙盐、镁盐、铝盐等，以及铵、季铵和胺 阳离子，其中包括但不限于铵、四甲基铵、四乙基铵、甲胺、二甲胺、 三甲胺、三乙胺、乙胺等以及用于形成碱加成盐的其它代表性有机胺包括 二乙胺、乙二胺、乙醇胺、二乙醇胺、旅唤；酯类化合物，指可在体内水 解的酯，包括在人体内降解释放出母体化合物或其盐的醋，合适的酯基团 包括例如衍生自药学上可接受的脂族羧酸或脂族族醇，尤其是链烷酸 (醇)、链烯酸(醇)、环烷酸(醇)和链烷二羧酸(二醇)的醋，其中 优选的各烷基或烯基部分少于6个碳原子。
5. 权利要求1至权利要求5中任一权利要求的树状多肽大分子栽体系统，其特征在于所述栽体与治疗基因的比例为0.5~20:1.
6. 权利要求1至权利要求5中任一权利要求的树状多肽大分子栽体 系统，其特征在于所迷栽体与治疗基因含有编码遗传标记的基因序列，所 述的遗传标记选自劳光素酶基因、p —半乳糖普酶基因、潮霉素杭性基因 和新霉素杭性基因以及氟審素乙敏转移酶基因，选自低密度脂蛋白受体、 凝固因子、肿瘤的基因抑制剂、主要组织相容性蛋白、杭癌基因、P16 、 p53 、胸普激酶、IL2 、 IL4以及TNFou
7. 权利要求1至权利要求5中任一权利要求的树状多肽大分子栽体 系统，其特征在于所述治疗基因含有编码病毒杭原的DNA序列，选自 RNA 、反义RNA和核酶的RNA;所述的核酸编码凝集素、甘露糖受体、 唾液酸粘附素或逆转录病毒反式激活因于(TAT )。
8. —种转染细胞的方法，所述的方法包括使所说的细胞与1至权利要 求5中任一权利要求的树状多肽大分子栽体系统在一定的条件下接触，组合物的核酸，
9. 权利要求1至权利要求5中任一权利要求的树状多肽大分子栽体 系统，其特征在于所迷栽体系统治疗基因缺陷所致的遗传病、免疫缺陷或 抑癌基因的失活所致的肿瘤等疾病，尤其是相关的肿瘤疾病，例如白血病、 结肠癌、前列腺癌、肝癌、胰腺癌等，
全文摘要
本发明涉及作为基因载体的多肽树状大分子及其应用。这种可用于制备装载治疗基因的树状多肽大分子载体系统，由治疗基因、树状多肽大分子或者具有连接有阳离子高分子的树状多肽大分子组成。树状多肽大分子的结构单元为天然的氨基酸，可以是单一的氨基酸，也可以由不同的氨基酸组成。树状多肽大分子载体系统，可以是药学可接受的盐类化合物和酯类化合物。这种装载治疗基因的树状多肽大分子载体系统可以治疗基因缺陷所致的遗传病、免疫缺陷或抑癌基因的失活所致的肿瘤等疾病。
文档编号A61K47/48GK101461947SQ200810171638
公开日2009年6月24日 申请日期2008年10月23日 优先权日2008年10月23日
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