前列腺癌的检测的制作方法

专利名称：：前列腺癌的检测的制作方法前列腺癌的检测
背景技术：
：本发明涉及与其他诊断方法以及供这些方法使用的试剂盒相一致的甲基化基因的检查。在高等真核细胞中，DNA仅在CpG二核苷酸中的位于鸟嘌呤5'位置的胞嘧啶处甲基化。这一修饰在基因表达上具有重要的调节效果，尤其是当它涉及位于基因启动子区域的富含CpG的区域(CpG岛)时。正常的未甲基化CpG岛的异常甲基化是永生化细胞和转化的细胞中的常见事件，并与特定肿瘤抑制基因或其他与一些人体癌症的改善有关的基因的转录失活相联系。最近公开了许多潜在的甲基化标记物。谷胱甘肽S-转移酶(GST)是示例性的蛋白质，其中表达它们的基因的甲基化状态对前列腺癌有重要的预后和诊断价值。所述蛋白质通过使具有化学反应性的亲电子试剂与谷胱甘肽缀合来催化细胞内解毒反应，包括使亲电子性的致癌物质失活(C.B.Pickett等人，An皿.Rev.Blocbern.，58:743，1989;B.Coles等人，CRCCrit.Rev.Biochem.Mol.Biol.，25:47，1990;T.H.Rushmore等人，J.Biol.Chem.268:11475,1993)。由在不同基因座的几个不同基因编码的人类GST已被分为四个不同的家族，称作a、y、ji禾Pe(B.Mannervik，etal.，Biochem.J.，282:305,1992)。由夕卜遗传(印igenetic)改变导致的GSTP1表达的降低常与前列腺癌与肝癌有关。S100蛋白是钙-结合蛋白，除了他以外，该蛋白与肿瘤发生(t咖erigenesis)有关。所述家族包括S100A2、S100A4、S100A5、S100A6、S100A8、S100A9和S100A11，虽然它们起到的确切作用还并不清楚，但其全部显示与肿瘤的发展具有某些关系。S100A6(结合蛋白)的表达似乎能够降低前列腺癌的发展。已经显示S100A2在乳腺癌、肺癌以及前列腺癌中呈现出减少的表达。据信这是由于基因启动子的超甲基化，但是实际情况并不清楚，因为在非恶性前列腺上皮细胞和BPH中也发现了超甲基化作用。在外遗传检测(印igenetictesting)中，样品和样品的制备是重要因素。每一个样品源都具有其问题(issues)。甚至直接从患病组织取得的活体检查样品也已知可能由于患病细胞的不均匀分步而呈现假阴性结果。尿是合意的样品，因为它的获得比其他可能样品的获得具有更少的侵入性。排入尿中的前列腺癌细胞的数目和浓度是非常易改变的，其取决于很多因素例如收集尿的时间、其是否是按照前列腺按摩法收集的、以及核酸酶的存在和作用以及用于使它们的作用最小化的试剂和方法。虽然一些人建议用尿样品进行前列腺癌检测，但实际上进行这样的检测已经被证明是困难的。首先，这样的检测的基础是假定癌细胞会从肿瘤或损伤部位脱落到泌尿系统中。实际上对这一过程的了解很少。并且似乎分析物浓度的变化可能会比其他样品例如组织活体检查甚至血清样品中的浓度变化更加显著，这取决于各种各样的生理和环境因素例如患者被水合的程度。考虑到核酸酶和各种其他物质的存在会影响核酸，所以对分析物在基质中的稳定性也没有很好的了解。供许多其他尿检测用的样品的制备使用的是被称为沉积物的旋转沉淀样品。这种方法是否对甲基化标记物具有意义是不能够演绎推测的。对患者的准备工作和可选的预处理也不是很了解。直肠指检(DRE)是用于确定前列腺健康的标准诊断方法，在该方法中治疗医师会注意解剖学异常。过去，将用DRE结果来决定是否需要进行活体检查或者其他诊断或治疗方法。所述方法例如DRE或相关的前列腺按摩是否会引起细胞脱落以便于在后续的诊断方法中能够检测到这些细胞以及脱落到什么程度是不清楚的。在程序上，DRE和手指直肠按摩法以及进行这些方法的时机存在很大的不同，这些也被加入到该领域内未知事物的目录中。发明简述本发明的一个方面是用于在患者中表征前列腺癌的方法，所述方法包括在收集尿三天内检测尿中的GSTP1甲基化和一种或多种参照基因。如果GSTP1的甲基化程度超过了预先确定的值则认为检测对前列腺癌是阳性的，如果没有超过预先确定的值则认为其对前列腺癌是阴性的。本发明的另一方面是用于在患者中表征前列腺癌的方法，所述方法包括在收集尿三天内检测尿中的GSTP1甲基化、一种或多种参照基因和S100基因。通过对GSTP1甲基化检测值和S100甲基化检测值进行比较来确定GSTP1的标准化值。如果标准化后的甲基化检测值超过了预先确定的值则认为检测对前列腺癌是阳性的，如果没有超过预先确定的值则认为其对前列腺癌是阴性的。本发明的又一方面是用于在患者中表征前列腺癌的方法，所述方法包括作为嵌套式PCR反应进行的检测GSTP1甲基化和一种或多种参照基因。如果GSTP1的甲基化程度超过了预先确定的值则认为检测对前列腺癌是阳性的，如果没有超过预先确定的值则认为其对前列腺癌是阴性的。在本发明的又一方面中，检测了以下基因组合的甲基化a.GSTPl，APC。b.GSTP1，APC，S100A2。c.GSTP1，RARP2。d.GSTP1，RARP2，S100A2。所述基因组合中还可以包括参照基因。在本发明的又一方面中，甲基化状态是通过实时定量PCR确定的。在又一个方面中，本发明是用于检测甲基化核酸的试剂盒。所述试剂盒包括一个或多个容器；第一容器含有用于修饰未甲基化的胞嘧啶的试剂，第二容器含有用于启动含CpG的核酸扩增的试剂，其中，所述试剂能区分修饰的甲基化核酸和未甲基化的核酸。所述试剂盒含有对被怀疑患有前列腺癌的患者进行分析的说明书。在本发明的又一个方面中，试剂盒包括具有分隔的部件的反应容器，引物最初储存在分隔的部件中，并且其中在试剂盒的使用期间，引物按照一定的顺序流入反应室以便能够适当地评估甲基化状态。所述引物能够用于实施嵌套式扩增反应。发明详述本发明的基于尿的检测优选在已经进行了PSA检测且结果不明确或难以确定(最优选2.5-4.Ong/ml)的患者上进行。用本发明检测的阴性结果(在没有其他临床症状时)能够使患者免于进行更具侵入性的检测例如用活体检查方法进行的检测。因此，从范围最广的方面来看，根据本发明的一个方法包括首先在患者中进行PSA检测，接着再对那些所测得的PSA水平为2.5-4.Ong/ml的患者进行下面更详细描述的检测。本发明的检测能够检出与特定基因相对应的核酸的超甲基化，其中所述特定基因的甲基化状态与前列腺癌相关。当某基因的甲基化状态提供关于前列腺癌的信息时，核酸对应于其甲基化状态与前列腺癌相关的该基因，并且所述序列是该基因的编码段或其补体、该基因的典型段或其补体、该基因的启动子或调控序列或其补体、表示该基因存在的序列或其补体、或该基因的全长序列或其补体。这样的核酸在本说明书中称为标志(Markers)。标志仅对应于下列基因GSTP1(Seq.IDNo.17)、APC(启动子二Seq.IDNo.18，基因二Seq.IDNo.19)、RARP2(Seq.IDNo.20)、S100A2(Seq.IDNo.21)。其他所关注的序列包括可用作检测参照的组成型基因，例如P-肌动蛋白(Seq.IDNo.22和23)和PTGS2(启动子=Seq.IDNo.24，基因=Seq.IDNo.25)。检测超甲基化的试验包括诸如MSP和限制性内切核酸酶分析的技术。启动子区域是用于检测这样的超甲基化分析的特别显著的目标。对GSTP1的启动子区域的序列分析显示近72%的核苷酸是CG，约10X是CpG双核苷酸。本发明包括测定尿或尿道冲洗物中的标志的一定区域的甲基化状态，其中与前列腺癌相关的DNA被扩增和检测。因为用标志编码的蛋白水平降低(g卩，较少转录)通常是由于特定区域如启动子的超甲基化所导致的，所以希望能够判断所述区域是否被超甲基化。这在GSTP1基因的情况中以及在发明概述部分显示的基因组合中是最有可能得到证实的。使用对于一定标志区域有特异性的核酸探针或报道基因来检测标志基因的甲基化区域的存在。超甲基化区域是与正常组织相比在疾病组织的样品中被甲基化到统计学显著程度的区域。如上面所指出的，本发明的测定是用尿作为基质进行的。最优选地，所述尿是在前列腺按摩后收集的，并储存在4t:直至其沉积。最优选其在4小时内旋转沉淀。前列腺按摩，当与本发明的甲基化分析一起进行时，最好如下进行紧紧地压迫腺体使其足以压低每个叶的从底部到顶部以及从侧线到中线的表面以确保能够排出足够数目的前列腺细胞。最优选该按摩进行20秒或更短的时间。将本发明的引物/探针或报道基因试剂中的一些用于检测标志基因的表达控制序列的甲基化。这些是调节核酸序列的转录，并在一些情况中是调节核酸序列的翻译的核酸序列。因此，表达控制序列可以包括与启动子、增强子、转录终止子、起始密码子(即ATG)、内含子的剪接信号、维持正确的所述基因的读框以许可mRNA的适当翻译和终止密码子有关的序列。GSTP1启动子是最优选的标志。它是能够引导基因转录以生成谷胱甘肽-s-转移酶蛋白的多核苷酸序列。启动子区域位于上游，或相对于结构基因的5'端。它可以包括下述元件(element)，所述元件足以致使启动子依赖的基因表达对于细胞型-特异性、组织-特异性是可控的，或是可通过外来信号或物质诱导的；这样的元件可位于多核苷酸序列的5'或3'区。本发明的一个方法包括使含有标志的靶细胞和与核酸结合的试剂接触。所述靶细胞组分是核酸例如从尿中通过产生不含蛋白质的纯DNA的细胞裂解和纯化(基于柱或溶液的)提取到的DNA。所述试剂包括引发和探测PCR或MSP反应以及检测目标序列的组分。这些试剂可以包括合并或键合至其自身的报道基因部分的引发序列，例如在Whitcombe等人的美国专利6，326，145和6，270，967中描述的、称为Scorpion试剂或Scorpion报道基因的那些启动序列(在此以引用的方式引入上述文献的全部内容)。尽管它们并不相同，但术语"引物"和"引发序列"在本说明书中可用于指引发核酸序列扩增的分子或分子段。检测甲基化模式的一个灵敏的方法包括联合使用甲基化敏感的酶和聚合酶链式反应(PCR)。在用酶消化DNA后，只有当DNA裂解被甲基化阻止时才从限制性酶切位点侧翼的引物来进行PCR扩增。本发明的PCR引物是以位于根据基因位置编号M24485(Genbank)距GSTP1转录起始位点大约-71+59bp之间的启动子和转录区域作为靶标设计的。本发明的方法还可以包括使含有核酸的样本与修饰非甲基化的胞嘧啶的试剂接触；利用CpG特异性寡核苷酸引物扩增样品中含有CpG的核酸；以及检测甲基化的核酸。优选的修饰是把未甲基化的胞嘧啶转换成另一个核苷酸，该核苷酸能够将未甲基化的胞嘧啶与甲基化的胞嘧啶区分开来。优选地，所述试剂将未甲基化的胞嘧啶修饰为尿嘧啶并且是亚硫酸氢钠，然而，也可以使用其他的修饰未甲基化的胞嘧啶而不是甲基化胞嘧啶的试剂。亚硫酸氢钠(NaHS03)修饰是最优选的，其易于与胞嘧啶的5，6-双键发生反应，但其与甲基化胞嘧啶的反应较差。胞嘧啶与亚硫酸氢盐离子反应形成对脱氨基作用敏感的磺化胞嘧啶反应中间体，从而产生磺化尿嘧啶。磺酸酯基团可以在碱性条件除去，结果形成尿嘧啶。尿嘧啶通过Taq聚合酶被识别为胸腺嘧啶，因此在进行PCR时，最终产品仅在初始模板中出现5-甲基胞嘧啶的位置处包含胞嘧啶。Scorpion报道基因和试剂以及其他的检测系统按照这种方式类似地将经修饰的样本与未经修饰的样本区分开来。本发明中用于扩增样本中含有CpG的核酸的引物在修饰(例如使用亚硫酸氢盐)后，能够明确地区分未处理的DNA、甲基化的DNA和非甲基化的DNA。在甲基化特异性PCR(MSPCR)中，用于非甲基化DNA的引物或引发序列优选在3'CG对具有T，从而将其与甲基化的DNA中保留的C相区别，补体被设计为反向引物。用于非甲基化DNA的MSP引物或引发序列(primingsequence)通常在序列中含有相对很少的Cs或Gs，因为Cs将在正义引物中缺失，而Gs在反向引物中缺失(C被修饰为U(尿嘧啶)，其在扩增产物中被扩增为T(胸腺嘧啶核苷))。本发明的引物是具有足够长度和适当序列的寡核苷酸，从而提供在多态性基因座(polymorphiclocus)中大量核酸的聚合的特异性引发。当暴露于适当的探针或报道基因时，被扩增的序列显示出甲基化状态，由此显示诊断信息。优选的引物最优选是八个或八个以上能够引发引物延伸产物合成的脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸，所述产物与多态性基因座链基本上互补。有助于合成的环境条件包括三磷酸核苷和聚合用试剂例如DNA聚合酶的存在，以及适当的温度和pH。为了最大扩增效率，所述引物的引发部分或引发序列优选是单链的，不过也可以是双链的。如果为双链，则所述引物在用于制备延伸产物前首先要进行处理以使其链分离。所述引物必须是足够长的以在存在聚合用诱导剂时引发延伸产物的合成。引物的精确长度取决于诸如温度、缓冲剂、阳离子和核苷酸组成的因素。寡核苷酸引物最优选包含约12-20个核苷酸，尽管它们可以包含更多或更少的核苷酸，优选按照公知的设计方针或规则。引物被设计成与将被扩增的基因座的每个链基本上互补，并包含如上所述适当的G或C核苷酸。这意味着所述引物必须充分互补从而在允许使用聚合用试剂的条件下与其各自的链杂交。换言之，所述引物应当与5'和3'侧翼序列充分互补以进行杂交和容许基因座扩增。8引物被用于扩增过程中。也就是说，相对于所包括的反应步骤的数目来说反应(优选酶链式反应)产生了非常大量的靶基因座。在最优的实施方案中，所述反应产生了按指数规律增大的量的靶基因座。例如这样的反应包括PCR反应。一般地，一个引物与基因座的负(_)链互补，而另一个引物与正(+)链互补。对引物进行退火以使核酸变性然后使用酶，例如DNA聚合酶I(Klenow)的大片段和核苷酸进行扩增，结果得到新合成的包含+链和_链的靶基因座序列。链式反应的产物是不连续的核酸双螺旋体，其末端相当于使用的特异引物的末端。所述引物可以通过使用任何适当的方法制备，例如包括自动化方法的常规的磷酸三酯和磷酸二酯法。在一个这样的自动化实施方案中，二乙基亚氨基磷酸酯(diethylphosphoramidite)单体用作起始材料，并可以通过Beaucage等人描述的方法合成(TetrahedronLetters,22:1859-1862，1981)。美国专利号4，458，066中描述了用于在经修饰的固体载体上合成寡核苷酸的方法。任何从尿或尿道冲洗物取得的核酸样本，以纯化或非纯化的形式，均可用作起始核酸，只要其含有或怀疑含有具有靶基因座(例如CpG)的特定核酸序列。因此，所述方法可以使用例如DNA或RNA，包括信使RNA。所述DNA或RNA可以是单链的，也可以是双链的。在RNA用作模板的事件中，可以使用用于将模板逆转录为DNA的最佳的酶和/或条件。另外，可以使用包含各自的一个链的DNA-RNA杂交体。还可以使用核酸的混合物，或者也可以使用利用相同或不同的引物在本文中前述的扩增反应中产生的核酸。将被扩增的特定的核酸序列，即耙基因座，可以是大分子的一部分，或者在开始时显现为不连续的分子从而使特定序列构成整个核酸。如果提取的样品不纯，则它可以在扩增之前使用一定量的试剂进行处理，所述试剂能够有效地打开样品的细胞、液体、组织或动物细胞膜，并能够暴露和/或分离核酸的链。用于暴露并分离链的该裂解和核酸变性步骤将使扩增能够更容易地进行。当样品的靶核酸序列包含两条链时，在其用作模板之前必须对核酸的链进行分离。链分离可以作为单独的步骤实施，也可以与引物延伸产物的合成同时进行。这样的链分离可以通过使用各种适当的变性条件，包括物理的、化学的或酶的方法来完成。一种分离核酸链的物理方法包括加热核酸直至其变性。典型的热变性包括在约80□_105°〇的温度范围内加热最长达10分钟。链的分离也可以通过来自被称作解螺旋酶类的酶或通过酶RecA得到诱导，所述酶RecA具有解螺旋酶活性，并且已知其在存在riboATP时能够使DNA变性。适于使用解螺旋酶分离核酸链的反应条件由KuhnHoffmann-Berling描述(CSH-QuantitativeBiology，43:63，1978)。在C.Radding中对使用RecA的技术进行了评述(Ann.Rev.Genetics,16:405-437，1982)。这些技术的精制形式现在也是众所周知的。当核酸的互补链被分离时，不管核酸原来是单链还是双链，分离的链将可以用作合成其他核酸链的模板。该合成在允许引物杂交到模板的条件下进行。合成通常发生在缓冲水溶液中，优选地pH值为7-9，最优选约为8。优选将摩尔量过量(对于基因组核酸，通常为引物模板约108:1)的两种寡核苷酸引物加入到含有分离的模板链的缓冲液中。如果将本发明的方法用于诊断应用，则互补链的量可以是未知的，因此相对于互补链的量的引物的量不一定总是能够准确地确定。然而，实际上当将被扩增的序列包含在复杂的长链核酸链的混合物中时，引物的添加量与互补链(模板)的量相比通常是摩尔量过量的。优选使用过量较多的摩尔量以改善所述方法的效率。将足够量的三磷酸脱氧核糖核苷dATP、dCTP、dGTP和dTTP单独地或与引物一起添加到合成混合物中，将所得溶液加热到大约90°C-IO(TC，加热最长达10分钟，优选1到4分钟。在该加热阶段后，使溶液冷却至室温，这对于引物杂交来说是优选的。向冷却的混合物中加入用于进行引物延伸反应的适宜的试剂("聚合用试剂")，并使反应在本领域公知的条件下进行。如果聚合用试剂是热稳定的，则聚合用试剂也可以与其他试剂一同加入。该合成(或扩增)反应可以在室温至聚合用试剂不再起作用的温度下进行。聚合用试剂可以是任何能用于完成引物延伸产物的合成的化合物或系统，优选酶。用于该目的的适宜的酶包括，例如，E.coilDNA聚合酶1、E.coilDNA聚合酶1的克列诺(Klenow)片段、T4DNA聚合酶、其他可利用的DNA聚合酶、聚合酶突变体、反转录酶、和其他酶，包括热稳定的酶(例如，在经受充分升高直至导致变性的温度后进行引物延伸的那些酶)。优选试剂是Taq聚合酶。适宜的酶将以适当的方式促进核苷酸的组合，从而形成与各基因座核酸链互补的引物延伸产物。通常，合成将在各引物的3'端开始，并沿模板链在5'方向进行，直到合成结束，以产生不同长度的分子。然而，也可以使用这样的聚合用试剂，其利用与上述方法相同的方法，在5'端开始合成，并沿另一个方向进行。最优选地，扩增方法是利用PCR进行的。也可以采用替代性扩增方法，只要使用本发明引物通过PCR扩增的甲基化和非甲基化基因座能够通过所述替代性手段被类似地扩增即可。在一个这样的最优选的实施方案中，试验是作为嵌套式PCR进行的。在嵌套式PCR方法中，采用两级或多级聚合酶链式反应。在第一级聚合酶链式反应中，使用一对外寡核苷酸引物来扩增第一序列，所述外寡核苷酸引物由上游引物和下游引物组成，所述上游引物和下游引物分别在5'和3'位置处位于特定第一靶核苷酸序列的侧翼。在随后的级次中，使用同样由上游引物和下游引物组成的第二组内或嵌套式寡核苷酸引物来扩增包含在第一靶核苷酸序列内的较小的第二靶核苷酸序列。上游内引物和下游内引物分别在5'和3'位置处位于第二靶核苷酸序列的侧翼。侧翼引物与在PCR过程中扩增的双链靶核苷酸序列的3'-端部分上片段互补。第一核苷酸序列，所述第一核苷酸序列位于以在第一级聚合酶链式反应中被扩增为目标的基因的区域内，其侧翼具有在5'上游位置处的上游引物和在3'下游位置处的下游引物。第一靶核苷酸序列，以及由此地第一级聚合酶链式反应的扩增产物的碱基对长度是可预知的，所述长度是通过下述碱基对之间的距离确定的，所述碱基对分别位于外引物对的上游引物和下游引物的5'上游和3'下游杂交位置处。在第一级聚合酶链式反应结束时，使等份试样的所得混合物继续进入第二级聚合酶链式反应。该反应优选自动地在密封或密闭的容器内进行，所述容器例如具有来自C印heid的"SMARTCAP"装置。在该第二级反应中，第一级反应的产物与特异性的内或嵌套弓I物合并。这些内引物来源于在第一靶核苷酸序列内的核苷酸序列，并且位于包含在第一靶核苷酸序列内的第二、较小的靶核苷酸序列的侧翼。使该混合物经受最开始进行的变性、退火和扩增步骤，然后如前所述地热循环以允许重复地变性、退火和延伸或复制第二靶核苷酸序列。该第二靶核苷酸序列侧翼具有在5'上游位置的上游引物和在3'下游位置处的下游引物。第二靶核苷酸序列，以及由此地第二级PCR扩增产物的碱基对长度是可预知的，所述长度是通过下述碱基对之间的距离确定的，所述碱基对分别位于内引物对的上游引物和下游引物的5'上游和3'下游杂交位置处。使用产物特异性的探针或报道基因将扩增产物优选鉴别为甲基化的或非甲基化的，其中所述探针或报道基因是例如授予Mullis等人的美国专利4，683，195所描述的，此处通过引用而全部引入。用于检测多核苷酸的探针和报道基因的领域的进展是本领域的技术人员所熟知的。任选地，核酸的甲基化模式可以通过其他技术确认，例如限制性内切酶酶解和DNA印迹分析。可用于检测5'CpG甲基化的甲基化敏感的限制性核酸内切酶的实例包括Smal、SaclI、Eagl、Mspl、HpalI、BstUI和BssHII。在本发明的另一个方面中，使用甲基化率。该甲基化率可以通过确定所得到的标志的扩增的甲基化种类的量与扩增的参照标志或扩增的非甲基化标志区域的量之间的比例获得。其最好使用实时定量PCR进行。比率超过确定的或预定的临界值(cutoff)或阈值时被认为是超甲基化的，并表示具有增殖病症如癌症(在GSTP1的情况中为前列腺癌)。临界值是按照已知的方法确定的，其中所述方法被用于至少两组样品具有已知疾病状况的样品和具有已知正常状况的样品。本发明的参照标志还可以用作内部参照。所述参照标志优选是在样品细胞中以组成型表达的基因，如P_肌动蛋白。已确定的或预定的值(临界值或阈值)也可以在根据本发明的不使用比率的方法中被确定并使用。在这种情况下，临界值由相对于某些基准值，例如正常样品或临床不显著的癌样品(已知不会发展为临床相应的状态或是非侵袭性的)中的甲基化的量或程度的甲基化的量或程度来建立。这些临界值是按照公知的方法建立的，正如其应用于基于甲基化率方法中的情况一样。在本发明最优选的实施方案中，将通过MSP或其他适当方法获得的GSTP1甲基化值用使用同样方法测定的S100A2甲基化值标准化。如实施例7中所显示的，标准化值是通过从GSTP1值中减去S100A2测定值获得的。也可以使用其他标准化方法例如生成甲基化率(其是通过下述方法获得的将Ct值转化为所关心的基因的拷贝数，并且用该拷贝数除以通过同样方式获得的P-肌动蛋白的拷贝数)。当使用标准化数值时，临界值是通过首先生成训练组(trainingset)，在该训练组中由临界值生成最佳灵敏度和专一性，然后再在不相关的有效组中验证所述临界值而确定的。本发明的方法和试剂盒可包括用于多路复用(multiplexing)的步骤和试剂。也就是说，可以同时测定一个以上的标志。但仅对以下标志进行了检测以作为本发明的部分GSTP1、RAR-P2、APC和S100A2以及内部参照基因例如P-肌动蛋白。由于与标志有关的基因转录水平的降低常常是多核苷酸序列和/或表达控制序列(例如启动子序列)的特定元件超甲基化的结果，因此制备匹配这些序列的引物。因而，本发明提供了通过检测特殊区域，优选在标志的表达控制或启动子区内的甲基化来检测或诊断细胞增殖性病症的方法。用于检测这些区域的甲基化的探针可用于这样的诊断或预后方法。本发明的试剂盒可以配置有各种构成部件，只要它们都包含至少一个引物或探针或检测分子(例如Scorpion报道基因)即可。在一个实施方案中，所述试剂盒包括用于扩增和检测超甲基化标志片段的试剂。任选地，所述试剂盒包括样品制备试剂和/或从样品中提取核酸的制品(例如管)。在优选的试剂盒中，包括单管(one-tube)MSP所必需的试剂，例如，相应的PCR引物组、热稳定的DNA聚合酶如Taq聚合酶和适当的检测试剂，如水解探针或分子信标。在任选优选试剂盒中，检测试剂是Scorpion报道基因或试剂。还可以使用对双链DNA有特异性的单独的染色引物或荧光染料，如溴化乙锭。引物优选是能产生高浓度的量。试剂盒中的其他材料可包括适宜的反应管或瓶、隔离成分，一般为蜡珠(waxbead)，任选包括镁；必需的缓冲液和试剂如dNTP;对照核酸和/或任何可用于MSP反应的另外的缓冲剂、化合物、辅因子、离子组分、蛋白质和酶、聚合物等。所述试剂盒任选包括核酸提取试剂和材料。实施例实施例1:样品的制备和MSPCR前列腺样品从已知临床结果的患者处获得。甲基化测定是如下进行的。使用商售的亚硫酸氢钠转化试剂盒(ZymoResearch,Orange,CA，USA)修饰基因组DNA。该处理将未甲基化的DNA中的所有胞嘧啶转化为尿嘧啶，而在甲基化的DNA中仅有不在鸟嘌呤前面的胞嘧啶被转化为尿嘧啶。所有在鸟嘌呤前面的胞嘧啶(在CpG双核苷酸中)仍然保持是胞嘧啶。下面将对所述试验进行更加全面的描述。a.沉积如下所述获得沉积的尿样品在+4摄氏度下将含有尿的50-mlFalcon管以3000g在VRXSorvall离心机上离心10分钟。除去上清液，并在离心团上方保留5ml上清液。然后再次对管进行旋转沉淀(3000g，5分钟)以弃去剩余的上清液(使用1ml吸头)。接着用20mL冷(4°C)PBS洗涤尿沉淀物，再次旋转沉淀(3000g，5分钟)，并将剩余的上清液吸出。然后在_201:下储存样CIb.细胞裂解和DNA的提取接着将沉淀物中的细胞如下地进行裂解。向每个含有尿细胞离心团的样品中加入700ill的细胞理解溶液。接着将裂解产物转移到2.Oml的微量离心管中，并向溶胞产物中加入3iU的蛋白酶K溶液(ProteinaseKSolution)(20mg/ml)，上下反转25次进行混合，并在55t:下培养一小时到过夜。通过在20°C(加热块)放置10分钟将样品冷却到室温。接着向裂解产物中加入3001的蛋白质沉淀溶液，然后将裂解产物高速剧烈涡旋20秒。将样品置于冰浴中5分钟并以(16000RPM)离心5分钟。沉淀的蛋白质形成紧密的离心团。然后将上清液转移到一个新的2.0ml的管中，重复沉淀步骤。然后将含有DNA的上清液转移到一个干净的2.0ml微量离心管中并重复离析分离操作(16000RPM，3分钟)，再次将上清液转移到一个干净的2.0ml的微量离心管中，该微量离心管中含有900ii1100%异丙醇和2iU的糖元(Glycogen)20mg/ml。通过轻轻地上下反转50次混合样品并将其在摇动器上在室温下保持至少10-15分钟，然后冷却到_20°C。接着将样品以16000RPM离心5分钟。此时可以看到DNA为小的白色离心团。用lml-移液管除去上清液并将样品以(16000RPM)离心60秒。用100iU-移液管除去剩余的上清液。加入900ii170X的乙醇并将管上下反转10次以洗涤DNA离心团，接着以16000RPM再次离心1分钟。用lml-移液管除去乙醇，接着以(16000RPM)再次离心60秒。用100yl-移液管除去剩余的上清液，并将样品空气干燥10-15分钟。向干燥的样品中加入45iULoTE缓冲液，通过在65t:以1100rpm摇动培养1小时并在20°C以llOOrpm摇动培养过夜来使DNA被再水合。将DNA存储于-S(TC下的带有清楚标签的管中。c.亚硫酸氢盐修饰接着用来自ZymoResearch的EZ-DNA甲基化试剂盒(商品目录号D5001)如下地修饰DNA样品。将24ml无水乙醇加入到M_洗涤(M-Wash)缓冲液浓縮物中以制备最终的M_洗涤(M-Wash)缓冲液。将5illM-稀释缓冲液(M-DilutionBuffer)直接加入到45的DNA样品中。通过用移液管上下地吸吐来混合该混合物，接着稍微旋转，然后将其在以llOOrpm摇动的加热块中在37t:下培养15分钟。在培养期间，通过加入750ii1的BakerWater和210ill的M-稀释缓冲液(M-DilutionBuffer)来制备CT转化试剂。接着通过每2分钟涡流旋转1分钟共计10分钟来进行混合。在上述的培养后，将100ml的制备的CT转化试剂(在略微摇动后)加入到各样品中，接着使各样品轻轻地涡旋并略微地旋转。然后将样品用盖有铝箔的加热块(以llOOrpm摇动)在7(TC下培养3小时。接着对样品略进行旋转沉淀并置于冰上10分钟。将400mlM_结合(M-Binding)缓冲液加入到样品中，通过用移液管上下吸吐对其进行混合。将全部的上清液负载在Zymo-SpinColumn柱上，所述柱子被放置在一个2ml的接收管中。将所述管以最大的速度离心15-30秒，丢弃流过柱子的部分。向柱子中加入200iU的M-洗涤缓冲液(M-WashBuffer)，将柱子以最大的速度离心15-30秒，再次丢弃流过柱子的部分。将200ii1的M-脱磺酸缓冲剂(M-DesulphonationBuffer)加入到柱子中并让其室温下直立15分钟，接着以最大的速度离心15-30秒并丢弃流过柱子的部分。然后重复进行该过程三次，最后一个离心步骤持续30秒。接着将柱子置于干净的1.5ml的管上，向其中加入50iU的M-洗脱缓冲液。然后使柱子在RT下静置2分钟，接着以最大的速度离心1分钟以洗脱DNA。将洗脱的DNA贴上标签并作为'BT修饰的'储存在-S(TC下。接着用以下引物和探针建立MSPCR试验夕卜PCR引物<table>tableseeoriginaldocumentpage13</column></row><table>内PCRScorpion探针/引物组<table>tableseeoriginaldocumentpage14</column></row><table>BHQ=BlackHoleQuencher报道分子。HEG=六乙二醇嵌套式PCR反应是使用"SMARTCAP"管(C印heid)禾口"SMARTCYCLER"(C印heid)PCR分析仪如下地进行的。将各解冻的试剂略微地涡旋以进行混合。将足够的C印heidSmartC即PCR反应管贴上标签并将其置于架子中。对每个管均使用新鲜的移液管尖，将5ul的第一轮PCR主混合物(mastermix)加入到每个管中。再次对每个样本使用新鲜的移液管尖，将5yL的样本加入到各自的管中，接着将所述管封闭但没有在原地咬合住SmartC即s。在"SMARTCYCLER"离心机中将所述管离心30秒，并以在"SMARTCYCLER"仪中的顺序放置，用"SMARTCYCLER"上的盖子封闭仪器，并且开始启动试验。以下显示了C印heid平台上的循环条件(第一轮PCR)。在上述过程完成后，除去管并如下地建立第二轮PCR。打开管盖，然后向"SMARTCAP"存储池中加入15ul第二轮PCR主混合物使得最终体积为25ul。插入长钉并将盖子咬合在相应位置。接着在微量离心机中将所述管用适当的转子离心30秒。然后在循环条件下在C印heid平台上使内PCR反应进行40次循环，其中所述循环条件如下所示(第二轮PCR)。在上述过程完成后，取出C印heid管并弃去。使用以下循环参数。第一轮PCR第二轮PCR<table>tableseeoriginaldocumentpage15</column></row><table>用以下单独组分来制备用于SMARTCAP管中的单个四路复用的反应混合物。<table>tableseeoriginaldocumentpage16</column></row><table>外引物PM-1最终浓度全部/肌动蛋白标志-0.05uM-0.04uM參第二轮PCR(R2)<table>tableseeoriginaldocumentpage16</column></row><table>PCR主混合物是如下制备的(外引物和内Scorpion探针/引物混合物)<table>tableseeoriginaldocumentpage17</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage18</column></row><table>最终25ii1反应物的组成如下<table>tableseeoriginaldocumentpage18</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage19</column></row><table>数据结果来自"SMARTCYCLER"分析仪。数据是通过执行表1中显示的预定阈值和标准而分析的。表1<table>tableseeoriginaldocumentpage19</column></row><table>按以下试验性能特征生成并显示结果％灵敏度，特异性和95%置信区间，它们是用为2合IPCR模式定义的Ct临界值为标志的组合计算的。以用两个统计软件程序包进行的ROC曲线分析为基础计算曲线数值下面积。对于单一的标志分析，使用MedCalc软件生成AUC值，并且对于多种标志的不同的组合使用S-Plus统计软件中的逻辑回归模型。以癌和非癌患者之间的Ct值的相对分布为基础设定临界值。如果由甲基化标志组所获得的Ct值中的任何一个低于定义的临界值，则认为该样品是甲基化的，即使肌动蛋白显示的是"未测定"的情形。图表显示了多种参数的交叉比较数据以说明本发明的各实施方案。实施例2:样品存储和基因组合鉴别的影响用组合试验重复实施例1中描述的方法，所述组合试验包含来自GSTP1、RARP2和APC基因的标志的组合。如所显示的，在样品收集的第3天，样品收集的第5天和样品收集的第16天内进行测定。结果显示于表2中。表2.GSTPRAR02APC储存天数灵敏度(％)特异性(％)X163196X163193X163686XX164491XX163985XXX164982X53596X53591X54085XX55090XX54484XXX55481X33691X33288X32993XX3548820<table>tableseeoriginaldocumentpage21</column></row><table>用于该实施例的样品组是全(纯)尿样品，其由16天组的148个样品(68个已知患有癌症)、5天组的121个样品(52个已知患有癌症)和三天组的73个样品(30个已知患有癌症)组成。意外的是，GSTP和RARP2的组合优于GSTP、RARP2和APC的组合，尽管APC是已知的前列腺癌标志。当样品被储存三天或更少的时间时，该二基因组合大大地优于任何其他的组合。当所有试验均被考虑时，与保留5天样品的51.35%的阳性预测值和储存16天样品的47.22%的阳性预测值相比，储存3天的样品的阳性预测值是65.9%。然后，使用全尿样品和使用如上所述制备且储存3天的沉淀物对新的数据组(N=73，已知患癌的个数=30，已知未患癌的个数=43)进行ROC曲线分析。确定单独的标志的曲线下面积。结果总结于表3中。表3标志样品灵敏度/特异性近似值(%)AUCGSTPWU38/93.66RAR0wu31/93.58APCWU35/98.64GSTP沉积43/90.64RAR0沉积56/77.64APC沉积52/87.62当样品为全尿(纯的)样品时，ROC分析表明单独的GSTP给出了最好的结果。如所显示的，该同样的分析表明旋转样品以使其沉降为沉积物的操作明显改善了RARI3标志的性能。实施例3:前列腺按摩对两个其他样品组进行试验并分析以确定前列腺按摩对尿基试验的性能的影响。在第一个样品组中，36个样品(20个已知患有癌症)是从接受了限于小于20秒的前列腺按摩的患者处获得的。在另一个样品组中，77个样品(30个已知患有癌症)是从接受了超过20秒的前列腺按摩的患者处获得的。在每种情况中，样品均被存储5天或更少。在这些样品上进行MSPCR的结果总结在表4中。表421<table>tableseeoriginaldocumentpage22</column></row><table>最好的结果是由包括GSTP、RARI3和APC的基因组合在前列腺按摩持续时间小于20秒时获得的。这是意外的，因为人们可能已经预期较长的按摩会排放出更多的细胞并且至少会提高特异性。实施例4.直肠指检对四个其他样品组进行试验和分析以确定根据直肠指检(DRE)异常比正常的比进行的样品选择对尿基试验性能的影响。在第一个样品组中，64个全尿样品(23个已知患有癌症)是从DRE正常的患者处获得的。在第二个样品组中，33个全尿样品(19个已知患有癌症)是从DRE异常的患者处获得的。第三个样品组包含显示DRE正常的48个沉积样品(21个已知患有癌症)。第四个样品组包含从DRE异常患者处获得的22个沉积样品(8个已知患有癌症)。在每种情况中，样品均被存储5天或更少。在这些样品上进行MSPCR的结果总结在表5中。表5<table>tableseeoriginaldocumentpage23</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage24</column></row><table>用于选自DRE异常患者的样品的标志，其表现显著优于在DRE阴性患者情况中的表现。当标志基因组合由GSTP和APC组成时，来自DRE异常患者的全尿样品被试验出具有几乎与最好的沉积样品相同的灵敏度和特异性。在DRE异常的沉积样品中，单独的标志(APC)试验的表现最好，但GSTP/APC基因组合的表现与其相差不大。实施例5:PSA水平对两个其他样品组进行试验和分析以确定以PSA水平为基础的样品选择的影响。在第一个样品组中，52个全尿样品(25个已知患有癌症)是从PSA值为2.5-4ng/ml的患者处获得的。在另一个样品组中，169个样品(80个已知患有癌症)是从PSA水平为4-10ng/ml的患者处获得的。在每种情况中，在尿收集和沉积过程之间，样品均在5天以内被存储于4t:下。在这些样品上进行MSPCR的结果总结在表6中。对于PSA水平在2.5到4ng/ml之间的52个受试者(包括25个患有癌症和27未患有癌症的病例)来说，当使用逻辑回归模型时其显示出58%的灵敏度和88%的特异性，或者当使用具有以下Ct临界值的3个标记物GSTP=26，RAR=28，APC=25并且无试验率为3.8%时，其分别显示为58%的灵敏度和81%的特异性。对于具有PSA4-10的队列(co-hort)的患者来说，使用相同标志和Ct临界值的敏感度/特异性特征值为59/65%。二样品的T-检验证实在下述试验中不存在统计学显著的差异，所述试验是在PSA范围为2.5-4和4-10ng/ml(P=0.000)的两个队列(co-hort)之间进行的。结果显示在表6中。表6<table>tableseeoriginaldocumentpage25</column></row><table>实施例6:更广泛的多路复用使用已知能够用于前列腺癌分析的其他标志进行更广泛的多路复用。如果试验的目的是解决PSA结果(在临床应用中为2.5-4ng/ml)不明确的问题，则追求最大试验特异性。试验在储存3天的沉积样品上进行。60个样品(30个来自患有癌症的病例，30个来自未患有癌症的病例)中的每一个均进行第一轮PCR。使用3个四路复用反应的6个标志(GST+RAR+APC+RASS+CDH1+PDLIM4)产生的尿沉积物的数据证明CDH1、RASS和PDLM4对保持80%特异性没有附加价值。包括全部6个标志削弱了试验特异性(灵敏度=44%，特异性=63%)。而且，6个标志的使用不适合于单管试验模式。结果显示于表7中。表7<table>tableseeoriginaldocumentpage25</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage26</column></row><table>以上数据显示了代表性的组中的三个标志各自的性能以及作为组合的性能，其中所述代表性的组中有20个患有癌症，10个未患有癌症。灵敏度比一般观察到的低，因为在沉积之前尿样品的储存时间小于其最佳存储时间。接着用S100分析同样的样品，并且用S100和所关心的基因之间的ACt来生成临界值。数据对RARP2和APC显示出改善的性能，但对GSTP1没有显示出改善的性能。观察到上述不同的影响是因为对于RARI32和APC来说，边缘情况现在可以被明显地确定为患有癌症，因此改善了灵敏度。然而，对于GSTPl来说在该数据组中不存在边缘情况，因此灵敏度保持不变。表8Pm-Mu-NormS100GSTP1RARAPC灵敏度20.00%15.00%20.00%特异性90.00%100,00%90.00%GSTP1/APC//RARB2灵敏度40.00%特异性80.00%序列表IndividualApplicant--------------------Street:City:State:Country:26〈222〉LocationTo:1其他信息fam-CDSJoin:No特征-------序列#3:〈221〉FeatureKey:miscj寺征〈222〉LocationF簡〈222>lxicationTo:其他信息GSTP1ScorpionCDSJoin:No特征-------序列#3:<221〉FeatureKey:modified_base〈222〉LocationFrom:32〈222〉LocationTo:32其他信息BHQ-HEG-CDSJoin:No序列--------〈213〉生物体名称人类〈400〉PreSequenceString:gccccaatactaaatcacgaeg22〈212〉类型DNA<211〉长度22序列名称#4序列描述特征-------序歹lj:#4:〈221〉FeatureKey:misc—特征〈222〉LocationFrom:〈222几ocationTo:其他信息GSTPi反向引物CDSJoin:No特征-------序列#4:〈221>FeatureKey:modified—base〈222〉LocationFrom:22〈222〉LocationTo:22其他信息3'CDSJoin:No牛寺征-------序歹lj:#4:〈221>FeatureKey:modified_base〈222>LocationFrom:1<222>LocationTo:1其他信息5'CDSJoin:No序歹lj--------〈213〉生物体名称人类〈400>PreSequenceString:gatataaggttagggataggatag24〈212〉类型DNA〈211>长度24序列名称#5序列描述特征-------序列#5:〈221〉FeatureKey:miscj寺征<222>LocationFrom:〈222>LocationTo:其他信息肌动蛋白_309_U24CDSJoin:No序列--------〈213>生物体名称人类〈400〉PreSequenceString:aaccaataaaacctactcctcc22〈212〉类型DNA〈211〉长度22序列名称#6序列描述特征-------序列恥〈221〉FeatureKey:miscj寺征〈222>LocationFrom:〈222>LocationTo:其他信息肌动蛋白_501_L22CDSJoin:No序歹lj--------〈213>生物体名称人类〈400>PreSequenceString:ccgcgcatcaccaccccacacgcgcggggagtatataggttggggaagtttg52〈212〉类型DNA〈211>长度52序列名称#7序列描述特征--------序列#7:〈221>FeatureKey-modified—base<222>Lx>cationFrom:1〈222〉LocationTo:1其他信息q670CDSJoin:No特征-------序列#7:<221>FeatureKey:misc—特征〈222〉LocationFrom:〈222几ocationTo:其他信息肌动蛋白ScorpionCDSJoin:No特征-------序歹lj:#7:〈221〉FeatureKey:modified_base〈222>LocationFrom:28<222>bocationTo:28其他信息-BHQ2-HEG-CDSJoin:No序列--------〈213>生物体名称人类〈400>PreSequenceString:朋c3C3C朋t朋C3肪C3C3朋ttcac27〈212>类型DNA<211>长度27序列名称#8序列描述特征-------序列#8:〈221>FeatureKey-modified—base〈222>LocationFrom:1〈222>lxicationTo:1其他信息5'CDSJoin:No特征-------序列#8:〈221〉FeatureKey:misc_特征〈222>LocationFrom:〈222>U>cationTo:其他信息肌动蛋白反向引物CDSJoin:No牛寺征-------序列#8:〈221>FeatureKey-modified—base〈222〉LocationFrom:27〈222〉LocationTo:27其他信息3'CDSJoin:No序列--------〈213>生物体名称人类〈400>PreSequenceString:ccctataccccactacgaa19〈212〉类型:DNA〈211〉长度19序列名称#9序列描述特征序列#9:〈221>FeatureKey:misc—特征〈222>LocationFrom:〈222〉LocationTo:其他信息APC—0uter_692_U19CDSJoin:No序列〈213〉生物体名称人类〈400〉PreSequenceString:ggcgggttgtatt朋tet;agttate2.5〈212〉类型DNA〈211〉长度25序列名称#10序列描述特征序列#10:〈221>FeatureKey:misc—特征〈222〉LocationFrom:〈222〉LocationTo:其他信息APC—0uter_830—L25CDSJoin:No序列〈213〉生物体名称人类〈400>PreSequenceString:gccggcgggttttcgacgggccggccgaaccaaaacgctcccca44〈212〉类型:DNA〈211〉长度44序列名称#11序列描述特征-------序列#11:〈221>FeatureKey:modified_base〈222>U)cationFrom:1〈222>LocationTo:1其他信息texasred-CDSJoin:No特征-------序列#11:〈221>FeatureKey:modified—base〈222〉LocationF濯25〈222〉LocationTo:25其他信息-BHQ2-HEG-CDSJoin:No序列--------〈213〉生物体名称人类〈400〉PreSequenceString:gtcggttacgtgcgtttatatttag25〈212〉类型DNA〈211>长度25序列名称#12序列描述特征-------序列#12:〈221〉FeatureKey:misc—特征〈222〉LocationFrom:〈222几ocationTo:其他信息APCLowerPrimerCDSJoin:No序列--------〈213〉生物体名称人类〈400〉PreSequenceString:ggaagtgagttgtttagaggtagga25〈212〉类型DNA〈211>长度25序列名称#13序列描述特征-------序列:#13:〈221〉FeatureKey:miscj寺征〈222〉LocationFrom:〈222〉1xicationTo:其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081009174公开日2010年6月9日申请日期2008年4月14日优先权日2007年4月12日发明者A·马祖姆达,D·乔达里,H·王,J·F·贝登,T·维纳申请人:维里德克斯有限责任公司