用于鉴定、评估、预防和治疗前列腺癌的基因、组合物、试剂盒和方法

专利名称：用于鉴定、评估、预防和治疗前列腺癌的基因、组合物、试剂盒和方法
技术领域：
本发明的领域为前列腺癌，包括前列腺癌的诊断、表征、处理和治疗。
背景技术：
在美国以及实际上在世界范围内报告的增加的癌症病例数都备受关注。当前对于特定类型的癌症仅有少数几种治疗方法有效，并且无法提供绝对成功的保证。为使疗效最好，这些治疗方法不仅需要对恶性肿瘤早期检测，还需要对恶性肿瘤的严重程度进行可靠的评估。
前列腺癌(PCA)是在美国男性中最常被诊断出的癌症，并且是排第二位的男性癌症死亡原因(Karp等人，1996，Cancer Res.565547-5556)。男性中该器官对癌症的急性易感性尚未被认识。斯基恩腺是女性中与男性前列腺相对应的组织，但不是观察到明显致瘤性转化的部位。
前列腺癌所表现出的一种不同寻常的挑战是大多数前列腺肿瘤不是危及生命的疾病。尸检调查表明多达1100万美国男性患有前列腺癌(Dhom，1983，J. Cancer Res.Clin.Oncol.，106210-218)。这些数字与前列腺癌的临床观察结果一致，即通常表现为缓慢和延迟的进展过程。这样的疾病进展导致相对较少的前列腺肿瘤在患者的生命期间发展为临床上关注的病例。如果一旦用有效的方法检测到，癌症就似乎已经是分化良好、局灶且器官限制的，治疗通常不能延长老年患者的预期寿命。
不幸的是，自然进展的前列腺癌在利用有效方法临床检测到时通常已经转移。患转移性前列腺癌的个体的存活率极低。在这两个极端之间是在生命期间将会转移但是尚未转移的前列腺肿瘤患者。对于这些患者，手术切除前列腺是可治愈的，并且延长预期寿命。因此，准确地确定新诊断的患者属于哪一类对于确定最佳治疗和患者的存活是关键性的。
当前医生至少可以使用一种早期的非侵入性试验来检测无症状的疾病。使用标准的基于抗体的检测试剂盒可以相对容易地检测血样中前列腺特异性抗原(PSA)的存在。患者血清中存在异常高水平的该抗原表明前列腺疾病的可能性，可能是癌症、良性前列腺增生(BPH)或前列腺炎。在大多数病例中，PSA升高是由于BPH或前列腺炎而不是由于癌症。
尽管已经利用临床和病理学分期和组织学分级系统(例如Gleason′s)根据肿瘤分化程度或腺型类型来指示患者组的预后(Carter和Coffey，InJ.P.Karr和H.Yamanak(eds.)，Prostate CancerThe SecondTokyo Symposium，pp.19-27，New YorkElsevier，1989.；Diamond等人，J.Urol.，128729-734，1982)，但是这些系统不能充分地预测癌症的进展速度。尽管已经建议使用原发损伤的组织切片的“核圆度”的计算机系统图像分析来作为处置患者个体的辅助手段(Diamond等人，1982，J.Urol.，128729-734)，但是该方法在研究疾病进展中应用有限。
使用流式细胞术和FISH分析DNA含量/倍性已经证明可用于预测前列腺癌的侵占性(Pearsons等人，1993，J.Urol.，150120-125；Macoska等人，1994，Cancer Res.，543824-3830；Visakorpi等人，1994，Am.J.Pathol.，1451-7；Takahashi等人，1994，Cancer Res.，543574-3579；Alcaraz等人，Cancer Res.，553998-4002，1994)，但是这些方法昂贵、费时，并且后一种方法需要构建着丝粒特异性探针进行分析。还存在已经报道其表达与前列腺癌有关的特异性核基质蛋白。但是，这些蛋白标志物显然不能区别BPH和前列腺癌(Partin等人，1993，Cancer Res.，53744-746)。遗憾的是，不能区别良性和恶性前列腺肿瘤的标志物没有价值。
因此，提供用于诊断、分期、预后、监测和治疗前列腺癌的方法和试剂是有益的。

发明内容
本发明涉及癌症标志物(下文称为“标志物”或“本发明的标志物”)，它们在表1中列出。本发明提供这些标志物编码的或相对应的核酸和蛋白质(下文分别称为“标志物核酸”和“标志物蛋白”)。本发明还提供与这些标志物蛋白和/或标志物蛋白的片段特异性结合的抗体、抗体衍生物和抗体片段。
本发明还涉及用于诊断、分期、预后、监测和治疗前列腺癌的各种方法、试剂和试剂盒。在一个实施方案中，本发明提供一种评估患者是否患有前列腺癌或者其发展为前列腺癌的危险是否高于正常的诊断方法，包括比较患者样品中至少一种本发明标志物的表达水平和对照，如未患前列腺癌者样品中所述标志物的正常表达水平。患者样品中所述标志物的表达水平显著提高指示所述患者患有前列腺癌或具有发展前列腺癌的危险。
在另一个实施方案中，本发明提供了评估患者是否患有前列腺癌或是否可能发展为前列腺癌的诊断方法，包括比较患者样品中至少一种本发明标志物的表达水平和患有良性前列腺增生或无前列腺肿瘤的对照受试者样品中该标志物的表达水平。标志物的表达水平升高可指示前列腺癌。
因此，本发明的方法可以用于鉴定发展前列腺癌的危险升高的患者(如具有前列腺癌家族史的患者、被鉴定为具有突变的癌基因的患者)。该方法也是用于评估患者是否患有前列腺癌或是否可能发展前列腺癌的有用的诊断方法.
本发明的方法也可以用于预测前列腺癌的特定分期，以及评估癌症是否转移(如转移到淋巴结)。此外，本发明的方法也可以用于预测前列腺癌患者或经受根除前列腺癌治疗的患者的临床结果。此外，本发明的方法也用于评估前列腺癌患者的治疗效果(如化疗效果)。另外，本发明的方法也可用于评估物质的与前列腺相关的致癌性。
根据本发明，选择标志物，使得本发明方法的阳性预测值为至少约10％，优选约25％，更优选约50％以及最优选约90％。本发明的以下实施方案也是优选的，其中与正常非前列腺癌患者相比，在至少约15％的前列腺癌患者(包括，例如T1期前列腺癌患者，T2期前列腺癌患者，T3期前列腺癌患者，T4期前列腺癌患者，N期前列腺癌患者，M期前列腺癌患者，以及任何其它类型的与前列腺相关的癌、恶性肿瘤和转化)中所述标志物过量表达至少5倍。
本发明进一步提供了用于评估患者是否患有已经转移的或可能转移的前列腺癌的诊断方法，该方法包括比较患者样品中至少一种表1所列的标志物的表达水平和患有非转移前列腺肿瘤或无前列腺肿瘤的对照受试者样品中所述标志物的表达水平。与对照受试者样品中的水平相比，患者样品中的表达水平明显较高表明前列腺癌已经转移或可能转移。
本发明还提供了用于预测前列腺癌患者的临床结果的方法，包括比较患者样品中至少一种表1所列的标志物的表达水平和具有良好临床结果的对照受试者(如具有大于5年的无病存活水平的以前的前列腺癌患者)样品中所述标志物的表达水平。与对照受试者样品中的表达水平相比，患者样品中的表达水平明显较高表明患者具有不良的结果(如小于三年的无病存活)。
本发明也提供用于评估一种疗法抑制患者前列腺癌的疗效的方法。该方法包括将对患者提供至少一部分治疗之前从患者中获得的第一样品中至少一种本发明标志物的表达与实施该部分治疗后从患者中获得的第二样品中该标志物的表达进行比较。该标志物在第二样品中的表达水平显著低于在第一样品中的表达水平表明该疗法对于抑制患者前列腺癌是有效的。
应当理解，在这些方法中，“疗法”可以是治疗前列腺癌的任何疗法，包括但不限于化疗、放疗、手术切除肿瘤组织、基因治疗和生物治疗，如施用抗体和趋化因子。因此，本发明的方法可以用于在治疗之前、期间及之后评价患者，例如评价肿瘤负荷的减少。
在一个优选实施方案中，这些方法是针对采用化学剂或生物剂的治疗。这些方法包括将从患者中获得并在化学剂或生物剂存在下保存的第一样品中至少一种本发明标志物的表达与从患者中获得并在不含上述药剂条件下保存的第二样品中该标志物的表达进行比较。该标志物在第二样品中的表达水平显著低于在第一样品中的表达水平表明该药剂在抑制患者的前列腺癌上有效。在某些实施方案中，第一和第二样品可以是从患者中获得的同一样品的部分，或者是从患者中获得的合并样品的部分。
本发明另外还提供一种评估患者中前列腺癌进展的监测方法，该方法包括检测第一时间点的患者样品中至少一种本发明标志物的表达；在后一时间点及时重复该表达检测步骤；和比较第一和第二检测步骤中检测到的表达水平，由此监测患者中前列腺癌的进展。该标志物在后一时间点样品中的表达水平显著高于在第一时间点样品中的表达水平表明患者的前列腺癌已经进展，而表达水平显著较低则表明前列腺癌已经消退。
本发明还提供一种选择用于抑制患者前列腺癌的候选组合物/化合物的试验方法。该方法包括以下步骤从患者中获得含癌细胞的样品；在至少一种试验组合物/化合物存在下分开保存来自患者的至少一种含有癌细胞的样品；比较至少一种本发明标志物在各等份中的表达；和选择一种试验组合物/化合物作为抑制前列腺癌的候选组合物/化合物，其中相对于该标志物在其他试验组合物/化合物存在下的表达水平，所选试验组合物/化合物显著降低至少一种本发明的标志物在含该试验组合物/化合物的等份中的表达水平。
本发明另外提供一种评估化合物的致前列腺癌能力的试验方法。该方法包括以下步骤在存在及不存在该化合物的条件下分开保存前列腺细胞等份；比较本发明标志物在各等份中的表达。在该化合物存在下保存的等份中该标志物的表达水平显著高于在不含该化合物条件下保存的等份中的表达水平表明该化合物具有致前列腺癌能力。
另外，本发明进一步提供一种抑制患者前列腺癌的方法。该方法包括以下步骤从患者中获得含癌细胞的样品；在试验组合物/化合物存在下分开保存来自患者的至少一种含癌细胞的样品；比较本发明标志物在各等份中的表达；确定一种组合物/化合物为前列腺癌的抑制剂，其中相对于该标志物在其他组合物/化合物存在下的表达水平，该组合物/化合物显著降低该标志物在含该组合物/化合物的等份中的表达水平；和向患者施用至少一种被确定为前列腺癌抑制剂的组合物/化合物。
根据本发明，本发明标志物在样品中的表达水平例如可以通过检测样品中下列物质的存在来评估相应的标志物蛋白(例如具有如下序列之一的蛋白质SEQ IDNO2、SEQ ID NO4、SEQ ID NO6、SEQ ID NO8、SEQ IDNO10、SEQ ID NO12、SEQ ID NO14、SEQ ID NO16、SEQ IDNO18、SEQ ID NO20、SEQ ID NO22、SEQ ID NO24、SEQ IDNO26、SEQ ID NO30、SEQ ID NO32、SEQ ID NO34、SEQ IDNO36、SEQ ID NO38、SEQ ID NO40、SEQ ID NO42和SEQ IDNO44)或蛋白质片段(例如通过使用特异性结合该蛋白质或蛋白质片段的试剂，例如抗体、抗体衍生物、抗体片段或单链抗体)；相应的标志物核酸(例如具有如下SEQ ID NO序列之一的核苷酸转录物(例如SEQ ID NO1、SEQ ID NO3、SEQ ID NO5、SEQID NO7、SEQ ID NO9、SEQ ID NO11、SEQ ID NO13、SEQ IDNO15、SEQ ID NO17、SEQ ID NO19、SEQ ID NO21、SEQ IDNO23、SEQ ID NO25、SEQ ID NO29、SEQ ID NO31、SEQ IDNO33、SEQ ID NO35、SEQ ID NO37、SEQ ID NO39、SEQ IDNO41和SEQ ID NO43)或其互补序列)，或核酸片段(例如通过将从样品中获得的转录多核苷酸与一种基质相接触，该基质上附着有一种或多种具有以下任一SEQ ID NO序列的完整序列或片段的核酸(例如SEQ ID NO1、SEQ ID NO3、SEQ ID NO5、SEQ IDNO7、SEQ ID NO9、SEQ ID NO11、SEQ ID NO13、SEQ IDNO15、SEQ ID NO17、SEQ ID NO19、SEQ ID NO21、SEQ IDNO23、SEQ ID NO25、SEQ ID NO29、SEQ ID NO31、SEQ IDNO33、SEQ ID NO35、SEQ ID NO37、SEQ ID NO39、SEQ IDNO41和SEQ ID NO43))或其互补序列；或相应标志物蛋白直接(即催化)或间接产生的代谢物。
根据本发明，上述任何方法都可以使用多种(例如2、3、5或10种或更多)前列腺癌标志物进行或对其进行检测，包括本发明提供的标志物与本领域公知的其他前列腺癌标志物的组合。在该方法中，将样品中多种标志物(其中至少一种是本发明的标志物)各自的表达水平与从未患前列腺癌的对照人体中获得的同类样品中所述多种标志物各自的正常表达水平进行比较。一种或多种本发明标志物或其一定组合在样品中的表达水平相对于该标志物的相应正常或对照水平显著改变(即升高或降低，如使用一种标志物的上述方法所说明的)表明该患者患有前列腺癌。对于所有上述方法，优选选择标志物，使该方法的阳性预测值至少约为10％。
另一方面，本发明提供了与标志物蛋白(例如具有如下任一序列的蛋白质SEQ ID NO2、SEQ ID NO4、SEQ ID NO6、SEQ IDNO8、SEQ ID NO10、SEQ ID NO12、SEQ ID NO14、SEQ IDNO16、SEQ ID NO18、SEQ ID NO20、SEQ ID NO22、SEQ IDNO24、SEQ ID NO26、SEQ ID NO30、SEQ ID NO32、SEQ IDNO34、SEQ ID NO36、SEQ ID NO38、SEQ ID NO40、SEQ IDNO42和SEQ ID NO44)或该蛋白的片段特异性结合的抗体、抗体衍生物或抗体片段。本发明也提供制备这些抗体、抗体衍生物和抗体片段的方法。这些方法可包括用包含标志物蛋白的全部或10个或10个以上氨基酸的片段(例如具有如下任一序列的蛋白质SEQ IDNO2、SEQ ID NO4、SEQ ID NO6、SEQ ID NO8、SEQ IDNO10、SEQ ID NO12、SEQ ID NO14、SEQ ID NO16、SEQ IDNO18、SEQ ID NO20、SEQ ID NO22、SEQ ID NO24、SEQ IDNO26、SEQ ID NO30、SEQ ID NO32、SEQ ID NO34、SEQ IDNO36、SEQ ID NO38、SEQ ID NO40、SEQ ID NO42和SEQ IDNO44)的蛋白质或肽免疫哺乳动物，其中该蛋白质或肽可以从细胞获得或者可以通过化学合成获得。本发明的方法也包括制备单克隆和单链抗体，进一步包括从被免疫的哺乳动物中分离脾细胞，将分离的脾细胞与无限增殖化细胞系相融合，形成杂交瘤，筛选各个杂交瘤，选择产生与标志物蛋白或该蛋白的片段特异性结合的抗体的杂交瘤。
另一方面，本发明涉及多种诊断和检测试剂盒。在一个实施方案中，本发明提供一种评估患者是否患有前列腺肿瘤的试剂盒。另一方面，该试剂盒可以用于评估患者是否具有发展前列腺癌的危险。该试剂盒包括用于评估至少一种本发明标志物的表达的试剂。再另一个实施方案提供一种试剂盒，其可以用于评估患者是否患有攻击性前列腺肿瘤。该试剂盒包括用于评估至少一种本发明标志物的表达的试剂。在另一个实施方案中，本发明提供一种评估化学剂或生物剂用于抑制患者前列腺癌的适用性的试剂盒。该试剂盒包括用于评估至少一种本发明标志物的表达的试剂，也可以包括一种或多种这样的试剂。在另一个实施方案中，本发明提供用于评估前列腺癌细胞的存在或者用于治疗前列腺癌的试剂盒。该试剂盒可以包括与标志物蛋白或蛋白质片段特异性结合的抗体、抗体衍生物或抗体片段。该试剂盒也可包括多种抗体、抗体衍生物或抗体片段，其中所述多种抗体物质与标志物蛋白或其片段特异性结合。
在另一个实施方案中，本发明提供用于评估前列腺癌细胞的存在的试剂盒，其中该试剂盒包括与至少一种标志物核酸或其片段特异性结合的至少一种核酸探针。该试剂盒还可包括多种探针，其中每种探针都与标志物核酸或其片段特异性结合。
另一方面，本发明涉及治疗前列腺癌患者或具有发展前列腺癌危险的患者的方法。该方法可以包括减少至少一种本发明标志物的表达和/或干扰其生物学功能。在一个实施方案中，该方法包括对患者提供与标志物核酸互补的反义寡核苷酸或多核苷酸或其片段。例如，可以通过给予表达标志物核酸或其片段的反义多核苷酸的载体而对患者提供反义多核苷酸。在另一个实施方案中，该方法包括对患者提供与标志物蛋白或其片段特异性结合的抗体、抗体衍生物或抗体片段。在一个优选实施方案中，抗体、抗体衍生物或抗体片段特异性结合具有SEQ ID NO2、SEQ ID NO4、SEQ ID NO6、SEQ ID NO8、SEQ IDNO10、SEQ ID NO12、SEQ ID NO14、SEQ ID NO16、SEQ IDNO18、SEQ ID NO20、SEQ ID NO22、SEQ ID NO24、SEQ IDNO26、SEQ ID NO30、SEQ ID NO32、SEQ ID NO34、SEQ IDNO36、SEQ ID NO38、SEQ ID NO40、SEQ ID NO42和SEQ IDNO44的序列的蛋白质或该蛋白质的片段。
应当理解，本发明的方法和试剂盒也可以包括已知的癌症标志物，包括已知的前列腺癌标志物。应当进一步理解，该方法和试剂盒可以用于鉴定除前列腺癌以外的癌症。
另一方面，本发明涉及编码标志物蛋白或标志物多肽例如标志物蛋白的生物活性部分的核酸分子。在一个优选实施方案中，分离的核酸分子编码具有如下氨基酸序列的标志物多肽SEQ ID NO2、SEQID NO4、SEQ ID NO6、SEQ ID NO8、SEQ ID NO10、SEQ IDNO12、SEQ ID NO14、SEQ ID NO16、SEQ ID NO18、SEQ IDNO20、SEQ ID NO22、SEQ ID NO24、SEQ ID NO26、SEQ IDNO30、SEQ ID NO32、SEQ ID NO34、SEQ ID NO36、SEQ IDNO38、SEQ ID NO40、SEQ ID NO42和SEQ ID NO44。在另外的实施方案中，本发明提供具有选自以下任一所示核苷酸序列的分离的标志物核酸分子SEQ ID NO1、SEQ ID NO3、SEQ ID NO5、SEQ ID NO7、SEQ ID NO9、SEQ ID NO11、SEQ ID NO13、SEQID NO15、SEQ ID NO17、SEQ ID NO19、SEQ ID NO21、SEQ IDNO23、SEQ ID NO25、SEQ ID NO29、SEQ ID NO31、SEQ IDNO33、SEQ ID NO35、SEQ ID NO37、SEQ ID NO39、SEQ IDNO41和SEQ ID NO43。在另外的实施方案中，本发明提供与如下所示核苷酸序列基本上相同(例如天然发生的等位基因变体)的核酸分子SEQ ID NO1、SEQ ID NO3、SEQ ID NO5、SEQ ID NO7、SEQ ID NO9、SEQ ID NO11、SEQ ID NO13、SEQ ID NO15、SEQ ID NO17、SEQ ID NO19、SEQ ID NO21、SEQ ID NO23、SEQ ID NO25、SEQ ID NO27、SEQ ID NO29、SEQ ID NO31、SEQ ID NO33、SEQ ID NO35、SEQ ID NO37、SEQ ID NO39、SEQ ID NO41和SEQ ID NO43。在其他实施方案中，本发明提供在如此处所述的严格杂交条件下与包含下列核苷酸序列的核酸分子杂交的核酸分子SEQ ID NO1、SEQ ID NO3、SEQ ID NO5、SEQ IDNO7、SEQ ID NO9、SEQ ID NO11、SEQ ID NO13、SEQ IDNO15、SEQ ID NO17、SEQ ID NO19、SEQ ID NO21、SEQ IDNO23、SEQ ID NO25、SEQ ID NO27、SEQ ID NO29、SEQ IDNO31、SEQ ID NO33、SEQ ID NO35、SEQ ID NO37、SEQ IDNO39、SEQ ID NO41和SEQ ID NO43，其中所述核酸编码全长标志物蛋白或其活性片段。
在一个相关方案中，本发明进一步提供包含本文所述标志物核酸分子的核酸构建体。在某些实施方案中，本发明的核酸分子与天然或异源调节序列可操作地连接。还包括含有本发明标志物核酸分子的载体和宿主细胞，例如适于产生多肽的载体和宿主细胞。
在另一相关方案中，本发明提供适合作为用于检测标志物编码核酸的引物或杂交探针的核酸片段。
在另一相关方案中，提供与标志物编码核酸分子反义的分离的核酸分子。
在其他实施方案中，本发明提供标志物多肽，例如具有如下氨基酸序列的标志物多肽SEQ ID NO2、SEQ ID NO4、SEQ ID NO6、SEQ ID NO8、SEQ ID NO10、SEQ ID NO12、SEQ ID NO14、SEQ ID NO16、SEQ ID NO18、SEQ ID NO20、SEQ ID NO22、SEQ ID NO24、SEQ ID NO26、SEQ ID NO28、SEQ ID NO30、SEQ ID NO32、SEQ ID NO34、SEQ ID NO36、SEQ ID NO38、SEQ ID NO40、SEQ ID NO42和SEQ ID NO44所示的氨基酸序列；与SEQ ID NO2、SEQ ID NO4、SEQ ID NO6、SEQ ID NO8、SEQ ID NO10、SEQ ID NO12、SEQ ID NO14、SEQ ID NO16、SEQ ID NO18、SEQ ID NO20、SEQ ID NO22、SEQ ID NO24、SEQ ID NO26、SEQ ID NO28、SEQ ID NO30、SEQ ID NO32、SEQ ID NO34、SEQ ID NO36、SEQ ID NO38、SEQ ID NO40、SEQ ID NO42和SEQ ID NO44所示氨基酸序列基本相同的氨基酸序列；或者由具有一种核苷酸序列的核酸分子编码的氨基酸序列，该核苷酸序列在本文所述的严格杂交条件下与包含SEQ ID NO1、SEQID NO3、SEQ ID NO5、SEQ ID NO7、SEQ ID NO9、SEQ IDNO11、SEQ ID NO13、SEQ ID NO15、SEQ ID NO17、SEQ IDNO19、SEQ ID NO21、SEQ ID NO23、SEQ ID NO25、SEQ IDNO29、SEQ ID NO31、SEQ ID NO33、SEQ ID NO35、SEQ IDNO37、SEQ ID NO39、SEQ ID NO41和SEQ ID NO43的核苷酸序列的核酸分子杂交，其中该核酸编码全长标志物蛋白或其活性片段。
在一个相关的方案中，本发明进一步提供包含本文所述多肽分子的蛋白质或肽构建体。在某些实施方案中，本发明的标志物多肽或片段与天然或异源非标志物多肽序列可操作连接，形成融合蛋白序列。
另一方面，本发明涉及与标志物多肽反应，或者更优选地，特异性或选择性结合的抗体及其抗原结合片段。
本发明涉及新发现的与前列腺细胞的癌性状态有关的癌症标志物。现发现，任何该标志物或该标志物组合的表达水平高于正常与患者存在前列腺癌有关。本发明部分地基于新鉴定的标志物，与在正常(即非癌)前列腺细胞中的表达相比这些标志物在前列腺癌细胞中过量表达。一种或多种这样的标志物在前列腺细胞中的表达提高在此与组织的癌性状态有关。表1列出了本发明的所有标志物，与在正常(即非癌)前列腺细胞中的表达中相比，它们在前列腺癌细胞中过量表达。
提供了检测样品中前列腺癌的存在、样品中前列腺癌包括恶变前病症如发育异常的不存在、前列腺癌分期，以及利用与预防、诊断、表征和治疗患者前列腺癌有关的前列腺癌其他特性的方法。也提供了鉴定用于治疗前列腺癌的药物的方法，并且也提供了治疗前列腺癌的方法。
表1列出了本发明的前列腺标志物。给所述标志物指定了名称(“标志物”)、如果适用，公知的基因名称(“基因名称”)、标志物编码或相对应的核苷酸转录物cDNA序列的序列表编号(“SEQ IDNO(nts)”)、核苷酸转录物编码的蛋白质氨基酸序列的序列表编号(“SEQ ID NO(AAs)”)和蛋白质编码序列在cDNA序列中的位置(“CDS”)。
表1.前列腺癌标志物


定义本文中使用的下列所有术语具有与其在该章节中有关的含义。
本文中使用的冠词“一种”是指一种或一种以上(即至少一种)的语法上的对象。例如，“一种成分”是指一种成分或一种以上的成分。
“标志物”是一种基因，其在组织或细胞中的表达水平与在正常或健康组织中的表达水平相比的改变与疾病状态如癌症有关。“标志物核酸”是本发明标志物编码的或相对应的核酸(例如mRNA、cDNA)。这些标志物核酸包括包含任何SEQ ID NO(nts)的完整或部分序列或该序列的互补序列的DNA(例如cDNA)。标志物核酸也包括包含任何SEQ ID NO(nts)的完整或部分序列或该序列的互补序列的RNA，其中所有胸腺嘧啶核苷残基都被尿嘧啶核苷残基取代。“标志物蛋白”是本发明标志物所编码的或相对应的蛋白质。标志物蛋白包含任何SEQ ID NO(AAs)的完整或部分序列。术语“蛋白质”和“多肽”可互换使用。
术语“探针”是指能够选择性结合特定靶分子例如标志物编码的或对应的核苷酸转录物或蛋白质的任何分子。探针既可以由本领域技术人员合成，也可以来源于适当的生物制品。为了检测靶分子，如本文所述，探针可以特别设计为标记探针。能够用作探针的分子的例子包括但不限于RNA、DNA、蛋白质、抗体和有机分子。
“前列腺相关的”体液是一种液体，当其在患者体内时接触或者通过前列腺细胞，或者从前列腺细胞脱落的细胞或蛋白质能够进入该液体中。示例性的前列腺相关的体液包括血液(例如全血、血清、已经除去血小板的血液)、淋巴、尿、前列腺液和精液。许多前列腺相关的体液(即通常不包括尿)可能含有前列腺细胞，特别是在前列腺细胞为癌细胞时，更特别的是在前列腺癌转移时。
“样品”或“患者样品”包括从患者中获得的细胞或前列腺相关的体液。该细胞可以从例如通过前列腺组织活检或组织切片或骨髓活检收集的前列腺组织样品中分离、鉴定或发现。或者，患者样品为体内样品。再另一种可替代的样品包括前列腺细胞或前列腺起始细胞的体外细胞或细胞系。
标志物的“正常”表达水平是标志物在未患前列腺癌的人类受试者或患者的前列腺细胞中的表达水平。
标志物的“过量表达”或“显著较高水平的表达”是指在试验样品中的表达水平高于用来评估表达的试验的标准误差，并且比该标志物在对照样品(例如来自未患该标志物相关疾病(即前列腺癌)的健康受试者的样品)中的表达水平，优选比该标志物在几种对照样品中的平均表达水平，优选至少高2倍，更优选3、4、5或10倍。
标志物的“显著较低水平的表达”是指该标志物在试验样品中的表达水平比在对照样品(例如来自未患该标志物相关疾病(即前列腺癌)的健康受试者的样品)中的表达水平，优选比该标志物在几种对照样品中的平均表达水平，至少低2倍，更优选3、4、5或10倍。
此处使用的术语“启动子/调节序列”是指与启动子/调节序列可操作连接的基因产物表达所需的核酸序列。在某些情况下，该序列可以是核心启动子序列，在另外一些情况下，该序列也可以包括增强子序列和基因产物表达所需的其他调节元件。启动子/调节序列例如可以是以组织特异性方式表达基因产物的序列。
“组成型”启动子是一种核苷酸序列，当与编码或确定基因产物的多核苷酸可操作地连接时，它使得在细胞的大多数或所有生理条件下，在活人类细胞中产生基因产物。
“诱导型”启动子是一种核苷酸序列，当其与编码或确定基因产物的多核苷酸可操作地连接时，使得基本上只有在细胞中存在对应于该启动子的诱导物时，才在活人类细胞中产生基因产物。
“组织特异性”启动子是一种核苷酸序列，当其与编码或确定基因产物的多核苷酸可操作地连接时，使得基本上只有在细胞是对应于该启动子的组织类型的细胞时，才在活人类细胞中产生基因产物。
“转录的多核苷酸”或“核苷酸转录物”是与成熟mRNA的全部或一部分互补或同源的多核苷酸(例如mRNA、hnRNA、cDNA或该RNA或cDNA的类似物)，该成熟mRNA是通过本发明标志物的转录及(如果有的话)RNA转录物的正常转录后加工(例如剪接)和RNA转录物的逆转录而获得的。
“互补”是指两条核酸链的区域之间或同一核酸链的两个区域之间序列互补性的较宽概念。众所周知，第一核酸区的腺嘌呤残基能够与反平行于第一区的第二核酸区的残基(如果该残基是胸腺嘧啶或尿嘧啶的话)形成特定的氢键(“碱基配对”)。同样众所周知，第一核酸链的胞嘧啶残基能够与反平行于第一链的第二核酸链的残基(如果该残基是鸟嘌呤的话)碱基配对。如果当核酸的第一区与相同或不同核酸的第二区以反平行方式排列时，第一区的至少一个核苷酸残基能够与第二区的一个碱基配对，则这两个区互补。优选地，该第一区包含第一部分，第二区包含第二部分，由此当第一部分和第二部分以反平行方式排列时，第一部分中至少约50％，优选至少约75％，至少约90％，或至少约95％的核苷酸残基能够与第二部分中的核苷酸残基碱基配对。更优选地，第一部分的所有核苷酸残基都能够与第二部分的核苷酸残基碱基配对。
此处使用的“同源”是指同一核酸链的两个区之间或两个不同核苷酸链的区之间的核苷酸序列相似性。当两个区中的一个核苷酸残基位点被相同核苷酸残基占据时，则两个区在该位点处同源。如果第一区和第二区的各自至少一个核苷酸残基位点被相同残基占据，则这两个区同源。两个区之间的同源性以两个区被相同核苷酸残基占据的核苷酸残基位点的比例来表示。例如，具有核苷酸序列5′-ATTGCC-3′的区和具有核苷酸序列5′-TATGGC-3′的区具有50％的同源性。优选地，第一区包含第一部分，第二区包含第二部分，从而每个部分有至少约50％，优选至少约75％，至少约90％，或至少约95％的核苷酸残基位点被相同的核苷酸残基所占据。更优选地，每个部分的所有核苷酸残基位点都被相同的核苷酸残基所占据。
如果一种分子与基质共价或非共价结合，该基质能够用流体(例如标准枸椽酸盐水，pH 7.4)漂洗，而没有相当一部分的分子从基质上脱离下来，则称该分子被“固定”或“附着”于该基质上。
此处使用的“天然存在的”核酸分子是指具有在自然界发现的生物中存在的核苷酸序列的RNA或DNA分子。
如果癌症的至少一种症状得到缓解、终止、减慢或阻止，则称该癌症得到“抑制”。在本文中，如果前列腺癌的复发或转移被减少、减慢、延迟或防止，也称前列腺癌得到“抑制”。
试剂盒是包含至少一种特异性检测本发明标志物表达的试剂例如探针的任何产品(例如包装或容器)。试剂盒可以作为一个用于实施本发明的方法的单元来推广、分发或销售。
“本发明的蛋白质”包括标志物蛋白及其片段；变异标志物蛋白及其片段；包含标志物蛋白或变异标志物蛋白的至少15个氨基酸片段的肽和多肽；以及包含标志物蛋白或变异标志物蛋白，或标志物蛋白或变异标志物蛋白的至少15个氨基酸片段的融合蛋白。
除非本文中另外指明，术语“抗体”广泛地包括天然存在的抗体形式(例如IgG、IgA、IgM、IgE)和重组抗体，如单链抗体、嵌合和人源化抗体和多特异性抗体，以及所有上述抗体的片段和衍生物，这些片段和衍生物具有至少一个抗原结合位点。抗体衍生物可以包括与抗体偶联的蛋白质或化学部分。
本发明提供用于评估前列腺细胞(例如从人体获得的细胞，培养的人类细胞，存档或保藏的人类细胞，和体内细胞)的癌性状态以及治疗前列腺癌患者的组合物、试剂盒和方法。
本发明的组合物、试剂盒和方法尤其具有如下用途评估患者是否患有前列腺癌；评估人类患者中前列腺癌的转移能力；制备用于治疗前列腺癌和/或评估患者是否患有前列腺癌的抗体、抗体片段或抗体衍生物；评估前列腺癌细胞的存在；评估一种或多种试验化合物抑制患者的前列腺癌的效果；评估一种治疗方法抑制患者的前列腺癌的效果；监测患者中前列腺癌的进展；筛选用于抑制患者的前列腺癌的组合物或治疗方法；治疗前列腺癌患者；抑制患者的前列腺癌；
评估试验化合物的致前列腺癌能力；以及预防具有发展前列腺癌危险的患者中前列腺癌的发病。
本发明因此包括一种评估患者是否患有前列腺癌的方法，包括评估患者是否具有转移前的前列腺癌。该方法将本发明标志物在患者样品中的表达水平与该标志物在对照例如非前列腺癌样品中的正常表达水平进行比较。该标志物在患者样品中的表达水平显著高于正常水平表明该患者患有前列腺癌。在一个优选实施方案中，该标志物选自表1中的标志物。
本发明也提供了基因递送载体、宿主细胞和组合物(均在此描述)，其含有包含SEQ ID NO(nts)任一序列或这些序列的互补序列的全部或其15个或更多核苷酸片段的核酸，以及包含SEQ ID NO(AAs)任一序列的全部或10个或更多氨基酸片段的多肽。
如本文所述，患者的前列腺癌与一种或多种本发明标志物的表达水平升高有关。尽管如上所述，有些这样的表达水平改变是前列腺癌的存在引起的，但是另外一些这样的改变诱导、保持和促进了前列腺癌细胞的癌性状态。因此，特征在于一种或多种本发明标志物表达水平升高的前列腺癌能够通过减少和/或干扰该标志物的表达和/或这些标志物编码的蛋白质的功能而得到抑制。
本发明标志物的表达能够以本领域公知的许多方法进行抑制。例如，能够向前列腺癌细胞提供反义寡核苷酸，从而抑制标志物的转录、翻译或转录及翻译。或者，可以向该细胞提供编码特异性结合标志物蛋白的抗体、抗体衍生物或抗体片段并且与适当启动子/调节区可操作连接的多核苷酸，从而产生将抑制该蛋白质的功能或活性的细胞内抗体。用特异性结合标志物蛋白的抗体、抗体衍生物或抗体片段处理前列腺癌细胞也可以抑制标志物的表达和/或功能。使用此处所述的方法，能够筛选多种分子，特别包括小到足以能够穿过细胞膜的分子，以鉴定抑制标志物表达或抑制标志物蛋白功能的分子。可以向患者提供这样鉴定的化合物，从而抑制患者的前列腺癌细胞。
本发明的任何标志物或标志物组合，以及任何已知的标志物与本发明的标志物组合，都可以在本发明的组合物、试剂盒和方法中使用。通常，优选使用在前列腺癌细胞中的表达水平与在正常前列腺细胞中的表达水平相差尽可能大的标志物。尽管这种差异可以小到用于评估该标志物表达的方法的检测限度，但是优选该差异至少高于该评估方法的标准误差，优选与同一标志物在正常前列腺组织中的表达水平相差至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、100、500、1000倍或更多。
已经公认某些标志物蛋白从前列腺细胞(即正常细胞和癌细胞之一或两者)分泌到细胞周围的细胞外间隙中。这些标志物优选用于本发明的组合物、试剂盒和方法的某些实施方案，其原因为如下事实在比组织活检样品更易从人类患者采集的前列腺相关体液样品中能够检测到这些标志物蛋白。另外，检测标志物蛋白的优选体内技术包括向受试者中导入标记的抗该蛋白质的抗体。例如，抗体可以用一种放射性标记物来标记，该放射性标记物在受试者中的存在和定位可以用标准成像技术来检测。
对于本领域技术人员而言，确定任一特定标志物蛋白是否是分泌的蛋白质是一件简单的事情。为了进行这种确定，例如在哺乳动物细胞中，优选在人类前列腺细胞系中表达该标志物蛋白，采集细胞外液，评估细胞外液中该蛋白质的存在与否(例如利用特异性结合该蛋白质的标记抗体)。
以下是能够用来检测蛋白质分泌的方法的一个例子。大约8×105293T细胞在含有培养基(Dulbecco改进Eagle培养基{DMEM}，补充10％胎牛血清)的孔中在5％(v/v)CO2，95％空气气氛下37℃温育，至大约60-70％汇合。然后用标准转染混合物转染细胞，该转染混合物每孔含有2微克含编码该蛋白质的表达载体的DNA和10微升LipofectAMINETM(GIBCO/BRL目录号18342-012)。转染混合物保持大约5小时，然后更换为新鲜培养基，保持在空气气氛中。各孔用不含甲硫氨酸或半胱氨酸的DMEM(DMEM-MC；ICN目录号16-424-54)轻轻漂洗两次。向每孔加入约1毫升DMEM-MC和约50微居里Trans-35STM试剂(ICN目录号51006)。各孔保持在上述5％CO2气氛下，并在选择的时间里37℃温育。温育后，除去150微升条件培养基，离心除去漂浮的细胞和碎片。上清液中存在该蛋白质表明该蛋白质被分泌。
应当认识到在本发明的方法中可以使用含有前列腺细胞的患者样品。在这些实施方案中，可以通过评估前列腺细胞样品中，例如从患者获得的前列腺组织活检中该标志物的量(例如绝对量或浓度)来评价标志物的表达水平。在评价样品中该标志物的量之前当然可以对该细胞样品进行多种众所周知的采集后制备和贮存技术(例如核酸和/或蛋白质提取、固定、贮存、冷冻、超滤、浓缩、蒸发、离心等)。同样，前列腺组织活检样品也可以进行采集后制备和贮存技术，例如固定。
本发明的组合物、试剂盒和方法可以用于检测其至少一部分展示于表达它的细胞表面上的标志物蛋白的表达。对于本领域技术人员而言，确定标志物蛋白或其部分是否暴露于细胞表面是一件容易的事情。例如，免疫学方法可以用来检测全细胞上的这些蛋白质，或者众所周知的基于计算机的序列分析方法可以用来预测至少一个胞外域的存在(即，既包括分泌的蛋白质又包括含有至少一个细胞表面域的蛋白质)。不必裂解细胞即可检测其至少一部分展示于表达它的细胞表面上的标志物蛋白的表达(例如使用特异性结合蛋白质的细胞表面域的标记抗体)。
本发明标志物的表达可以采用多种众所周知的用于检测转录核酸或蛋白质表达的方法中的任一种来评估。该方法的非限制性例子包括用于检测分泌的、细胞表面、细胞质或核蛋白质的免疫学方法，蛋白质纯化方法，蛋白质功能或活性测定，核酸杂交方法，核酸逆转录方法，和核酸扩增方法。
在一个优选实施方案中，标志物表达的评估使用特异性结合该标志物蛋白或其片段-包括经历全部或部分正常翻译后修饰的标志物蛋白-的抗体(例如放射性标记的、生色团标记的、荧光团标记的或酶标记的抗体)、抗体衍生物(例如与底物或与蛋白质-配体对{例如生物素-链霉亲和素}的蛋白质或配体偶联的抗体)或抗体片段(例如单链抗体，分离的抗体超变区等)。
在另一个优选实施方案中，标志物的表达如下评估从患者样品中的细胞制备mRNA/cDNA(即转录的多核苷酸)，并且将该mRNA/cDNA与互补于标志物核酸的参照多核苷酸或其片段进行杂交。任选地，cDNA在与参照多核苷酸杂交之前可以用多种聚合酶链反应方法中的任何一种进行扩增；优选不进行扩增。一种或多种标志物的表达也可以用定量PCR进行检测，以估计该标志物的表达水平。或者，也可以使用检测本发明标志物的突变或变异(例如单核苷酸多态性、缺失等)的任一已知方法来检测患者中标志物的存在。
在一个有关实施方案中，从样品中获得的转录多核苷酸混合物与一个基质接触，该基质上固定了与标志物核酸的至少一部分(例如至少7、10、15、20、25、30、40、50、100、500或更多核苷酸残基)互补或同源的多核苷酸。如果互补或同源的多核苷酸在基质上可差别地检测到(例如可用不同生色团或荧光团检测，或者固定于选择的不同位置)，则多种标志物的表达水平能够用一种基质(例如固定于选定位置的多核苷酸的“基因芯片”微阵列)同时评估。当使用的评估标志物表达的方法涉及一种核酸与另一种核酸杂交时，优选在严格杂交条件下进行杂交。
因为本发明的组合物、试剂盒和方法依赖于检测一种或多种本发明标志物的表达水平的差异，因此优选标志物的表达水平显著高于用来评估在正常前列腺细胞和癌性前列腺细胞至少之一中之表达的方法的最低检测限值。
应当理解，通过使用一种或多种本发明的标志物常规筛选其它患者样品，将认识到某些标志物在多种类型的癌症中过量表达，包括特定前列腺癌，以及其他癌症。例如，将会证实某些本发明的标志物在大多数(即50％或以上)或基本上全部(即80％或以上)前列腺癌中过量表达。此外也证实，某些本发明的标志物与各个分期的前列腺癌有关。TNM分期法根据前列腺内原发肿瘤的大小和位置将原发肿瘤(T)分为四期中的一个(以及这些分类中的另外的亚分期)。T1表示通过数字直肠检查检测不到的显微肿瘤。T2NO是指在数字直肠检查中可触及但是包括在前列腺囊内的肿瘤(局部疾病)。在所有形式的T3期疾病中，肿瘤已经通过前列腺囊扩散到周围的结缔组织或精囊。T4是指已经离开前列腺并且可在盆腔区中发现的肿瘤。N期涉及原发性肿瘤是否已经扩散到局部淋巴结(盆腔淋巴结)。M期涉及肿瘤细胞是否已经转移到远端部位。
另外，通过对较大数量的患者样品评估本发明标志物的表达的改变，并且将获得样品的各个患者的结果相关联，也证实本发明某些标志物的表达改变与恶性肿瘤高度相关。本发明的组合物、试剂盒和方法因此可用于表征患者前列腺癌的分期、分级、组织学类型和良性/恶性性质中的一种或多种。
当本发明的组合物、试剂盒和方法用于表征患者前列腺癌的分期、分级、组织学类型和良性/恶性性质中的一种或多种时，优选选择本发明的标志物或一组标志物，以便在至少约20％，，优选至少约40％、60％或80％及更多的，优选在基本上全部的相应分期、分级、组织学类型或良性/恶性的前列腺癌患者中获得阳性结果。优选选择本发明的标志物或一组标志物，以便在总人群中获得高于约10％的阳性预测值(PPV)(更优选地同时有高于80％的测定特异性)。
当在本发明的组合物、试剂盒和方法中使用多种本发明的标志物时，可以将患者样品中每种标志物的表达水平与在单一反应混合物中(即对于每种标志物使用试剂，例如不同的荧光探针)或在对应于一种或多种标志物的各反应混合物中的相同类型非癌样品中所述多种标志物之每一种的正常表达水平进行比较。在一个实施方案中，相对于相应的正常水平，多种标志物中一种以上的标志物在样品中的表达水平显著增加表明该患者患有前列腺癌。当使用多种标志物时，优选使用2、3、4、5、8、10、12、15、20、30或50种或更多的标志物，其中优选较少的标志物。
为了使本发明的组合物、试剂盒和方法的灵敏度最大化(即通过患者样品中非前列腺来源的细胞引起的干扰)，优选此处使用的本发明的标志物是具有受限的组织分布的标志物，例如在非前列腺组织中通常不表达的标志物。
只知道有少量标志物与前列腺癌相关(例如前列腺特异性抗原(PSA，KLK3)、前列腺特异性膜抗原(PSMA FOLH1)、前列腺酸性磷酸酶(PAP，ACPP)、前列腺癌抗原3(PCA3，DD3)、前列腺癌肿瘤抗原(PCTA-1 LGALS8)、前列腺干细胞抗原(PSCA)、腺激肽释放酶-1(hGK-1，KLK2)、prostase(KLK4，PRSS17，KLK-L1)、前列腺特异性G-蛋白偶联受体(PSGR)和前列腺六跨膜上皮抗原(STEAP，PRSS24))。在一个实施方案中，这些标志物可以与一组标志物中的一种或多种本发明的标志物一起使用。众所周知，某些基因类型，例如癌基因、肿瘤抑制基因、生长因子样基因、蛋白酶样基因和蛋白激酶样基因，通常与各种类型癌症的发展有关。因此，在本发明的标志物中，优选使用相应于与已知癌基因和肿瘤抑制基因所编码的已知蛋白质类似的蛋白质的标志物，和相应于类似生长因子、蛋白酶和蛋白激酶的蛋白质的标志物。
认为本发明的组合物、试剂盒和方法对发展前列腺癌危险高的患者以及他们的医学顾问特别有用。被认为发展前列腺癌危险高的患者包括，例如，具有前列腺癌家族史的患者，被确定为具有突变癌基因(即至少一个等位基因)的患者，和高龄患者(即大约50或60岁以上的男性)。
一种标志物在正常(即非癌)人类前列腺组织中的表达水平可以用多种方法评估。在一个实施方案中，这种正常表达水平的评估方法包括评估该标志物在看来是非癌细胞的前列腺细胞的一部分中的表达水平，将该正常表达水平与在怀疑为癌细胞的前列腺细胞的一部分中的表达水平进行比较。另外并且特别地，由于常规进行本文所述的方法可以获得进一步的信息，本发明标志物的正常表达可以使用人群平均值。在其他实施方案中，标志物的“正常”表达水平可以如下确定评估从非癌患者获得的患者样品中、在怀疑患者前列腺癌发病之前从患者中获得的患者样品中、存档的患者样品等中该标志物的表达。
本发明包括用于评估样品(例如存档的组织样品或从患者中获得的样品)中前列腺癌细胞的存在的组合物、试剂盒和方法。这些组合物、试剂盒和方法基本与上述相同，除了在必要时为了使用患者样品以外的样品而对该组合物、试剂盒和方法作适应性改变。例如，当使用的样品是石蜡处理的存档的人类组织样品时，调节本发明组合物、本发明试剂盒中化合物的比例，或调整用于评估样品中标志物表达水平的方法可能是必要的。这些方法在本领域中公知，并且在本领域技术人员的技能之内。
本发明包括用于评估(例如在样品如患者样品中)前列腺癌细胞的存在的试剂盒。该试剂盒包括多种试剂，其中每一种试剂都能够特异性结合一种标志物核酸或蛋白。合适的用于结合标志物蛋白的试剂包括抗体、抗体衍生物、抗体片段等。合适的用于结合标志物核酸(例如基因组DNA、mRNA、剪接的mRNA、cDNA等)的试剂包括互补核酸。例如，核酸试剂可包括固定于基质上的寡核苷酸(标记或非标记的)、未与基质结合的标记寡核苷酸、PCR引物对、分子信标探针等。
本发明的试剂盒可以任选地包括用于进行本发明方法的其他成分。例如，该试剂盒可包括适用于互补核酸退火或适用于结合抗体和与之特异性结合的蛋白质的流体(例如SSC缓冲液)，一个或多个样品室，描述本发明方法的操作的说明材料，正常前列腺细胞样品，前列腺癌细胞样品，等等。
本发明也包括一种制备分离的杂交瘤的方法，该杂交瘤产生用于评估患者是否患有前列腺癌的抗体。在该方法中，合成或分离包含标志物蛋白的全部或片段的蛋白质或肽(例如通过从表达细胞中纯化，或者通过应用已知方法在体内或体外转录和翻译编码该蛋白质或肽的核酸)。用该蛋白质或肽免疫脊椎动物，优选哺乳动物，如小鼠、大鼠、兔或绵羊。该脊椎动物任选地(且优选地)可以用该蛋白质或肽进行至少另一次免疫，以使该脊椎动物表现出对该蛋白质或肽的加强的免疫应答。使用本领域公知的任一方法，从免疫的脊椎动物中分离脾细胞，并且将其与无限增殖化细胞系融合，形成杂交瘤。然后用标准方法筛选这样形成的杂交瘤，从而鉴定出一种或多种产生特异性结合该标志物蛋白或其片段的抗体的杂交瘤。本发明也包括利用该方法制备的杂交瘤和利用该杂交瘤制备的抗体。
本发明也包括一种评估试验化合物抑制前列腺癌细胞的效果的方法。如上所述，本发明标志物的表达水平的差异与前列腺细胞的癌性状态有关。虽然认为本发明某些标志物的表达水平的改变可能是前列腺细胞的癌性状态引起的，但是同样认为，本发明其他标志物的表达水平的改变诱导、保持和促进了这些细胞的癌性状态。因此，抑制患者中前列腺癌的化合物将使一种或多种本发明标志物的表达水平变化为更接近于该标志物的正常表达水平(即该标志物在非癌前列腺细胞中的表达水平)的水平。
该方法因此包括将在试验化合物存在下保存的第一前列腺细胞样品中一种标志物的表达与在不含该试验化合物条件下保存的第二前列腺细胞样品中该标志物的表达进行比较。在试验化合物存在下本发明标志物的表达显著降低表明该试验化合物抑制前列腺癌。前列腺细胞样品例如可以是从患者中获得的一种正常前列腺细胞样品的等份，从患者中获得的正常前列腺细胞的合并样品，正常前列腺细胞系细胞，从患者中获得的一种前列腺癌细胞样品的等份，从患者中获得的前列腺癌细胞的合并样品，前列腺癌细胞系细胞，等等。在一个实施方案中，样品是从患者中获得的前列腺癌细胞，并且检测已知有效抑制各种前列腺癌的多种化合物，以鉴定最有可能抑制患者前列腺癌的化合物。
该方法同样可以用于评估一种疗法抑制患者前列腺癌的疗效。在该方法中，评估一种或多种本发明标志物在一对样品(一个经过治疗，另一个没有经过治疗)中的表达水平。如同评估试验化合物的效果的方法一样，如果这种疗法诱导明显较低的本发明标志物的表达水平，则这种疗法对于抑制前列腺癌是有效的。如上所述，如果在该方法中使用来自选定患者的样品，则可以在体外评估备选疗法，以选择最可能有效抑制患者前列腺癌的疗法。
如上所述，人前列腺细胞的癌性状态与本发明标志物的表达水平的变化有关。本发明包括用于评估试验化合物致人前列腺细胞癌的能力的方法。该方法包括在存在及不存在试验化合物的条件下分开保存人前列腺细胞等份。比较本发明标志物在各等份中的表达。(与不存在试验化合物条件下保存的等份相比)在试验化合物存在下保存的等份中本发明标志物的表达水平明显更高表明该试验化合物具有致人前列腺细胞癌的能力。各种试验化合物的相对致癌能力的评估可以通过比较有关标志物表达水平提高或抑制的程度，比较表达水平提高或抑制的标志物的数量，或者以上两者都比较。
本发明的各个方面在下面的部分中进一步详细描述。
分离的核酸分子本发明的一个方案涉及分离的核酸分子，包括编码标志物蛋白或其一部分的核酸。本发明的分离的核酸也包括足以用作杂交探针来鉴定标志物核酸分子和标志物核酸分子的片段的核酸分子，例如适合作为标志物核酸分子扩增或突变的PCR引物使用的那些。此处使用的术语“核酸分子”包括DNA分子(例如cDNA或基因组DNA)和RNA分子(例如mRNA)和用核苷酸类似物产生的DNA或RNA的类似物。核酸分子可以是单链或双链的，但优选是双链DNA。
“分离的”核酸分子是从该核酸分子天然来源中存在的其他核酸分子中分离出来的核酸分子。在一个实施方案中，“分离的”核酸分子不含在作为该核酸来源的生物的基因组DNA中天然位于该核酸侧翼的序列(优选蛋白质编码序列)(即位于该核酸5′和3′末端的序列)。例如，在各种实施方案中，分离的核酸分子可含有少于约5kB、4kB、3kB、2kB、1kB、0.5kB或0.1kB的在作为该核酸来源的细胞的基因组DNA中天然位于该核酸分子之侧的核苷酸序列。在另外一个实施方案中，“分离的”核酸分子，如cDNA分子，基本不含其他细胞材料，或者当利用重组技术产生时基本不含培养基，或者当化学合成时基本不含化学前体或其他化学物质。基本不含细胞材料的核酸分子包括含有少于约30％、20％、10％或5％的异源核酸(在此也被称为“污染核酸”)的制剂。
本发明的核酸分子可以利用标准分子生物学技术和本文所述数据库中记录的序列信息来分离。利用这些核酸序列的全部或一部分，可以利用标准杂交和克隆技术(例如，Sambrook等人，ed.，MolecularCloningA Laboratory Manuaal 2nd ed.，Cold Spring Harbor LaboratoryPress，Cold Spring Harbor，NY，1989所述的方法)分离本发明的核酸分子。
本发明的核酸分子可以用cDNA、mRNA或基因组DNA作为模板并且使用合适的寡核苷酸引物按照标准PCR扩增技术来扩增。可将这样扩增的核酸克隆到合适的载体中，并且通过DNA序列分析进行表征。此外，对应于本发明核酸分子的全部或一部分的核苷酸也可以利用标准合成技术制备，例如用自动DNA合成仪制备。
在另一优选实施方案中，本发明的分离的核酸分子包括一种核酸分子，其具有与标志物核酸的核苷酸序列互补或与编码标志物蛋白的核酸的核苷酸序列互补的核苷酸序列。与特定核苷酸序列互补的核酸分子是与特定核苷酸序列完全互补，因此能够与特定核苷酸序列杂交从而形成稳定双链体的核酸分子。
另外，本发明的核酸分子可以只含有核酸序列的一部分，其中全长核酸序列包含一种标志物核酸或编码一种标志物蛋白。该核酸例如可以用作探针或引物。探针/引物一般使用一种或多种基本上纯化的寡核苷酸。该寡核苷酸一般包含一个核苷酸序列区，该区在严格条件下与本发明核酸的至少约7个，优选约15个，更优选约25、50、75、100、125、150、175、200、250、300、350或400个或更多的连续核苷酸杂交。
基于本发明核酸分子序列的探针能够用于检测对应于一种或多种本发明标志物的转录物或基因组序列。探针含有与之连接的标记基团，例如放射性同位素、荧光化合物、酶或酶辅因子。这些探针可以用作鉴定错误表达该蛋白质的细胞或组织的诊断检测试剂盒的一部分，例如通过测定在来自受试者的细胞样品中编码该蛋白质的核酸分子的水平，例如检测mRNA水平或确定编码该蛋白质的基因是否已经突变或缺失。
本发明进一步包括由于遗传密码简并性而与编码标志物蛋白(即具有SEQ ID NO(AAs)的序列的蛋白质)的核酸的核苷酸序列不同，因而编码相同蛋白质的核酸分子。
本领域技术人员应当理解，导致氨基酸序列变化的DNA序列多态性可能存在于一个群体(例如人群)中。由于自然等位基因变异，这种遗传多态性可能存在于一个群体内的个体之间。等位基因是在特定基因座处可替代地存在的一组基因中的一个。另外，应当理解，也可能存在影响RNA表达水平的DNA多态性，其可以影响该基因的总体表达水平(例如通过影响调节或降解)。
此处使用的短语“等位基因变体”是指在特定基因座处发生的核苷酸序列，或者是指该核苷酸序列编码的多肽。
此处使用的术语“基因”和“重组基因”是指包含编码对应于本发明标志物的多肽的开放阅读框的核酸分子。这些自然等位基因变异一般可导致特定基因的核苷酸序列中1-5％的变化。替代的等位基因可以通过对大量不同个体中的目标基因进行测序来鉴定。使用杂交探针鉴定多个个体中的同一基因座能够容易地进行这种鉴定。自然等位基因变异导致的并且未改变功能活性的任意及所有的这些核苷酸变异和产生的氨基酸多态性或变异，都在本发明的范围之内。
在另一个实施方案中， 本发明的分离的核酸分子长度至少为7、15、20、25、30、40、60、80、100、150、200、250、300、350、400、450、550、650、700、800、900、1000、1200、1400、1600、1800、2000、2200、2400、2600、2800、3000、3500、4000、4500个或更多的核苷酸，并且在严格条件下与标志物核酸或与编码标志物蛋白的核酸杂交。此处使用的术语“在严格条件下杂交”是指这样的杂交和洗涤条件，在该条件下彼此至少60％(65％、70％，优选75％)相同的核苷酸序列一般保持彼此杂交。这些严格条件为本领域技术人员所公知，并且可见于Current Protocols in Molecular Biology，JohnWiley & Sons，N.Y.(1989)的第6.3.1-6.3.6节。严格杂交条件的一个优选的非限制性实例是在大约45℃下在6×氯化钠/柠檬酸钠(SSC)中杂交，然后在50-65℃下用0.2×SSC，0.1％SDS洗涤一次或数次。
除了群体中可能存在的本发明核酸分子的天然存在的等位基因变体之外，本领域技术人员应当进一步理解，可以通过突变引入序列改变，从而使其编码的蛋白质的氨基酸序列改变，而不改变其编码的蛋白质的生物活性。例如，可以进行核苷酸置换，在“非必需”氨基酸残基处进行氨基酸置换。“非必需”氨基酸残基是可能与野生型序列相比发生改变但不改变生物活性的残基，而“必需”氨基酸残基是生物活性所必需的。例如，在不同物种的同源物之间不保守或仅仅半保守的氨基酸残基对于活性可能是非必需的，因此可能是改变的目标。另外，在不同物种(例如鼠和人类)的同源物之间保守的氨基酸残基对于活性可能是必需的，因此不能作为改变的目标。
因此，本发明的另一方案涉及编码变异标志物蛋白的核酸分子，该变异标志物蛋白含有对于活性而言非必需的氨基酸残基的改变。该变异标志物蛋白在氨基酸序列上不同于天然存在的标志物蛋白，但仍保留生物活性。在一个实施方案中，这种变异标志物蛋白具有与标志物蛋白的氨基酸序列至少大约40％、50％、60％、70％、80％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同的氨基酸序列。
编码变异标志物蛋白的分离的核酸分子可以如下产生向标志物核酸的核苷酸序列中引入一个或多个核苷酸置换、添加或缺失，从而向其编码的蛋白质中引入一个或多个氨基酸残基置换、添加或缺失。可以利用标准技术如定点诱变和PCR介导的诱变来引入突变。优选地，在一个或多个预测的非必需氨基酸残基处进行保守氨基酸置换。“保守氨基酸置换”是氨基酸残基被置换为具有相似侧链的另一氨基酸残基的置换。具有相似侧链的氨基酸残基的家族在本领域中已经定义。这些家族包括具有碱性侧链(例如赖氨酸、精氨酸、组氨酸)、酸性侧链(例如天冬氨酸、谷氨酸)、不带电荷的极性侧链(例如甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、半胱氨酸)、非极性侧链(例如丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、色氨酸)、β-分支侧链(例如苏氨酸、缬氨酸、异亮氨酸)和芳香族侧链(例如酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、组氨酸)的氨基酸。或者，也可以通过例如饱和诱变，沿编码序列的全部或一部分随机引入突变，获得的突变体可以根据生物活性进行筛选，以鉴定出保留活性的突变体。诱变后，可以重组表达编码的蛋白质，并且可以测定该蛋白质的活性。
本发明包括反义核酸分子，即与本发明的有义核酸互补的分子，例如与双链标志物cDNA分子的编码链互补，或者与标志物mRNA序列互补的分子。因此，本发明的反义核酸可以与本发明的有义核酸形成氢键(即退火)。反义核酸可以互补于整个编码链，或者只互补于其中一部分，例如蛋白质编码区(或开放阅读框)的全部或一部分。反义核酸分子也可以对于编码标志物蛋白的核苷酸序列编码链的非编码区的全部或一部分而言是反义的。非编码区(″5′和3′非翻译区″)是位于编码区之侧的5′和3′序列，不翻译为氨基酸。
反义寡核苷酸的长度可以是，例如大约5、10、15、20、25、30、35、40、45或50个或更多个核苷酸。本发明的反义核酸可以利用化学合成及酶连接反应采用本领域公知的程序来构建。例如，反义核酸(例如反义寡核苷酸)可以利用天然存在的核苷酸或各种修饰的核苷酸化学合成，这些修饰核苷酸被设计为提高该分子的生物学稳定性或提高反义与有义核酸之间形成的双链体的物理稳定性，例如可以使用硫代磷酸酯衍生物和吖啶取代的核苷酸。能够用于产生反义核酸的修饰核苷酸的例子包括5-氟尿嘧啶、5-溴尿嘧啶、5-氯尿嘧啶、5-碘尿嘧啶、次黄嘌呤、黄嘌呤、4-乙酰胞嘧啶、5-(羧基羟甲基)尿嘧啶、5-羧甲基氨甲基-2-硫尿核苷，5-羧甲基氨甲基尿嘧啶、二氢尿嘧啶、β-D-半乳糖基Q核苷、肌苷、N6-异戊烯腺嘌呤、1-甲基乌嘌呤、1-甲基肌苷、2，2-二甲基鸟嘌呤、2-甲基腺嘌呤、2-甲基乌嘌呤、3-甲基胞嘧啶、5-甲基胞嘧啶、N6-腺嘌呤、7-甲基鸟嘌呤、5-甲基氨甲基尿嘧啶、5-甲氧基氨甲基-2-硫尿嘧啶、β-D-甘露糖基Q核苷、5′-甲氧基羧甲基尿嘧啶、5-甲氧基尿嘧啶、2-甲硫基-N6-异戊烯腺嘌呤、尿嘧啶-5-氧乙酸(v)、怀丁苷(wybutoxosine)、假尿嘧啶、Q核苷、2-硫胞嘧啶、5-甲基-2-硫尿嘧啶、2-硫尿嘧啶、4-硫尿嘧啶、5-甲基尿嘧啶、尿嘧啶-5-氧乙酸甲酯、尿嘧啶-5-氧乙酸(v)、5-甲基-2-硫尿嘧啶、3-(3-氨基-3-N-2-羧丙基)尿嘧啶、(acp3)w和2，6-二氨基嘌呤。或者，反义核酸也可以利用表达载体以生物学方法产生，该表达载体中已经以反义方向亚克隆了核酸(即由插入核酸转录的RNA与靶核酸为反义方向，在以下部分中进一步描述)。
本发明的反义核酸分子一般对受试者施用，或者在原位产生，使其与编码标志物蛋白的细胞mRNA和/或基因组DNA杂交或结合，从而抑制该标志物的表达，例如通过抑制转录和/或翻译来实现。杂交可以通过常规核苷酸互补性来形成稳定的双链体，或者例如在结合DNA双链体的反义核酸分子的情况中，通过双螺旋大沟中的特异性相互作用来实现。本发明反义核酸分子的给药途径的例子包括在组织部位直接注射，或者将反义核酸输注到前列腺相关体液中。或者，也可以为了靶向于选定的细胞而修饰反义核酸分子，然后全身给药。例如，对于全身给药，可以修饰反义分子，使其特异性结合在所选细胞表面表达的受体或抗原，例如，通过将反义核酸分子与结合细胞表面受体或抗原的肽或抗体相连接。也可以利用此处所述的载体将反义核酸分子导入细胞中。为了达到反义分子的足够的细胞内浓度，优选反义核酸分子被置于pol II或pol III强启动子控制下的载体构建体。
本发明的反义核酸分子可以是α-异头核酸分子。α-异头核酸分子与互补RNA形成特殊的双链杂合体，其中与通常的α-单元不同，两条链彼此平行(Gaultier等人，1987，Nucleic Acids Res.156625-6641)。反义核酸分子也可以包含2′-o-甲基核糖核苷酸(Inoue等人，1987，Nucleic Acids Res.156131-6148)或嵌合RNA-DNA类似物(Inoue等人，1987，FEBS Lett.215327-330)。
本发明也包括核酶。核酶是具有核糖核酸酶活性的催化性RNA分子，它能够切割与其具有互补区的单链核酸，如mRNA。因此，核酶(例如Haselhoff和Gerlach，1988，Nature 334585-591所述的锤头状核酶)能够用于催化性切割mRNA转录物，从而抑制mRNA编码的蛋白质的翻译。对编码标志物蛋白的核酸分子具有特异性的核酶可以根据对应于该标志物的cDNA的核苷酸序列来设计。例如，可以构建四膜虫(Tetrahymena)L-19 IVS RNA的衍生物，其中活性部位的核苷酸序列与将要切割的核苷酸序列互补(参见Cech等人，美国专利No.4,987,071；和Cech等人，美国专利No.5,116,742)。或者，能够利用编码本发明多肽的mRNA从RNA分子库中选择具有特异性核糖核酸酶活性的催化性RNA(参见，例如Bartel和Szostak，1993，Science261141l-1418)。
本发明也包括形成三股螺旋结构的核酸分子。例如，通过靶向至与编码标志物核酸或蛋白的基因的调节区(例如启动子和/或增强子)互补的核苷酸序列，形成阻止基因在靶细胞中转录的三股螺旋结构，能够抑制本发明标志物的表达。一般地参见Helene(1991)AnticancerDrug Des.6(6)569-84；Helene(1992)Ann.N.Y.Acad.Sci.66027-36；和Maher(1992)Bioassays 14(12)807-15。
在各个实施方案中，可以在碱基部分、糖部分或磷酸骨架上修饰本发明的核酸分子，以改善例如分子的稳定性、杂交或溶解性。例如，可以修饰核酸的脱氧核糖磷酸骨架，产生肽核酸(参见Hyrup等人，1996，Bioorganic & Medicinal Chemistry 4(1)5-23)。此处使用的术语“肽核酸”或“PNA”是指脱氧核糖磷酸骨架被假肽骨架所取代并且只保留了4种天然核碱基的核酸模拟物，例如DNA模拟物。已经证实，PNA的中性骨架允许DNA和RNA在低离子强度条件下特异性杂交。PNA寡聚体的合成可以利用Hyrup等人(1996)，同上；Perry-O′Keefe等人(1996)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 9314670-675所述的标准固相肽合成方案进行。
PNA可用于治疗和诊断用途。例如，PNA可以作为反义试剂或抗基因剂用于序列特异性地调节基因表达，例如通过诱导转录或翻译停滞或抑制复制。PNA也可以用于例如基因中单碱基对突变的分析，例如通过PNA引导的PCR锁止技术(PCR clamping)；在与其他酶例如S1核酸酶联合使用时作为人工限制性酶(Hyrup(1996)，同上)；或者作为DNA测序和杂交的探针或引物(Hyrup，1996，同上；Perry-O′Keefe等人，1996，Proe.Natl.Acad Sci.USA 9314670-675)。
在另一个实施方案中，通过将亲脂性或其他辅助基团与PNA连接，通过形成PNA-DNA嵌合体，或者通过使用脂质体或本领域公知的其他给药技术，可以修饰PNA，例如提高其稳定性或细胞摄取。例如，可以生成PNA-DNA嵌合体，该嵌合体能够结合PNA和DNA的有利特性。该嵌合体允许DNA识别酶，例如RNase H和DNA聚合酶，与DNA部分相互作用，而PNA部分提供高结合亲和力和特异性。PNA-DNA嵌合体可以用根据碱基堆积、核碱基间键的数量和方向选择的适当长度的接头连接(Hyrup，1996，同上)。PNA-DNA嵌合体的合成可以如Hyrup(1996)，同上，和Finn等人(1996)Nucleic AcidsRes.24(17)3357-63所述进行。例如，可以利用标准亚磷酰胺偶合化学法和修饰的核苷类似物在固体支持体上合成DNA链。化合物，如5′-(4-甲氧三苯甲基)氨基-5′-脱氧-胸苷亚磷酰胺，可以用作PNA与DNA的5′末端之间的连接物(Mag等人，1989，Nucleic Acids Res.175973-88)。PNA单体然后以逐步的方式偶合，产生具有5′ PNA片段和3′DNA片段的嵌合分子(Finn等人，1996，Nucleic Acids Res.24(17)3357-63)。或者，也可以合成具有5′DNA片段和3′PNA片段的嵌合分子(Peterser等人，1975，Bioorganic Med. Chem.Lett.51119-11124)。
在另外的实施方案中，寡核苷酸可以包括其他附加基团，例如肽(例如用于在体内靶向至宿主细胞受体)，或有利于穿过细胞膜(参见，例如Letsinger等人，1989，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 866553-6556；Lemaitre等人，1987，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 84648-652；PCT公布号WO 88/09810)或血脑屏障(参见，例如PCT公布号WO89/10134)转运的试剂。另外，寡核苷酸也可以用杂交触发的切割剂(参见，例如Krol等人，1988，Bio/Techniques 6958-976)或嵌入剂(参见，例如Zon，1988，Pharm.Res.5539-549)修饰。为此，寡核苷酸可以偶联到另一分子，例如肽、杂交触发的交联剂、转运载体、杂交触发的切割剂等。
本发明也包括分子信标核酸，其具有至少一个与本发明的核酸互补的区，因此该分子信标可用于定量样品中本发明的核酸的存在。“分子信标”核酸是包含一对互补区并且具有与之结合的荧光团和荧光猝灭剂的核酸。荧光团和猝灭剂与核酸的不同部分结合，其方向为，当互补区彼此退火时，荧光团的荧光被猝灭剂猝灭。当核酸的互补区彼此不退火时，荧光团的荧光猝灭程度较低。分子信标核酸例如在美国专利5,876,930中记载。
分离的蛋白质和抗体本发明的一个方案涉及分离的标志物蛋白及其生物活性部分，以及适于作为免疫原来产生针对标志物蛋白或其片段的抗体的多肽片段。在一个实施方案中，可以采用标准蛋白质纯化技术按照适当的纯化方案从细胞或组织来源中分离天然标志物蛋白。在另一个实施方案中，含有标志物蛋白的全部或片段的蛋白质或肽通过重组DNA技术产生。作为重组表达的替代方法，该蛋白质或肽可以采用标准肽合成技术化学合成。
“分离的”或“纯化的”蛋白质或其生物活性部分基本不含来自衍生该蛋白质的细胞或组织来源的细胞材料或其他污染蛋白质，或者在化学合成时基本不含化学前体或其他化学物质。短语“基本不含细胞材料”包括其中蛋白质与分离或重组产生该蛋白质的细胞的细胞成分相分离的蛋白质制品。因此，基本不含细胞材料的蛋白质包括含有少于约30％、20％、10％或5％(基于干重)异源蛋白质(在此也称为“污染蛋白质”)的蛋白质制品。当蛋白质或其生物活性部分重组产生时，也优选基本不含培养基，即培养基占蛋白质制品体积的不到约20％、10％或5％。当蛋白质通过化学合成产生时，优选基本不含化学前体或其他化学物质，即与参与蛋白质合成的化学前体或其他化学物质分离。因此，这些蛋白质制品含有低于约30％、20％、10％、5％(基于干重)的化学前体或目标多肽以外的化合物。
标志物蛋白的生物活性部分包括含有充分等同于或来源于该标志物蛋白的氨基酸序列的氨基酸序列的多肽，其包含比全长蛋白质更少的氨基酸，并且表现出相应全长蛋白质的至少一种活性。一般来说，生物活性部分包含具有相应全长蛋白质的至少一种活性的结构域或基序。本发明标志物蛋白的生物活性部分可以是长度为例如10、25、50、100个或更多氨基酸的多肽。而且，其中标志物蛋白的其他区缺失的其他生物活性部分可以利用重组技术制备，并且针对标志物蛋白天然形式的一种或多种功能活性进行评价。
优选的标志物蛋白由包含SEQ ID NO(nts)任一序列的核苷酸序列编码。其他有用的蛋白质与这些序列之一具有基本相同(例如至少约40％，优选50％、60％、70％、80％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同)，并且保留天然存在的相应标志物蛋白的功能活性，然而由于天然等位基因变异或诱变其在氨基酸序列上不同。
为了确定两个氨基酸序列或两种核酸的百分同一性，将序列进行比对以便进行最佳比较(例如，为了与第二氨基酸或核酸序列进行最佳比对，可以在第一氨基酸或核酸序列中引入缺口)。然后比较相应氨基酸位点或核苷酸位点处的氨基酸残基或核苷酸。当第一序列中的一个位点与第二序列中的相应位点被相同的氨基酸残基或核苷酸占据时，该分子在该位点处相同。两个序列之间的百分同一性是序列共有的相同位点数的函数(即％同一性＝相同位点数/位点(例如重叠位点)总数×100)。在一个实施方案中，两个序列长度相同。
两个序列之间百分同一性的确定可以用数学算法实现。用于比较两个序列的数学算法的一个优选的非限制性例子是Karlin和Altschul(1990)Proc.Natl.Acad. Sci.USA 872264-2268的算法，Karlin和Altschul(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 905873-5877对其进行了改良。该算法并入Altschul等人(1990)J.Mol.Biol.215403-410的BLASTN和BLASTX程序中。BLAST核苷酸检索可以用BLASTN程序进行，得分＝100，字长＝12，以获得与本发明的核酸分子同源的核苷酸序列。BLAST蛋白质检索可以用BLASTP程序进行，得分＝50，字长＝3，以获得与本发明的蛋白质分子同源的氨基酸序列。为了获得用于比较目的的有缺口的比对，可以如Altschul等人(1997)Nucleic Acids Res.253389-3402所述使用较新版本的BLAST算法，称为缺口BLAST，它能够进行缺口局部比对，用于BLASTN、BLASTP和BLASTX程序。或者，也能够利用PSI-Blast进行迭代检索，该迭代检索检测分子之间的远缘关系。当使用BLAST、缺口BLAST和PSI-Blast程序时，可以使用相应程序(例如BLASTX和BLASTN)的缺省参数。参见http://www.ncbi.nlm.nih.gov。用于序列比较的数学算法的另一优选的非限制性例子是Myers和Miller，(1988)CABIOS 411-17的算法。该算法被并入ALIGN程序(版本2.0)中，该程序是GCG序列比对软件包的一部分。当使用AUGN程序比较氨基酸序列时，可以使用PAMl20重量残基表、空位长度罚分为12、空位罚分为4。用于鉴定局部序列相似性区和用于比对的另一种有用的算法是如Pearson和Lipman(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.USA852444-2448所述的FASTA算法。当使用FASTA算法比较核苷酸或氨基酸序列时，PAMl20重量残基表例如可以使用为2的k-元组值。
两个序列之间的百分同一性可以用与以上所述类似、允许或不允许缺口的技术来确定。在计算百分同一性时，只计数准确的匹配。
本发明也提供包含标志物蛋白或其片段的嵌合或融合蛋白。此处使用的“嵌合蛋白”或“融合蛋白”包含与异源多肽(即标志物蛋白以外的多肽)可操作连接的标志物蛋白的全部或部分(优选生物活性部分)。用于融合蛋白时，术语“可操作连接”是指标志物蛋白或其片段和异源多肽彼此在阅读框内融合。异源多肽可以与标志物蛋白或片段的氨基端或羧基端融合。
一种有用的融合蛋白是GST融合蛋白，其中标志物蛋白或片段与GST序列的羧基端融合。该融合蛋白有利于本发明的重组多肽的纯化。
在另一个实施方案中，融合蛋白在其氨基端含有异源信号序列。例如，可以将标志物蛋白的天然信号序列除去并替换为来自另一种蛋白质的信号序列。例如，杆状病毒包膜蛋白的gp67分泌序列可以用作异源信号序列(Ausubel等人，ed.，Current Protocols in MolecularBiology，John Wiley & Sons，NY，1992)。真核生物异源信号序列的其他例子包括蜂毒肽和人胎盘碱性磷酸酶的分泌序列(Stratagene；LaJolla，California)。在另一个例子中，有用的原核生物异源信号序列包括phoA分泌信号(Sambrook等人，同上)和蛋白A分泌信号(PharmaciaBiotech；Piscataway，New Jersey)。
在另一个实施方案中，所述融合蛋白是免疫球蛋白融合蛋白，其中标志物蛋白的全部或一部分与来源于该免疫球蛋白家族成员的序列融合。本发明的免疫球蛋白融合蛋白可以加入到药物组合物中，对受试者施用，来抑制(可溶性的或膜结合的)配体与细胞表面上的蛋白质(受体)之间的相互作用，从而抑制体内信号转导。免疫球蛋白融合蛋白可以用来影响标志物蛋白的相应配体的生物利用度。配体/受体相互作用的抑制在治疗上可能有用，既可用于治疗增生性和分化性疾病，又可用于调节(例如促进或抑制)细胞存活率。而且，本发明的免疫球蛋白融合蛋白能够作为免疫原用于在受试者中产生抗标志物蛋白的抗体，用于纯化配体，以及在筛选试验中用来鉴定抑制标志物蛋白与配体相互作用的分子。
本发明的嵌合蛋白和融合蛋白可以通过标准重组DNA技术制备。在另一个实施方案中，融合基因可以利用常规技术合成，包括使用自动DNA合成仪。或者，可以用锚引物进行基因片段的PCR扩增，该锚引物在两个连续基因片段之间产生互补的突出部分(overhang)，之后可以退火并再次扩增，产生嵌合基因序列(参见，例如Ausubel等人，同上)。另外，许多已经编码融合部分(例如GST多肽)的表达载体在商业上可以获得。可以将编码本发明多肽的核酸克隆到这种表达载体中，使融合部分与本发明的多肽在阅读框内连接。
可以利用信号序列促进标志物蛋白的分泌和分离。信号序列的特征一般在于疏水性氨基酸的核心，通常在一个或多个切割事件中在分泌过程中从成熟蛋白上切下。该信号肽含有加工位点，该加工位点允许在其通过分泌途径时从成熟蛋白上切下信号序列。因此，本发明涉及具有信号序列的标志物蛋白、融合蛋白或其片段，以及已经蛋白水解切割下信号序列的蛋白质(即切割产物)。在一个实施方案中，编码信号序列的核酸序列在表达载体中可以与目标蛋白质如标记蛋白或其片段可操作地连接。信号序列引导例如从用表达载体转化的原核宿主中分泌蛋白质，该信号序列后来或者同时被切下。然后可以通过本领域公知的方法容易地从胞外基质中纯化该蛋白质。或者，可以利用有利于纯化的序列，如利用GST域，将信号序列与目标蛋白质连接。
本发明也涉及标志物蛋白的变体。该变体具有改变的氨基酸序列，其可以作为激动剂(模拟物)或拮抗剂。可以通过诱变，例如不连续的点突变或截短来产生变体。激动剂可保留与天然存在的蛋白质形式基本相同的生物活性，或其一部分活性。蛋白质的拮抗剂能够抑制该蛋白质天然存在形式的一种或多种活性，例如通过竞争性结合到包括目标蛋白质的细胞信号级联的下游或上游成员上产生这种抑制。因此，用有限功能的变体处理能够引发特定的生物效应。相对于用蛋白质的天然存在形式处理，用具有该蛋白质天然存在形式的一部分生物活性的变体处理受试者可能在受试者中具有更少的副作用。
作为激动剂(模拟物)或拮抗剂的标志物蛋白的变体可以通过对激动剂或拮抗剂活性筛查本发明蛋白质的突变体例如截短突变体的组合文库来鉴定。在一个实施方案中，多样化的(variegated)变体文库通过在核酸水平上的组合诱变而产生，并且由多样化的基因文库编码。例如，通过将合成寡核苷酸的混合物酶学连接到基因序列中，使简并的一组可能的蛋白质序列表达为各种多肽，或者表达为一组较大的融合蛋白(例如用于噬菌体展示)，能够产生多样化的变体文库。有多种方法能够用于由简并寡核苷酸序列产生标志物蛋白的可能变体的文库。合成简并寡核苷酸的方法在本领域公知(参见，例如Narang，1983，Tetrahedron 393；Itakura等人，1984，Annu.Rev.Biochem.53323；Itakura等人，1984，Science 1981056；Ike等人，1983 Nucleic Acid Res.11477)。
另外，可以利用标志物蛋白片段文库产生多样化的一群多肽，用于筛选及随后选择变异标志物蛋白或其片段。例如，编码序列片段文库可以如下产生在每个分子仅发生大约一次缺刻的条件下用核酸酶处理目标编码序列的双链PCR片段，变性该双链DNA，将该DNA复性以形成可以包括来自不同缺刻产物的有义/反义对的双链DNA，通过S1核酸酶处理从重新形成的双链体中除去单链部分，以及将产生的片段文库连接到表达载体中。利用该方法能够产生表达文库，其编码目标蛋白质的各种大小的氨基末端和内部片段。
有几种技术在本领域中公知用于筛查通过点突变或截短制备的组合文库的基因产物，以及为了具有选择的性质的基因产物而筛查cDNA文库。适用于高通量分析、用于筛查大基因文库的最广泛应用的技术通常包括，将基因文库克隆到复制型表达载体中，用得到的载体文库转化合适的细胞，以及在一定条件下表达该组合基因，其中对所需活性的检测有利于分离编码其产物被检测的基因的载体。递归总体诱变(REM)是一种提高文库中功能突变体频率的技术，可以与筛查试验联合应用，用来鉴定本发明的蛋白质的变体(Arkin和Yourvan，1992，Proc.Natl.Acad.Sci.USA897811-7815；Delgrave等人，1993，Protein Engineering 6(3)327-331)。
本发明的另一个方案涉及抗本发明蛋白质的抗体。在优选实施方案中，所述抗体特异性结合标志物蛋白或其片段。此处使用的术语“抗体”是指免疫球蛋白分子及其包含免疫球蛋白分子的免疫活性部分的片段和衍生物(即该部分含有抗原结合位点，该位点特异性结合抗原，如标志物蛋白，例如标志物蛋白质的表位)。特异性结合本发明蛋白质的抗体是与该蛋白质结合但是基本不与天然含有该蛋白质的样品例如生物样品中的其他分子结合的抗体。免疫球蛋白分子的免疫活性部分的例子包括但不限于单链抗体(scAb)、F(ab)和F(ab′)2片段。
分离的本发明的蛋白质或其片段可以作为免疫原用于产生抗体。可以使用全长蛋白质，或者本发明提供抗原性肽片段用作免疫原。本发明蛋白质的抗原性肽包含本发明蛋白质之一的氨基酸序列的至少8个(优选10、15、20或30个或更多)氨基酸残基，并且包含该蛋白质的至少一个表位，从而抗该肽的抗体与该蛋白质形成特定的免疫复合物。该抗原性肽包含的优选表位是位于蛋白质表面上的区域，例如亲水区。疏水性序列分析，亲水性序列分析，或类似的分析，都能够用来鉴定亲水区。在优选实施方案中，用分离的标志物蛋白或其片段作为免疫原。
一般利用免疫原，通过免疫合适的(即免疫活性)受试者，如兔、山羊、小鼠或其他哺乳动物或脊椎动物，来制备抗体。合适的免疫原性制品可能包含，例如重组表达的或化学合成的蛋白质或肽。该制品可进一步包含佐剂，如弗氏完全或不完全佐剂，或类似的免疫刺激剂。优选的免疫原组合物不含其他人类蛋白质，例如利用重组表达本发明蛋白质的非人类宿主细胞制备的免疫原组合物。在这种情况下，产生的抗体组合物没有或者具有减少的本发明蛋白质以外的人类蛋白质的结合。
本发明提供多克隆和单克隆抗体。此处使用的术语“单克隆抗体”或“单克隆抗体组合物”是指一组抗体分子，它们只含一种能够与特定表位免疫反应的抗原结合位点。优选的多克隆和单克隆抗体组合物是已经为抗本发明蛋白质的抗体而选择的那些。特别优选的多克隆和单克隆抗体制剂是只含抗标志物蛋白或其片段的抗体的那些。
多克隆抗体可以通过用本发明的蛋白质作为免疫原免疫合适的受试者来制备。被免疫的受试者中的抗体效价可以利用标准技术随时间监测，例如采用应用固定多肽的酶联免疫吸附测定(ELISA)。在免疫后适当的时间，例如当特异性抗体效价最高时，可以从受试者中获得抗体产生细胞，并且通过标准技术用其制备单克隆抗体(mAb)，例如最早由Kohler和Milstein(1975)Nature 256495-497描述的杂交瘤技术，人B细胞杂交瘤技术(参见Kozbor等人，1983，Immunol.Today472)，EBV-杂交瘤技术(参见Cole等人，pp.77-96 In MonoclonalAntibodies and Cancer Therapy，Alan R.Liss，Inc.，1985)或三源杂交瘤(trioma)技术。产生杂交瘤的技术众所周知(一般参见CurrentProtocols in Immunology，Coligan等人ed.，John Wiley & Sons，NewYork，1994)。通过例如利用标准ELISA试验针对可结合目标多肽的抗体筛查杂交瘤培养上清液，检测产生本发明的单克隆抗体的杂交瘤细胞。
作为制备分泌单克隆抗体的杂交瘤的替代方法，也可以通过用目标多肽筛查重组组合免疫球蛋白文库(例如抗体噬菌体展示文库)来鉴定和分离抗本发明蛋白质的单克隆抗体。用于制备和筛查噬菌体展示文库的试剂盒在商业上可以获得(例如Pharmacia重组噬菌体抗体系统，目录号27-9400-01；和Stratagene SurfZAP噬菌体展示试剂盒，目录号240612)。另外，特别适用于制备和筛查抗体展示文库的方法和试剂的例子可见于例如美国专利No.5,223,409；PCT公布号WO92/18619；PCT公布号WO 91/17271；PCT公布号WO 92/20791；PCT公布号WO 92/15679；PCT公布号WO 93/01288；PCT公布号WO92/01047；PCT公布号WO 92/09690；PCT公布号WO 90/02809；Fuchs等人(1991)Bio/Technology 91370-1372；Hay等人(1992)Hum.Antibod.Hybridomas 381-85；Huse等人(1989)Science 2461275-1281；Griffiths等人(1993)EMBO J.12725-734。
本发明也提供特异性结合本发明蛋白质的重组抗体。在优选实施方案中，该重组抗体特异性结合标志物蛋白或其片段。重组抗体包括但不限于包含人类和非人类部分的嵌合和人源化单克隆抗体、单链抗体和多特异性抗体。嵌合抗体是不同部分来源于不同动物种的分子，例如具有来源于鼠mAb的可变区和人免疫球蛋白恒定区的抗体。(参见，例如Cabilly等人，美国专利No.4,816,567；和Boss等人，美国专利No.4,816,397，其全文在此引作参考)。单链抗体具有一个抗原结合位点，并且由一种多肽组成。它们可以利用本领域公知的技术制备，例如利用Ladner等人的美国专利No.4,946,778(其全文在此引作参考)；Bird等人，(1988)Science 242423-426；Whitlow等人，(1991)Methodsin Enzymology 21-9；Whitlow等人，(1991)Methods in Enzymology297-105；和Huston等人，(1991)Methods in Enzymology MolecularDesign and ModelingConcepts and Applications 20346-88所述的方法制备。多特异性抗体是具有至少两个抗原结合位点的抗体分子，这些位点特异性可结合不同的抗原。这类分子可以利用本领域公知的技术制备，例如利用Segal的美国专利No.4,676,980(其全文在此引作参考)；Holliger等人，(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 906444-6448；Whitlow等人，(1994)Protein Eng.71017-1026和美国专利No.6,121,424所述的方法制备。
人源化抗体是这样的抗体分子其来自非人类物种，具有一个或多个来自非人类物种的互补决定区(CDR)和来自人免疫球蛋白分子的框架区。(参见，例如Queen，美国专利No.5,585,089，其全文在此引作参考)。人源化单克隆抗体可以利用本领域公知的重组DNA技术制备，例如采用PCT公布号WO 87/02671；欧洲专利申请184,187；欧洲专利申请171,496；欧洲专利中请173,494；PCT公布号WO 86/01533；美国专利No.4,816,567；欧洲专利申请125,023；Better等人(1988)Science 2401041-1043；Liu等人(1987)Proc.Natl.Acad.Sci.USA843439-3443；Liu等人(1987)J.Immunol.1393521-3526；Sun等人(1987)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 84214-218；Nishimura等人(1987)Cancer Res.47999-1005；Wood等人(1985)Nature 314446-449；Shaw等人(1988)J.Natl.Cancer Inst.801553-1559；Morrison(1985)Science2291202-1207；Oi等人(1986)Bio/Techniques 4214；美国专利5,225,539；Jones等人(1986)Nature 321552-525；Verhoeyan等人(1988)Science 2391534；和Beidler等人(1988)J.Immunol.1414053-4060中所述的方法制备。
更特别地，人源化抗体例如可以用转基因小鼠产生，该转基因小鼠不能表达内源免疫球蛋白重链和轻链基因，但是能够表达人重链和轻链基因。用选定的抗原，例如对应于本发明标志物的多肽的全部或一部分，按照正常方式免疫该转基因小鼠。可以用常规杂交瘤技术获得抗该抗原的单克隆抗体。转基因小鼠携带的人免疫球蛋白转基因在B细胞分化过程中重排，随后经历类别转换和体细胞突变。因此，采用该技术，能够产生在治疗上有用的IgG、IgA和IgE抗体。关于这种制备人抗体的技术的综述，参见Lonberg和Huszar(1995)Int.Rev.Immunol.1365-93。关于这种制备人抗体和人单克隆抗体的技术和制备该抗体的方案的详细记载，参见，例如美国专利5,625,126；美国专利5,633,425；美国专利5,569,825；美国专利5,661,016；和美国专利5,545,806。另外，诸如Abgenix，Inc.(Freemont，CA)等公司能够接受委托利用与上述类似的技术提供抗选定抗原的人抗体。
识别选定表位的完全人抗体可以利用一种被称为“指导选择”的技术来制备。在该方法中，利用选择的非人单克隆抗体，例如鼠抗体，指导对识别相同表位的完全人抗体的选择(Jespers等人，1994，Bio/technology 12899-903)。
本发明的抗体可以在(例如从受试者血液或血清中)产生或合成后分离，并进一步用众所周知的技术纯化。例如，IgG抗体可以利用蛋白A层析法纯化。本发明蛋白质的特异性抗体可以利用例如亲和层析法来选择或(例如部分纯化)或纯化。例如，重组表达并纯化的(或部分纯化的)本发明的蛋白质如此处所述制备，并且共价或非共价偶联到固体支持物，例如层析柱上。然后可以用该柱从含有抗大量不同表位的抗体的样品中亲和纯化本发明蛋白质的特异性抗体，从而产生基本纯化的抗体组合物，即基本不含污染抗体的组合物。基本纯化的抗体组合物在本文中是指抗体样品最多只含有30％(基于干重)抗本发明所需蛋白质表位之外的表位的污染抗体，该样品中优选最多20％，更优选最多10％，最优选最多5％(基于干重)是污染抗体。纯化的抗体组合物是指该组合物中至少99％的抗体是抗本发明所需蛋白质的抗体。
在一个优选实施方案中，基本纯化的本发明的抗体可以特异性结合本发明蛋白质的信号肽、分泌序列、胞外域、跨膜区或胞质域或细胞质膜。在一个特别优选的实施方案中，基本纯化的本发明的抗体特异性结合本发明蛋白质的氨基酸序列的分泌序列或胞外域。在一个更优选的实施方案中，基本纯化的本发明的抗体特异性结合标志物蛋白的氨基酸序列的分泌序列或胞外域。
可以通过标准技术，例如亲和层析或免疫沉淀法，利用抗本发明蛋白质的抗体分离该蛋白质。另外，也可以利用这种抗体检测(例如细胞裂解液或细胞上清液中的)标志物蛋白或其片段，从而评价该标志物的表达水平和模式。也可以在诊断上应用这些抗体来监测组织或体液(例如前列腺相关体液)中的蛋白质水平，作为临床检验程序的一部分，例如确定特定治疗方案的效果。利用包含偶联到可检测物质上的本发明抗体的抗体衍生物可有利于检测。可检测物质的例子包括各种酶、辅基、荧光物质、发光物质、生物发光物质和放射性物质。合适的酶的例子包括辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶、β-半乳糖苷酶或乙酰胆碱酯酶；合适的辅基复合物的例子包括链霉亲和素/生物素和亲和素/生物素；合适的荧光物质的例子包括伞形酮、荧光素、异硫氰酸荧光素、罗丹明、二氯三嗪胺荧光素、丹磺酰氯或藻红蛋白；发光物质的例子包括鲁米诺；生物发光物质的例子包括萤光素酶、萤光素和水母蛋白；合适的放射性物质的例子包括125I、131I、35S或3H。
本发明的抗体也可以用作治疗癌症的治疗剂。在一个优选实施方案中，本发明的完全人类抗体用于治疗人类癌症患者，特别是前列腺癌患者。在另一优选实施方案中，能与标志物蛋白或其片段特异性结合的抗体用于治疗。另外，这些治疗性抗体也可以是抗体衍生物或免疫毒素，其含有与治疗性部分如细胞毒素、治疗剂或放射性金属离子偶联的抗体。细胞毒素或细胞毒性剂包括对细胞有害的任何药剂。例子包括紫杉醇、松胞菌素B、短杆菌肽D、溴乙锭、依米丁、丝裂霉素、依托泊苷、鬼臼噻吩甙(tenoposide)、长春新碱、长春碱、秋水仙素、阿霉素、柔红霉素、二羟基炭疽菌素二酮、米托蒽醌、光辉霉素、放线菌素D、1-去氢睾酮、糖皮质激素类、普鲁卡因、丁卡因、利多卡因、普萘洛尔和嘌呤霉素及其类似物或同源物。治疗剂包括但不限于抗代谢物(例如，氨甲喋呤、6-巯基嘌呤、6-硫代鸟嘌呤、阿糖胞苷、5-氟尿嘧啶甲氮咪胺)、烷化剂(例如，氮芥，三胺硫磷(thioepa)、苯丁酸氮芥、苯丙氨酸氮芥、卡莫司汀(BSNU)和洛莫司汀(CCNU)、环磷酰胺、白消安、二溴甘露醇、链脲霉素、丝裂霉素C和顺-二氯二胺铂(II)(DDP)顺铂)、蒽环霉素类(例如柔红霉素(以前称为道诺霉素)和多柔比星)、抗生素(例如放线菌素D(以前称为放线菌素)、博来霉素、光辉霉素和安曲霉素(AMC))，和抗有丝分裂剂(例如长春新碱和长春碱)。
偶联的本发明的抗体可以用于改变特定生物学应答，对于药物部分而言，不应理解为限于经典的化学治疗剂。例如，药物部分可以是具有需要的生物活性的蛋白质或多肽。这样的蛋白质可包括，例如毒素，如核糖体抑制蛋白(参见Better等人的美国专利No.6,146,631，其公开内容在此全文引作参考)、相思豆毒蛋白、蓖麻毒蛋白A、假单胞菌外毒素或白喉毒素；蛋白质，如肿瘤坏死因子、α-干扰素、β-干扰素、神经生长因子、血小板衍生生长因子、组织纤维蛋白溶酶原激活剂；或生物反应调节剂，例如淋巴因子、白介素-1(″IL-1″)、白介素-2(″IL-2″)、白介素-6(″IL-6″)、粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(″GM-CSF″)、粒细胞集落刺激因子(″G-CSF″)或其他生长因子。
将治疗性部分与抗体进行偶联的技术众所周知，参见，例如Arnon等人，″Monoclonal Antibodies For Immunotargeting Of Drugs InCancer Therapy″(癌症治疗中用于药物免疫靶向的单克隆抗体)，inMonoclonal Antibodies And Cancer Therapy，Reisfeld等人(eds.)，pp.243-56(Alan R.Liss，Inc.1985)；Hellstrom等人，″Antibodies For DrugDelivery″(用于药物递送的抗体)，in Controlled Drug Delivery(2ndEd.)，Robinson等人(eds.)，pp.623-53(Marcel Dekker，Inc.1987)；Thorpe，″Antibody Carriers Of Cytotoxic Agents In Cancer TherapyAReview″(癌症治疗中细胞毒性剂的抗体载体综述)，in MonoclonalAntibodies′84Biological And Clinical Applications，Pinchera等人(eds.)，pp.475-506(1985)；″Analysis，Results，And Future ProspectiveOf The Therapeutic Use Of Radiolabeled Antibody In Cancer Therapy″(放射性标记抗体在癌症治疗中的治疗应用的分析、结果和前景)，inMonoclonal Antibodies For Cancer Detection And Therapy，Baldwin等人(eds.)，pp.303-16(Academic Press 1985)，和Thorpe等人，″ThePreparation And Cytotoxic Properties Of Antibody-Toxin Conjugates″(抗体-毒素偶联物的制备和细胞毒性性质)，Immunol.Rev.，62119-58(1982)。
因此，在一个方面，本发明提供基本纯化的抗体、抗体片段和衍生物，它们全都特异性结合本发明的蛋白质，优选标志物蛋白。在各个实施方案中，基本纯化的本发明的抗体或其片段或衍生物可以是人、非人、嵌合和/或人源化抗体。在另一个方面，本发明提供非人抗体、抗体片段和衍生物，它们全都特异性结合本发明的蛋白质，优选标志物蛋白。这样的非人抗体可以是山羊、小鼠、绵羊、马、鸡、兔或大鼠抗体。或者，本发明的非人抗体可以是嵌合和/或人源化抗体。另外，本发明的非人抗体可以是多克隆抗体或单克隆抗体。在又另一个方面，本发明提供单克隆抗体、抗体片段和衍生物，它们全都特异性结合本发明的蛋白质，优选标志物蛋白。该单克隆抗体可以是人、人源化、嵌合和/或非人抗体。
本发明也提供一种试剂盒，其包括与可检测物质偶联的本发明的抗体，和使用说明。本发明的再一方案是一种含有本发明的抗体的药物组合物。在一个实施方案中，药物组合物含有本发明的抗体和药学可接受的载体。
重组表达载体和宿主细胞本发明的另一方案涉及载体，优选表达载体，其含有编码标志物蛋白(或该蛋白的一部分)的核酸。此处使用的术语“载体”是指能够转运与之连接的另一种核酸的核酸分子。一种类型的载体是“质粒”，它是指可以向其中连接其他DNA片段的环状双链DNA环。另一种类型的载体是病毒载体，其中其他DNA片段可以连接到病毒基因组中。某些载体能够在引入它们的宿主细胞中自主复制(例如具有细菌复制起点的细菌载体和附加型哺乳动物载体)。其他载体(例如非附加型哺乳动物载体)在引入宿主细胞后整合到宿主细胞基因组中，从而与宿主基因组一起复制。而且，某些载体，即表达载体，能够引导与它们可操作连接的基因的表达。通常，在重组DNA技术中使用的表达载体常常为质粒形式(载体)。但是，本发明也包括行使同等功能的其他形式的表达载体，例如病毒载体(例如复制缺陷型逆转录病毒、腺病毒和腺伴随病毒)。
本发明的重组表达载体包含本发明的核酸，其形式适于在宿主细胞中表达该核酸。意思是重组表达载体包括一个或多个调节序列，该调节序列是根据用于表达的宿主细胞选择的，与将要表达的核酸序列可操作地连接。在重组表达载体内，“可操作地连接”是指目标核苷酸序列以允许该核苷酸序列(例如在体外转录/翻译系统中，或者当向宿主细胞中引入该载体时在宿主细胞中)表达的方式与调节序列连接。术语“调节序列”包括启动子、增强子和其他表达控制元件(例如聚腺苷酸化信号)。这些调节序列例如在Goeddel，Methods in EnzymologyGene Expression Technology vol.185，Academic Press，San Diego，CA(1991)中记载。调节序列包括引导核苷酸序列在多种类型宿主细胞中组成型表达的那些，和引导核苷酸序列只在特定宿主细胞中表达的那些(例如组织特异性调节序列)。本领域技术人员应当理解，表达载体的设计将取决于诸如将要转化的宿主细胞的选择、需要的蛋白质表达水平等因素。本发明的表达载体可以导入宿主细胞中，从而产生如本文所述的由核酸编码的蛋白质或肽，包括融合蛋白或肽。
本发明的重组表达载体可以设计用于标志物蛋白或其片段在原核(例如大肠杆菌)或真核细胞(例如昆虫细胞{利用杆状病毒表达载体}、酵母细胞或哺乳动物细胞)中的表达。合适的宿主细胞进一步记载在Goeddel，同上中。或者，重组表达载体也可以在体外转录和翻译，例如应用T7启动子调节序列和T7聚合酶。
蛋白质在原核生物中的表达最常使用含有引导融合或非融合蛋白表达的组成型或诱导型启动子的载体在大肠杆菌中进行。融合载体向本文所述编码的蛋白质中，通常向重组蛋白的氨基端添加许多氨基酸。该融合载体一般用于三个目的1)提高重组蛋白的表达；2)提高重组蛋白的可溶性；和3)通过在亲和纯化中作为配体来帮助重组蛋白的纯化。在融合表达载体中，通常在融合部分和重组蛋白的连接处引入一个蛋白水解切割位点，从而能够在融合蛋白纯化后将重组蛋白与融合部分分离。这样的酶，及其相应的识别序列，包括因子Xa、凝血酶和肠激酶。典型的融合表达载体包括pGEX(Pharmacia BiotechInc；Smith和Johnson，1988，Gene 6731-40)、pMAL(New EnglandBiolabs，Beverly，MA)和pRIT5(Pharmacia，Piscataway，NJ)，它们分别将谷胱甘肽S-转移酶(GST)、麦芽糖E结合蛋白或蛋白A与靶重组蛋白相融合。
合适的诱导型非融合大肠杆菌表达载体的例子包括pTrc(Amann等人，1988，Gene 69301-315)和pET 11d(Studier等人，p.60-89，InGene Expression TechnologyMethods in Enzymology vol.185，AcademicPress，San Diego，CA，1991)。由pTrc载体表达靶基因依赖于从杂合trp-lac融合启动子开始的宿主RNA聚合酶转录。由pET 11d载体表达靶基因依赖于由共表达的病毒RNA聚合酶(T7gn1)介导的从T7gn10-lac融合启动子开始的转录。该病毒聚合酶由宿主株BL21(DE3)或HMS174(DE3)从驻留的原噬菌体提供，该原噬菌体携带处于lacUV5启动子转录控制下的T7gnl基因。
一种使重组蛋白在大肠杆菌中的表达最大化的策略是在蛋白水解该重组蛋白能力受损的宿主细菌中表达该蛋白质(Gottesman，p.119-128，In Gene Expression TechnologyMethods in Enzymology vol.185，Academic Press，San Diego，CA，1990)。另一种策略是改变将要插入到表达载体内的核酸的核酸序列，使每个氨基酸的各个密码子是大肠杆菌偏好使用的(Wada等人，1992，Nucleic Acids Res.202111-2118)。本发明的核酸序列的这种改变可以采用标准DNA合成技术进行。
在另一个实施方案中，表达载体是酵母表达载体。用于在酿酒酵母(S.cerevisiae)中表达的载体的例子包括pYepSec1(Baldari等人，1987，EMBO J. 6229-234)、pMFa(Kurjan和Herskowitz，1982，Cell30933-943)、pJRY88(Schultz等人，1987，Gene 54113-123)、pYES2(Invitrogen Corporation，San Diego，CA)和pPicZ(Invitrogen Corp，SanDiego，CA)。
或者，表达载体是杆状病毒表达载体。可以获得的用于在培养的昆虫细胞(例如Sf9细胞)中表达蛋白质的杆状病毒载体包括pAc系列(Smith等人，1983，Mol.Cell Biol.32156-2165)和pVL系列(Lucklow和Summers，1989，Virology 17031-39)。
在另一个实施方案中，使用哺乳动物表达载体在哺乳动物细胞中表达本发明的核酸。哺乳动物表达载体的例子包括pCDM8(Seed，1987，Nature 329840)和pMT2PC(Kaufman等人，1987，EMBO J.6187-195)。当在哺乳动物细胞中使用时，表达载体的控制功能通常由病毒调节元件提供。例如，常用的启动子来源于多瘤、腺病毒2、巨细胞病毒和猿猴病毒40。关于用于原核和真核细胞的其他合适的表达系统，见Sambrook等人，同上的第16、17章。
在另一个实施方案中，重组哺乳动物表达载体能够引导核酸优先在特定细胞型中表达(例如利用组织特异性调节元件表达核酸)。组织特异性调节元件在本领域中公知。合适的组织特异性启动子的例子包括但不限于白蛋白启动子(肝特异性的；Pinkert等人，1987，GenesDev.1268-277)，淋巴特异性启动子(Calame和Eaton，1988，Adv.Immuno l.43235-275)，特别是T细胞受体的启动子(Winoto和Baltimore，1989，EMBO J.8729-733)和免疫球蛋白的启动子(Banerji等人，1983，Cell33729-740；Queen和Baltimore，1983，Cell33741-748)，神经元特异性启动子(例如神经丝启动子；Byrne和Ruddle，1989，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 865473-5477)，胰特异性启动子(Edlund等人，1985，Science 230912-916)，和乳腺特异性启动子(例如乳清启动子；美国专利No.4,873,316和欧洲申请公布号264,166)。也包括发育调节的启动子，例如鼠hox启动子(Kessel和Gruss，1990，Science 249374-379)和甲胎蛋白启动子(Camper和Tilghman，1989，Genes Dev.3537-546)。
本发明还提供一种重组表达载体，其包含以反义方向克隆到该表达载体内的本发明的DNA分子。即，该DNA分子与调节序列可操作地连接，其连接方式允许相对于编码本发明多肽的mRNA而言为反义的RNA分子表达(通过DNA分子的转录)。可以选择以反义方向与克隆的核酸可操作连接的调节序列，其引导反义RNA分子在多种细胞型中的连续表达，例如病毒启动子和/或增强子，或者可以选择引导反义RNA的组成型、组织特异性或细胞型特异性表达的调节序列。反义表达载体可以是重组质粒、噬菌粒或减毒病毒的形式，其中反义核酸在高效调节区控制下产生，其活性取决于该载体所导入的细胞型。关于使用反义基因调节基因表达的讨论，参见Weintraub等人，1986，Trends in Genetics，Vol.1(1)。
本发明的另一方面涉及已经导入本发明的重组表达载体的宿主细胞。术语“宿主细胞”和“重组宿主细胞”在此可交换使用。应当理解，这些术语不仅指特定受试细胞，而且指该细胞的后代或可能的后代。由于突变或环境的影响在连续几代中可能发生某些变化，因此这些后代实际上可能与母细胞不同，但是仍然包括在此处所用术语的范围内。
宿主细胞可以是任何原核(例如大肠杆菌)或真核细胞(例如昆虫细胞、酵母或哺乳动物细胞)。
可以通过常规转化或转染技术将载体DNA导入原核或真核细胞中。此处使用的术语“转化”和“转染”是指多种本领域公知的向宿主细胞中引入外源核酸的技术，包括磷酸钙或氯化钙共沉淀、DEAE-葡聚糖-介导的转染、脂转染或电穿孔。用于转化或转染宿主细胞的合适的方法可见Sambrook，等人(同上)和其他实验室手册。
对于哺乳动物细胞的稳定转染，众所周知，根据使用的表达载体和转染技术，只有少部分细胞可以将外源DNA整合到其基因组中。为了鉴定和选择这些整合体，通常与目标基因一起向宿主细胞中引入编码选择性标记(例如抗生素抗性)的基因。优选的选择性标记包括提供药物抗性，例如G418、潮霉素和氨甲喋呤抗性的标记。用引入的核酸稳定转染的细胞可以通过药物筛选来鉴定(例如，已引入选择性标记的细胞将存活，而其他细胞将死亡)。
本发明的宿主细胞，如培养的原核或真核宿主细胞，可以用来产生标志物蛋白或其片段。因此，本发明进一步提供利用本发明的宿主细胞产生标志物蛋白或其片段的方法。在一个实施方案中，该方法包括在适当的培养基中培养本发明的宿主细胞(其中已经引入了编码标志物蛋白或其片段的重组表达载体)，从而使其产生。在另一个实施方案中，该方法进一步包括从培养基或宿主细胞中分离该标志物蛋白或其片段。
也可以利用本发明的宿主细胞产生非人转基因动物。例如，在一个实施方案中，本发明的宿主细胞是已经引入编码标志物蛋白或其片段的序列的受精卵母细胞或胚胎干细胞。然后可以用该宿主细胞产生已经向其基因组中导入编码本发明标志物蛋白的外源序列的非人转基因动物，或编码标志物蛋白的内源基因已经改变的同源重组动物。这些动物可用于研究该标志物蛋白的功能和/或活性，以及鉴定和/或评价该标志物蛋白的调节剂。此处使用的“转基因动物”是非人动物，优选哺乳动物，更优选啮齿类动物，如大鼠或小鼠，其中该动物的一个或多个细胞包含转基因。转基因动物的其他例子包括非人灵长类动物、绵羊、狗、牛、山羊、鸡、两栖动物等。转基因是这样的外源DNA，其整合到将发育为转基因动物的细胞的基因组内，并且保留在成熟动物的基因组内，从而引导在该转基因动物的一种或多种细胞型或组织中表达编码的基因产物。此处使用的“同源重组动物”是非人类动物，优选哺乳动物，更优选小鼠，其中在发育为动物之前，通过内源基因与引入动物细胞例如动物胚胎细胞内的外源DNA分子之间的同源重组，该内源基因已经改变。
本发明的转基因动物可以如下产生例如通过显微注射、逆转录病毒感染将编码标志物蛋白的核酸导入受精卵母细胞的雄性原核内，并且使该卵母细胞在假孕雌性代孕动物中发育。内含子序列和聚腺苷酸化信号也可以包含在转基因中来提高转基因的表达效率。组织特异性调节序列可以与转基因可操作连接，以使本发明多肽的表达针对特定细胞。通过胚胎操作和显微注射产生转基因动物，特别是如小鼠等动物的方法在本领域中已经成为常规，例如在美国专利No.4,736,866和4,870,009，美国专利No.4,873,191和Hogan，Manipulating theMouse Embryo，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold SpringHarbor，N.Y.，1986中描述。类似的方法用于其他转基因动物的产生。可以根据转基因在其基因组中的存在和/或编码转基因的mRNA在动物组织或细胞中的表达来鉴定转基因起始(founder)动物。然后可以用转基因起始动物繁殖携带该转基因的其他动物。另外，携带该转基因的转基因动物可以进一步与携带其他转基因的其他转基因动物繁殖。
为了产生同源重组动物，制备一种载体，该载体含有编码标志物蛋白的基因的至少一部分，其中已经引入了缺失、添加或置换，从而改变，例如功能破坏了该基因。在一个优选实施方案中，该载体被设计为内源基因在同源重组后被功能破坏(即不再编码功能蛋白质；也被称为“敲除”载体)。或者，该载体也可以被设计为内源基因在同源重组后突变或者以其他方式改变，但是仍然编码功能蛋白质(例如可以改变上游调节区，从而改变内源蛋白质的表达)。在该同源重组载体中，改变的基因部分在5′端和3′端之侧为该基因的其他核酸，允许在该载体携带的外源基因与胚胎干细胞中的内源基因之间发生同源重组。其他侧翼核酸序列的长度足以成功地与内源基因同源重组。载体中一般包含几千个碱基的侧翼DNA(在5′端和3′端)(关于同源重组载体的描述，参见，例如，Thomas和Capecchi，1987，Cell 51503)。将该载体导入胚胎干细胞系中(例如通过电穿孔)，选择被导入的基因已经与内源基因同源重组的细胞(参见，例如Li等人，1992，Cell69915)。然后将选择的细胞注射到动物(例如小鼠)的胚囊中，形成聚集嵌合体(参见，例如Bradley，Teratocarcinomas and EmbryonicStem CellsA Practical Approach，Robertson，Ed.，IRL，Oxford，1987，pp.113-152)。然后可以将嵌合胚植入合适的假孕雌性代孕动物中，使胚胎发育。在生殖细胞中携带同源重组的DNA的后代可以用来繁殖动物，其中通过转基因的种系传递，动物的所有细胞都含有同源重组的DNA。构建同源重组载体和同源重组动物的方法在Bradley(1991)Current Opinion in Bio/Technology 2823-829和PCT公布号WO90/11354、WO 91/01140、WO 92/0968和WO 93/04169中记载。
在另一个实施方案中，可以产生转基因非人动物，其含有选择的允许调节转基因表达的系统。该系统的一个例子是噬菌体P1的cre/loxP重组酶系统。关于cre/loxP重组酶系统的描述，参见，例如Lakso等人(1992)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 896232-6236。重组酶系统的另一个例子是酿酒酵母FLP重组酶系统(O′Gorman等人，1991，Science 2511351-1355)。如果利用cre/loxP重组酶系统调节转基因的表达，则需要含有编码Cre重组酶和选定蛋白质这两者的转基因的动物。可以通过构建“双”转基因动物提供这样的动物，例如通过使两个转基因动物交配，其中一个含有编码选定蛋白质的转基因，另一个含有编码重组酶的转基因。
本文所述的非人转基因动物的克隆也可以按照Wilmut等人(1997)Nature 385810-813和PCT公布号WO 97/07668和WO 97/07669所述的方法产生。
药物组合物本发明的核酸分子、多肽和抗体(在此也被称为“活性化合物”)可以掺入适于施用的药物组合物中。该组合物一般含有核酸分子、蛋白质或抗体和药学可接受的载体。此处使用的短语“药学可接受的载体”包括与给药相容的任何和所有溶剂、分散介质、包衣、抗细菌剂和抗真菌剂、等渗剂和吸收延迟剂，等等。这些介质和药剂用于药学活性物质的用途在本领域公知。除非任一常规介质或药剂与活性化合物不相容，涉及其在组合物中的应用。也可以在组合物中掺入补充活性化合物。
本发明包括制备用于调节标志物核酸或蛋白的表达或活性的药物组合物的方法。该方法包括将药学可接受的载体与调节标志物核酸或蛋白的表达或活性的药剂进行配制。该组合物可进一步包含其他活性剂。因此，本发明进一步包括通过将药学可接受的载体与调节标志物核酸或蛋白的表达或活性的药剂和一种或多种其他活性化合物进行配制而制备药物组合物的方法。
本发明也提供用于鉴定调节剂，即候选或试验化合物或药剂(例如肽、拟肽、类肽、小分子或其他药物)的方法(在此也称为“筛选试验”)，所述调节剂(a)能与标志物结合，或者(b)对标志物的活性具有调节(例如刺激或抑制)作用，或者更特别地，(c)对标志物与一种或多种其天然底物(例如肽、蛋白质、激素、辅因子或核酸)的相互作用具有调节作用，或者(d)对标志物的表达具有调节作用。该试验一般包括标志物与一种或多种测定成分的反应。其他成分可以是试验化合物本身，或试验化合物与标志物的天然结合配偶体的组合。
本发明的试验化合物可以从任何可获得的来源中获得，包括天然和/或合成化合物的系统文库。试验化合物也可以利用本领域公知的任一种组合文库方法而获得，包括生物学文库；类肽文库(分子文库，该分子具有肽的功能，但是具有新的非肽骨架，其耐受酶的降解，但是仍然具有生物活性；参见，例如，Zuckermann等人，1994，J.Med.Chem.372678-85)；可空间定位的平行固相或溶液相文库；需要重叠合(deconvolution)的合成文库方法；“一珠一化合物”文库法；和采用亲和层析筛选的合成文库法。生物文库和类肽文库法仅限于肽库，而其他四种方法适于肽库、非肽寡聚体文库或小分子化合物文库(Lam，1997，Anticancer Drug Des.12145)。
用于合成分子文库的方法的例子在本领域中可见于，例如DeWitt等人(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.906909；Erb等人(1994)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 9111422；Zuckermann等人(1994).J.Med.Chem.372678；Cho等人(1993)Science 2611303；Carrell等人(1994)Angew.Chem.Int.Ed.Engl.332059；Carell等人(1994)Angew.Chem.Int.Ed.Engl.332061；和Gallop等人(1994)J.Med.Chem.371233。
化合物文库可以存在于溶液中(例如Houghten，1992，Biotechniques 13412-421)或珠(Lam，1991，Nature 35482-84)、芯片(Fodor，1993，Nature 364555-556)、细菌和/或孢子(Ladner，USP5,223,409)、质粒(Cull等人，1992，Proc Natl Acad Sci USA 891865-1869)或噬菌体(Scott和Smith，1990，Science 249386-390；Devlin，1990，Science 249404-406；Cwirla等人，1990，Proc.Natl.Acad.Sci.876378-6382；Felici，1991，J.Mol.Biol.222301-310；Ladner，同上)上。
在一个实施方案中，本发明提供用于筛选候选或试验化合物的试验，该化合物是一种标志物或其生物活性部分所编码的或对应的蛋白质的底物。在另一个实施方案中，本发明提供用于筛选候选或试验化合物的试验，该化合物与一种标志物或其生物活性部分所编码的或对应的蛋白质结合。确定试验化合物直接结合一种蛋白质的能力可以如下实现，例如，通过将该化合物与放射性同位素或酶标记物偶联，使该化合物与标志物的结合可以通过检测复合物中的标记的标志物化合物来测定。例如，化合物(例如标志物底物)可以用125I、35S、14C或3H直接或间接标记，通过直接计数放射性发射或通过闪烁计数来检测放射性同位素。或者，测定成分可以用例如辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶或萤光素酶进行酶标记，通过测定适当底物向产物的转化检测酶标记。
在另一个实施方案中，本发明提供用于筛选候选或试验化合物的试验，该化合物调节标志物的表达或标志物或其生物活性部分所编码的或对应的蛋白质的活性。在所有的可能性中，该标志物所编码的或对应的蛋白质能够在体内与一种或多种分子相互作用，这些分子例如但不限于肽、蛋白质、激素、辅因子和核酸。为进行描述，这些细胞和细胞外分子在此被称为“结合配偶体”或标志物“底物”。
为了有利于这种筛选，本发明的一个必要的实施方案是使用标志物所编码的或对应的蛋白质鉴定蛋白质的天然体内结合配偶体。实现这一点可使用本领域技术人员公知的多种方法。一个例子是在双杂交试验或三杂交试验中使用标志物蛋白作为“饵蛋白”(参见，例如，美国专利No.5,283,317；Zervos等人，1993，Cell 72223-232；Madura等人，1993，J.Biol.Chem.26812046-12054；Bartel等人，1993，Biotechniques14920-924；Iwabuchi等人，1993 Oncogene 81693-1696；BrentWO94/10300)，以鉴定与该标志物结合或相互作用(结合配偶体)，因此可能与该标志物的天然功能有关的其他蛋白质。该标志物结合配偶体也可能参与通过标志物蛋白或标志物蛋白介导的信号传导途径的下游元件的信号传送。此外也可能发现该标志物蛋白结合配偶体是标志物蛋白的抑制剂。
双杂交系统基于大多数转录因子的模块性质，由可分开的DNA结合域和活化域组成。简而言之，该试验使用两种不同的DNA构建体。在一种构建体中，编码标志物蛋白的基因与编码已知转录因子(例如GAL-4)的DNA结合域的基因融合。在另一构建体中，来自DNA序列文库的编码未确定蛋白质(“猎物”或“样品”)的DNA序列与编码已知转录因子活化域的基因融合。如果“诱饵”和“猎物”蛋白能够在体内相互作用，形成依赖于标志物的复合物，则该转录因子的DNA结合域和活化域紧密接近。这种接近性允许与转录因子反应性的转录调节位点可操作连接的报道基因(例如LacZ)转录。报道基因的表达能够容易地检测，含有功能转录因子的细胞集落能够分离，并且用来获得编码与标志物蛋白相互作用的蛋白质的克隆基因。
在另一个实施方案中，可以利用本发明设计试验，用于鉴定调节(例如正或负影响)标志物蛋白与其底物和/或结合配偶体之间相互作用的化合物。这样的化合物包括但不限于诸如抗体、肽、激素、寡核苷酸、核酸及其类似物的分子。这样的化合物也可以从任何可获得的来源获得，包括天然和/或合成化合物的系统文库。用于该实施方案的优选试验成分是此处鉴定的前列腺癌标志物蛋白，其已知的结合配偶体和/或底物，和试验化合物。试验化合物可以来自任何来源。
用来鉴定干扰标志物蛋白与其结合配偶体之间相互作用的化合物的试验系统的基本原则包括在足以使两种产物相互作用和结合的条件下及时间里制备含有该标志物蛋白及其结合配偶体的反应混合物，从而形成复合物。为了检测药剂的抑制活性，在存在及不存在试验化合物的情况下制备反应混合物。试验化合物可以在开始时即包含在反应混合物中，或者可以在添加标志物蛋白及其结合配偶体之后加入。对照反应混合物不含试验化合物或者与安慰剂一起温育。然后检测标志物蛋白与其结合配偶体之间任何复合物的形成。若在对照反应中形成复合物，但在含有试验化合物的反应混合物中不形成或者形成很少，则表明该化合物干扰标志物蛋白与其结合配偶体的相互作用。相反，若在化合物存在下比在对照反应中形成更多复合物，则表明该化合物可增强标志物蛋白与其结合配偶体的相互作用。
对干扰标志物蛋白与其结合配偶体相互作用的化合物的测定可以以非均相或均相形式进行。非均相测定包括将标志物蛋白或其结合配偶体锚定在固相上，在反应结束时检测锚定在固相上的复合物。在均相测定中，整个反应都在液相中进行。在每一种方法中，为了获得关于所测化合物的不同信息，反应物的添加顺序可以不同。例如，通过在试验物质的存在下进行反应，即通过在标志物及其反应性结合配偶体之前或同时将试验物质加入反应混合物中，来鉴定干扰(例如通过竞争)标志物蛋白与其结合配偶体的相互作用的试验化合物。或者，可以通过在形成复合物之后将试验化合物加入反应混合物中，来检测破坏预先形成的复合物的试验化合物，例如具有替换复合物中一种成分的较高结合常数的化合物。各种形式在下面简述。
在一种非均相测定系统中，标志物蛋白或其结合配偶体锚定于固体表面或基质上，而另一相应的非锚定成分可以被直接或间接标记。在实际中，该方法通常使用微量滴定板。可以利用许多方法非共价或共价固定锚定的物质，这些方法一般是实施该技术的人员所公知的。非共价连接通常可以通过用标志物蛋白或其结合配偶体的溶液包被固体表面并且干燥而简单地实现。另外，对于将要锚定的测定成分特异性的固定抗体也可以用于该目的。所述表面通常可以提前准备并贮存起来。
在相关实施方案中，提供一种融合蛋白，该融合蛋白增加了允许一种或两种测定成分锚定在基质上的结构域。例如，谷胱甘肽-S-转移酶/标志物融合蛋白或谷胱甘肽-S-转移酶/结合配偶体可以吸附到谷胱甘肽sepharose珠(Sigma Chemical，St.Louis，MO)或谷胱甘肽衍化的微量滴定板上，然后与试验化合物，或者与试验化合物和未吸附的标志物或其结合配偶体组合，该混合物在有利于复合物形成的条件(例如生理条件)下温育。温育后，洗涤珠或微量滴定板的孔，除去任何未结合的测定成分，直接或间接评估固定的复合物，例如如上所述。或者，复合物也可以从基质上解离下来，并用标准技术测定标志物的结合或活性水平。
在本发明的筛选试验中也可以使用其他用于将蛋白质固定在基质上的技术。例如，标志物蛋白或标志物蛋白结合配偶体可以利用生物素和链霉亲和素的偶联来固定。生物素化标志物蛋白或靶分子可以利用本领域公知的技术(例如生物素化试剂盒，Pierce Chemicals，Rockford，IL)由生物素-NHS(N-羟基-琥珀酰亚胺)制备，并且固定在链霉亲和素包被的96孔板(Pierce Chemical)的孔中。在一些实施方案中，蛋白质固定的表面可以提前准备并贮存起来。
为了进行该试验，使固定的测定成分的相应配偶体在含有或不含试验化合物的情况下暴露于包被的表面。反应结束后，除去(例如通过洗涤)未反应的测定成分，而形成的任何复合物仍将固定在固体表面上。锚定在固体表面上的复合物的检测可以用多种方法来完成。当预先标记未固定的成分时，检测到固定于表面上的标记则表明形成了复合物。当未固定的成分未预先标记时，可以利用间接标记检测锚定在该表面上的复合物；例如，使用对于开始时未固定的物质具有特异性的标记抗体(该抗体可以直接标记或者利用例如标记的抗Ig抗体间接标记)。根据反应成分的添加顺序，可以检测调节(抑制或增强)复合物的形成或破坏预先形成的复合物的试验化合物。
在本发明的一个替代实施方案中，可以采用均相测定。这一般是同以上所述类似的反应，其在存在或不存在试验化合物的液相中进行。然后将形成的复合物与未反应的成分分离，测定形成的复合物的量。如非均相测定系统所述，向液相中添加反应物的顺序可以获得关于哪种试验化合物调节(抑制或增强)复合物的形成以及哪种破坏预先形成的复合物的信息。
在这样的均相测定中，可以利用大量标准技术之一将反应产物与未反应的测定成分分离，这些技术包括但不限于差速离心、层析法、电泳和免疫沉淀。在差速离心中，由于复合物根据其大小和密度不同而具有不同的沉降平衡，因此通过一系列离心步骤，分子的复合物可以与未复合的分子分离(参见，例如Rivas，G.和Minton，A.P.，Trends Biochem Sci 1993 Aug；18(8)284-7)。也可以利用标准层析技术将复合的分子与未复合的分子分离。例如，凝胶过滤层析利用适当的凝胶过滤树脂以柱的形式基于大小分离分子，例如相对较大的复合物可以与相对较小的未复合的成分分离。类似地，可以利用复合物与未复合分子相比相对不同的电荷性质将该复合物与剩余的各种反应物差异分离，例如，使用离子交换层析树脂。这些树脂和层析技术是本领域技术人员公知的(参见，例如，Heegaard，1998，J Mol.Recognit.11141-148；Hage和Tweed，1997，J. Chromatogr.B.Biomed.Sci.Appl.，699499-525)。也可以利用凝胶电泳将复合的分子与未结合的分子分离(参见，例如，Ausubel等人(编)，Current Protocols in MolecularBiology，J.Wiley & Sons，New York.1999)。在该技术中，例如根据大小或电荷分离蛋白质或核酸复合物。为了在电泳过程中保持结合相互作用，通常优选不含还原剂的非变性凝胶，但是适合特定相互作用物的条件是本领域技术人员公知的。免疫沉淀法是用于从溶液中分离蛋白质-蛋白质复合物的另一种常用技术(参见，例如，Ausubel等人(eds.)，InCurrent Protocols in Molecular Biology，J.Wiley & Sons，NewYork.1999)。在该技术中，通过将一种结合分子的特异性抗体与易于离心收集的聚合物珠相偶联，从溶液中沉淀与该抗体结合的所有蛋白质。从珠上释放结合的测定成分(通过特异性蛋白质水解或本领域周知的不干扰复合物中蛋白质-蛋白质相互作用的其他技术)，进行第二个免疫沉淀步骤，这次使用对相应不同相互作用的测定成分具有特异性的抗体。这样，只有形成的复合物保持连接到珠上。可以比较在存在及不存在试验化合物条件下复合物形成的变化，从而提供关于该化合物调节标志物蛋白与其结合配偶体间相互作用的能力的信息。
本发明的范围内也包括不需进一步样品处理即在均相或非均相测定系统中直接检测标志物蛋白与其结合配偶体和/或试验化合物之间相互作用的方法。例如，可以采用荧光能量转移技术(参见，例如Lakowicz等人的美国专利No.5,631,169；Stavrianopoulos等人的美国专利No.4,868,103)。该技术通常包括在第一“供体”分子(例如标志物或试验化合物)上添加荧光团标记，使其发射的荧光能量被第二“受体”分子(例如标志物或试验化合物)上的荧光标记吸收，第二“受体”分子又由于吸收了能量而能够发荧光。或者，“供体”蛋白质分子可以只利用色氨酸残基的天然荧光能量。选择发出不同波长的光的标记，使“受体”分子标记可以与“供体”分子标记区别开来。由于标记之间的能量转移效率与分子间距有关，因此能够估测分子之间的空间关系。在分子之间发生结合的情况下，试验中“受体”分子标记的荧光发射应当最大。可以通过本领域公知的标准荧光检测手段(例如使用荧光计)常规测定FET结合事件。能增强或阻碍一种物质加入预先形成的复合物中的试验物质将导致产生不同于背景的信号。这样，可以用受控制的试验鉴定能调节标志物与其结合配偶体之间的相互作用的试验物质。
在另一个实施方案中，用一种方法鉴定标志物表达的调节剂，在该方法中，使细胞与一种候选化合物接触，并且测定细胞中标志物mRNA或蛋白质的表达。将在该候选化合物存在下标志物mRNA或蛋白质的表达水平与不存在该候选化合物条件下标志物mRNA或蛋白质的表达水平进行比较。然后可以基于这种比较将该候选化合物鉴定为标志物表达的调节剂。例如，当在该候选化合物存在下标志物mRNA或蛋白质的表达高于(统计学上显著性地高于)不存在该候选化合物的情况时，该候选化合物被鉴定为标志物mRNA或蛋白质表达的刺激剂。相反，当在该候选化合物存在下标志物mRNA或蛋白质的表达低于(统计学上显著性地低于)不存在该候选化合物的情况时，该候选化合物被鉴定为标志物mRNA或蛋白质表达的抑制剂。细胞中标志物mRNA或蛋白质的表达水平可以用此处所述的用于检测标志物mRNA或蛋白质的方法来测定。
在另一方面，本发明涉及两种或多种本文所述试验的组合。例如，可以利用基于细胞的试验或不含细胞的试验鉴定调节剂，并且调节剂调节标志物蛋白的活性的能力可以进一步在体内证实，例如在用于细胞转化和/或肿瘤发生的完整动物模型中证实。
本发明进一步涉及通过上述筛选试验鉴定的新药剂。因此，本发明的范围内包括在合适的动物模型中进一步使用如本文所述鉴定的药剂。例如，如此处所述鉴定的药剂(例如标志物调节剂，反义标志物核酸分子，标志物特异性抗体，或标志物结合配偶体)可以在动物模型中用来确定使用该药剂治疗的效果、毒性或副作用。另外，如此处所述鉴定的药剂也可以在动物模型中用于确定该药剂的作用机理。另外，本发明涉及通过上述筛选试验鉴定的新药剂用于此处所述治疗的用途。
应当理解，小分子药物和蛋白质或多肽剂的适当剂量取决于普通医生、兽医或研究人员所知的许多因素。例如，根据所治疗的受试者或样品的特性、大小和状况，如果可行，进一步根据组合物的施用途径，以及医生所希望的该药剂对本发明核酸或多肽的作用，这些药剂的剂量将会变化。小分子剂量的例子包括每千克受试者或样品重量毫克或微克的量(例如约每千克1微克至约每千克500毫克，约每千克100微克至约每千克5毫克，或者约每千克1微克至约每千克50微克)。蛋白质或多肽的剂量的例子包括每千克受试者或样品重量克、毫克或微克的量(例如约每千克1微克至约每千克5克，约每千克100微克至约每千克500毫克，或者约每千克1毫克至约每千克50毫克)。还应当理解，一种这样的药剂的适当剂量取决于该药剂与调节表达或活性有关的能力。这种适当的剂量可以用此处所述的试验来确定。当对动物(例如人)施用一种或多种这样的药剂，以调节本发明的多肽或核酸的表达或活性时，医生、兽医或研究人员可以，例如，先给出较低剂量的处方，然后再提高剂量，直到获得合适的应答。另外，应当理解，用于任何特定受试动物的特定剂量水平将取决于多种因素，包括所用特定药剂的活性，受试者的年龄、体重、一般健康情况、性别和饮食，给药时间，给药途径，排泄率，任何药物联用，以及要调节的表达或活性的程度。
本发明的药物组合物配制成与预期给药途径相适应的形式。给药途径的例子包括肠胃外给药，例如静脉、皮内、皮下、经口(例如吸入)、经皮(局部)、经粘膜和直肠给药。用于肠胃外、皮内或皮下施用的溶液或悬浮液可包括如下成分无菌稀释液，如注射用水、盐水溶液、非挥发油、聚乙二醇、甘油、丙二醇或其他合成溶剂；抗菌剂，如苯甲醇或对羟基苯甲酸甲酯；抗氧化剂，如抗坏血酸或亚硫酸氢钠；螯合剂，如乙二胺四乙酸；缓冲剂，如乙酸盐、柠檬酸盐或磷酸盐缓冲液，和用于调节张度的试剂，如氯化钠或葡萄糖。pH可以用酸或碱，如盐酸或氢氧化钠来调节。肠胃外制剂可以包封在由玻璃或塑料制成的安瓿、一次性注射器或多剂量瓶中。
适合注射使用的药物组合物包括无菌水溶液(水溶性时)或分散液，和用于即时配制无菌注射溶液或分散液的无菌粉末。对于静脉给药，合适的载体包括生理盐水、抑菌水、聚氧乙烯蓖麻油(Cremophor EL)(BASF；Parsippany，NJ)或磷酸盐缓冲液(PBS)。在所有情况下，组合物必须是无菌的，并且其流动性应当达到易于注射的程度。在生产和贮存条件下必须稳定，必须能够抵御微生物如细菌和真菌的污染作用。载体可以是溶剂或分散介质，其含有例如水、乙醇、多元醇(例如甘油、丙二醇和液体聚乙二醇等)及其适当的混合物。例如，通过使用包衣如卵磷脂，对于分散液的情况通过保持需要的颗粒大小，和通过使用表面活性剂，可以保持适当的流动性。微生物作用的防止可以用各种抗细菌剂和抗真菌剂来实现，例如对羟苯甲酸酯、三氯叔丁醇、苯酚、抗坏血酸、硫柳汞等。在许多情况下，组合物中优选包含等渗剂，例如糖、多元醇，如甘露醇、山梨醇，或氯化钠。注射组合物的延时吸收可以通过在该组合物中包含延迟吸收的药剂例如单硬脂酸铝和明胶来实现。
无菌注射溶液可以如下制备将活性化合物(例如多肽或抗体)以所需的量加入适当的溶剂中，需要时加入以上列举的一种成分或成分组合，接下来过滤除菌。分散液通常如下制备将活性化合物掺入含有基本分散介质的无菌载体中，然后掺入选自以上列举的所需的其他成分。对于用于制备无菌注射溶液的无菌粉末而言，优选的制备方法是真空干燥和冷冻干燥，该方法由预先无菌过滤的溶液产生活性成分加需要的任何其他成分的粉末。
口服组合物通常包含惰性稀释剂或可食用载体。它们可以包封在明胶胶囊中或者压制成片剂。为了治疗性口服给药，活性化合物可以与赋形剂掺合，并以片剂、糖锭或胶囊的形式使用。口服组合物也可以用一种流体载体制备用作漱口剂，其中该液体载体中的化合物经口施用、漱口(swish)和吐出或吞咽。
可以包含药学上相容的结合剂，和/或佐剂物质，作为组合物的一部分。片剂、丸剂、胶囊、糖锭等可以含有任何下列成分，或具有类似性质的化合物粘合剂，如微晶纤维素、西黄蓍胶或明胶；赋形剂，如淀粉或乳糖；崩解剂，如海藻酸、Primogel或玉米淀粉；润滑剂，如硬脂酸镁或Sterotes；助流剂，如二氧化硅胶体，甜味剂，如蔗糖或糖精；或调味剂，如薄荷、水杨酸甲酯或橙味调味剂。
为了通过吸入给药，化合物以喷雾剂的形式施用，该喷雾剂来自压力容器或含有适当的推进剂，例如气体，如二氧化碳的分液器或雾化器。
全身给药也可以通过经粘膜或经皮方式实现。为了经粘膜或经皮给药，在制剂中使用适合于所要渗透的障碍物的渗透剂。该渗透剂在本领域中公知，例如对于经粘膜给药而言，包括去污剂、胆汁盐和夫西地酸衍生物。经粘膜给药可以使用鼻腔喷剂或栓剂来实现。对于经皮给药而言，活性化合物配制成本领域公知的软膏、药膏、凝胶或乳膏。
该化合物也可以制备成用于直肠给药的栓剂(例如含有常规栓剂基质，如可可脂和其他甘油酯)或保留灌肠剂的形式。
在一个实施方案中，活性化合物用将保护化合物免遭机体快速清除的载体制备，例如控释制剂，包括埋植剂和微胶囊化的递送系统。可以使用生物可降解的、生物相容的聚合物，例如乙烯乙酸乙烯酯、聚酐、聚乙醇酸、胶原、 聚正酯和聚乳酸。制备这些制剂的方法对于本领域技术人员来说是显而易见的。这些材料也可以商业上从AlzaCorporation和Nova Pharmaceuticals，Inc.获得。脂质体悬浮液(包括向其中或其上掺入单克隆抗体的脂质体)也可以用作药学可接受的载体。它们可以按照本领域技术人员公知的方法制备，例如美国专利No.4,522,811所述。
特别有利的是以剂量单位形式配制口服或肠胃外组合物，以利于给药和剂量的均匀性。此处使用的剂量单位形式是指适于作为单一剂量用于所治疗的受试者的物理上分散的单位；每单位含有预定量的活性化合物，该预定量是计算出能与需要的药物载体相结合产生理想的疗效的量。本发明的剂量单位形式的规格直接取决于活性化合物的独特性质和所要达到的特定疗效，以及在制备用于个体治疗的活性化合物的技术中固有的限制。
对于抗体，优选剂量是0.1mg/kg至100mg/kg体重(通常10mg/kg至20mg/kg)。如果抗体在脑中起作用，50mg/kg至100mg/kg的剂量通常是合适的。一般来说，部分人抗体和完全人抗体在人体内比其他抗体具有更长的半衰期。因此，较低的剂量和较低频率的给药常常是可能的。可以利用诸如脂化的修饰来稳定抗体以及提高摄入和组织渗透(例如向前列腺上皮内渗透)。Cruikshank等人(1997)J.Acquired Immune Deficieny Syndromes and Human Retrovirology14193描述了一种脂化抗体的方法。
本发明也提供用于预防和/或治疗前列腺癌的疫苗组合物。本发明提供一种前列腺癌疫苗组合物，其中为了刺激针对前列腺癌的免疫应答，向受试者中导入表1中的标志物蛋白或表1的标志物蛋白的组合。本发明也提供一种前列腺癌疫苗组合物，其中向受试者中导入表达表1所列标志物或标志物片段的基因表达构建体，从而使受试者中被转染的细胞以高于正常的水平产生表1的标志物所编码的蛋白质或蛋白质片段，并且引发免疫应答。
在一个实施方案中，提供一种前列腺癌疫苗并将其作为用于预防前列腺癌的免疫治疗剂使用。在另一个实施方案中，提供一种前列腺癌疫苗并将其作为用于治疗前列腺癌的免疫治疗剂使用。
例如，一种由表1的标志物蛋白组成的前列腺癌疫苗可以通过经例如皮内、皮下或肌肉内的多种途径施用该疫苗用于预防和/或治疗受试者中的前列腺癌。另外，前列腺癌疫苗可以与佐剂和/或免疫调节剂一起施用，以加强疫苗的活性和受试者的应答。在一个实施方案中，可以将适合持续或间歇释放的含有该疫苗的装置和/或组合物植入体内，或者局部应用，以便相对较慢地向体内释放该物质。为了产生在消除癌症上将会更有效的应答，前列腺癌疫苗可以与能够改变所产生的免疫应答类型的免疫调节化合物一起引入。
在另一个实施方案中，通过注射到肌肉内，或者通过包衣到微粒上并且使用为将颗粒高速射入皮肤内而设计的装置，可以引入由表1中标志物的表达构建体组成的前列腺癌疫苗。受试者的细胞于是表达表1的标志物蛋白的蛋白质或片段，并且诱导免疫应答。另外，为了产生在消除癌症上将会更有效的应答，前列腺癌疫苗可以与免疫调节分子如细胞因子的表达构建体一起引入，该免疫调节分子可以增强免疫应答或调节所产生的免疫应答的类型。
标志物核酸分子可以插入载体中，并且用作基因治疗载体。基因治疗载体可以通过例如静脉注射、局部给药(美国专利5,328,470)或立体定向注射(参见，例如，Chen等人，1994，Proc.Natl.Acad.Sci.USA913054-3057)递送给受试者。基因治疗载体的药物制剂可包括在可接受的稀释剂中的基因治疗载体，或者可包含包埋有基因递送载体的缓释基质。或者，当能够从重组细胞中完整产生整个基因递送载体，例如逆转录病毒载体时，该药物制剂可包含一种或多种产生该基因递送系统的细胞。
药物组合物可以与使用说明一起包含在容器、包装或分配器中。
预测医学本发明涉及预测医学领域，其中诊断试验、预后试验、药物基因组学和监测临床试验用于预后(预测)目的，从而预防性地处置个体。因此，本发明的一个方案涉及一种诊断试验，其用于测定一种或多种标志物蛋白或核酸的表达水平，从而确定个体是否具有发展前列腺癌的危险。该试验可以用于预后或预测目的，从而在癌症发病之前预防性地处置个体。
本发明的另一个方案涉及在临床试验中监测药剂(例如为了抑制前列腺癌或治疗或预防其他任何疾病{即为了理解这种治疗可能具有的任何致前列腺癌作用}而施用的药物或其他化合物)对本发明标志物的表达或活性的影响。这些及其他药剂在以下部分中进一步详细描述。
诊断试验检测生物样品中是否存在标志物蛋白或核酸的方法的一个例子包括从受试者中获得生物样品(例如前列腺相关体液)，使该生物样品与能够检测该多肽或核酸(例如mRNA、基因组DNA或cDNA)的化合物或试剂接触。本发明的检测方法因此可以用于在体内及体外检测例如生物样品中的mRNA、蛋白质、cDNA或基因组DNA。例如，用于检测mRNA的体外技术包括Northern杂交和原位杂交。用于检测标志物蛋白的体外技术包括酶联免疫吸附测定(ELISA)、蛋白质印迹分析、免疫沉淀和免疫荧光法。用于检测基因组DNA的体外技术包括Southern杂交。用于检测mRNA的体内技术包括聚合酶链反应(PCR)、Northern杂交和原位杂交。此外，用于检测标志物蛋白的体内技术包括向受试者中导入抗该蛋白质或其片段的标记抗体。例如，抗体可以用一种放射性标记进行标记，该标记在受试者中的存在和定位可以通过标准成像技术来检测。
这些诊断和预后试验的一个共同原则包括制备可能含有标志物的样品或反应混合物，和探针，在适当的条件下和足够的时间里使标志物和探针相互作用及结合，从而在反应混合物中形成能够取出和/或检测的复合物。这些试验可以用多种方式进行。
例如，一种进行这种测定的方法包括将标志物或探针锚定在固相支持体上，该固相支持体也被称为基质，并且在反应结束时检测锚定在固相上的靶标志物/探针复合物。在这种方法的一个实施方案中，将要测定标志物的存在和/或浓度的来自受试者的样品可以锚定在载体或固相支持体上。在另一个实施方案中，可以是相反的情况，即其中探针可以锚定在固相上，而来自受试者的样品可以作为未锚定的测定成分进行反应。
有多种已建立的方法用于将测定成分锚定在固相上。包括但不限于通过生物素和链霉亲和素偶联而固定的标志物或探针分子。这些生物素化的测定成分可以利用本领域公知的方法(例如生物素化试剂盒，Pierce Chemicals，Rockford，IL)由生物素-NHS(N-羟基-琥珀酰亚胺)制备，并且固定在链霉亲和素包被的96孔板(Pierce Chemical)的孔中。在某些实施方案中，具有固定的测定成分的表面可以提前制备好并贮存起来。
用于这些试验的其他合适的载体或固相支持体包括能够与标志物或探针所属的分子类别结合的任何材料。众所周知的支持体或载体包括但不限于玻璃、聚苯乙烯、尼龙、聚丙烯、尼龙、聚乙烯、葡聚糖、淀粉酶、天然及改性纤维素、聚丙烯酰胺、辉长岩和磁铁矿石。
为了用上述方法进行试验，将未固定的成分加到上面锚定了第二成分的固相上。反应结束后，可以在使得形成的任何复合物将保持固定在固相上的条件下除去(例如通过洗涤)未复合的成分。锚定在固相上的标志物/探针复合物的检测可以用此处所述的许多方法进行。
在一个优选实施方案中，当探针是未锚定的测定成分时，可以为了检测和试验的读数目的而用此处所述的及本领域技术人员公知的可检测标记直接或间接标记该探针。
也可以直接检测标志物/探针复合物的形成，而无需进一步操作或标记每种成分(标志物或探针)，例如，利用荧光能量转移技术(参见，例如，Lakowicz等人的美国专利No.5,631,169；Stavrianopoulos等人的美国专利No.4,868,103)。选择第一“供体”分子上的荧光团标记，使其在用适当波长的入射光激发后，发射的荧光能量将被第二“受体”分子上的荧光标记吸收，第二“受体”分子由于吸收了能量又能够发出荧光。或者，“供体”蛋白质分子可以只利用色氨酸残基的天然荧光能量。选择发出不同波长的光的标记，使“受体”分子标记可以与“供体”分子标记区别开来。由于标记之间的能量转移效率与分子间距有关，因此能够估测分子之间的空间关系。在分子之间发生结合的情况下，试验中“受体”分子标记的荧光发射应当最大。可以通过本领域公知的标准荧光检测手段(例如使用荧光计)常规测定FET结合事件。
在另一个实施方案中，可以不标记每种测定成分(探针或标志物)，而利用诸如实时生物分子相互作用分析(BIA)(参见，例如，Sjolander，S.和Urbaniczky，C.，1991，Ahal.Chem.632338-2345，和Szabo等人，1995，Curr.Opin.Struct.Biol.5699-705)等技术来确定探针识别标志物的能力。如此处使用的“BIA”或“表面等离振子共振(surface plasmon resonance)”是用于实时研究生物特异性相互作用的技术，无需标记任何相互作用物(例如BIAcore)。结合表面的质量的改变(指示结合事件)导致靠近表面的光折射率改变(表面等离振子共振(SPR)的光学现象)，产生可检测的信号，该信号可以用作生物分子之间实时反应的指示。
此外，在另一个实施方案中，可以用标志物和探针作为液相中的溶质进行类似的诊断和预后试验。在这种试验中，利用许多标准技术中的任一种将复合的标志物和探针与未复合的成分分离开来，这些标准技术包括但不限于差速离心、层析、电泳和免疫沉淀。在差速离心中，由于复合物根据不同的大小和密度而有不同的沉降平衡，因此可以通过一系列离心步骤将标志物/探针复合物与未复合的测定成分分离开来(参见，例如，Rivas，G.和Minton，A.P.，1993，Trends BiochemSci.18(8)284-7)。标准层析技术也可以用来将复合的分子与未复合的分子分离开来。例如，凝胶过滤层析法通过以柱形式使用适当的凝胶过滤树脂基于大小分离分子，例如，相对较大的复合物可以与相对较小的未复合的成分相分离。类似地，可以利用标志物/探针复合物与未复合的成分相比相对不同的电荷性质来区别复合物与未复合的成分，例如通过使用离子交换层析树脂。这些树脂和层析技术是本领域技术人员公知的(参见，例如，Heegaard，N.H.，1998，J.Mol.Recognit.Winter 11(1-6)141-8；Hage，D.S.和Tweed，S.A.J Chromatogrr BBiomed Sci Appl 1997 Oct 10；699(1-2)499-525)。也可以利用凝胶过滤将复合的测定成分与未结合的成分分离(参见，例如Ausubel等人，ed.，Current Protocols in Molecular Biology，John Wiley & Sons，New York，1987-1999)。在该技术中，例如基于大小或电荷分离蛋白质或核酸复合物。为了在电泳过程中保持结合的相互作用，一般优选不含还原剂的非变性凝胶基质材料和条件。用于特定试验及其成分的适当条件是本领域技术人员公知的。
在一个特定实施方案中，可以使用本领域公知的方法通过原位和体外形式测定生物样品中标志物mRNA的水平。术语“生物样品”包括从受试者中分离的组织、细胞、生物液体及其分离物，以及存在于受试者体内的组织、细胞和液体。有许多表达检测方法使用分离的RNA。对于体外方法而言，任何不是针对分离mRNA而选择的RNA分离技术都可以用于从前列腺细胞中纯化RNA(参见，例如，Ausubel等人，ed.，Current Protocols in Molecular Biology，John Wiley& Sons，New York 1987-1999)。另外，能够用本领域技术人员公知的技术，例如Chomczynski(1989，美国专利No.4,843,155)的一步RNA分离法来容易地处理大量组织样品。
分离的mRNA可以在杂交或扩增试验中使用，这些试验包括但不限于Southern或Northern分析、聚合酶链反应分析和探针阵列。用于检测mRNA水平的一种优选诊断方法包括使分离的mRNA与一种核酸分子(探针)接触，该核酸分子能够与被检测的基因所编码的mRNA杂交。该核酸分子探针可以是，例如，全长cDNA或其部分，如长度为至少7、15、30、50、100、250或500个核苷酸且在严格条件下足以与编码本发明标志物的mRNA或基因组DNA特异性杂交的寡核苷酸。此处描述了其他适合在本发明的诊断试验中使用的探针。mRNA与探针杂交表明所述标志物得到表达。
在一种形式中，将mRNA固定在固体表面上，并且与探针接触，例如通过在琼脂糖凝胶上电泳分离的mRNA，并将mRNA从凝胶转移到诸如硝酸纤维素膜的膜上。在一种替代形式中，将探针固定在固体表面上，mRNA与例如Affymetrix基因芯片阵列中的探针接触。本领域技术人员能够容易地改变已知的mRNA检测方法，以用于检测本发明标志物编码的mRNA的水平。
测定样品中mRNA标志物水平的一种替代方法包括如下步骤核酸扩增，例如通过RT-PCR(Mullis，1987，美国专利No.4,683,202中所述的实验实施方案)，连接酶链反应(Barany，1991，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，88189-193)，自动维持序列扩增(Guatelli等人，1990，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 871874-1878)，转录扩增系统(Kwoh等人，1989，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 861173-1177)，Q-Beta复制酶(Lizardi等人，1988，Bio/Technology 61197)，滚环复制(Lizardi等人的美国专利No.5,854,033)，或其他任何核酸扩增方法，之后使用本领域技术人员公知的技术检测扩增的分子。这些检测方案尤其可用于检测以极低量存在的核酸分子。此处使用的扩增引物被定义为一对核酸分子，它可以与基因的5’或3’区退火(分别是正链和负链，或者相反)，并且在之间含有一个短区。通常，扩增引物的长度为约10到30个核苷酸，并且位于长度约50到200个核苷酸的区域之侧。在适当的条件下及使用适当的试剂，这些引物允许扩增包含侧翼为该引物的核苷酸序列的核酸分子。
对于原位方法而言，mRNA不需要在检测前从前列腺细胞中分离出来。在这些方法中，利用已知的组织学方法制备/处理细胞或组织样品。然后将样品固定于支持物上，一般是载玻片，然后使其接触能够与编码该标志物的mRNA杂交的探针。
作为根据标志物的绝对表达水平进行确定的替代方法，也可以根据标准化的标志物表达水平进行确定。通过将其表达与不是标志物的基因，例如组成型表达的管家基因的表达进行比较，修正标志物的绝对表达水平，将表达水平标准化。用于标准化的合适的基因包括管家基因，如肌动蛋白基因，或上皮细胞特异性的基因。这种标准化允许将一种样品例如患者样品中的表达水平与另一种样品例如非前列腺癌样品中的表达水平进行比较，或者在来自不同来源的样品之间进行比较。
另外，表达水平也可以作为相对表达水平来提供。为了确定标志物的相对表达水平，在测定所述样品的表达水平之前，测定正常细胞相对于癌细胞分离物的各10个或更多样品中，优选50个或更多样品中标志物的表达水平。确定在大量样品中测定的每种基因的平均表达水平，用其作为该标志物的基线表达水平。然后将测定的试验样品中标志物的表达水平(绝对表达水平)除以获得的该标志物的平均表达值。从而得到相对表达水平。
优选地，在基线测定中使用的样品来自于前列腺癌或来自于前列腺组织的非前列腺癌细胞。细胞来源的选择取决于相对表达水平的使用。利用在正常组织中发现的表达作为平均表达得分有助于确认测定的标志物是否是前列腺特异性的(相对于正常细胞)。另外，随着更多数据的积累，可以修正平均表达值，提供基于积累的数据修正的相对表达值。来自前列腺细胞的表达数据提供用于对前列腺癌状态的严重程度进行分级的手段。
在本发明的另一个实施方案中，检测标志物蛋白。用于检测本发明标志物蛋白的优选试剂是能够结合该蛋白质或其片段的抗体，优选具有可检测标记的抗体。抗体可以是多克隆抗体，或者更优选地，可以是单克隆抗体。可以使用完整的抗体，或其片段或衍生物(例如Fab或F(ab′)2)。术语“标记”用于探针或抗体时包括通过偶联(即物理连接)可检测物质与探针或抗体来直接标记探针或抗体，以及通过与直接标记的另一试剂反应来间接标记探针或抗体。间接标记的例子包括利用荧光标记的第二抗体检测第一抗体，以及用生物素末端标记DNA探针，使其能够用荧光标记的链霉亲和素检测。
来源于前列腺细胞的蛋白质可以用本领域公知的技术来分离。采用的蛋白质分离方法可以是，例如Harlow和Lane(Harlow和Lane，1988，AntibodiesA Laboratory Manual，Cold Spring Harbor LaboratoryPress，Cold Spring Harbor，New York)所述的方法。
可以利用多种形式确定一种样品是否含有能够结合特定抗体的蛋白质。这类形式的例子包括但不限于酶免疫测定(EIA)、放射免疫测定(RIA)、蛋白质印迹分析和酶联免疫吸附测定(ELISA)。本领域技术人员能够容易地修改已知的蛋白质/抗体检测方法，用于确定前列腺细胞是否表达本发明的标志物。
在一种形式中，抗体或抗体片段或衍生物可以在诸如蛋白质印迹或免疫荧光技术等方法中使用，用来检测表达的蛋白质。在这些应用中，通常优选将抗体或蛋白质固定在固体支持体上。合适的固相支持体或载体包括能够结合抗原或抗体的任何支持体。众所周知的支持体或载体包括玻璃、聚苯乙烯、聚丙烯、聚乙烯、葡聚糖、尼龙、淀粉酶、天然及改性纤维素、聚丙烯酰胺、辉长岩和磁铁矿石。
本领域技术人员应当知道许多其他的用于结合抗体或抗原的合适的载体，并且能够将这些支持体用于本发明。例如，从前列腺细胞中分离的蛋白质可以进行聚丙烯酰胺凝胶电泳，并固定在固相支持体如硝酸纤维素上。然后可以用适当的缓冲液洗涤该支持体，接着用可检测标记的抗体处理。然后可以用缓冲液第二次洗涤该固相支持体，以除去未结合的抗体。然后可以用常规方法检测该固相支持体上结合的标记的量。
本发明也包括用于检测生物样品中标志物蛋白或核酸的存在的试剂盒。该试剂盒能够用来确定受试者是否患有前列腺癌或者具有提高的发展前列腺癌的危险。例如，该试剂盒可包括能够检测生物样品中的标志物蛋白或核酸的标记化合物或试剂，以及用于确定样品中蛋白质或mRNA的量的工具(例如，能够结合该蛋白质或其片段的抗体，或能够结合编码该蛋白质的DNA或mRNA的寡核苷酸探针)。试剂盒也可包括用于说明使用该试剂盒获得的结果的说明书。
对于基于抗体的试剂盒，该试剂盒可包括，例如(1)能够结合标志物蛋白的第一抗体(例如连接到固体支持体上)；和任选地，(2)不同的第二抗体，其能够结合该蛋白质或第一抗体，并且与可检测标记偶联。
对于基于寡核苷酸的试剂盒，该试剂盒可包括，例如(1)寡核苷酸，例如可检测标记的寡核苷酸，它与编码标志物蛋白的核酸序列杂交，或(2)用于扩增标志物核酸分子的一对引物。该试剂盒也可包括，例如缓冲剂、防腐剂或蛋白质稳定剂。该试剂盒可进一步包括用于检测可检测标记所必需的成分(例如酶或底物)。该试剂盒也可含有可以测定并与受试样品进行比较的对照样品或一系列对照样品。该试剂盒的每种成分都可以包含在各自的容器内，所有各容器都可以与用于说明使用该试剂盒进行试验的结果的说明书一起置于一个包装内。
药物基因组学和药效学本发明的标志物也可用作药物基因组学标志物，这里所用的“药物基因组学标志物”指客观的生化标志物，其表达水平与患者的特定临床药物反应或易感性相关(参见，例如，McLeod等人(1999)Eur.J.Cancer 35(12)1650-1652)。药物基因组学标志物表达的存在或量与预测的患者，更具体地患者的肿瘤，对特定药物或药物种类治疗的反应有关。通过评估患者中的一个或多个药物基因组学标志物的表达的存在或量，可以选出最适合于该患者的或预计有更大成功程度的药物疗法。例如，根据患者中特定肿瘤标志物编码的RNA或蛋白质的存在或数量，可以选择最优化的用于治疗患者中可能存在的特定肿瘤的药物或疗程。因此应用药物基因组学标志物可以在不用尝试不同药物或方案的情况下，对每个癌症患者选择出或设计出最合适的疗法。
药物基因组学的另一方面涉及改变身体对药物的作用方式的遗传状况。这些药理遗传状况可以作为罕见的缺陷或作为多态性发生。例如，葡萄糖-6-磷酸脱氢酶(G6PD)缺陷是一种常见的遗传性酶病，其主要的临床并发症是摄入氧化剂药物(抗疟药、磺胺类药物、镇痛药、硝基呋喃类药物)及食用蚕豆后溶血。
作为一个说明性的实施方案，药物代谢酶的活性是药物作用强度和持续时间的一个主要决定因素。药物代谢酶(例如N-乙酰转移酶2(NAT2)和细胞色素P450酶CYP2D6和CYP2C19)的遗传多态性的发现已经对为什么一些患者无法获得预期的药物效果或者在使用标准且安全剂量的药物后显示过度的药物应答和严重的毒性提供了一种解释。这些多态性在人群中以两种表型表达，强代谢者(EM)和弱代谢者(PM)。PM的普遍程度在不同群体中不同。例如，编码CYP2D6的基因具有高度多态性，并且在PM中已经鉴定出几个突变，这些突变均导致功能性CYP2D6的缺乏。CYP2D6和CYP2C19的弱代谢者当接受标准剂量时非常经常地表现出过度的药物应答和副作用。如果代谢物是活性治疗性部分，则PM将不表现治疗响应，正如通过其CYP2D6-形成的代谢物吗啡介导的可待因的镇痛作用所证实的。另一极端情况是所谓的超快速代谢者，他们对标准剂量没有响应。最近，超快速代谢的分子基础已经被确定为是由于CYP2D6基因扩增。
因此，可以确定个体中本发明标志物的表达水平，从而选择用于治疗或预防性处理个体的合适的药物。另外，药物遗传学研究也能够用来将编码药物代谢酶的多态性等位基因的基因分型应用于鉴定个体的药物响应表型。当用本发明标志物的表达的调节剂处理受试者时，这些知识在用于选择剂量或药物时可以避免不良反应或治疗失败，因而提高了治疗或预防的效果。
本发明的标志物可以作为一种或多种紊乱或疾病状态或可导致疾病状态特别是前列腺癌的状况的替代标志物。此处使用的“替代标志物”是一种客观生化标志物，它与是否患有疾病或紊乱有关，或者与疾病或紊乱的进展有关(例如与肿瘤的存在与否有关)。该标志物的存在或量独立于疾病。因此，这些标志物可用来说明特定治疗过程是否可有效缓解疾病状态或紊乱。当疾病状态或紊乱的存在或程度难以用标准方法评估时(例如早期肿瘤)，或者当在达到可能危险的临床终点之前希望评价疾病进展时，替代标志物特别有用(例如，在心肌梗塞或完全发展的AIDS的不良临床结果之前，可以用胆固醇水平作为替代标志物进行心血管疾病的评价，以及可以用HIV RNA水平作为替代标志物进行HIV感染的分析)。本领域中替代标志物的应用的例子包括Koomen等人(2000)J.Mass.Spectrom.35258-264；和James(1994)AIDS Treatment News Archive 209。
本发明的标志物也可用作药效学标志物。此处使用的“药效学标志物”是与药物疗效特别相关的客观生物化学标志物。药效学标志物的存在或量与给药治疗的疾病状态或紊乱无关；因此，该标志物的存在或量指示该药物在受试者中的存在或活性。例如，药效学标志物可以指示药物在生物组织中的浓度，因为该标志物在该组织中表达或转录或不表达或不转录与药物水平有关。以这种方式，可以用药效学标志物监测药物的分布或摄取。同样，药效学标志物的存在或量可能与药物代谢产物的存在或量有关，因此标志物的存在或量表示药物在体内的相对分解率。药效学标志物尤其用于提高药物疗效检测的灵敏度，特别是在低剂量给药时。由于甚至少量药物也可能足以激活多轮标志物转录或表达，扩增的标志物的量可能比药物本身更容易检测到。另外由于标志物本身的性质，标志物也可能更容易检测；例如，使用此处所述的方法，可以在基于免疫的蛋白质标志物检测系统中使用抗体，或者可以利用标志物特异性的放射性标记探针检测mRNA标志物。而且，使用药效学标志物还可以允许基于机理地预测超出可直接观测范围以外的药物治疗引起的危险。本领域中药效学标志物的应用的例子包括Matsuda等人US 6,033,862；Hattis等人(1991)Env.Health Perspect.90229-238；Schentag(1999)Am.J Health-Syst.Pharm.56 Suppl.3S21-S24；和Nicolau(1999)Am，J Health-Syst.Pharm.56 Suppl.3S16-S20。
监测临床试验监测药剂(例如药物化合物)对本发明标志物的表达水平的影响不仅可以在基本药物筛选中使用，而且可以在临床试验中使用。例如，可以在接受前列腺癌治疗的受试者的临床试验中监测一种药剂影响标志物表达的有效性。在一个优选实施方案中，本发明提供一种监测用药剂(例如激动剂、拮抗剂、拟肽、蛋白质、肽、核酸、小分子或其他候选药物)治疗受试者的效果的方法，该方法包括如下步骤(i)在施用所述药剂前从受试者中获得给药前样品；(ii)检测给药前样品中一种或多种选择的本发明标志物的表达水平；(iii)从受试者获得一种或多种给药后样品；(iv)检测给药后样品中该标志物的表达水平；(v)将给药前样品中该标志物的表达水平与给药后样品中该标志物的表达水平进行比较；和(vi)相应地改变对受试者的给药。例如，治疗过程中标志物基因的表达提高可能表明剂量无效及需要提高剂量。相反，标志物基因的表达降低可能表明治疗有效，并且不需要改变剂量。
电子设备可读介质知阵引也提供了包含本发明标志物的电子设备可读介质。此处使用的“电子设备可读介质”是指用于存储、保存或容纳数据或信息的任何合适的介质，这些数据或信息可以被电子设备直接读取和访问。这类介质包括但不限于磁性存储介质，如软盘、硬盘存储介质和磁带；光存储介质，如光盘；电子存储介质，如RAM、ROM、EPROM、EEPROM等；普通硬盘，和这些种类的混合体，例如磁性/光存储介质。改变或构造该介质用于在上面记录本发明的标志物。
此处使用的术语“电子设备”包括为存储数据或信息而构造或改变的任何合适的计算或处理设备或其他装置。适合本发明使用的电子设备的例子包括单机计算设备；网络，包括局域网(LAN)、广域网(WAN)、互联网、内联网和外联网；电子用品，如个人数字助理(PDA)、移动电话、寻呼机等；以及本地的和分布式处理系统。
此处使用的“记录”是指在电子设备可读介质上存储或编码信息的过程。本领域技术人员可以容易地采用任何当前已知的方法在已知介质上记录信息，从而产生包含本发明标志物的产品。
有多种软件程序和格式可以用于在电子设备可读介质上存储本发明的标志物信息。例如，标志物核酸序列可以用字处理文本文件来表示，其格式为商业上可获得的软件如WordPerfect和MicroSoftWord，或者用ASCII文件的形式来表示，存储在数据库中，如DB2、Sybase、Oracle等，以及用其他形式。为了获得或产生上面记录着本发明标志物的介质，可以使用任意数量的数据处理器结构格式(例如文本文件或数据库)。
通过以可读形式提供本发明的标志物，人们能够为了多种目的常规获取标志物序列信息。例如，本领域技术人员可以使用可读形式的本发明的核苷酸或氨基酸序列，将靶序列或靶结构基序与存储在数据存储工具内的序列信息进行比较。利用检索工具鉴定与特定靶序列或靶基序匹配的本发明序列的片段或区域。
本发明因此提供一种保存运行一种方法的指令的介质，该方法用于确定受试者是否患有前列腺癌或者易患前列腺癌，其中该方法包括以下步骤确定标志物的存在与否，根据该标志物的存在与否确定受试者是否患有前列腺癌或易患前列腺癌，和/或推荐用于前列腺癌或前列腺癌前病变的具体治疗方法。
本发明进一步在电子系统和/或网络中提供一种确定受试者是否患有前列腺癌或者易患与一种标志物有关的前列腺癌的方法，其中该方法包括以下步骤确定标志物的存在与否，根据该标志物的存在与否确定受试者是否患有前列腺癌或易患前列腺癌，和/或推荐用于前列腺癌或前列腺癌前病变的具体治疗方法。该方法可以进一步包括以下步骤接受与该受试者有关的表型信息，和/或从网络上获取与该受试者有关的表型信息。
本发明也在网络上提供一种确定受试者是否患有前列腺癌或者易患与一种标志物有关的前列腺癌的方法，该方法包括以下步骤接受与该标志物有关的信息，接受与该受试者有关的表型信息，从网络上获取对应于该标志物和/或前列腺癌的信息，并且根据一种或多种表型信息、标志物和获得的信息，确定该受试者是否患有前列腺癌或易患前列腺癌。该方法可进一步包括推荐用于前列腺癌或前列腺癌前病变的具体治疗方法的步骤。
本发明也提供一种确定受试者是否患有前列腺癌或者易患前列腺癌的商业方法，该方法包括以下步骤接受与标志物有关的信息，接受与该受试者有关的表型信息，从网络上获取对应于该标志物和/或前列腺癌的信息，并且根据一种或多种表型信息、标志物和获得的信息，确定该受试者是否患有前列腺癌或易患前列腺癌。该方法可进一步包括推荐用于前列腺癌或前列腺癌前病变的具体治疗方法的步骤。
本发明也包括一种包含本发明标志物的阵列。该阵列可以用来在阵列中测定一个或多个基因的表达。在一个实施方案中，该阵列可以用来在阵列中测定组织中的基因表达，从而确定基因的组织特异性。利用这种方法，可以同时测定最多大约7600个基因的表达。这可以形成一个图谱，显示在一个或多个组织中特异性表达的一组基因。
除了这些定性检测以外，本发明还允许对基因表达定量。因此，不仅一组基因的组织特异性，而且其在组织中的表达水平，都可以确定。因此，可以根据其组织表达本身以及在该组织中的表达水平来对基因分组。例如，在确定组织之间基因表达的关系时，这是有用的。因此，可以干扰一种组织，而测定对第二组织中基因表达的影响。在本文中，可以测定一种细胞型响应生物学刺激对另一种细胞型的作用。这种测定例如可用于了解在基因表达水平上细胞-细胞相互作用的效应。如果治疗性地施用一种药剂来处理一种细胞型但是对另一种细胞型有不希望的作用，则本发明提供一种确定这种不希望的作用的分子基础的试验，从而提供同时施用对抗剂或者以其他方式处理这种不希望的作用的机会。同样，甚至在单细胞型内，也可以在分子水平上确定不希望的生物效应。因此，可以确定并抵消一种药剂对靶基因以外的基因表达的影响。
在另一个实施方案中，可以利用阵列监测一种或多种基因的表达的时程。这可以在如此处所述的各种生物事件中发生，例如，前列腺癌的发展，前列腺癌的进展，和过程，与前列腺癌有关的细胞转化。
所述阵列也可以用于确定一种基因的表达对同一细胞中或不同细胞中其他基因表达的影响。这提供了，例如，如果最终或下游靶标不能调节，则为治疗性干预选择替代分子靶标。
所述阵列也可用于确定一种或多种基因在正常和异常细胞中的不同表达模式。这提供了一组基因，它们能用作诊断或治疗性干预的分子靶标。
实验实施例1前列腺癌标志物的鉴定材料与方法RNA制备从来源于前列腺肿瘤标本、正常前列腺标本、非前列腺肿瘤标本和非前列腺正常标本的样品制备RNA。将冷冻的组织块切片，从样品中分离RNA。使用Trizol试剂(Invitrogen，San Diego，CA)从冷冻的组织中提取总RNA，然后用Qiagen’s RNeasy试剂盒进行第二次纯化步骤，以提高RNA探针的标记效率(Qiagen，Valencia CA)。该研究中只使用根据琼脂糖凝胶电泳后RNA的乙锭染色计算28S/18S核糖体RNA比值至少为1.0的RNA。
cDNA微阵列杂交在尼龙滤膜上形成含有来自Research Genetics(Hunstville，AL)的30,732个单基因克隆的cDNA微阵列。用总共4-6μg总RNA作为模板，使用33p-dCTP、oligo dT-30引物和Superscript II逆转录酶(LifeTechnologies)通过逆转录产生放射性标记的cDNA。为了减少非特异性杂交，33P-标记的第一链cDNA与cot-1 DNA和聚-dA 40-60(Pharmacia，Peapack，NJ)预退火。在65℃下每个滤膜与约6×106计数的标记探针在含7％十二烷基硫酸钠(SDS)、250mM Na3PO4(pH7.2)、1mM EDTA、0.5％酪蛋白-Hammerstein和0.1mg/ml变性鲑精DNA的缓冲液中杂交16小时。用4％和1％SDS洗涤缓冲液(20mMNa3PO4(pH 7.2)，1mM EDTA和4％或1％SDS)洗涤滤膜后，将其暴露于Fuji磷成像仪屏，并用Fuji扫描仪BAS 2500扫描。用Millennium Pharmaceuticals，Inc.开发的自动阵列分析程序Grid Guruvl.0对斑点进行定量。
标志物评分算法和数据分析为了修正杂交效率的差异，用滤膜上所有斑点的密度中位数标准化来自每个微阵列滤膜的数字化数据。进行基于阵列的和基于基因的分级群聚，并用Stanford’s基因簇和基因树显示软件显现出来。通过计算每个基因的标志物得分将差异表达的基因排序。
为了计算标志物得分，将样品分为对照组和试验组。标志物得分的起点是试验样品高于对照样品的平均倍数改变(比值)。得分设计为反映显示差异表达的试验样品的改变程度(表达比)和数量，而不是被具有极高数值的少部分试验样品所主导。为了减少这种“离群值”效应，将表达比高于10的基因处理为与表达比为10的基因没有实质不同。在得到检测样品间的平均倍数改变之前，用渐近压缩函数转化试验样品对照表达比，来实现标志物得分的这种理想的表现。当试验样品看起来没有比对照更高表达时，标志物得分的值为1，在其他情况下该值大于1。任何基因的标志物得分都不会超过10。
因此基因g的标志物得分Sg如下计算为各试验样品和对照水平的加权强度的比值的平均值Sg＝(∑Sgs)/N试验Sgs＝C(xgs/(k+xgQ))，其中Sgs代表基因g和样品s的标志物得分，C(r)r≥1时，是压缩函数C(r)＝A(1-e-r/A)，r＜1时C(r)＝1，A是倍数改变值上的上渐进数(我们使用10)，xgs是样品s上的基因g的表达值，xgQ是对照样品表达值的第Q百分位数；一般Q＝50，k是一个常数，其反映数据中的可加噪声，即重复测量中变异的固定成分。使用微阵列技术由校准实验得到的该参数的值为0.25。
N试验试验样品数。
利用定量PCR的基因表达分析通过TAQMAN_定量PCR(Applied Biosystems)测定从正常和患病(如癌)人组织样品制备的cDNA中的基因表达。简言之，按照厂商的说明书(Invitrogen)利用TRIZOL试剂，用单步提取法从患者样品制备总RNA。用DNase I(Ambion)在37℃下处理每个RNA制备物1小时。利用β2微球蛋白作为内部扩增对照，样品如果需要至少38个PCR扩增循环以达到荧光阈值水平(或18s核糖体基因进行35个PCR扩增循环)，则确定DNase I处理已完成。DNaseI处理后，通过琼脂糖凝胶电泳和溴化乙锭染色来确认RNA样品的完整性。用苯酚提取RNA后，根据厂商的说明书(AppliedBiosytems)利用Taqman逆转录试剂从样品中制备cDNA。未加逆转录酶的RNA阴性对照针对每个RNA样品进行模拟逆转录。
基于特定基因及其相关转录物的序列，用PrimerExPress软件(Applied Biosystems)设计探针。每个靶基因探针用FAM(6-羧基荧光素)标记，而18s参照探针用不同的荧光染料VIC来标记。因此靶基因和内部对照基因不一样的标记能使测定在同一个孔中进行。检测引物和探针对特定基因的每个转录物的灵敏度和特异性。把用于18s和靶基因的正向和反向引物和探针加入到TAQMAN_通用PCR主混合物(Applied Biosystems)中。尽管引物和探针的终浓度可能发生变化，但是每个在特定实验中都是内在一致的。对于18s，典型的实验包含100nM正向和反向引物加上200nM探针，对于靶基因，包含900nM正向和反向引物加上250nM探针。在ABI PRISM 7700型序列检测系统(Applied Biosystems)上进行TAQMAN_基质实验。热循环条件如下50℃下维持2分钟并在95℃下维持10分钟，接着进行两步PCR95℃下15秒，接着60℃下1分钟，40个循环。
应用以下方法定量计算相对于相同组织中的18s表达，各种组织中的基因表达。阈循环(Ct)值定义为检测到荧光有统计学显著增加的循环。较低的Ct值指示了较高的mRNA浓度。应用以下公式ΔCt＝Ct(靶转录物)-Ct(18s)，减去18s核糖体基因的Ct值获得ΔCt值，使基因的Ct值标准化。然后用2-ΔCt给出的算术公式计算相对表达。
结果前列腺标志物选择通过在上文材料与方法部分定义的转录谱分析，使用来自于前列腺筛选组的mRNA，鉴定了表1中列出的所有标志物，所述筛选组由“前列腺肿瘤库”(3个前列腺肿瘤患者样品)、“前列腺正常库”(5个正常前列腺上皮患者样品)和“其它正常库”(来自于正常心脏、肾、小肠、脾、白细胞、肺、肝、脑、骨髓和结肠患者组织样品每种的一个样品)和“其它肿瘤库”(4个宫颈癌、5个结肠肿瘤、8个各种类型的肺癌患者样品、4个卵巢肿瘤样品和5个前列腺肿瘤样品)的患者样品组成。与前列腺正常、其它正常或其它肿瘤中的表达相比，在至少25％的前列腺肿瘤中表达至少高3倍的克隆被称作前列腺肿瘤特异性筛选标志物。选择这些cDNA克隆以确定它们的蛋白编码转录物序列。
为了确定所选cDNA克隆的全长蛋白编码转录物，用所选克隆的序列查询公共和私有的序列数据库，以便鉴定其它具有显著重叠的EST序列或簇。这样，将邻接的EST序列和/或簇组装到蛋白编码转录物中。按如下描述进行所有要求保护的标志物的可变转录物分析采用现有的将任意给定标志物基因的已知核苷酸序列对人基因组序列作图的方法，并且通过额外将任意给定标志物基因的新核苷酸序列在人基因组序列上作图(如，使用诸如“UCSC基因组浏览器”等资源或具有相似功能的内部资源，结合允许快速和精确地将检索序列在基因组序列上作图的诸如BLAT等算法)，确定标志物基因的外显子-内含子结构，其中还考虑了匹配相同基因的EST序列。
设计PCR引物以便从感兴趣的组织和对照样品扩增给定标志物基因的编码序列。由此分析得到的具有改变编码序列潜力的标志物基因的替代的5’或3’末端导致设计出了另外一种对此替代的末端具有特异性的引物。
将用来源于前列腺肿瘤标本的cDNA模板获得的PCR产物克隆到质粒载体中，并且通过DNA序列分析进行表征。典型地，通过PCR产物的限制消化和凝胶电泳，或通过DNA序列分析，分析96个克隆。
对以2％或更高的频率存在的代表可变基因转录物的克隆进行测序。通过基于所有可获得的序列鉴定在人工管理的组装体(重叠群)中包含的可读框(ORF)而完成相应于这些可变转录物的蛋白质序列的鉴定。在表1和序列表中指定了这些被鉴定序列的归属。
在从患者组织标本制备的cDNA中通过TAQMAN_定量PCR(Applied Biosystems)证实了具有鉴定的可变转录物的基因的差别基因表达。在某些情况下(如AMACR，LIM)制备对给定基因鉴定的所有转录物敏感的基因特异性TAQMAN_试剂。此外，对某些标志物的每种转录物或转录物组(如M683A，M684A，M686；M283A，M747；M742，M743，M744，M745，M260A；M322A)分别开发剪接形式特异性TAQMAN_试剂。发现了具有相似扩增效率的、证明有不同的肿瘤-正常表达的基因特异性以及转录物特异性表达谱。与正常或其他肿瘤样品相比，如表1所示的标志物M683A、M684A、M686、M283A、M747、M742、M743、M744、M745、M260A和M322A中的每一个都证明有高于正常的表达水平。M747和M283A为LIM基因的可变剪接变体(见表2)。但是只证明M747有差别表达，导致与正常或其他肿瘤样品相比其表达上调。M747代表比M283A实质上更短的LIM转录物，其特征在于独特的可变转录起始位点。M747比M283A短，但是与M283A蛋白序列的C末端部分相同(见表2；SEQID NO27，SEQ ID NO29；和SEQ ID NO28，SEQ ID NO30)。
表2

实施例2通过终点PCR的基因表达分析材料与方法终点PCR分析简言之，合并来自不同样品的总RNA，将其用作产生第一链cDNA的模板。库中包括等量的每种样品。前列腺筛选组由“前列腺肿瘤库”(3个前列腺肿瘤患者样品)、“前列腺正常库”(5个正常前列腺上皮患者样品)、“其他正常库”(来自正常心脏、肾、小肠、脾脏、WBC、肺、肝脏、脑、骨髓和结肠组织患者组织样品的各1个样品)、和“其他肿瘤库”(4个子宫颈癌，5个结肠肿瘤，8个不同类型的肺癌患者样品，4个卵巢肿瘤样品，和5个前列腺肿瘤样品)的患者样品组成(例如，见表3)。
使用TRIZOL试剂按照使用说明书(Invitrogen)通过一步提取法从患者样品制备总RNA。每种RNA制品都用DNase I(Ambion)在37℃下处理1小时。将来自每个患者样品的RNA并入四个库之一，例如前列腺正常库、前列腺肿瘤库、其他正常库和其他肿瘤库。
利用ThermoScript RT-PCR系统(Invitrogen，San Diego，CA)从4个库中的每一个获得cDNA。简言之，按照使用说明书所述，1μgRNA在65℃下在10μl体积中与1μl50μM oligo(dT)20引物变性5分钟。在85℃下温育5分钟终止反应。终产物用水稀释至终体积为100μl。
基因特异性引物设计为恰好在开放阅读框之外(如表3中项目“终点PCR引物1”和“终点PCR引物2”所示)。对引物和预期的产物大小优化PCR条件。应用降落(touchdown)循环条件在20μl反应中使用2μl cDNA。产物在含溴化乙锭的琼脂糖凝胶上电泳，并对得到的凝胶图进行半定量分析和评分。对组织组进行的终点PCR的凝胶图按照1-5的等级进行评分。每张图由三个人根据目测条带强度独立评分，并汇总结果，将得分进行比较，以证实全部三个人在条带相对强度上一致，必要时进行修正。然后记录三个得分的中位数作为最终得分。
II结果表3.前列腺筛选终点PCR数据


标志物在前列腺肿瘤样品中的表达水平高于在其他肿瘤样品或正常样品组中获得的表达水平(表3)。对于M245A，M686，M261，M271A，M747，M164A，M320和M389，与前列腺正常、其他正常或其他肿瘤组相比，在前列腺肿瘤组中观察到特别强的表达。
此处引用的参考文献，包括本申请全文中引用的期刊文章、专利、公开的专利申请和数据库记录，包括GenBank，IMAGE联盟和Derwent，均引入作为参考。
其他实施方案本领域技术人员应当认识到，或者仅利用常规实验就能够确定本文所述的本发明具体实施方案的等同实施方案。这些等同实施方案包括在权利要求书的范围内。
序列表<110>千年药品公司等<120>用于鉴定、评价、预防和治疗前列腺癌的基因、组合物、试剂盒和方法<130>MRI-066PC<150>60/601413<151>2004-08-13<160>44<170>FastSEQ for Windows Version 4.0<210>1<211>5871<212>DNA<213>人<220>
<221>CDS<222>(116)...(4093)<400>1ggacaggcgt ggcggccgga gccccagcat ccctgcttga ggtccaggag cggagcccgc 60ggccaccgcc gcctgatcag cgcgaccccg gcccgcgccc gccccgcccg gcaag atg 118Met1ctg ccc gtg tac cag gag gtg aag ccc aac ccg ctg cag gac gcg aac 166Leu Pro Va1 Tyr Gln Glu Val Lys Pro Asn Pro Leu Gln Asp Ala Asn5 10 15atc tgc tca cgc gtg ttc ttc tgg tgg ctc aat ccc ttg ttt aaa att 214Ile Cys Ser Arg Val Phe Phe Trp Trp Leu Asn Pro Leu Phe Lys Ile20 25 30ggc cat aaa cgg aga tta gag gaa gat gat atg tat tca gtg ctg cca 262Gly His Lys Arg Arg Leu Glu Glu Asp Asp Met Tyr Ser Val Leu Pro35 40 45gaa gac cgc tca cag cac ctt gga gag gag ttg caa ggg ttc tgg gat 310Glu Asp Arg Ser Gln His Leu Gly Glu Glu Leu Gln Gly Phe Trp Asp50 55 60 65aaa gaa gtt tta aga gct gag aat gac gca cag aag cct tct tta aca 358Lys Glu Val Leu Arg Ala Glu Asn Asp Ala Gln Lys Pro Ser Leu Thr70 75 80aga gca atc ata aag tgt tac tgg aaa tct tat tta gtt ttg gga att 406Arg Ala Ile Ile Lys Cys Tyr Trp Lys Ser Tyr Leu Val Leu Gly Ile85 90 95ttt acg tta att gag gaa agt gcc aaa gta atc cag ccc ata ttt ttg 454Phe Thr Leu Ile Glu Glu Ser Ala Lys Val Ile Gln Pro Ile Phe Leu100 105 110gga aaa att att aat tat ttt gaa aat tat gat ccc atg gat tct gtg 502Gly Lys Ile Ile Asn Tyr Phe Glu Asn Tyr Asp Pro Met Asp Ser Val115 120 125gct ttg aac aca gcg tac gcc tat gcc acg gtg ctg act ttt tgc acg 550Ala Leu Asn Thr Ala Tyr Ala Tyr Ala Thy Val Leu Thr Phe Cys Thr130 135 140 145ctc att ttg gct ata ctg cat cac tta tat ttt tat cac gtt cag tgt 598Leu Ile Leu Ala Ile Leu His His Leu Tyr Phe Tyr His Val Gln Cys150 155 160gct ggg atg agg tta cga gta gcc atg tgc cat atg att tat cgg aag 646Ala Gly Met Arg Leu Arg Val Ala Met Cys His Met Ile Tyr Arg Lys165 170 175gca ctt cgt ctt agt aac atg gcc atg ggg aag aca acc aca ggc cag 694Ala Leu Arg Leu Ser Asn Met Ala Met Gly Lys Thr Thr Thr Gly Gln
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gta cgc gtg gac cgg ccc ggc tcc cgc tac gac gtg agc cgc ttg ggc 206Val Arg Val Asp Arg Pro Gly Ser Arg Tyr Asp Val Ser Arg Leu Gly35 40 45cgg ggc aag cgc tcg cta gtg ctg gac ctg aag cag ccg cgg gga gcc 254Arg Gly Lys Arg Ser Leu Val Leu Asp Leu Lys Gln Pro Arg Gly Ala50 55 60gcc gtg ctg cgg cgt ctg tgc aag cgg tcg gat gtg ctg ctg gag ccc 302Ala Val Leu Arg Arg Leu Cys Lys Arg Ser Asp Val Leu Leu Glu Pro65 70 75ttc cgc cgc ggt gtc atg gag aaa ctc cag ctg ggc cca gag att ctg 350Phe Arg Arg Gly Val Met Glu Lys Leu Gln Leu Gly Pro Glu Ile Leu80 85 90 95cag cgg gaa aat cca agg ctt att tat gcc agg ctg agt gga ttt ggc 398Gln Arg Glu Asn Pro Arg Leu Ile Tyr Ala Arg Leu Ser Gly Phe Gly100 105 110cag tca gga agc ttc tgc cgg tta gct ggc cac gat atc aac tat ttg 446Gln Ser Gly Ser Phe Cys Arg Leu Ala Gly His Asp Ile Asn Tyr Leu115 120 125gct ttg tca ggt gtt ctc tca aaa att ggc aga agt ggt gag aat ccg 494Ala Leu Ser Gly Val Leu Ser Lys Ile Gly Arg Ser Gly Glu Asn Pro130 135 140tat gcc ccg ctg aat ctc ctg gct gac ttt gct ggt ggt ggc ctt atg 542Tyr Ala Pro Leu Asn Leu Leu Ala Asp Phe Ala Gly Gly Gly Leu Met145 150 155tgt gca ctg ggc att ata atg gct ctt ttt gac cgc aca cgc act ggc 590Cys Ala Leu Gly Ile Ile Met Ala Leu Phe Asp Arg Thr Arg Thr Gly160 165 170 175aag ggt cag gtc att gat gca aat atg gtg gaa gga aca gca tat tta 638Lys Gly Gln Val Ile Asp Ala Asn Met Val Glu Gly Thr Ala Tyr Leu180 185 190agt tct ttt ctg tgg aaa act cag aaa tcg agt ctg tgg gaa gca cct 686Ser Ser Phe Leu Trp Lys Thr Gln Lys Ser Ser Leu Trp Glu Ala Pro195 200 205cga gga cag aac atg ttg gat ggt gga gca cct ttc tat acg act tac 734Arg Gly Gln Asn Met Leu Asp Gly Gly Ala Pro Phe Tyr Thr Thr Tyr210 215 220agg aca gca gat ggg gaa ttc atg gct gtt gga gca ata gaa ccc cag 782Arg Thr Ala Asp Gly Glu Phe Met Ala Val Gly Ala Ile Glu Pro Gln225 230 235ttc tac gag ctg ctg atc aaa ggt ctg gga gaa ctg atc ttg ctg aaa 830Phe Tyr Glu Leu Leu Ile Lys Gly Leu Gly Glu Leu Ile Leu Leu Lys240 245 250 255ata caa cag gaa gca gta tcg tgc cag gca agg caa acc ctc gtc agt 878Ile Gln Gln Glu Ala Val Ser Cys Gln Ala Arg Gln Thr Leu Val Ser260 265 270gtg aag caa tgg cca tcg ttg cag ccc aag tca tgg ggt ttt gtg tgg 926Val Lys Gln Trp Pro Ser Leu Gln Pro Lys Ser Trp Gly Phe Val Trp275 280 285cag taa ccgttggagg cggcaatggc cattttgagt tggatgtttt caagccaatg982Gln *atgattaaaa atttatgtta cactcaggct gctgggggat gcttcagttt ccttcacaga 1042aaactaaata gtgggaatcc ggaccaataa agaaaggatc aagaagctaa tgaattagtc 1102gctaatgctg gtgacagctc tcaaccctca tatagggtat gacaaaacag cagaattgct 1162aagacaacac cccaaaatgg atcaacctta aaggaaactg ccgttgaact tggctctctc 1222acagcagagc agtttgatga atgggtaaaa cctaaggaca tgctgggtcc aaagtgactt 1282aaataagttt taatgaaaat aaacgtgtaa aatt 1316<210>8<211>288
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Pro Ser Gln Val Asn Gly Ser Arg Asn Ser Pro Asp Glu Cys Ser Val80 85 90gcc aaa ggc ggg aag atg gtg ggc agc cca gac acc gtt ggg atg aac 576Ala Lys Gly Gly Lys Met Val Gly Ser Pro Asp Thr Val Gly Met Asn95 100 105 110tac ggc agc tac atg gag gag aag cac atg cca ccc cca aac atg acc 624Tyr Gly Ser Tyr Met Glu Glu Lys His Met Pro Pro Pro Asn Met Thr115120 125acg aac gag cgc aga gtt atc gtg cca gca gat cct acg cta tgg agt 672Thr Asn Glu Arg Arg Val Ile Val Pro Ala Asp Pro Thr Leu Trp Ser130 135 140aca gac cat gtg cgg cag tgg ctg gag tgg gcg gtg aaa gaa tat ggc 720Thr Asp His Val Arg Gln Trp Leu Glu Trp Ala Val Lys Glu Tyr Gly145 150 155ctt cca gac gtc aac atc ttg tta ttc cag aac atc gat ggg aag gaa 768Leu Pro Asp Val Asn Ile Leu Leu Phe Gln Asn Ile Asp Gly Lys Glu160 165 170ctg tgc aag atg acc aag gac gac ttc cag agg ctc acc ccc agc tac 816Leu Cys Lys Met Thr Lys Asp Asp Phe Gln Arg Leu Thr Pro Ser Tyr175 180 185 190aac gcc gac atc ctt ctc tca cat ctc cac tac ctc aga gag act cct 864Asn Ala Asp Ile Leu Leu Ser His Leu His Tyr Leu Arg Glu Thr Pro195 200 205ctt cca cat ttg act tca gat gat gtt gat aaa gcc tta caa aac tct 912Leu Pro His Leu Thr Ser Asp Asp Val Asp Lys Ala Leu Gln Asn Ser210215 220cca cgg tta atg cat gct aga aac aca gat tta cca tat gag ccc ccc 960Pro Arg Leu Met His Ala Arg Asn Thr Asp Leu Pro Tyr Glu Pro Pro225 230 235agg aga tca gcc tgg acc ggt cac ggc cac ccc acg ccc cag tcg aaa 1008Arg Arg Ser Ala Trp Thr Gly His Gly His Pro Thr Pro Gln Ser Lys240 245 250gct gct caa cca tct cct tcc aca gtg ccc aaa act gaa gac cag cgt 1056Ala Ala Gln Pro Ser Pro Ser Thr Val Pro Lys Thr Glu Asp Gln Arg255 260 265 270cct cag tta gat cct tat cag att ctt gga cca aca agt agc cgc ctt 1104Pro Gln Leu Asp Pro Tyr Gln Ile Leu Gly Pro Thr Ser Ser Arg Leu275 280 285gca aat cca ggc agt ggc cag atc cag ctt tgg cag ttc ctc ctg gag 1152Ala Asn Pro Gly Ser Gly Gln Ile Gln Leu Trp Gln Phe Leu Leu Glu290 295 300ctc ctg tcg gac agc tcc aac tcc agc tgc atc acc tgg gaa ggc acc 1200Leu Leu Ser Asp Ser Ser Asn Ser Ser Cys Ile Thr Trp Glu Gly Thr305 310 315aac ggg gag ttc aag atg acg gat ccc gac gag gtg gcc cgg cgc tgg 1248Asn Gly Glu Phe Lys Met Thr Asp Pro Asp Glu Val Ala Arg Arg Trp320 325 330gga gag cgg aag agc aaa ccc aac atg aac tac gat aag ctc agc cgc 1296Gly Glu Arg Lys Ser Lys Pro Asn Met Asn Tyr Asp Lys Leu Ser Arg335 340 345 350gcc ctc cgt tac tac tat gac aag aac atc atg acc aag gtc cat ggg 1344Ala Leu Arg Tyr Tyr Tyr Asp Lys Asn Ile Met Thr Lys Val His Gly355 360 365aag cgc tac gcc tac aag ttc gac ttc cac ggg atc gcc cag gcc ctc 1392Lys Arg Tyr Ala Tyr Lys Phe Asp Phe His Gly Ile Ala Gln Ala Leu370 375 380cag ccc cac ccc ccg gag tca tct ctg tac aag tac ccc tca gac ctc 1440Gln Pro His Pro Pro Glu Ser Ser Leu Tyr Lys Tyr Pro Ser Asp Leu
385 390 395ccg tac atg ggc tcc tat cac gcc cac cca cag aag atg aac ttt gtg 1488Pro Tyr Met Gly Ser Tyr His Ala His Pro Gln Lys Met Asn Phe Val400 405 410gcg ccc cac cct cca gcc ctc ccc gtg aca tct tcc agt ttt gct 1536Ala Pro His Pro Pro Ala Leu Pro Val Thr Ser Ser Ser Phe Phe Ala415 420 425 430gcc cca aac cca tac tgg aat tca cca act ggg ggt ata tac ccc aac 1584Ala Pro Asn Pro Tyr Trp Asn Ser Pro Thr Gly Gly Ile Tyr Pro Asn435 440 445act agg ctc ccc acc agc cat atg cct tct cat ctg ggc act tac tac 1632Thr Arg Leu Pro Thr Ser His Met Pro Ser His Leu Gly Thr Tyr Tyr450455 460taaagacctg gcggaggctt ttcccatcag cgtgcattca ccagcccatc gccacaaact 1692ctatcggaga acatgaatca aaagtgcctc aagaggaatg aaaaaagctt tactggggct 1752ggggaaggaa gccggggaag agatccaaag actcttggga gggagttact gaagtcttac 1812tacagaaatg aggaggatgc taaaaatgtc acgaatatgg acatatcatc tgtggactga 1872ccttgtaaaa gacagtgtat gtagaagcat gaagtcttaa ggacaaagtg ccaaagaaag 1932tggtcttaag aaatgtataa actttagagt agagtttgga atcccactaa tgcaaactgg 1992gatgaaacta aagcaataga aacaacacag ttttgaccta acataccgtt tataatgcca 2052ttttaaggaa aactacctgt atttaaaaat agaaacatat caaaaacaag agaaaagaca 2112cgagagagac tgtggcccat caacagacgt tgatatgcaa ctgcatggca tgtgctgttt 2172tggttgaaat caaatacatt ccgtttgatg gacagctgtc agctttctca aactgtgaag 2232atgacccaaa gtttccaact cctttacagt attaccggga ctatgaacta aaaggtggga 2292ctgaggatgt gtatagagtg agcgtgtgat tgtagacaga ggggtgaaga aggaggagga 2352agaggcagag aaggaggaga ccagggctgg gaaagaaact tctcaagcaa tgaagactgg 2412actcaggaca tttggggact gtgtacaatg agttatggag actcgagggt tcatgcagtc 2472agtgttatac caaacccagt gttaggagaa aggacacagc gtaatggaga aaggggaagt 2532agtagaattc agaaacaaaa atgcgcatct ctttctttgt ttgtcaaatg aaaattttaa 2592ctggaattgt ctgatattta agagaaacat tcaggacctc atcattatgt gggggctttg 2652ttctccacag ggtcaggtaa gagatggcct tcttggctgc cacaatcaga aatcacgcag 2712gcattttggg taggcggcct ccagttttcc tttgagtcgc gaacgctgtg cgtttgtcag 2772aatgaagtat acaagtcaat gtttttcccc ctttttatat aataattata taacttatgc 2832atttatacac tacgagttga tctcggccag ccaaagacac acgacaaaag agacaatcga 2892tataatgtgg ccttgaattt taactctgta tgcttaatgt ttacaatatg aagttattag 2952ttcttagaat gcagaatgta tgtaataaaa taagcttggc ctagcatggc aaatcagatt 3012tatacaggag tctgcatttg cacttttttt agtgactaaa gttgcttaat gaaaacatgt 3072gctgaatgtt gtggattttg tgttataatt tactttgtcc aggaacttgt gcaagggaga 3132gccaaggaaa taggatgttt ggcacccaaa tggcgtcagc ctctccaggt ccttcttgcc 3192tcccctcctg tcttttattt ctagcccctt ttggaacaga aggaccccgg gtttcacatt 3252ggagcctcca tatttatgcc tggaatggaa agaggcctat gaagctgggg ttgtcattga 3312gaaattctag ttcagcacct ggtcacaaat cacccttaat tcctgctatg attaaaatac 3372atttgttgaa cagtgaacaa gctaccactc gtaaggcaaa ctgtattatt actggcaaat 3432aaagcgtcat ggatagctgc aatttctcac tttaca 3468<210>10<211>462<212>PRT<213>人<400>10Met Ile Gln Thr Val Pro Asp Pro Ala Ala His Ile Lys Glu Ala Leu1 5 10 15Ser Val Val Ser Glu Asp Gln Ser Leu Phe Glu Cys Ala Tyr Gly Thr20 25 30Pro His Leu Ala Lys Thr Glu Met Thr Ala Ser Ser Ser Ser Asp Tyr35 40 45Gly Gln Thr Ser Lys Met Ser Pro Arg Val Pro Gln Gln Asp Trp Leu50 55 60Ser Gln Pro Pro Ala Arg Val Thr Ile Lys Met Glu Cys Asn Pro Ser65 70 75 80Gln Val Asn Gly Ser Arg Asn Ser Pro Asp Glu Cys Ser Val Ala Lys85 90 95Gly Gly Lys Met Val Gly Ser Pro Asp Thr Val Gly Met Asn Tyr Gly100 105 110Ser Tyr Met Glu Glu Lys His Met Pro Pro Pro Asn Met Thr Thr Asn115 120 125Glu Arg Arg Val Ile Val Pro Ala Asp Pro Thr Leu Trp Ser Thr Asp130 135 140His Val Arg Gln Trp Leu Glu Trp Ala Val Lys Glu Tyr Gly Leu Pro145 150 155 160Asp Val Asn Ile Leu Leu Phe Gln Asn Ile Asp Gly Lys Glu Leu Cys
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<221>CDS<222>(247)...(1626)<400>11ccgtcggcgc cgagggagtt agtgcgaccc ggctcggcgc gcacggccaa ggcacgcgcg 60ctggcacacg cgggcgcgga cacgcgcgga cacacacgtt attccaggat ctttggagac 120ccgaggaaag ccgtgttgac caaaagcaag acaaatgact cacagagaaa aaagatggca 180gaaccaaggg caactaaagc cgtcaggttc tgaacagctg gtagatgggc tggcttactg 240aaggac atg att cag act gtc ccg gac cca gca gct cat atc aag gaa288Met Ile Gln Thr Val Pro Asp Pro Ala Ala His Ile Lys Glu1 5 10gcc tta tca gtt gtg agt gag gac cag tcg ttg ttt gag tgt gcc tac 336Ala Leu Ser Val Val Ser Glu Asp Gln Ser Leu Phe Glu Cys Ala Tyr15 20 25 30gga acg cca cac ctg gct aag aca gag atg acc gcg tcc tcc tcc agc 384Gly Thr Pro His Leu Ala Lys Thr Glu Met Thr Ala Ser Ser Ser Ser35 40 45gac tat gga cag act tcc aag atg agc cca cgc gtc cct cag cag gat 432Asp Tyr Gly Gln Thr Ser Lys Met Ser Pro Arg Val Pro Gln Gln Asp50 55 60tgg ctg tct caa ccc cca gcc agg gtc acc atc aaa atg gaa tgt aac 480Trp Leu Ser Gln Pro Pro Ala Arg Val Thr Ile Lys Met Glu Cys Asn65 70 75cct agc cag gtg aat ggc tca agg aac tct cct gat gaa tgc agt gtg 528Pro Ser Gln Val Asn Gly Ser Arg Asn Ser Pro Asp Glu Cys Ser Val80 85 90
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Gly Ser Tyr His Ala His Pro Gln Lys Met Asn Phe Val Ala Pro His400 405 410cct cca gcc ctc ccc gtg aca tct tcc agt ttt ttt gct gcc cca aac 1536Pro Pro Ala Leu Pro Val Thr Ser Ser Ser Phe Phe Ala Ala Pro Asn415 420 425 430cca tac tgg aat tca cca act ggg ggt ata tac ccc aac act agg ctc 1584Pro Tyr Trp Asn Ser Pro Thr Gly Gly Ile Tyr Pro Asn Thr Arg Leu435 440 445ccc acc agc cat atg cct tct cat ctg ggc act tac tac taa 1626Pro Thr Ser His Met Pro Ser His Leu Gly Thr Tyr Tyr *450 455agacctggcg gaggcttttc ccatcagcgt gcattcacca gcccatcgcc acaaactcta 1686tcggagaaca tgaatcaaaa gtgcctcaag aggaatgaaa aaagctttac tggggctggg 1746gaaggaagcc ggggaagaga tccaaagact cttgggaggg agttactgaa gtcttactac 1806agaaatgagg aggatgctaa aaatgtcacg aatatggaca tatcatctgt ggactgacct 1866tgtaaaagac agtgtatgta gaagcatgaa gtcttaagga caaagtgcca aagaaagtgg 1926tcttaagaaa tgtataaact ttagagtaga gtttggaatc ccactaatgc aaactgggat 1986gaaactaaag caatagaaac aacacagttt tgacctaaca taccgtttat aatgccattt 2046taaggaaaac tacctgtatt taaaaataga aacatatcaa aaacaagaga aaagacacga 2106gagagactgt ggcccatcaa cagacgttga tatgcaactg catggcatgt gctgttttgg 2166ttgaaatcaa atacattccg tttgatggac agctgtcagc tttctcaaac tgtgaagatg 2226acccaaagtt tccaactcct ttacagtatt accgggacta tgaactaaaa ggtgggactg 2286aggatgtgta tagagtgagc gtgtgattgt agacagaggg gtgaagaagg aggaggaaga 2346ggcagagaag gaggagacca gggctgggaa agaaacttct caagcaatga agactggact 2406caggacattt ggggactgtg tacaatgagt tatggagact cgagggttca tgcagtcagt 2466gttataccaa acccagtgtt aggagaaagg acacagcgta atggagaaag gggaagtagt 2526agaattcaga aacaaaaatg cgcatctctt tctttgtttg tcaaatgaaa attttaactg 2586gaattgtctg atatttaaga gaaacattca ggacctcatc attatgtggg ggctttgttc 2646tccacagggt caggtaagag atggccttct tggctgccac aatcagaaat cacgcaggca 2706ttttgggtag gcggcctcca gttttccttt gagtcgcgaa cgctgtgcgt ttgtcagaat 2766gaagtataca agtcaatgtt tttccccctt tttatataat aattatataa cttatgcatt 2826tatacactac gagttgatct cggccagcca aagacacacg acaaaagaga caatcgatat 2886aatgtggcct tgaattttaa ctctgtatgc ttaatgttta caatatgaag ttattagttc 2946ttagaatgca gaatgtatgt aataaaataa gcttggccta gcatggcaaa tcagatttat 3006acaggagtct gcatttgcac tttttttagt gactaaagtt gcttaatgaa aacatgtgct 3066gaatgttgtg gattttgtgt tataatttac tttgtccagg aacttgtgca agggagagcc 3126aaggaaatag gatgtttggc acccaaatgg cgtcagcctc tccaggtcct tcttgcctcc 3186cctcctgtct tttatttcta gccccttttg gaacagaagg accccgggtt tcacattgga 3246gcctccatat ttatgcctgg aatggaaaga ggcctatgaa gctggggttg tcattgagaa 3306attctagttc agcacctggt cacaaatcac ccttaattcc tgctatgatt aaaatacatt 3366tgttgaacag tgaacaagct accactcgta aggcaaactg tattattact ggcaaataaa 3426gcgtcatgga tagctgcaat ttctcacttt aca 3459<210>12<211>459<212>PRT<213>人<400>12Met Ile Gln Thr Val Pro Asp Pro Ala Ala His Ile Lys Glu Ala Leu1 5 10 15Ser Val Val Ser Glu Asp Gln Ser Leu Phe Glu Cys Ala Tyr Gly Thr20 25 30Pro His Leu Ala Lys Thr Glu Met Thr Ala Ser Ser Ser Ser Asp Tyr35 40 45Gly Gln Thr Ser Lys Met Ser Pro Arg Val Pro Gln Gln Asp Trp Leu50 55 60Ser Gln Pro Pro Ala Arg Val Thr Ile Lys Met Glu Cys Asn Pro Ser65 70 75 80Gln Val Asn Gly Ser Arg Asn Ser Pro Asp Glu Cys Ser Val Ala Lys85 90 95Gly Gly Lys Met Val Gly Ser Pro Asp Thr Val Gly Met Asn Tyr Gly100 105 110Ser Tyr Met Glu Glu Lys His Met Pro Pro Pro Asn Met Thr Thr Asn115 120 125Glu Arg Arg Val Ile Val Pro Ala Asp Pro Thr Leu Trp Ser Thr Asp130135 140His Val Arg Gln Trp Leu Glu Trp Ala Val Lys Glu Tyr Gly Leu Pro145 150 155 160Asp Val Asn Ile Leu Leu Phe Gln Asn Ile Asp Gly Lys Glu Leu Cys165 170 175Lys Met Thr Lys Asp Asp Phe Gln Arg Leu Thr Pro Ser Tyr Asn Ala180 185 190
Asp Ile Leu Leu Ser His Leu His Tyr Leu Arg Glu Arg Gly Ala Ala195 200 205Phe Ile Phe Pro Asn Thr Ser Val Tyr Pro Glu Ala Thr Gln Arg Ile210 215 220Thr Thr Arg Pro Asp Leu Pro Tyr Glu Pro Pro Arg Arg Ser Ala Trp225 230 235 240Thr Gly His Gly His Pro Thr Pro Gln Ser Lys Ala Ala Gln Pro Ser245 250 255Pro Ser Thr Val Pro Lys Thr Glu Asp Gln Arg Pro Gln Leu Asp Pro260 265 270Tyr Gln Ile Leu Gly Pro Thr Ser Ser Arg Leu Ala Asn Pro Gly Ser275 280 285Gly Gln Ile Gln Leu Trp Gln Phe Leu Leu Glu Leu Leu Ser Asp Ser290 295 300Ser Asn Ser Ser Cys Ile Thr Trp Glu Gly Thr Asn Gly Glu Phe Lys305 310 315 320Met Thr Asp Pro Asp Glu Val Ala Arg Arg Trp Gly Glu Arg Lys Ser325 330 335Lys Pro Asn Met Asn Tyr Asp Lys Leu Ser Arg Ala Leu Arg Tyr Tyr340 345 350Tyr Asp Lys Asn Ile Met Thr Lys Val His Gly Lys Arg Tyr Ala Tyr355 360 365Lys Phe Asp Phe His Gly Ile Ala Gln Ala Leu Gln Pro His Pro Pro370 375 380Glu Ser Ser Leu Tyr Lys Tyr Pro Ser Asp Leu Pro Tyr Met Gly Ser385 390 395 400Tyr His Ala His Pro Gln Lys Met Asn Phe Val Ala Pro His Pro Pro405 410 415Ala Leu Pro Val Thr Ser Ser Ser Phe Phe Ala Ala Pro Asn Pro Tyr420 425 430Trp Asn Ser Pro Thr Gly Gly Ile Tyr Pro Asn Thr Arg Leu Pro Thr435 440 445Ser His Met Pro Ser His Leu Gly Thr Tyr Tyr450 455<210>13<211>3241<212>DNA<213>人<220>
<221>CDS<222>(326)...(1408)<400>13ccgtcggcgc cgagggagtt agtgcgaccc ggctcggcgc gcacggccaa ggcacgcgcg 60ctggcacacg cgggcgcgga cacgcgcgga cacacacgtt attccaggat ctttggagac 120ccgaggaaag ccgtgttgac caaaagcaag acaaatgact cacagagaaa aaagatggca 180gaaccaaggg caactaaagc cgtcaggttc tgaacagctg gtagatgggc tggcttactg 240aaggacatga ttcagactgt cccggaccca gcagctcata tcaaggaact ctcctgatga 300atgcagtgtg gccaaaggcg ggaag atg gtg ggc agc cca gac acc gtt ggg 352Met Val Gly Ser Pro Asp Thr Val Gly1 5atg aac tac ggc agc tac atg gag gag aag cac atg cca ccc cca aac 400Met Asn Tyr Gly Ser Tyr Met Glu Glu Lys His Met Pro Pro Pro Asn10 15 20 25atg acc acg aac gag cgc aga gtt atc gtg cca gca gat cct acg cta 448Met Thr Thr Asn Glu Arg Arg Val Ile Val Pro Ala Asp Pro Thr Leu30 35 40tgg agt aca gac cat gtg cgg cag tgg ctg gag tgg gcg gtg aaa gaa 496Trp Ser Thr Asp His Val Arg Gln Trp Leu Glu Trp Ala Val Lys Glu45 50 55tat ggc ctt cca gac gtc aac atc ttg tta ttc cag aac atc gat ggg 544Tyr Gly Leu Pro Asp Val Asn Ile Leu Leu Phe Gln Asn Ile Asp Gly60 65 70aag gaa ctg tgc aag atg acc aag gac gac ttc cag agg ctc acc ccc 592Lys Glu Leu Cys Lys Met Thr Lys Asp Asp Phe Gln Arg Leu Thr Pro75 80 85agc tac aac gcc gac atc ctt ctc tca cat ctc cac tac ctc aga gag 640Ser Tyr Asn Ala Asp Ile Leu Leu Ser His Leu His Tyr Leu Arg Glu
90 95 100 105agg ggt gca gct ttt att ttc cca aat act tca gta tat cct gaa gct 688Arg Gly Ala Ala Phe Ile Phe Pro Asn Thr Ser Val Tyr Pro Glu Ala110 115 120acg caa aga att aca act agg cca gat tta cca tat gag ccc ccc agg 736Thr Gln Arg Ile Thr Thr Arg Pro Asp Leu Pro Tyr Glu Pro Pro Arg125 130 135aga tca gcc tgg acc ggt cac ggc cac ccc acg ccc cag tcg aaa gct 784Arg Ser Ala Trp Thr Gly His Gly His Pro Thr Pro Gln Ser Lys Ala140 145 150gct caa cca tct cct tcc aca gtg ccc aaa act gaa gac cag cgt cct 832Ala Gln Pro Ser Pro Ser Thr Val Pro Lys Thr Glu Asp Gln Arg Pro155 160 165cag tta gat cct tat cag att ctt gga cca aca agt agc cgc ctt gca 880Gln Leu Asp Pro Tyr Gln Ile Leu Gly Pro Thr Ser Ser Arg Leu Ala170 175 180 185aat cca ggc agt ggc cag atc cag ctt tgg cag ttc ctc ctg gag ctc 928Asn Pro Gly Ser Gly Gln Ile Gln Leu Trp Gln Phe Leu Leu Glu Leu190 195 200ctg tcg gac agc tcc aac tcc agc tgc atc acc tgg gaa ggc acc aac 976Leu Ser Asp Ser Ser Asn Ser Ser Cys Ile Thr Trp Glu Gly Thr Asn205 210 215ggg gag ttc aag atg acg gat ccc gac gag gtg gcc cgg cgc tgg gga 1024Gly Glu Phe Lys Met Thr Asp Pro Asp Glu Val Ala Arg Arg Trp Gly220 225 230gag cgg aag agc aaa ccc aac atg aac tac gat aag ctc agc cgc gcc 1072Glu Arg Lys Ser Lys Pro Asn Met Asn Tyr Asp Lys Leu Ser Arg Ala235 240 245ctc cgt tac tac tat gac aag aac atc atg acc aag gtc cat ggg aag 1120Leu Arg Tyr Tyr Tyr Asp Lys Asn Ile Met Thr Lys Val His Gly Lys250 255 260 265cgc tac gcc tac aag ttc gac ttc cac ggg atc gcc cag gcc ctc cag 1168Arg Tyr Ala Tyr Lys Phe Asp Phe His Gly Ile Ala Gln Ala Leu Gln270 275 280ccc cac ccc ccg gag tca tct ctg tac aag tac ccc tca gac ctc ccg 1216Pro His Pro Pro Glu Ser Ser Leu Tyr Lys Tyr Pro Ser Asp Leu Pro285 290 295tac atg ggc tcc tat cac gcc cac cca cag aag atg aac ttt gtg gcg 1264Tyr Met Gly Ser Tyr His Ala His Pro Gln Lys Met Asn Phc Val Ala300 305 310ccc cac cct cca gcc ctc ccc gtg aca tct tcc agt ttt ttt gct gcc 1312Pro His Pro Pro Ala Leu Pro Val Thr Ser Ser Ser Phe Phe Ala Ala315 320 325cca aac cca tac tgg aat tca cca act ggg ggt ata tac ccc aac act 1360Pro Asn Pro Tyr Trp Asn Ser Pro Thr Gly Gly Ile Tyr Pro Asn Thr330 335 340 345agg ctc ccc acc agc cat atg cct tct cat ctg ggc act tac tac taa 1408Arg Leu Pro Thr Ser His Met Pro Ser His Leu Gly Thr Tyr Tyr *350 355 360agacctggcg gaggcttttc ccatcagcgt gcattcacca gcccatcgcc acaaactcta 1468tcggagaaca tgaatcaaaa gtgcctcaag aggaatgaaa aaagctttac tggggctggg 1528gaaggaagcc ggggaagaga tccaaagact cttgggaggg agttactgaa gtcttactac 1588agaaatgagg aggatgctaa aaatgtcacg aatatggaca tatcatctgt ggactgacct 1648tgtaaaagac agtgtatgta gaagcatgaa gtcttaagga caaagtgcca aagaaagtgg 1708tcttaagaaa tgtataaact ttagagtaga gtttggaatc ccactaatgc aaactgggat 1768gaaactaaag caatagaaac aacacagttt tgacctaaca taccgtttat aatgccattt 1828taaggaaaac tacctgtatt taaaaataga aacatatcaa aaacaagaga aaagacacga 1888gagagactgt ggcccatcaa cagacgttga tatgcaactg catggcatgt gctgttttgg 1948ttgaaatcaa atacattccg tttgatggac agctgtcagc tttctcaaac tgtgaagatg 2008acccaaagtt tccaactcct ttacagtatt accgggacta tgaactaaaa ggtgggactg 2068
aggatgtgta tagagtgagc gtgtgattgt agacagaggg gtgaagaagg aggaggaaga 2128ggcagagaag gaggagacca gggctgggaa agaaacttct caagcaatga agactggact 2188caggacattt ggggactgtg tacaatgagt tatggagact cgagggttca tgcagtcagt 2248gttataccaa acccagtgtt aggagaaagg acacagcgta atggagaaag gggaagtagt 2308agaattcaga aacaaaaatg cgcatctctt tctttgtttg tcaaatgaaa attttaactg 2368gaattgtctg atatttaaga gaaacattca ggacctcatc attatgtggg ggctttgttc 2428tccacagggt caggtaagag atggccttct tggctgccac aatcagaaat cacgcaggca 2488ttttgggtag gcggcctcca gttttccttt gagtcgcgaa cgctgtgcgt ttgtcagaat 2548gaagtataca agtcaatgtt tttccccctt tttatataat aattatataa cttatgcatt 2608tatacactac gagttgatct cggccagcca aagacacacg acaaaagaga caatcgatat 2668aatgtggcct tgaattttaa ctctgtatgc ttaatgttta caatatgaag ttattagttc 2728ttagaatgca gaatgtatgt aataaaataa gcttggccta gcatggcaaa tcagatttat 2788acaggagtct gcatttgcac tttttttagt gactaaagtt gcttaatgaa aacatgtgct 2848gaatgttgtg gattttgtgt tataatttac tttgtccagg aacttgtgca agggagagcc 2908aaggaaatag gatgtttggc acccaaatgg cgtcagcctc tccaggtcct tcttgcctcc 2968cctcctgtct tttatttcta gccccttttg gaacagaagg accccgggtt tcacattgga 3028gcctccatat ttatgcctgg aatggaaaga ggcctatgaa gctggggttg tcattgagaa 3088attctagttc agcacctggt cacaaatcac ccttaattcc tgctatgatt aaaatacatt 3148tgttgaacag tgaacaagct accactcgta aggcaaactg tattattact ggcaaataaa 3208gcgtcatgga tagctgcaat ttctcacttt aca 3241<210>14<211>360<212>PRT<213>人<400>14Met Val Gly Ser Pro Asp Thr Val Gly Met Asn Tyr Gly Ser Tyr Met1 5 10 15Glu Glu Lys His Met Pro Pro Pro Asn Met Thr Thr Asn Glu Arg Arg20 25 30Val Ile Val Pro Ala Asp Pro Thr Leu Trp Ser Thr Asp His Val Arg35 40 45Gln Trp Leu Glu Trp Ala Val Lys Glu Tyr Gly Leu Pro Asp Val Asn50 55 60Ile Leu Leu Phe Gln Asn Ile Asp Gly Lys Glu Leu Cys Lys Met Thr65 70 75 80Lys Asp Asp Phe Gln Arg Leu Thr Pro Ser Tyr Asn Ala Asp Ile Leu85 90 95Leu Ser His Leu His Tyr Leu Arg Glu Arg Gly Ala Ala Phe Ile Phe100 105 110Pro Asn Thr Ser Val Tyr Pro Glu Ala Thr Gln Arg Ile Thr Thr Arg115 120 125Pro Asp Leu Pro Tyr Glu Pro Pro Arg Arg Ser Ala Trp Thr Gly His130 135 140Gly His Pro Thr Pro Gln Ser Lys Ala Ala Gln Pro Ser Pro Ser Thr145 150 155 160Val Pro Lys Thr Glu Asp Gln Arg Pro Gln Leu Asp Pro Tyr Gln Ile165 170 175Leu Gly Pro Thr Ser Ser Arg Leu Ala Asn Pro Gly Ser Gly Gln Ile180 185 190Gln Leu Trp Gln Phe Leu Leu Glu Leu Leu Ser Asp Ser Ser Asn Ser195 200 205Ser Cys Ile Thr Trp Glu Gly Thr Asn Gly Glu Phe Lys Met Thr Asp210 215 220Pro Asp Glu Val Ala Arg Arg Trp Gly Glu Arg Lys Ser Lys Pro Asn225 230 235 240Met Asn Tyr Asp Lys Leu Ser Arg Ala Leu Arg Tyr Tyr Tyr Asp Lys245 250 255Asn Ile Met Thr Lys Val His Gly Lys Arg Tyr Ala Tyr Lys Phe Asp260 265 270Phe His Gly Ile Ala Gln Ala Leu Gln Pro His Pro Pro Glu Ser Ser275 280 285Leu Tyr Lys Tyr Pro Ser Asp Leu Pro Tyr Met Gly Ser Tyr His Ala290 295 300His Pro Gln Lys Met Asn Phe Val Ala Pro His Pro Pro Ala Leu Pro305 310 315 320Val Thr Ser Ser Ser Phe Phe Ala Ala Pro Asn Pro Tyr Trp Asn Ser325 330 335Pro Thr Gly Gly Ile Tyr Pro Asn Thr Arg Leu Pro Thr Ser His Met340 345 350Pro Ser His Leu Gly Thr Tyr Tyr355 360<210>15<211>3250
<212>DNA<213>人<220>
<221>CDS<222>(326)...(1417)<400>15ccgtcggcgc cgagggagtt agtgcgaccc ggctcggcgc gcacggccaa ggcacgcgcg 60ctggcacacg cgggcgcgga cacgcgcgga cacacacgtt attccaggat ctttggagac 120ccgaggaaag ccgtgttgac caaaagcaag acaaatgact cacagagaaa aaagatggca 180gaaccaaggg caactaaagc cgtcaggttc tgaacagctg gtagatgggc tggcttactg 240aaggacatgatt cagactgt cccggaccca gcagctcata tcaaggaact ctcctgatga 300atgcagtgtg gccaaaggcg ggaag atg gtg ggc agc cca gac acc gtt ggg 352Met Val Gly Ser Pro Asp Thr Val Gly1 5atg aac tac ggc agc tac atg gag gag aag cac atg cca ccc cca aac 400Met Asn Tyr Gly Ser Tyr Met Glu Glu Lys His Met Pro Pro Pro Asn10 15 20 25atg acc acg aac gag cgc aga gtt atc gtg cca gca gat cct acg cta 448Met Thr Thr Asn Glu Arg Arg Val Ile Val Pro Ala Asp Pro Thr Leu30 35 40tgg agt aca gac cat gtg cgg cag tgg ctg gag tgg gcg gtg aaa gaa 496Trp Ser Thr Asp His Val Arg Gln Trp Leu Glu Trp Ala Val Lys Glu45 50 55tat ggc ctt cca gac gtc aac atc ttg tta ttc cag aac atc gat ggg 544Tyr Gly Leu Pro Asp Val Asn Ile Leu Leu Phe Gln Asn Ile Asp Gly60 65 70aag gaa ctg tgc aag atg acc aag gac gac ttc cag agg ctc acc ccc 592Lys Glu Leu Cys Lys Met Thr Lys Asp Asp Phe Gln Arg Leu Thr Pro75 80 85agc tac aac gcc gac atc ctt ctc tca cat ctc cac tac ctc aga gag 640Ser Tyr Asn Ala Asp Ile Leu Leu Ser His Leu His Tyr Leu Arg Glu90 95 100 105act cct ctt cca cat ttg act tca gat gat gtt gat aaa gcc tta caa 688Thr Pro Leu Pro His Leu Thr Ser Asp Asp Val Asp Lys Ala Leu Gln110 115 120aac tct cca cgg tta atg cat gct aga aac aca gat tta cca tat gag 736Asn Ser Pro Arg Leu Met His Ala Arg Asn Thr Asp Leu Pro Tyr Glu125 130 135ccc ccc agg aga tca gcc tgg acc ggt cac ggc cac ccc acg ccc cag 784Pro Pro Arg Arg Ser Ala Trp Thr Gly His Gly His Pro Thr Pro Gln140 145 150tcg aaa gct gct caa cca tct cct tcc aca gtg ccc aaa act gaa gac 832Ser Lys Ala Ala Gln Pro Ser Pro Ser Thr Val Pro Lys Thr Glu Asp155 160 165cag cgt cct cag tta gat cct tat cag att ctt gga cca aca agt agc 880Gln Arg Pro Gln Leu Asp Pro Tyr Gln Ile Leu Gly Pro Thr Ser Ser170 175 180 185cgc ctt gca aat cca ggc agt ggc cag atc cag ctt tgg cag ttc ctc 928Arg Leu Ala Asn Pro Gly Ser Gly Gln Ile Gln Leu Trp Gln Phe Leu190 195 200ctg gag ctc ctg tcg gac agc tcc aac tcc agc tgc atc acc tgg gaa 976Leu Glu Leu Leu Ser Asp Ser Ser Asn Ser Ser Cys Ile Thr Trp Glu205 210 215ggc acc aac ggg gag ttc aag atg acg gat ccc gac gag gtg gcc cgg 1024Gly Thr Asn Gly Glu Phe Lys Met Thr Asp Pro Asp Glu Val Ala Arg220 225 230cgc tgg gga gag cgg aag agc aaa ccc aac atg aac tac gat aag ctc 1072Arg Trp Gly Glu Arg Lys Ser Lys Pro Asn Met Asn Tyr Asp Lys Leu235 240 245
agc cgc gcc ctc cgt tac tac tat gac aag aac atc atg acc aag gtc 1120Ser Arg Ala Leu Arg Tyr Tyr Tyr Asp Lys Asn Ile Met Thr Lys Val250 255 260 265cat ggg aag cgc tac gcc tac aag ttc gac ttc cac ggg atc gcc cag 1168His Gly Lys Arg Tyr Ala Tyr Lys Phe Asp Phe His Gly Ile Ala Gln270 275 280gcc ctc cag ccc cac ccc ccg gag tca tct ctg tac aag tac ccc tca 1216Ala Leu Gln Pro His Pro Pro Glu Ser Ser Leu Tyr Lys Tyr Pro Ser285 290 295gac ctc ccg tac atg ggc tcc tat cac gcc cac cca cag aag atg aac 1264Asp Leu Pro Tyr Met Gly Ser Tyr His Ala His Pro Gln Lys Met Asn300 305 310ttt gtg gcg ccc cac cct cca gcc ctc ccc gtg aca tct tcc agt ttt 1312Phe Val Ala Pro His Pro Pro Ala Leu Pro Val Thr Ser Ser Ser Phe315 320 325ttt gct gcc cca aac cca tac tgg aat tca cca act ggg ggt ata tac 1360Phe Ala Ala Pro Asn Pro Tyr Trp Asn Ser Pro Thr Gly Gly Ile Tyr330 335 340 345ccc aac act agg ctc ccc acc agc cat atg cct tct cat ctg ggc act 1408Pro Asn Thr Arg Leu Pro Thr Ser His Met Pro Ser His Leu Gly Thr350 355 360tac tac taa agacctggcg gaggcttttc ccatcagcgt gcattcacca 1457Tyr Tyr *gcccatcgcc acaaactcta tcggagaaca tgaatcaaaa gtgcctcaag aggaatgaaa 1517aaagctttac tggggctggg gaaggaagcc ggggaagaga tccaaagact cttgggaggg 1577agttactgaa gtcttactac agaaatgagg aggatgctaa aaatgtcacg aatatggaca 1637tatcatctgt ggactgacct tgtaaaagac agtgtatgta gaagcatgaa gtcttaagga 1697caaagtgcca aagaaagtgg tcttaagaaa tgtataaact ttagagtaga gtttggaatc 1757ccactaatgc aaactgggat gaaactaaag caatagaaac aacacagttt tgacctaaca 1817taccgtttat aatgccattt taaggaaaac tacctgtatt taaaaataga aacatatcaa 1877aaacaagaga aaagacacga gagagactgt ggcccatcaa cagacgttga tatgcaactg 1937catggcatgt gctgttttgg ttgaaatcaa atacattccg tttgatggac agctgtcagc 1997tttctcaaac tgtgaagatg acccaaagtt tccaactcct ttacagtatt accgggacta 2057tgaactaaaa ggtgggactg aggatgtgta tagagtgagc gtgtgattgt agacagaggg 2117gtgaagaagg aggaggaaga ggcagagaag gaggagacca gggctgggaa agaaacttct 2177caagcaatga agactggact caggacattt ggggactgtg tacaatgagt tatggagact 2237cgagggttca tgcagtcagt gttataccaa acccagtgtt aggagaaagg acacagcgta 2297atggagaaag gggaagtagt agaattcaga aacaaaaatg cgcatctctt tctttgtttg 2357tcaaatgaaa attttaactg gaattgtctg atatttaaga gaaacattca ggacctcatc 2417attatgtggg ggctttgttc tccacagggt caggtaagag atggccttct tggctgccac 2477aatcagaaat cacgcaggca ttttgggtag gcggcctcca gttttccttt gagtcgcgaa 2537cgctgtgcgt ttgtcagaat gaagtataca agtcaatgtt tttccccctt tttatataat 2597aattatataa cttatgcatt tatacactac gagttgatct cggccagcca aagacacacg 2657acaaaagaga caatcgatat aatgtggcct tgaattttaa ctctgtatgc ttaatgttta 2717caatatgaag ttattagttc ttagaatgca gaatgtatgt aataaaataa gcttggccta 2777gcatggcaaa tcagatttat acaggagtct gcatttgcac tttttttagt gactaaagtt 2837gcttaatgaa aacatgtgct gaatgttgtg gattttgtgt tataatttac tttgtccagg 2897aacttgtgca agggagagcc aaggaaatag gatgtttggc acccaaatgg cgtcagcctc 2957tccaggtcct tcttgcctcc cctcctgtct tttatttcta gccccttttg gaacagaagg 3017accccgggtt tcacattgga gcctccatat ttatgcctgg aatggaaaga ggcctatgaa 3077gctggggttg tcattgagaa attctagttc agcacctggt cacaaatcac ccttaattcc 3137tgctatgatt aaaatacatt tgttgaacag tgaacaagct accactcgta aggcaaactg 3197tattattact ggcaaataaa gcgtcatgga tagctgcaat ttctcacttt aca3250<210>16<211>363<212>PRT<213>人<400>16Met Val Gly Ser Pro Asp Thr Val Gly Met Asn Tyr Gly Ser Tyr Met1 5 10 15Glu Glu Lys His Met Pro Pro Pro Asn Met Thr Thr Asn Glu Arg Arg20 25 30Val Ile Val Pro Ala Asp Pro Thr Leu Trp Ser Thr Asp His Val Arg35 40 45Gln Trp Leu Glu Trp Ala Val Lys Glu Tyr Gly Leu Pro Asp Val Asn50 55 60
Ile Leu Leu Phe Gln Asn Ile Asp Gly Lys Glu Leu Cys Lys Met Thr65 70 75 80Lys Asp Asp Phe Gln Arg Leu Thr Pro Ser Tyr Asn Ala Asp Ile Leu85 90 95Leu Ser His Leu His Tyr Leu Arg Glu Thr Pro Leu Pro His Leu Thr100 105 l10Ser Asp Asp Val Asp Lys Ala Leu Gln Asn Ser Pro Arg Leu Met His115 120 125Ala Arg Asn Thr Asp Leu Pro Tyr Glu Pro Pro Arg Arg Ser Ala Trp130 135 140Thr Gly His Gly His Pro Thr Pro Gln Ser Lys Ala Ala Gln Pro Ser145 150 155 160Pro Ser Thr Val Pro Lys Thr Glu Asp Gln Arg Pro Gln Leu Asp Pro165 170 175Tyr Gln Ile Leu Gly Pro Thr Ser Ser Arg Leu Ala Asn Pro Gly Ser180 185 190Gly Gln Ile Gln Leu Trp Gln Phe Leu Leu Glu Leu Leu Ser Asp Ser195 200 205Ser Asn Ser Ser Cys Ile Thr Trp Glu Gly Thr Asn Gly Glu Phe Lys210 215 220Met Thr Asp Pro Asp Glu Val Ala Arg Arg Trp Gly Glu Arg Lys Ser225 230 235 240Lys Pro ASn Met Asn Tyr Asp Lys Leu Ser Arg Ala Leu Arg Tyr Tyr245 250 255Tyr Asp Lys Asn Ile Met Thr Lys Val His Gly Lys Arg Tyr Ala Tyr260 265 270Lys Phe Asp Phe His Gly Ile Ala Gln Ala Leu Gln Pro His Pro Pro275 280 285Glu Ser Ser Leu Tyr Lys Tyr Pro Ser Asp Leu Pro Tyr Met Gly Ser290 295 300Tyr His Ala His Pro Gln Lys Met Asn Phe Val Ala Pro His Pro Pro305 310 315 320Ala Leu Pro Val Thr Ser Ser Ser Phe Phe Ala Ala Pro Asn Pro Tyr325 330 335Trp Asn Ser Pro Thr Gly Gly Ile Tyr Pro Asn Thr Arg Leu Pro Thr340 345 350Ser His Met Pro Ser His Leu Gly Thr Tyr Tyr355 360<210>17<211>3304<212>DNA<213>人<220>
<221>CDS<222>(104)...(1471)<400>17aatctcatcc gctctaaaca acctcatcaa aactactttc tggtcagaga gaagcaataa 60ttattattaa catttattaa cgatcaataa acttgatcgc att atg gcc agc act 115Met Ala Ser Thr1att aag gaa gcc tta tca gtt gtg agt gag gac cag tcg ttg ttt gag 163Ile Lys Glu Ala Leu Ser Val Val Ser Glu Asp Gln Ser Leu Phe Glu5 10 15 20tgt gcc tac gga acg cca cac ctg gct aag aca gag atg acc gcg tcc 211Cys Ala Tyr Gly Thr Pro His Leu Ala Lys Thr Glu Met Thr Ala Ser25 30 35tcc tcc agc gac tat gga cag act tcc aag atg agc cca cgc gtc cct 259Ser Ser Ser Asp Tyr Gly Gln Thr Ser Lys Met Ser Pro Arg Val Pro40 45 50cag cag gat tgg ctg tct caa ccc cca gcc agg gtc acc atc aaa atg 307Gln Gln Asp Trp Leu Ser Gln Pro Pro Ala Arg Val Thr Ile Lys Met55 60 65gaa tgt aac cct agc cag gtg aat ggc tca agg aac tct cct gat gaa 355Glu Cys Asn Pro Ser Gln Val Asn Gly Ser Arg Asn Ser Pro Asp Glu70 75 80tgc agt gtg gcc aaa ggc ggg aag atg gtg ggc agc cca gac acc gtt 403Cys Ser Val Ala Lys Gly Gly Lys Met Val Gly Ser Pro Asp Thr Val
85 90 95 100ggg atg aac tac ggc agc tac atg gag gag aag cac atg cca ccc cca 451Gly Met Asn Tyr Gly Ser Tyr Met Glu Glu Lys His Met Pro Pro Pro105 110 115aac atg acc acg aac gag cgc aga gtt atc gtg cca gca gat cct acg 499Asn Met Thr Thr Asn Glu Arg Arg Val Ile Val Pro Ala Asp Pro Thr120 125 130cta tgg agt aca gac cat gtg cgg cag tgg ctg gag tgg gcg gtg aaa 547Leu Trp Ser Thr Asp His Val Arg Gln Trp Leu Glu Trp Ala Val Lys135 140 145gaa tat ggc ctt cca gac gtc aac atc ttg tta ttc cag aac atc gat 595Glu Tyr Gly Leu Pro Asp Val Asn Ile Leu Leu Phe Gln Asn Ile Asp150 155 160ggg aag gaa ctg tgc aag atg acc aag gac gac ttc cag agg ctc acc 643Gly Lys Glu Leu Cys Lys Met Thr Lys Asp Asp Phe Gln Arg Leu Thr165 170 175 180ccc agc tac aac gcc gac atc ctt ctc tca cat ctc cac tac ctc aga 691Pro Ser Tyr Asn Ala Asp Ile Leu Leu Ser His Leu His Tyr Leu Arg185 190 195gag act cct ctt cca cat ttg act tca gat gat gtt gat aaa gcc tta 739Glu Thr Pro Leu Pro His Leu Thr Ser Asp Asp Val Asp Lys Ala Leu200 205 210caa aac tct cca cgg tta atg cat gct aga aac aca gat tta cca tat 787Gln Asn Ser Pro Arg Leu Met His Ala Arg Asn Thr Asp Leu Pro Tyr215 220 225gag ccc ccc agg aga tca gcc tgg acc ggt cac ggc cac ccc acg ccc 835Glu Pro Pro Arg Arg Ser Ala Trp Thr Gly His Gly His Pro Thr Pro230 235 240cag tcg aaa gct gct caa cca tct cct tcc aca gtg ccc aaa act gaa 883Gln Ser Lys Ala Ala Gln Pro Ser Pro Ser Thr Val Pro Lys Thr Glu245 250 255 260gac cag cgt cct cag tta gat cct tat cag att ctt gga cca aca agt 931Asp Gln Arg Pro Gln Leu Asp Pro Tyr Gln Ile Leu Gly Pro Thr Ser265 270 275agc cgc ctt gca aat cca ggc agt ggc cag atc cag ctt tgg cag ttc 979Ser Arg Leu Ala Asn Pro Gly Ser Gly Gln Ile Gln Leu Trp Gln Phe280 285 290ctc ctg gag ctc ctg tcg gac agc tcc aac tcc agc tgc atc acc tgg 1027Leu Leu Glu Leu Leu Ser Asp Ser Ser Asn Ser Ser Cys Ile Thr Trp295 300 305gaa ggc acc aac ggg gag ttc aag atg acg gat ccc gac gag gtg gcc 1075Glu Gly Thr Asn Gly Glu Phe Lys Met Thr Asp Pro Asp Glu Val Ala310 315 320cgg cgc tgg gga gag cgg aag agc aaa ccc aac atg aac tac gat aag 1123Arg Arg Trp Gly Glu Arg Lys Ser Lys Pro Asn Met Asn Tyr Asp Lys325 330 335 340ctc agc cgc gcc ctc cgt tac tac tat gac aag aac atc atg acc aag 1171Leu Ser Arg Ala Leu Arg Tyr Tyr Tyr Asp Lys Asn Ile Met Thr Lys345 350 355gtc cat ggg aag cgc tac gcc tac aag ttc gac ttc cac ggg atc gcc 1219Val His Gly Lys Arg Tyr Ala Tyr Lys Phe Asp Phe His Gly Ile Ala360 365 370cag gcc ctc cag ccc cac ccc ccg gag tca tct ctg tac aag tac ccc 1267Gln Ala Leu Gln Pro His Pro Pro Glu Ser Ser Leu Tyr Lys Tyr Pro375 380 385tca gac ctc ccg tac atg ggc tcc tat cac gcc cac cca cag aag atg 1315Ser Asp Leu Pro Tyr Met Gly Ser Tyr His Ala His Pro Gln Lys Met390 395 400
aac ttt gtg gcg ccc cac cct cca gcc ctc ccc gtg aca tct tcc agt 1363Asn Phe Val Ala Pro His Pro Pro Ala Leu Pro Val Thr Ser Ser Ser405 410 415 420ttt ttt gct gcc cca aac cca tac tgg aat tca cca act ggg ggt ata 1411Phe Phe Ala Ala Pro Asn Pro Tyr Trp Asn Ser Pro Thr Giy Giy Iie425 430 435tac ccc aac act agg ctc ccc acc agc cat atg cct tct cat ctg ggc 1459Tyr Pro Asn Thr Arg Leu Pro Thr Ser His Met Pro Ser His Leu Gly440 445 450act tac tac taa agacctggcg gaggcttttc ccatcagcgt gcattcacca 1511Thr Tyr Tyr *455gcccatcgcc acaaactcta tcggagaaca tgaatcaaaa gtgcctcaag aggaatgaaa 1571aaagctttac tggggctggg gaaggaagcc ggggaagaga tccaaagact cttgggaggg 1631agttactgaa gtcttactac agaaatgagg aggatgctaa aaatgtcacg aatatggaca 1691tatcatctgt ggactgacct tgtaaaagac agtgtatgta gaagcatgaa gtcttaagga 1751caaagtgcca aagaaagtgg tcttaagaaa tgtataaact ttagagtaga gtttggaatc 1811ccactaatgc aaactgggat gaaactaaag caatagaaac aacacagttt tgacctaaca 1871taccgtttat aatgccattt taaggaaaac tacctgtatt taaaaataga aacatatcaa 1931aaacaagaga aaagacacga gagagactgt ggcccatcaa cagacgttga tatgcaactg 1991catggcatgt gctgttttgg ttgaaatcaa atacattccg tttgatggac agctgtcagc 2051tttctcaaac tgtgaagatg acccaaagtt tccaactcct ttacagtatt accgggacta 2111tgaactaaaa ggtgggactg aggatgtgta tagagtgagc gtgtgattgt agacagaggg 2171gtgaagaagg aggaggaaga ggcagagaag gaggagacca gggctgggaa agaaacttct 2231caagcaatga agactggact caggacattt ggggactgtg tacaatgagt tatggagact 2291cgagggttca tgcagtcagt gttataccaa acccagtgtt aggagaaagg acacagcgta 2351atggagaaag gggaagtagt agaattcaga aacaaaaatg cgcatctctt tctttgtttg 2411tcaaatgaaa attttaactg gaattgtctg atatttaaga gaaacattca ggacctcatc 2471attatgtggg ggctttgttc tccacagggt caggtaagag atggccttct tggctgccac 2531aatcagaaat cacgcaggca ttttgggtag gcggcctcca gttttccttt gagtcgcgaa 2591cgctgtgcgt ttgtcagaat gaagtataca agtcaatgtt tttccccctt tttatataat 2651aattatataa cttatgcatt tatacactac gagttgatct cggccagcca aagacacacg 2711acaaaagaga caatcgatat aatgtggcct tgaattttaa ctctgtatgc ttaatgttta 2771caatatgaag ttattagttc ttagaatgca gaatgtatgt aataaaataa gcttggccta 2831gcatggcaaa tcagatttat acaggagtct gcatttgcac tttttttagt gactaaagtt 2891gcttaatgaa aacatgtgct gaatgttgtg gattttgtgt tataatttac tttgtccagg 2951aacttgtgca agggagagcc aaggaaatag gatgtttggc acccaaatgg cgtcagcctc 3011tccaggtcct tcttgcctcc cctcctgtct tttatttcta gccccttttg gaacagaagg 3071accccgggtt tcacattgga gcctccatat ttatgcctgg aatggaaaga ggcctatgaa 3131gctggggttg tcattgagaa attctagttc agcacctggt cacaaatcac ccttaattcc 3191tgctatgatt aaaatacatt tgttgaacag tgaacaagct accactcgta aggcaaactg 3251tattattact ggcaaataaa gcgtcatgga tagctgcaat ttctcacttt aca3304<210>18<211>455<212>PRT<213>人<400>18Met Ala Ser Thr Ile Lys Glu Ala Leu Ser Val Val Ser Glu Asp Gln1 5 10 15Ser Leu Phe Glu Cys Ala Tyr Gly Thr Pro His Leu Ala Lys Thr Glu20 25 30Met Thr Ala Ser Ser Ser Ser Asp Tyr Gly Gln Thr Ser Lys Met Ser35 40 45Pro Arg Val Pro Gln Gln Asp Trp Leu Ser Gln Pro Pro Ala Arg Val50 55 60Thr Ile Lys Met Glu Cys Asn Pro Ser Gln Val Asn Gly Ser Arg Asn65 70 75 80Ser Pro Asp Glu Cys Ser Val Ala Lys Gly Gly Lys Met Val Gly Ser85 90 95Pro Asp Thr Val Gly Met Asn Tyr Gly Ser Tyr Met Glu Glu Lys His100 105 110Met Pro Pro Pro Asn Met Thr Thr Asn Glu Arg Arg Val Ile Val Pro115 120 125Ala Asp Pro Thr Leu Trp Ser Thr Asp His Val Arg Gln Trp Leu Glu130 135 140Trp Ala Val Lys Glu Tyr Gly Leu Pro Asp Val Asn Ile Leu Leu Phe145 150 155 160Gln Asn Ile Asp Gly Lys Glu Leu Cys Lys Met Thr Lys Asp Asp Phe165 170 175Gln Arg Leu Thr Pro Ser Tyr Asn Ala Asp Ile Leu Leu Ser His Leu
180 185 190His Tyr Leu Arg Glu Thr Pro Leu Pro His Leu Thr Ser Asp Asp Val195 200 205Asp Lys Ala Leu Gln Asn Ser Pro Arg Leu Met His Ala Arg Asn Thr210 215 220Asp Leu Pro Tyr Glu Pro Pro Arg Arg Ser Ala Trp Thr Gly His Gly Gly His Gly225 230 235 240His Pro Thr Pro Gln Ser Lys Ala Ala Gln Pro Ser Pro Ser Thr Val245 250 255Pro Lys Thr Glu Asp Gln Arg Pro Gln Leu Asp Pro Tyr Gln Ile Leu260 265 270Gly Pro Thr Ser Ser Arg Leu Ala Asn Pro Gly Ser Gly Gln Ile Gln275 280 285Leu Trp Gln Phe Leu Leu Glu Leu Leu Ser Asp Ser Ser Asn Ser Ser290 295 300Cys Ile Thr Trp Glu Gly Thr Asn Gly Glu Phe Lys Met Thr Asp Pro305 310 315 320Asp Glu Val Ala Arg Arg Trp Gly Glu Arg Lys Ser Lys Pro Asn Met325 330 335Asn Tyr Asp Lys Leu Ser Arg Ala Leu Arg Tyr Tyr Tyr Asp Lys Asn340 345 350Ile Met Thr Lys Val His Gly Lys Arg Tyr Ala Tyr Lys Phe Asp Phe355 360 365His Gly Ile Ala Gln Ala Leu Gln Pro His Pro Pro Glu Ser Ser Leu370 375 380Tyr Lys Tyr Pro Ser Asp Leu Pro Tyr Met Gly Ser Tyr His Ala His385 390 395 400Pro Gln Lys Met Asn Phe Val Ala Pro His Pro Pro Ala Leu Pro Val405 410 415Thr Ser Ser Ser Phe Phe Ala Ala Pro Asn Pro Tyr Trp Asn Ser Pro420 425 430Thr Gly Gly Ile Tyr Pro Asn Thr Arg Leu Pro Thr Ser His Met Pro435 440 445Ser His Leu Gly Thr Tyr Tyr450 455<210>19<211>662<212>DNA<213>人<220>
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100 105 110 115tta gtg gtg gag tgt gtc atg aac aat gtc acc tgt act cgg atc tat 441Leu Val Val Glu Cys Val Met Asn Asn Val Thr Cys Thr Arg Ile Tyr120 125 130gaa aaa gta gaa taa aaattccatc atcactttgg acaggagtta attaagagaa 496Glu Lys Val Glu *135tgaccaagct cagttcaatg agcaaatctc catactgttt ctttcttttt tttttcatta 556ctgtgttcaa ttatctttat cataaacatt ttacatgcag ctatttcaaa gtgtgttgga 616ttaattagga tcatcccttt ggttaataaa taaatgtgtt tgtgct662<210>20<211>135<212>PRT<213>人<400>20Met Ala Thr Val Gln Gln Leu Glu Gly Arg Trp Arg Leu Val Asp Ser1 5 10 15Lys Gly Phe Asp Glu Tyr Met Lys Glu Leu Gly Val Gly Ile Ala Leu20 25 30Arg Lys Met Gly Ala Met Ala Lys Pro Asp Cys Ile Ile Thr Cys Asp35 40 45Gly Lys Asn Leu Thr Ile Lys Thr Glu Ser Thr Leu Lys Thr Thr Gln50 55 60Phe Ser Cys Thr Leu Gly Glu Lys Phe Glu Glu Thr Thr Ala Asp Gly65 70 75 80Arg Lys Thr Gln Thr Val Cys Ash Phe Thr Asp Gly Ala Leu Val Gln85 90 95His Gln Glu Trp Asp Gly Lys Glu Ser Thr Ile Thr Arg Lys Leu Lys100 105 110Asp Gly Lys Leu Val Val Glu Cys Val Met Asn Asn Val Thr Cys Thr115 120 125Arg Ile Tyr Glu Lys Val Glu130 135<210>21<211>4466<21 2>DNA<213>人<220>
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85 90 95 100ttg gta gac atc agc aac aac ctc aaa atc aat caa tat cca gaa tct 450Leu Val Asp Ile Ser Asn Asn Leu Lys Ile Asn Gln Tyr Pro Glu Ser105 110 115aat gca gag tac ctt gct cat ttg gtg cca gga gcc cac gtg gta aaa 498Asn Ala Glu Tyr Leu Ala His Leu Val Pro Gly Ala His Val Val Lys120 125 130gca ttt aac acc atc tca gcc tgg gct ctc cag tca gga gca ctg gat 546Ala Phe Asn Thr Ile Ser Ala Trp Ala Leu Gln Ser Gly Ala Leu Asp135 140 145gca agt cgg cag gtg ttt gtg tgt gga aat gac agc aaa gcc aag caa 594Ala Ser Arg Gln Val Phe Val Cys Gly Asn Asp Ser Lys Ala Lys Gln150 155 160aga gtg atg gat att gtt cgt aat ctt gga ctt act cca atg gat caa 642Arg Val Met Asp Ile Val Arg Asn Leu Gly Leu Thr Pro Met Asp Gln165 170 175 180gga tca ctc atg gca gcc aaa gaa att gaa aag tac ccc ctg cag cta 690Gly Ser Leu Met Ala Ala Lys Glu Ile Glu Lys Tyr Pro Leu Gln Leu185 190 195ttt cca atg tgg agg ttc ccc ttc tat ttg tct gct gtg ctg tgt gtc 738Phe Pro Met Trp Arg Phe Pro Phe Tyr Leu Ser Ala Val Leu Cys Val200 205 210ttc ttg ttt ttc tat tgt gtt ata aga gac gta atc tac cct tat gtt 786Phe Leu Phe Phe Tyr Cys Val Ile Arg Asp Val Ile Tyr Pro Tyr Val215 220 225tat gaa aag aaa gat aat aca ttt cgt atg gct att tcc att cca aat 834Tyr Glu Lys Lys Asp Asn Thr Phe Arg Met Ala Ile Ser Ile Pro Asn230 235 240cgt atc ttt cca ata aca gca ctt aca ctg ctt gct ttg gtt tacctc882Arg Ile Phe Pro Ile Thr Ala Leu Thr Leu Leu Ala Leu Val Tyr Leu245 250 255 260cct ggt gtt att gct gcc att cta caa ctg tac cga ggc aca aaa tac 930Pro Gly Val Ile Ala Ala Ile Leu Gln Leu Tyr Arg Gly Thr Lys Tyr265 270 275cgt cga ttc cca gac tgg ctt gac cac tgg atg ctt tgc cga aag cag 978Arg Arg Phe Pro Asp Trp Leu Asp His Trp Met Leu Cys Arg Lys Gln280 285 290ctt ggc ttg gta gct ctg gga ttt gcc ttc ctt cat gtc ctc tac aca 1026Leu Gly Leu ValAla Leu Gly Phe Ala Phe Leu His Val Leu Tyr Thr295300 305ctt gtg att cct att cga tat tat gta cga tgg aga ttg gga aac tta 1074Leu Val Ile Pro Ile Arg Tyr Tyr Val Arg Trp Arg Leu Gly Asn Leu310 315 320acc gtt acc cag gca ata ctc aag aag gag aat cca ttt agc acc tcc 1122Thr Val Thr Gln Ala Ile Leu Lys Lys Glu Asn Pro Phe Ser Thr Ser325 330 335 340tca gcc tgg ctc agt gat tca tat gtg gct ttg gga ata ctt ggg ttt 1170Ser Ala Trp Leu Ser Asp Ser Tyr Val Ala Leu Gly Ile Leu Gly Phe345 350 355ttt ctg ttt gta ctc ttg gga atc act tct ttg cca tct gtt agc aat 1218Phe Leu Phe Val Leu Leu Gly Ile Thr Ser Leu Pro Ser Val Ser Asn360 365 370gca gtc aac tgg aga gag ttc cga ttt gtc cag tcc aaa ctg ggt tat 1266Ala Val Asn Trp Arg Glu Phe Arg Phe Val Gln Ser Lys Leu Gly Tyr375 380 385ttg acc ctg atc ttg tgt aca gcc cac acc ctg gtg tac ggt ggg aag 1314Leu Thr Leu Ile Leu Cys Thr Ala His Thr Leu Val Tyr Gly Gly Lys390 395 400
aga ttc ctc agc cct tca aat ctc aga tgg tat ctt cct gca gcc tac 1362Arg Phe Leu Ser Pro Ser Asn Leu Arg Trp Tyr Leu Pro Ala Ala Tyr405 410 415 420gtg tta ggg ctt atc att cct tgc act gtg ctg gtg atc aag ttt gtc 1410Val Leu Gly Leu Ile Ile Pro Cys Thr Val Leu Val Ile Lys Phe Val425 430 435cta atc atg cca tgt gta gac aac acc ctt aca agg atc cgc cag ggc 1458Leu Ile Met Pro Cys Val Asp Asn Thr Leu Thr Arg Ile Arg Gln Gly440 445 450tgg gaa agg aac tca aaa cac tag aaaaagcatt gaatggaaaa tcaatattta 1512Trp Glu Arg Asn Ser Lys His *455aaacaaagtt caatttagct ggatttctga actatggttt tgaatgttta aagaagaatg 1572atgggtacag ttaggaaagt ttttttctta caccgtgact gagggaaaca ttgcttgtct 1632ttgagaaatt gactgacata ctggaagaga acaccatttt atctcaggtt agtgaagaat 1692cagtgcaggt ccctgactct tattttccca gaggccatgg agctgagatt gagactagcc 1752ttgtggtttc acactaaaga gtttccttgt tatgggcaac atgcatgacc taatgtcttg 1812caaaatccaa tagaagtatt gcagcttcct tctctggctc aagggctgag ttaagtgaaa 1872ggaaaaacag cacaatggtg accactgata aaggctttat taggtatatc tgaggaagtg 1932ggtcacatga aatgtaaaaa gggaatgagg tttttgttgt tttttggaag taaaggcaaa 1992cataaatatt accatgatga attctagtga aatgacccct tgactttgct tttcttaata 2052cagatattta ctgagaggaa ctatttttat aacacaagaa aaatttacaa ttgattaaaa 2112gtatccatgt cttggataca tacgtatcta tagagctggc atgtaattct tcctctataa 2172agaataggta taggaaagac tgaataaaaa tggagggata tccccttgga tttcacttgc 2232attgtgcaat aagcaaagaa gggttgataa aagttcttga tcaaaaagtt caaagaaacc 2292agaattttag acagcaagct aaataaatat tgtaaaattg cactatatta ggttaagtat 2352tatttaggta ttataatatg ctttgtaaat tttatattcc aaatattgct caatattttt 2412catctattaa attaatttct agtgtaaata agtagcttct atatctgtct tagtctatta 2472taattgtaag gagtaaaatt aaatgaatag tctgcaggta taaatttgaa caatgcatag 2532atgatcgaaa attacggaaa atcatagggc agagaggtgt gaagattcat cattatgtga 2592aatttggatc tttctcaaat ccttgctgaa atttaggatg gttctcactg tttttctgtg 2652ctgatagtac cctttccaag gtgaccttca gggggattaa ccttcctagc tcaagcaatg 2712agctaaaagg agccttatgc atgatcttcc cacatatcaa aataactaaa aggcactgag 2772tttggcattt ttctgcctgc tctgctaaga cctttttttt tttttacttt cattataaca 2832tattatacat gacattatac aaaaatgatt aaaatatatt aaaacaacat caacaatcca 2892ggatattttt ctataaaact ttttaaaaat aattgtatct atatattcaa ttttacatcc 2952tttttcaaag gctttgtttt tctaaaggct ttgttttcct ttttattatt tttttctttt 3012ttattttttt gagacagtct tgctctgtcg ctcaggctgg agtgcagtgg cacgatctca 3072gctcactgca acctcctcct cccaggttca agtgattctt gttcatcagc ctcccgagta 3132gctgggacta caggcatgtg ccactatgcc cagctaattt ttgtactttt agtagagaca 3192gggtttcacc acattggtca ggctggtctt gaaatgctgg cgtcaagtga tctgcctgcc 3252tccgcctcac aaagcactgg gattacaggc atgaatctgg ccttacgtaa tatattttct 3312taatggctgc ataatatcac atcaaatagg catttttcaa acctctttcc ttattaaaca 3372tgtagactat atccattttt tactaaaata aataacattt cagataatat ctttgcactg 3432ataatgttgc caagccattt ctaaagtgac cttatcaatt taattaccat tggatgaggg 3492tgttgctttc atcgcaccat tgtagattgt cttttttatt tcaatttgcg tttatttata 3552actggttgca aaggtacaca gaacacacgc tccttcaact tatctttgat aaacccaagc 3612aaggatacaa aaagttggac gacattgagt agagtcatgg tatacggtgc tgaccctaca 3672gtatcagtgg aaaagataag gaaaatgtca ctactcacct atgttatgca aaacagttag 3732gtgtgctggg gctggatact gctcttttac ttgagcattg gttgattaaa gtttaggtac 3792catccaggct ggtctagaga agtctttgga gttaaccatg ctctttttgt taaagaagag 3852agtaatgtgt ttatcctggc tcatagtccg tcaccgaaaa tagaaaatgc catccatagg 3912taaaatgctg acctatagaa aaaaatgaac tctactttta tagcctagta aaaatgctct 3972acctgagtag ttaaaagcaa ttcatgaagc ctgaagctaa agagcactct gatggttttg 4032gcataatagc tgcatttcca gacctgacct ttggccccaa ccacaagtgc tccaagcccc 4092accagctgac caaagaaagc ccaagttctc cttctgtcct tcccacaacc tccctgctcc 4152caaaactatg aaattaattt gaccatatta acacagctga ctcctccagt ttacttaagg 4212tagaaagaat gagtttacaa cagatgaaaa taagtgcttt gggcgaactg tattcctttt 4272aacagatcca aactatttta catttaaaaa aaaagttaaa ctaaacttct ttactgctga 4332tatgtttcct gtattctaga aaaattttta cactttcaca ttatttttgt acactttccc 4392catgttaagg gatgatggct tttataaatg tgtattcatt aaatgttact ttaaaaataa 4452aaaaaaaaaa aaaa 4466<210>22<211>459<212>PRT<213>人<400>22Met Glu Lys Thr Cys Ile Asp Ala Leu Pro LPu Thr Met Asn Ser Ser1 5 10 15Glu Lys Gln Glu Thr Val Cys Ile Phe Gly Thr Gly Asp PhP Gly Arg
20 25 30Ser Leu Gly Leu Lys Met Leu Gln Cys Gly Tyr Ser Val Val Phe Gly35 40 45Ser Arg Asn Pro Gln Lys Thr Thr Leu Leu Pro Ser Gly Ala Glu Val50 55 60Leu Ser Tyr Ser Glu Ala Ala Lys Lys Ser Asp Ile Ile Ile Ile Ala65 70 75 80Ile His Arg Glu His Tyr Asp Phe Leu Thr Glu Leu Thr Glu Val Leu85 90 95Asn Gly Lys Ile Leu Val Asp Ile Ser Asn Asn Leu Lys Ile Asn Gln100 105 110Tyr Pro Glu Ser Asn Ala Glu Tyr Leu Ala His Leu Val Pro Gly Ala115 120 125His Val Val Lys Ala Phe Asn Thr Ile Ser Ala Trp Ala Leu Gln Ser130 135 140Gly Ala Leu Asp Ala Ser Arg Gln Val Phe Val Cys Gly Asn Asp Ser145 150 155 160Lys Ala Lys Gln Arg Val Met Asp Ile Val Arg Asn Leu Gly Leu Thr165 170 175Pro Met Asp Gln Gly Ser Leu Met Ala Ala Lys Glu Ile Glu Lys Tyr180 185 190Pro Leu Gln Leu Phe Pro Met Trp Arg Phe Pro Phe Tyr Leu Ser Ala195 200 205Val Leu Cys Val Phe Leu Phe Phe Tyr Cys Val Ile Arg Asp Val Ile210 215 220Tyr Pro Tyr Val Tyr Glu Lys Lys Asp Asn Thr Phe Arg Met Ala Ile225 230 235 240Ser Ile Pro Asn Arg Ile Phe Pro Ile Thr Ala Leu Thr Leu Leu Ala245 250 255Leu Val Tyr Leu Pro Gly Val Ile Ala Ala Ile Leu Gln Leu Tyr Arg260 265 270Gly Thr Lys Tyr Arg Arg Phe Pro Asp Trp Leu Asp His Trp Met Leu275 280 285Cys Arg Lys Gln Leu Gly Leu Val Ala Leu Gly Phe Ala Phe Leu His290 295 300Val Leu Tyr Thr Leu Val Ile Pro Ile Arg Tyr Tyr Val Arg Trp Arg305 310 315 320Leu Gly Asn Leu Thr Val Thr Gln Ala Ile Leu Lys Lys Glu Asn Pro325 330 335Phe Ser Thr Ser Ser Ala Trp Leu Ser Asp Ser Tyr Val Ala Leu Gly340 345 350Ile Leu Gly Phe Phe Leu Phe Val Leu Leu Gly Ile Thr Ser Leu Pro355 360 365Ser Val Ser Asn Ala Val Asn Trp Arg Glu Phe Arg Phe Val Gln Ser370 375 380Lys Leu Gly Tyr Leu Thr Leu Ile Leu Cys Thr Ala His Thr Leu Val385 390 395 400Tyr Gly Gly Lys Arg Phe Leu Ser Pro Ser Asn Leu Arg Trp Tyr Leu405 410 415Pro Ala Ala Tyr Val Leu Gly Leu Ile Ile Pro Cys Thr Val Leu Val420 425 430Ile Lys Phe Val Leu Ile Met Pro Cys Val Asp Asn Thr Leu Thr Arg435 440 445Ile Arg Gln Gly Trp Glu Arg Asn Set Lys His450 455<210>23<211>3080<212>DNA<213>人<220>
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ttg ggc ttc aac tac tgg att gcg agc tcc cgg agc gtg gac ctc cag 327Leu Gly Phe Asn Tyr Trp Ile Ala Ser Ser Arg Ser Val Asp Leu Gln30 35 40aca cgg atc atg gag ctg gaa ggc agg gtc cgc agg gcg gct gca gag 375Thr Arg Ile Met Glu Leu Glu Gly Arg Val Arg Arg Ala Ala Ala Glu45 50 55aga ggc gcc gtg gag ctg aag aag aac gag ttc cag gga gag ctg gag 423Arg Gly Ala Val Glu Leu Lys Lys Asn Glu Phe Gln Gly Glu Leu Glu60 65 70 75aag cag cgg gag cag ctt gac aaa atc cag tcc agc cac aac ttc cag 471Lys Gln Arg Glu Gln Leu Asp Lys Ile Gln Ser Ser His Asn Phe Gln80 85 90ctg gag agc gtc aac aag ctg tac cag gac gaa aag gcg gtt ttg gtg 519Leu Glu Ser Val Asn Lys Leu Tyr Gln Asp Glu Lys Ala Val Leu Val95 100 105aat aac atc acc aca ggt gag agg ctc atc cga gtg ctg caa gac cag 567Asn Asn Ile Thr Thr Gly Glu Arg Leu Ile Arg Val Leu Gln Asp Gln110 115 120tta aag acc ctg cag agg aat tac ggc agg ctg cag cag gat gtc ctc 615Leu Lys Thr Leu Gln Arg Asn Tyr Gly Arg Leu Gln Gln Asp Val Leu125 130 135cag ttt cag aag aac cag acc aac ctg gag agg aag ttc tcc tac gac 663Gln Phe Gln Lys Asn Gln Thr Asn Leu Glu Arg Lys Phe Ser Tyr Asp140 145 150 155ctg agc cag tgc atc aat cag atg aag gag gtg aag gaa cag tgt gag 711Leu Ser Gln Cys Ile Asn Gln Met Lys Glu Val Lys Glu Gln Cys Glu160 165 170gag cga ata gaa gag gtc acc aaa aag ggg aat gaa gct gta gct tcc 759Glu Arg Ile Glu Glu Val Thr Lys Lys Gly Asn Glu Ala Val Ala Ser175 180 185aga gac ctg agt gaa aac aac gac cag aga cag cag ctc caa gcc ctc 807Arg Asp Leu Ser Glu Asn Asn Asp Gln Arg Gln Gln Leu Gln Ala Leu190 195 200agt gag cct cag ccc agg ctg cag gca gca ggc ctg cca cac aca gag 855Ser Glu Pro Gln Pro Arg Leu Gln Ala Ala Gly Leu Pro His Thr Glu205 210 215gtg cca caa ggg aag gga aac gtg ctt ggt aac agc aag tcc cag aca 903Val Pro Gln Gly Lys Gly Asn Val Leu Gly Asn Ser Lys Ser Gln Thr220 225 230 235cca gcc ccc agt tcc gaa gtg gtt ttg gat tca aag aga caa gtt gag 951Pro Ala Pro Ser Ser Glu Val Val Leu Asp Ser Lys Arg Gln Val Glu240 245 250aaa gag gaa acc aat gag atc cag gtg gtg aat gag gag cct cag agg 999Lys Glu Glu Thr Asn Glu Ile Gln Val Val Asn Glu Glu Pro Gln Arg255 260 265gac agg ctg ccg cag gag cca ggc cgg gag cag gtg gtg gaa gac aga 1047Asp Arg Leu Pro Gln Glu Pro Gly Arg Glu Gln Val Val Glu Asp Arg270 275 280cct gta ggt gga aga ggc ttc ggg gga gcc gga gaa ctg ggc cag acc 1095Pro Val Gly Gly Arg Gly Phe Gly Gly Ala Gly Glu Leu Gly Gln Thr285 290 295cca cag gtg cag gct gcc ctg tca gtg agc cag gaa aat cca gag atg 1143Pro Gln Val Gln Ala Ala Leu Ser Val Ser Gln Glu Asn Pro Glu Met300 305 310 315gag ggc ccc gag cga gac cag ctt gtc atc ccc gac gga cag gag gag 1191Glu Gly Pro Glu Arg Asp Gln Leu Val Ile Pro Asp Gly Gln Glu Glu320 325 330
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105 110 115 120ccc atc tac tcg cgg tat ggt agt gtg gag gcg ctg tcg gct acc atg 738Pro Ile Tyr Ser Arg Tyr Gly Ser Val Glu Ala Leu Ser Ala Thr Met125 130 135ggt gta atg acc gcc ctg gtg tcc ttt gtg cag agt gcg gga gat gcc 786Gly Val Met Thr Ala Leu Val Ser Phe Val Gln Ser Ala Gly Asp Ala140 145 150atc cgt gcc atc tac gct gag gac cac aag ctg gtg ttc cta caa cag 834Ile Arg Ala Ile Tyr Ala Glu Asp His Lys Leu Val Phe Leu Gln Gln155 160 165ggc cca ctg ttg ctc gtg gcc atg tca cgg act tct cag tca gca gcc 882Gly Pro Leu Leu Leu Val Ala Met Ser Arg Thr Ser Gln Ser Ala Ala170 175 180cag ctg cgg ggg gag ctg cta gct gtg cac gca cag atc gtg agc aca 930Gln Leu Arg Gly Glu Leu Leu Ala Val His Ala Gln Ile Val Ser Thr185 190 195 200ctt aca cgt gca agt gtc gcc cgc atc ttc gca cac aag cag aac tat 978Leu Thr Arg Ala Ser Val Ala Arg Ile Phe Ala His Lys Gln Asn Tyr205 210 215gac ctc cgc cgc ctg ctg gct ggt tca gag cgc aca ctg gac cga ctt 1026Asp Leu Arg Arg Leu Leu Ala Gly Ser Glu Arg Thr Leu Asp Arg Leu220 225 230ctg gac agt atg gag cag gac cca gga gcc ctg ctc ctg ggt gcc gtg 1074Leu Asp Ser Met Glu Gln Asp Pro Gly Ala Leu Leu Leu Gly Ala Val235 240 245cgc tgt gtg ccc ctt gcc cgc ccg ctg cga gac gca cta ggt gcg ctc 1122Arg Cys Val Pro Leu Ala Arg Pro Leu Arg Asp Ala Leu Gly Ala Leu250 255 260ctc cga cgt tgc aca gcg cct ggc ctg gcg ctg tca gtg ctg gca gta 1170Leu Arg Arg Cys Thr Ala Pro Gly Leu Ala Leu Ser Val Leu Ala Val265 270 275 280ggc ggt cga ctt ata aca gca gcc cag gag cga aat gtg ctg gcc gag 1218Gly Gly Arg Leu Ile Thr Ala Ala Gln Glu Arg Asn Val Leu Ala Glu285 290 295tgc cgg ctg gac cca gct gac ctg cag ttg ctg ctc gac tgg gtg ggt 1266Cys Arg Leu Asp Pro Ala Asp Leu Gln Leu Leu Leu Asp Trp Val Gly300 305 310gca cca gcc ttt gcg gcg ggt gag gct tgg gca cct gtg tgc ctg ccc 1314Ala Pro Ala Phe Ala Ala Gly Glu Ala Trp Ala Pro Val Cys Leu Pro315 320 325cgc ttc aac cct gat ggt ttt ttc tac gcc tac gtg gcc cgc ctg gat 1362Arg Phe Asn Pro Asp Gly Phe Phe Tyr Ala Tyr Val Ala Arg Leu Asp330 335 340gct atg cct gtc tgc ctg ctg ctg ctt ggc acc caa cgt gaa gcc ttc 1410Ala Met Pro Val Cys Leu Leu Leu Leu Gly Thr Gln Arg Glu Ala Phe345 350 355 360cat gcc atg gcc gcc tgc cgg cgc ctg gtt gaa gat ggg atg cat gcc 1458His Ala Met Ala Ala Cys Arg Arg Leu Val Glu Asp Gly Met His Ala365 370 375ctt ggt gcc atg cgt gcc ctt ggg gag gct gcc agc ttc tct aat gcc 1506Leu Gly Ala Met Arg Ala Leu Gly Glu Ala Ala Ser Phe Ser Asn Ala380 385 390tca tca gcc agt gct cct gcc tac agc gtg cag gct gtc ggg gcg ccg 1554Ser Ser Ala Ser Ala Pro Ala Tyr Ser Val Gln Ala Val Gly Ala Pro395 400 405ggc ctc cgg cac ttc ctg tat aag ccg ctg gac atc cct gac cac cac 1602Gly Leu Arg His Phe Leu Tyr Lys Pro Leu Asp Ile Pro Asp His His410 415 420
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260 265 270cca agg act gga aca act cag tct cgc tct ttc cga atc ctt gcc cag 984Pro Arg Thr Gly Thr Thr Gln Ser Arg Ser Phe Arg Ile Leu Ala Gln275 280 285atc act ggg act gaa cat ttg aaa gaa tct gaa gcc gat aat aca aag 1032Ile Thr Gly Thr Glu His Leu Lys Glu Ser Glu Ala Asp Asn Thr Lys290 295 300aag gca aat aac tct cag gag cct tct ccg cag ttg gct tcc tcg gta 1080Lys Ala Asn Asn Ser Gln Glu Pro Ser Pro Gln Leu Ala Ser Ser Val305 310 315 320gct tcc aca cgg agc atg ccc gag agc ctg gac agc cca acc tct ggc 1128Ala Ser Thr Arg Ser Met Pro Glu Ser Leu Asp Ser Pro Thr Ser Gly325 330 335aga cca ggg gtt acc agc ctc aca act gca gct gcc ttc aag cct gta 1176Arg Pro Gly Val Thr Ser Leu Thr Thr Ala Ala Ala Phe Lys Pro Val340 345 350gga tcc act ggc gtc atc aag tca cca agc tgg caa cgg cca aac caa 1224Gly Ser Thr Gly Val Ile Lys Ser Pro Ser Trp Gln Arg Pro Asn Gln355 360 365gga gta cct tcc act gga aga atc tca aac agc gct act tac tca gga 1272Gly Val Pro Ser Thr Gly Arg Ile Ser Asn Ser Ala Thr Tyr Ser Gly370 375 380tca gtg gca cca gcc aac tca gct ttg gga caa acc cag cca agt gac 1320Ser Val Ala Pro Ala Asn Ser Ala Leu Gly Gln Thr Gln Pro Ser Asp385 390 395 400cag gac act tta gtg caa aga gct gag cac att cca gca ggg aaa cga 1368Gln Asp Thr Leu Val Gln Arg Ala Glu His Ile Pro Ala Gly Lys Arg405 410 415act ccg atg tgc gcc cat tgt aac cag gtc atc aga gga cca ttc tta 1416Thr Pro Met Cys Ala His Cys Asn Gln Val Ile Arg Gly Pro Phe Leu420 425 430gtg gca ctg ggg aaa tct tgg cac cca gaa gaa ttc aac tgc gct cac 1464Val Ala Leu Gly Lys Ser Trp His Pro Glu Glu Phe Asn Cys Ala His435 440 445tgc aaa aat aca atg gcc tac att gga ttt gta gag gag aaa gga gcc 1512Cys Lys Asn Thr Met Ala Tyr Ile Gly Phe Val Glu Glu Lys Gly Ala450 455 460ctg tat tgt gag ctg tgc tat gag aaa ttc ttt gcc cct gaa tgt ggt 1560Leu Tyr Cys Glu Leu Cys Tyr Glu Lys Phe Phe Ala Pro Glu Cys Gly465 470 475 480cga tgc caa agg aag atc ctt gga gaa gtc atc aat gcg ttg aaa caa 1608Arg Cys Gln Arg Lys Ile Leu Gly Glu Val Ile Asn Ala Leu Lys Gln485 490 495act tgg cat gtt tcc tgt ttt gtg tgt gta gcc tgt gga aag ccc att 1656Thr Trp His Val Ser Cys Phe Val Cys Val Ala Cys Gly Lys Pro Ile500 505 510cgg aac aat gtt ttt cac ttg gag gat ggt gaa ccc tac tgt gag act 1704Arg Asn Asn Val Phe His Leu Glu Asp Gly Glu Pro Tyr Cys Glu Thr515 520 525gat tat tat gcc ctc ttt ggt act ata tgc cat gga tgt gaa ttt ccc 1752Asp Tyr Tyr Ala Leu Phe Gly Thr Ile Cys His Gly Cys Glu Phe Pro530 535 540ata gaa gct ggt gac atg ttc ctg gaa gct ctg ggc tac acc tgg cat 1800Ile Glu Ala Gly Asp Met Phe Leu Glu Ala Leu Gly Tyr Thr Trp His545 550 555 560gac act tgc ttt gta tgc tca gtg tgt tgt gaa agt ttg gaa ggt cag 1848Asp Thr Cys Phe Val Cys Ser Val Cys Cys Glu Ser Leu Glu Gly Gln565 570 575
acc ttt ttc tcc aag aag gac aag ccc ctg tgt aag aaa cat gct cat1896Thr Phe Phe Ser Lys Lys Asp Lys Pro Leu Cys Lys Lys His Ala His580 585 590tct gtg aat ttt tga aagtcaacag ttcaggagaa gagaaggaat ttgaagagaa1951Ser Val Asn Phe *595aaaggaaaat taaaattact aattaatttt tagattcaat atttatatgg agttttgaaa 2011aataatagtg gccctgaagg aataaattcc agctttaaaa accaagtctg aggaaatatt 2071tggcttcata aagtaaagag acggtttggc atttattatt actttttcct gtattttatg 2131cccataaaat aagctttata aaaaccaatt tcctgatgga ctattaaatt catcttagaa 2191taaattagtg aagaatttaa ttttagaata aataatccaa tctgaaataa ttataccttc 2251tttccttgtt aggtagttat gagtaaatct gcaaaaggca atgaaaatgc cttaaatttt 2311atcaataaca gaattattgt atttaaaaaa aaactaatac ttatctttaa aatagtaaat 2371aggattttaa acagagaatt ttatcagtaa taggtgtcag tttttaaaaa attgcttgta 2431ggctgagcgc ggtggctcac gcctgtaatc ccagcacttt gggaggccaa ggtgggtgga 2491ccacatgagg tcaggagttt gagatcagcc tggccaacat ggtgaaaccc catctctact 2551aaaaatacaa aaattagccg gacgcagtgg cacgcgcctg taatcccagc tactcaagag 2611gctgaggcac gagaatcact tgaacccggg agggagaggt tgcagtgagc caagatcgta 2671ccactgcact ccagcctggg tgacagagtg agactctgtc tccaaaaaaa aactttgctt 2731gtatattatt tttgccttac agtggatcat tctagtagga aaggacaata agatttttta 2791tcaaaatgtg tcatgccagt aagagatgtt atattctttt ctcatttctt ccccacccaa 2851aaataagcta ccatatagct tataagtctc aaatttttgc cttttactaa aatgtgattg 2911tttctgttca ttgtgtatgc ttcatcacct atattaggca aattccattt ttttcccttg 2971tgctaaggta aagatttaat taaataattt tggcctctca tagttttctc tctctttaaa 3031gagaataaat agagggccag gtgtggtggc tcacgcctgt gatcccagca ctttgggagg 3091ccaagacggg cggatcatga ggtcaagaga tcaagatcat cctggccaac atggtgaaac 3151cctgtctcta ctaaaaatac aaaaatgagc tgggcatggt ggggcgtgcc tgtagtccca 3211tgtacttggg aggctgaggc aggaaaattc ttgaacccag gagacggaag ttgcagtgag 3271ctgagatcac accactgcac tccagcctgg tgacagagca agactccggc tcttaaaaaa 3331aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa agagagagag aataaataga aaagaatgtg gctgggaatt 3391gtgaatcaga agattatacc ccccaattgt ttttcaatcc ccttttctca aataataaat 3451tagttaaatc agtttctgag ttatgccact ggctgatgaa gagttgagag gtctctttgc 3511agaatgatct ttttgtttcg ttttgtttct tcttctgcat ttaaaaatta aaagattggt 3571ttgaggatgt gatgaaattg agactttttg tggttttctc tcaataataa gtgaaccaat 3631ttcaaatgtg atcacaaagt ttggaaagct tttattcaca gaggttgggt agtgttggga 3691ggggagttta attactcaga ttggcctgtt atttgatttc ctcctttggg aaaagaatta 3751tgtagatacc acatggagac agggaaacaa ttgtggtaaa actgtggatc ctgttgctat 3811ttgcccagtg agaaaacaga ttctggtatt tgatttggtt tttctctttg tttccagaat 3871ggatgaaagt ccatgaacct cctaagttat aatttaaatt tgtttggggc aaggtgattt 3931tatagtcgag acagagccct aggtccttcc tgccccatca ctcacttacg acatcacttc 3991cattgtgtgc atgtttgtta tagaggaggt tttaggctac aatatttgtt taacctccct 4051aagaactttc aaggcatctg tcctgaaagc tgttaattta tggtctagca gatttatatt 4111atatgcagat aataattaac tggggataaa agaatggcaa ggggtgacac aaagtagcaa 4171actgaatact tctccaatag caaccccaag ctacctcctc accctgcatc ttggagggag 4231gcaggaaatt tcttttgaaa taaagtgctg gagctgaatt ctgcattatt tatcgttgct 4291gctgaaacca cctataaaag acttgctggc taatgtgcat tgtcatataa tgtacactgt 4351cacatcttta cagtcttgta tgttatagaa tacaaaataa gttgatggtt ttgtttggtg 4411tgagcttttt gtttgtttag ttttgccttc ataggttata tgccaagata gtatttgata 4471agtcaatgac atttggatgt tttcttcaaa gaattttatt tgacccagat ttcttataaa 4531gttatcttac attaaggatg tcattttcat cagaccttct ttctacatat tattcatgaa 4591gcataatgtt gcatttctcc aaattttatg cctgaaaggg tagtgttgct tcctaaggta 4651tcatgttgtc tttgtgcttt gtccatctct tccgtggcga agctttatat ctgttcctaa 4711aacagttaat cctgtgaaat aaatattgaa cataatccag aagaatctct ctatttccct 4771tggggaatgc catatttaat tcaccagcag taatccttta ataactggca gagcacttta 4831ttcttctggt gagctccctg aatatttatt tttctgatta taaattttct atattagtag 4891cattttttaa ttattacttc ttcactatag agcatttact tttagtctct agatgtatat 4951tttggaatgc tgtacttggc ataacataga ttaaaatcat aatgcatgac taaaaactcc 5011ttggatttat ttcccatttt aaaattttta gcggtaagtt cagatttata atctttctct 5071agacttccat ggtctgaatg ttgcctgctg aagtagcaac ctaaaaagta tcccctgctt 5131atgcttctcc agttggccct ccatgtccat aggcttcgca tctgtgattc agcccactgt 5191gggtcaaaaa tatttgggga aaaaatggat ggttgcgcct ttgctgaaca tgtacaaact 5251tgtttttgtc attaaacaat atagtataac aactatttac aaagcattta cattgtatta 5311gctattatag gtaatctaga gatgatttaa agtgtatggt aggatgtgca caggttatat 5371gcaaatacta caccattttc tataagggac ttgaacatca tggactttag tatcctaggg 5431ggttcttgga acccatcacc cataggggca ccataggaca actatagtac cgtgtttatt 5491tcctattaat tcaggttccg tttagagtct aaaactaaaa cctaatcatt tagtcacagt 5551gtaaaaacaa atggaaataa cagctcaaat cttcaaaata ttaccatagc attatgttta 5611aaataatcta caacaaaaat gtaccatttt caagcagtac tacattàgga gcccttttat 5671agaaaataat ttcttcttta cccccgttcc agtgtgaatc tagtattctg ttaacatttg 5731tgtggcattt ggagtttgtc atccccattg aagggagagc cttctcagac atgaagcaag 5791ggaaacatac tgaatagttt tacacaaatt tgatctggct tccatttgtc cccctcattt 5851cccaaatgtt taaatgtatt ggatttgggt tctcaatgta taagttgcct tatctgttaa 5911tgtctatctt ctgtctcttt aattttgtat atctgctgtt ttgcttttgg atacattttc 5971taattagaag tcacatgata aatataatca gtatagtaat aataccataa tgtgcacata 6031
ctcaataaat aaatgactgc attgttgtaa aaaaaaaaaa aaaaaaaa6079<210>28<211>596<212>PRT<213>人<400>28Met Ser Asn Tyr Ser Val Ser Leu Val Gly Pro Ala Pro Trp Gly Phe1 5 10 15Arg Leu Gln Gly Gly Lys Asp Phe Asn Met Pro Leu Thr Ile Ser Ser20 25 30Leu Lys Asp Gly Gly Lys Ala Ala Gln Ala Asn Val Arg Ile Gly Asp35 40 45Val Val Leu Ser Ile Asp Gly Ile Asn Ala Gln Gly Met Thr His Leu50 55 60Glu Ala Gln Asn Lys Ile Lys Gly Cys Thr Gly Ser Leu Asn Met Thr65 70 75 80Leu Gln Arg Ala Ser Ala Ala Pro Lys Pro Glu Pro Val Pro Val Gln85 90 95Lys Gly Glu Pro Lys Glu Val Val Lys Pro Val Pro Ile Thr Ser Pro100 105 110Ala Val Ser Lys Val Thr Ser Thr Asn Asn Met Ala Tyr Asn Lys Ala115 120 125Pro Arg Pro Phe Gly Ser Val Ser Ser Pro Lys Val Thr Ser Ile Pro130 135 140Ser Pro Ser Ser Ala Phe Thr Pro Ala His Ala Thr Thr Ser Ser His145 150 155 160Ala Ser Pro Ser Pro Val Ala Ala Val Thr Pro Pro Leu Phe Ala Ala165170 175Ser Gly Leu His Ala Asn Ala Asn Leu Ser Ala Asp Gln Ser Pro Ser180 185 190Ala Leu Ser Ala Gly Lys Thr Ala Val Asn Val Pro Arg Gln Pro Thr195 200 205Val Thr Ser Val Cys Ser Glu Thr Ser Gln Glu Leu Ala Glu Gly Gln210 215 220Arg Arg Gly Ser Gln Gly Asp Ser Lys Gln Gln Asn Gly Pro Pro Arg225 230 235 240Lys His Ile Val Glu Arg Tyr Thr Glu Phe Tyr His Val Pro Thr His245 250 255Ser Asp Ala Ser Lys Lys Arg Leu Ile Glu Asp Thr Glu Asp Trp Arg260 265 270Pro Arg Thr Gly Thr Thr Gln Ser Arg Ser Phe Arg Ile Leu Ala Gln275 280 285Ile Thr Gly Thr Glu His Leu Lys Glu Ser Glu Ala Asp Asn Thr Lys290 295 300Lys Ala Asn Asn Ser Gln Glu Pro Ser Pro Gln Leu Ala Ser Ser Val305 310 315 320Ala Ser Thr Arg Ser Met Pro Glu Ser Leu Asp Ser Pro Thr Ser Gly325 330 335Arg Pro Gly Val Thr Ser Leu Thr Thr Ala Ala Ala Phe Lys Pro Val340 345 350Gly Ser Thr Gly Val Ile Lys Ser Pro Ser Trp Gln Arg Pro Asn Gln355 360 365Gly Val Pro Ser Thr Gly Arg Ile Ser Asn Ser Ala Thr Tyr Ser Gly370 375 380Ser Val Ala Pro Ala Asn Ser Ala Leu Gly Gln Thr Gln Pro Ser Asp385 390 395 400Gln Asp Thr Leu Val Gln Arg Ala Glu His Ile Pro Ala Gly Lys Arg405 410 415Thr Pro Met Cys Ala His Cys Asn Gln Val Ile Arg Gly Pro Phe Leu420 425 430Val Ala Leu Gly Lys Ser Trp His Pro Glu Glu Phe Asn Cys Ala His435 440 445Cys Lys Asn Thr Met Ala Tyr Ile Gly Phe Val Glu Glu Lys Gly Ala450 455 460Leu Tyr Cys Glu Leu Cys Tyr Glu Lys Phe Phe Ala Pro Glu Cys Gly465 470 475 480Arg Cys Gln Arg Lys Ile Leu Gly Glu Val Ile Asn Ala Leu Lys Gln485 490 495Thr Trp His Val Ser Cys Phe Val Cys Val Ala Cys Gly Lys Pro Ile500 505 510Arg Asn Asn Val Phe His Leu Glu Asp Gly Glu Pro Tyr Cys Glu Thr515 520 525Asp Tyr Tyr Ala Leu Phe Gly Thr Ile Cys His Gly Cys Glu Phe Pro530 535 540Ile Glu Ala Gly Asp Met Phe Leu Glu Ala Leu Gly Tyr Thr Trp His
545 550 555 560Asp Thr Cys Phe Val Cys Ser Val Cys Cys Glu Ser Leu Glu Gly Gln565 570 575Thr Phe Phe Ser Lys Lys Asp Lys Pro Leu Cys Lys Lys His Ala His580 585 590Ser Val Asn Phe595<210>29<211>4996<212>DNA<213>人<220>
<221>CDS<222>(394)...(828)<400>29attctcaatc ctacccatga tgcagacaga ttacctcatt tcagctcaat aaaacatcac 60caaattccct taggcagaaa aagggtgggg agtgcccttt cttgaaggaa tcccttaagt 120gcacgtctcc cgttttcttt tcacatcaat gcagagtccc tctgtgaatt tacaacaccc 180aacacccatg agttcagtcc ttaagaagga aaattgagca agtatttaat tggttggaca 240ttgcataaaa gaggtccata tccaggctaa ctctagaaat tttattctca aacttagttg 300gcctcttttt cttctgtcag aggaccattc ttagtggcac tggggaaatc ttggcaccca 360gaagaattca actgcgctca ctgcaaaaat aca atg gcc tac att gga ttt gta 414Met Ala Tyr Ile Gly Phe Val1 5gag gag aaa gga gcc ctg tat tgt gag ctg tgc tat gag aaa ttc ttt 462Glu Glu Lys Gly Ala Leu Tyr Cys Glu Leu Cys Tyr Glu Lys Phe Phe10 15 20gcc cct gaa tgt ggt cga tgc caa agg aag atc ctt gga gaa gtc atc 510Ala Pro Glu Cys Gly Arg Cys Gln Arg Lys Ile Leu Gly Glu Val Ile25 30 35aat gcg ttg aaa caa act tgg cat gtt tcc tgt ttt gtg tgt gta gcc 558Asn Ala Leu Lys Gln Thr Trp His Val Ser Cys Phe Val Cys Val Ala40 45 50 55tgt gga aag ccc att cgg aac aat gtt ttt cac ttg gag gat ggt gaa 606Cys Gly Lys Pro Ile Arg Asn Asn Val Phe His Leu Glu Asp Gly Glu60 65 70ccc tac tgt gag act gat tat tat gcc ctc ttt ggt act ata tgc cat 654Pro Tyr Cys Glu Thr Asp Tyr Tyr Ala Leu Phe Gly Thr Ile Cys His75 80 85gga tgt gaa ttt ccc ata gaa gct ggt gac atg ttc ctg gaa gct ctg 702Gly Cys Glu Phe Pro Ile Glu Ala Gly Asp Met Phe Leu Glu Ala Leu90 95 100ggc tac acc tgg cat gac act tgc ttt gta tgc tca gtg tgt tgt gaa 750Gly Tyr Thr Trp His Asp Thr Cys Phe ValCys Ser Val Cys Cys Glu105 110115agt ttg gaa ggt cag acc ttt ttc tcc aag aag gac aag ccc ctg tgt 798Ser Leu Glu Gly Gln Thr Phe Phe Ser Lys Lys Asp Lys Pro Leu Cys120 125 130 135aag aaa cat gct cat tct gtg aat ttt tga aagtcaacag ttcaggagaa 848Lys Lys His Ala His Ser Val Asn Phe *140gagaaggaat ttgaagagaa aaaggaaaat taaaattact aattaatttt tagattcaat 908atttatatgg agttttgaaa aataatagtg gccctgaagg aataaattcc agctttaaaa 968accaagtctg aggaaatatt tggcttcata aagtaaagag acggtttggc atttattatt 1028actttttcct gtattttatg cccataaaat aagctttata aaaaccaatt tcctgatgga 1088ctattaaatt catcttagaa taaattagtg aagaatttaa ttttagaata aataatccaa 1148tctgaaataa ttataccttc tttccttgtt aggtagttat gagtaaatct gcaaaaggca 1208atgaaaatgc cttaaatttt atcaataaca gaattattgt atttaaaaaa aaactaatac 1268ttatctttaa aatagtaaat aggattttaa acagagaatt ttatcagtaa taggtgtcag 1328tttttaaaaa attgcttgta ggctgagcgc ggtggctcac gcctgtaatc ccagcacttt 1388gggaggccaa ggtgggtgga ccacatgagg tcaggagttt gagatcagcc tggccaacat 1448ggtgaaaccc catctctact aaaaatacaa aaattagccg gacgcagtgg cacgcgcctg 1508taatcccagc tactcaagag gctgaggcac gagaatcact tgaacccggg agggagaggt 1568
tgcagtgagc caagatcgta ccactgcact ccagcctggg tgacagagtg agactctgtc 1628tccaaaaaaa aactttgctt gtatattatt tttgccttac agtggatcat tctagtagga 1688aaggacaata agatttttta tcaaaatgtg tcatgccagt aagagatgtt atattctttt 1748ctcatttctt ccccacccaa aaataagcta ccatatagct tataagtctc aaatttttgc 1808cttttactaa aatgtgattg tttctgttca ttgtgtatgc ttcatcacct atattaggca 1868aattccattt ttttcccttg tgctaaggta aagatttaat taaataattt tggcctctca 1928tagttttctc tctctttaaa gagaataaat agagggccag gtgtggtggc tcacgcctgt 1988gatcccagca ctttgggagg ccaagacggg cggatcatga ggtcaagaga tcaagatcat 2048cctggccaac atggtgaaac cctgtctcta ctaaaaatac aaaaatgagc tgggcatggt 2108ggggcgtgcc tgtagtccca tgtacttggg aggctgaggc aggaaaattc ttgaacccag 2168gagacggaag ttgcagtgag ctgagatcac accactgcac tccagcctgg tgacagagca 2228agactccggc tcttaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa agagagagag aataaataga 2288aaagaatgtg gctgggaatt gtgaatcaga agattatacc ccccaattgt ttttcaatcc 2348ccttttctca aataataaat tagttaaatc agtttctgag ttatgccact ggctgatgaa 2408gagttgagag gtctctttgc agaatgatct ttttgtttcg ttttgtttct tcttctgcat 2468ttaaaaatta aaagattggt ttgaggatgt gatgaaattg agactttttg tggttttctc 2528tcaataataa gtgaaccaat ttcaaatgtg atcacaaagt ttggaaagct tttattcaca 2588gaggttgggt agtgttggga ggggagttta attactcaga ttggcctgtt atttgatttc 2648ctcctttggg aaaagaatta tgtagatacc acatggagac agggaaacaa ttgtggtaaa 2708actgtggatc ctgttgctat ttgcccagtg agaaaacaga ttctggtatt tgatttggtt 2768tttctctttg tttccagaat ggatgaaagt ccatgaacct cctaagttat aatttaaatt 2828tgtttggggc aaggtgattt tatagtcgag acagagccct aggtccttcc tgccccatca 2888ctcacttacg acatcacttc cattgtgtgc atgtttgtta tagaggaggt tttaggctac 2948aatatttgtt taacctccct aagaactttc aaggcatctg tcctgaaagc tgttaattta 3008tggtctagca gatttatatt atatgcagat aataattaac tggggataaa agaatggcaa 3068ggggtgacac aaagtagcaa actgaatact tctccaatag caaccccaag ctacctcctc 3128accctgcatc ttggagggag gcaggaaatt tcttttgaaa taaagtgctg gagctgaatt 3188ctgcattatt tatcgttgct gctgaaacca cctataaaag acttgctggc taatgtgcat 3248tgtcatataa tgtacactgt cacatcttta cagtcttgta tgttatagaa tacaaaataa 3308gttgatggtt ttgtttggtg tgagcttttt gtttgtttag ttttgccttc ataggttata 3368tgccaagata gtatttgata agtcaatgac atttggatgt tttcttcaaa gaattttatt 3428tgacccagat ttcttataaa gttatcttac attaaggatg tcattttcat cagaccttct 3488ttctacatat tattcatgaa gcataatgtt gcatttctcc aaattttatg cctgaaaggg 3548tagtgttgct tcctaaggta tcatgttgtc tttgtgcttt gtccatctct tccgtggcga 3608agctttatat ctgttcctaa aacagttaat cctgtgaaat aaatattgaa cataatccag 3668aagaatctct ctatttccct tggggaatgc catatttaat tcaccagcag taatccttta 3728ataactggca gagcacttta ttcttctggt gagctccctg aatatttatt tttctgatta 3788taaattttct atattagtag cattttttaa ttattacttc ttcactatag agcatttact 3848tttagtctct agatgtatat tttggaatgc tgtacttggc ataacataga ttaaaatcat 3908aatgcatgac taaaaactcc ttggatttat ttcccatttt aaaattttta gcggtaagtt 3968cagatttata atctttctct agacttccat ggtctgaatg ttgcctgctg aagtagcaac 4028ctaaaaagta tcccctgctt atgcttctcc agttggccct ccatgtccat aggcttcgca 4088tctgtgattc agcccactgt gggtcaaaaa tatttgggga aaaaatggat ggttgcgcct 4148ttgctgaaca tgtacaaact tgtttttgtc attaaacaat atagtataac aactatttac 4208aaagcattta cattgtatta gctattatag gtaatctaga gatgatttaa agtgtatggt 4268aggatgtgca caggttatat gcaaatacta caccattttc tataagggac ttgaacatca 4328tggactttag tatcctaggg ggttcttgga acccatcacc cataggggca ccataggaca 4388actatagtac cgtgtttatt tcctattaat tcaggttccg tttagagtct aaaactaaaa 4448cctaatcatt tagtcacagt gtaaaaacaa atggaaataa cagctcaaat cttcaaaata 4508ttaccatagc attatgttta aaataatcta caacaaaaat gtaccatttt caagcagtac 4568tacattagga gcccttttat agaaaataat ttcttcttta cccccgttcc agtgtgaatc 4628tagtattctg ttaacatttg tgtggcattt ggagtttgtc atccccattg aagggagagc 4688cttctcagac atgaagcaag ggaaacatac tgaatagttt tacacaaatt tgatctggct 4748tccatttgtc cccctcattt cccaaatgtt taaatgtatt ggatttgggt tctcaatgta 4808taagttgcct tatctgttaa tgtctatctt ctgtctcttt aattttgtat atctgctgtt 4868ttgcttttgg atacattttc taattagaag tcacatgata aatataatca gtatagtaat 4928aataccataa tgtgcacata ctcaataaat aaatgactgc attgttgtaa aaaaaaaaaa 4988aaaaaaaa 4996<210>30<211>144<212>PRT<213>人<400>30Met Ala Tyr Ile Gly Phe Val Glu Glu Lys Gly Ala Leu Tyr Cys Glu1 5 10 15Leu Cys Tyr Glu Lys Phe Phe Ala Pro Glu Cys Gly Arg Cys Gln Arg20 25 30Lys Ile Leu Gly Glu Val Ile Asn Ala Leu Lys Gln Thr Trp His Val35 40 45Set Cys Phe Val Cys Val Ala Cys Gly Lys Pro Ile Arg Asn Asn Val50 55 60Phe His Leu Glu Asp Gly Glu Pro Tyr Cys Glu Thr Asp Tyr Tyr Ala65 70 75 80Leu Phe Gly Thr Ile Cys His Gly Cys Glu Phe Pro Ile Glu Ala Gly85 90 95
Asp Met Phe Leu Glu Ala Leu Gly Tyr Thr Trp His Asp Thr Cys Phe100 105 110Val Cys Ser Val Cys Cys Glu Ser Leu Glu Gly Gln Thr Phe Phe Ser115 120 125Lys Lys Asp Lys Pro Leu Cys Lys Lys His Ala His Ser Val Asn Phe130 135 140<210>31<211>1875<212>DNA<213>人<220>
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45 50 55ctc atc acc agg cag aga tat gga aaa cga tcc agc cca gag aca ctg 305Leu Ile Thr Arg Gln Arg Tyr Gly Lys Arg Ser Ser Pro Glu Thr Leu60 65 70att tca gac ctc ttg atg aga gaa agc aca gaa aat gtt ccc aga act 353Ile Ser Asp Leu Leu Met Arg Glu Ser Thr Glu Asn Val Pro Arg Thr75 80 85cgg ctt gaa gac cct gca atg tgg tga tgggaaatga gacttgctct 400Arg Leu Glu Asp Pro Ala Met Trp *90 95ctggcctttt cctattttca gcccatattt catcgtgtaa aacgagaatc cacccatcct 460accaatgcat gcagccactgt gctgaattc tgcaatgttt tcctttgtca tcattgtata 520tatgtgtgtt taaataaagt atcatgcatt c551<210>34<211>97<212>PRT<213>人<400>34Met Leu Gly Asn Lys Arg Leu Gly Leu Ser Gly Leu Thr Leu Ala Leu1 5 10 15Ser Leu Leu Val Cys Leu Gly Ala Leu Ala Glu Ala Tyr Pro Ser Lys20 25 30Pro Asp Asn Pro Gly Glu Asp Ala Pro Ala Glu Asp Met Ala Arg Tyr35 40 45Tyr Ser Ala Leu Arg His Tyr Ile Asn Leu Ile Thr Arg Gln Arg Tyr50 55 60Gly Lys Arg Ser Ser Pro Glu Thr Leu Ile Ser Asp Leu Leu Met Arg65 70 75 80Glu Ser Thr Glu Asn Val Pro Arg Thr Arg Leu Glu Asp Pro Ala Met85 90 95Trp<210>35<211>997<212>DNA<213>人<220>
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Lys Asn Gly Ser Phe Ala Asn Leu Arg Ile Tyr Pro His Gly Leu Val55 60 65ttg ctg gac ctt cag agt tat gat ggt gat gcg caa ggc aaa gaa gag 356Leu Leu Asp Leu Gln Ser Tyr Asp Gly Asp Ala Gln Gly Lys Glu Glu70 75 80 85atc gac agt att ttg aac aaa gta gag gaa aga atg aaa gaa ttg agt 404Ile Asp Ser Ile Leu Asn Lys Val Glu Glu Arg Met Lys Glu Leu Ser90 95 100cag gac agt act ggg cgg gtg aaa cga tta cca ccc ata gtg cga gga 452Gln Asp Ser Thr Gly Arg Val Lys Arg Leu Pro Pro Ile Val Arg Gly105 110 115gga gcc atc gac aga tac tgg ccc acc gcc gac ggg cgc ctg gtt gaa 500Gly Ala Ile Asp Arg Tyr Trp Pro Thr Ala Asp Gly Arg Leu Val Glu120 125 130tat gac ata gat gaa gtg gta tat gac gaa gat tca cct tat caa aat 548Tyr Asp Ile Asp Glu Val Val Tyr Asp Glu Asp Ser Pro Tyr Gln Asn135 140 145ata aaa att cta cac tcg aag cag ttt gga aat att ctc atc ctt agt 596Ile Lys Ile Leu His Ser Lys Gln Phe Gly Asn Ile Leu Ile Leu Ser150 155 160 165ggg gat gtt aat ttg gca gag agt gat ttg gca tat acc cgg gcc atc 644Gly Asp Val Asn Leu Ala Glu Ser Asp Leu Ala Tyr Thr Arg Ala Ile170 175 180atg ggc agt ggc aaa gaa gat tac act ggc aaa gat gta ctc att ctg 692Met Gly Ser Gly Lys Glu Asp Tyr Thr Gly Lys Asp Val Leu Ile Leu185 190 195gga ggt gga gac gga ggc ata ttg tgt gaa ata gtc aaa cta aaa cca 740Gly Gly Gly Asp Gly Gly Ile Leu Cys Glu Ile Val Lys Leu Lys Pro200 205 210aag atg gtc act atg gta gag att gac caa atg gtg att gat ggg tgt 788Lys Met Val Thr Met Val Glu Ile Asp Gln Met Val Ile Asp Gly Cys215 220 225aag aaa tac atg cga aaa acg tgt ggc gat gtc tta gac aat ctt aaa 836Lys Lys Tyr Met Arg Lys Thr Cys Gly Asp Val Leu Asp Asn Leu Lys230 235 240 245gga gac tgc tat cag gtt cta ata gaa gac tgt atc ccg gta ctg aag 884Gly Asp Cys Tyr Gln Val Leu Ile Glu Asp Cys Ile Pro Val Leu Lys250 255 260agg tac gcc aaa gaa ggg aga gaa ttt gat tat gtg att aat gat ttg 932Arg Tyr Ala Lys Glu Gly Arg Glu Phe Asp Tyr Val Ile Asn Asp Leu265 270 275aca gct gtt cca atc tcc acg tct cca gaa gaa gat tcc aca tgg gag 980Thr Ala Val Pro Ile Ser Thr Ser Pro Glu Glu Asp Ser Thr Trp Glu280 285 290ttt ctc aga ctg att ctt gac ctc tca atg aaa gtg ttg aaa cag gat 1028Phe Leu Arg Leu Ile Leu Asp Leu Set Met Lys Val Leu Lys Gln Asp295 300 305ggg aaa tat ttt aca cag ggg aac tgt gtc aat ctg aca gaa gca ctg 1076Gly Lys Tyr Phe Thr Gln Gly Asn Cys Val Asn Leu Thr Glu Ala Leu310 315 320 325tcg ctc tat gaa gaa cag ctg ggg cgc ctg tat tgt cct gtg gaa ttt 1124Ser Leu Tyr Glu Glu Gln Leu Gly Arg Leu Tyr Cys Pro Val Glu Phe330 335 340tca aag gag atc gtc tgt gtc cct tca tac ttg gaa ttg tgg gta ttt 1172Ser Lys Glu Ile Val Cys Val Pro Ser Tyr Leu Glu Leu Trp Val Phe345 350 355tac act gtt tgg aag aaa gct aaa ccc tga agatcagtag cccctaatca 1222Tyr Thr Val Trp Lys Lys Ala Lys Pro *
360 365catgtgctgc aaatagcctt cctgacctcc atatgctgta catgacatca aaatgagtca 1282ggcaattgat tgtgaattcc ttaaagtttt ccttttttta ataattattt ttaatttaaa 1342aaagcaaatg gaaaatgtat attttgatga gcttagggtg tttttttttt gaaagtcagc 1402tgaaggatgg ttagacagca cagcgaagac tgctaaatgc actgaccccc cccattagaa 1462tgtgattttt gttccttttt atttctctgt gggcttttgt ttttgttttt gttttggtag 1522atcttcaatt tggatatttg gaggagtgaa catcgttgtt ttgctggagg gaagatcttg 1582atggtgtttc tttccccaaa aattgactta gatattaaaa tttggtgctt ataagagaga 1642gttaaaaaaa aataggattg cttcaattaa aattacaaaa gagacaaaaa aaaaaaaaaa 1702aaaaaaaaaa aaaaa 1717<210>38<211>366<212>PRT<213>人<400>38Met Ala Ala Ala Arg His Ser Thr Leu Asp Phe Met Leu Gly Ala Lys1 5 10 15Ala Asp Gly Glu Thr Ile Leu Lys Gly Leu Gln Ser Ile Phe Gln Glu20 25 30Gln Gly Met Ala Glu Ser Val His Thr Trp Gln Asp His Gly Tyr Leu35 40 45Ala Thr Tyr Thr Asn Lys Asn Gly Ser Phe Ala Asn Leu Arg Ile Tyr50 55 60Pro His Gly Leu Val Leu Leu Asp Leu Gln Ser Tyr Asp Gly Asp Ala65 70 75 80Gln Gly Lys Glu Glu Ile Asp Ser Ile Leu Asn Lys Val Glu Glu Arg85 90 95Met Lys Glu Leu Ser Gln Asp Ser Thr Gly Arg Val Lys Arg Leu Pro100 105 110Pro Ile Val Arg Gly Gly Ala Ile Asp Arg Tyr Trp Pro Thr Ala Asp115 120 125Gly Arg Leu Val Glu Tyr Asp Ile Asp Glu Val Val Tyr Asp Glu Asp130 135 140Ser Pro Tyr Gln Asn Ile Lys Ile Leu His Ser Lys Gln Phe Gly Asn145 150 155 160Ile Leu Ile Leu Ser Gly Asp Val Asn Leu Ala Glu Ser Asp Leu Ala165 170 175Tyr Thr Arg Ala Ile Met Gly Ser Gly Lys Glu Asp Tyr Thr Gly Lys180 185 190Asp Val Leu Ile Leu Gly Gly Gly Asp Gly Gly Ile Leu Cys Glu Ile195 200 205Val Lys Leu Lys Pro Lys Met Val Thr Met Val Glu Ile Asp Gln Met210 215 220Val Ile Asp Gly Cys Lys Lys Tyr Met Arg Lys Thr Cys Gly Asp Val225 230 235 240Leu Asp Asn Leu Lys Gly Asp Cys Tyr Gln Val Leu Ile Glu Asp Cys245 250 255Ile Pro Val Leu Lys Arg Tyr Ala Lys Glu Gly Arg Glu Phe Asp Tyr260 265 270Val Ile Asn Asp Leu Thr Ala Val Pro Ile Ser Thr Ser Pro Glu Glu275 280 285Asp Ser Thr Trp Glu Phe Leu Arg Leu Ile Leu Asp Leu Ser Met Lys290 295 300Val Leu Lys Gln Asp Gly Lys Tyr Phe Thr Gln Gly Asn Cys Val Asn305 310 315 320Leu Thr Glu Ala Leu Ser Leu Tyr Glu Glu Gln Leu Gly Arg Leu Tyr325 330 335Cys Pro Val Glu Phe Ser Lys Glu Ile Val Cys Val Pro Ser Tyr Leu340 345 350Glu Leu Trp Val Phe Tyr Thr Val Trp Lys Lys Ala Lys Pro355 360 365<210>39<211>1807<212>DNA<213>人<220>
<221>CDS<222>(276)...(1271)<400>39gcacgaggga agagggtgat ccgacccggg gaaggtcgct gggcagggcg agttgggaaa 60
gcggcagccc ccgccgcccc cgcagcccct tctcctcctt tctcccacgt cctatctgcc 120tctcgctgga ggccaggccg tgcagcatcg aagacaggag gaactggagc ctcattggcc 180ggcccggggc gccggcctcg ggcttaaata ggagctccgg gctctggctg ggacccgacc 240gctgccggcc gcgctcccgc tgctcctgcc gggtg atg gaa aac ccc agc ccg293Met Glu Asn Pro Ser Pro1 5gcc gcc gcc ctg ggc aag gcc ctc tgc gct ctc ctc ctg gcc act ctc 341Ala Ala Ala Leu Gly Lys Ala Leu Cys Ala Leu Leu Leu Ala Thr Leu10 15 20ggc gcc gcc ggc cag cct ctt ggg gga gag tcc atc tgt tcc gcc aga 389Gly Ala Ala Gly Gln Pro Leu Gly Gly Glu Ser Ile Cys Ser Ala Arg25 30 35gcc ccg gcc aaa tac agc atc acc ttc acg ggc aag tgg agc cag acg 437Ala Pro Ala Lys Tyr Ser Ile Thr Phe Thr Gly Lys Trp Ser Gln Thr40 45 50gcc ttc ccc aag cag tac ccc ctg ttc cgc ccc cct gcg cag tgg tct 485Ala Phe Pro Lys Gln Tyr Pro Leu Phe Arg Pro Pro Ala Gln Trp Ser55 60 65 70tcg ctg ctg ggg gcc gcg cat agc tcc gac tac agc atg tgg agg aag 533Ser Leu Leu Gly Ala Ala His Ser Ser Asp Tyr Ser Met Trp Arg Lys75 80 85aac cag tac gtc agt aac ggg ctg cgc gac ttt gcg gag cgc ggc gag 581Asn Gln Tyr Val Ser Asn Gly Leu Arg Asp Phe Ala Glu Arg Gly Glu90 95 100gcc tgg gcg ctg atg aag gag atc gag gcg gcg ggg gag gcg ctg cag 629Ala Trp Ala Leu Met Lys Glu Ile Glu Ala Ala Gly Glu Ala Leu Gln105 110 115agc gtg cac gcg gtg ttt tcg gcg ccc gcc gtc ccc agc ggc acc ggg 677Ser Val His Ala Val Phe Ser Ala Pro Ala Val Pro Ser Gly Thr Gly120 125 130cag acg tcg gcg gag ctg gag gtg cag cgc agg cac tcg ctg gtc tcg 725Gln Thr Ser Ala Glu Leu Glu Val Gln Arg Arg His Ser Leu Val Ser135 140 145 150ttt gtg gtg cgc atc gtg ccc agc ccc gac tgg ttc gtg ggc gtg gac 773Phe Val Val Arg Ile Val Pro Ser Pro Asp Trp Phe Val Gly Val Asp155 160 165agc ctg gac ctg tgc gac ggg gac cgt tgg cgg gaa cag gcg gcg ctg 821Ser Leu Asp Leu Cys Asp Gly Asp Arg Trp Arg Glu Gln Ala Ala Leu170 175 180gac ctg tac ccc tac gac gcc ggg acg gac agc ggc ttc acc ttc tcc 869Asp Leu Tyr Pro Tyr Asp Ala Gly Thr Asp Ser Gly Phe Thr Phe Ser185 190 195tcc ccc aac ttc gcc acc atc ccg cag gac acg gtg acc gag ata acg 917Ser Pro Asn Phe Ala Thr Ile Pro Gln Asp Thr Val Thr Glu Ile Thr200 205 210tcc tcc tct ccc agc cac ccg gcc aac tcc ttc tac tac ccg cgg ctg 965Ser Ser Ser Pro Ser His Pro Ala Asn Ser Phe Tyr Tyr Pro Arg Leu215 220 225 230aag gcc ctg cct ccc atc gcc agg gtg aca ctg gtg cgg ctg cga cag 1013Lys Ala Leu Pro Pro Ile Ala Arg Val Thr Leu Val Arg Leu Arg Gln235 240 245agc ccc agg gcc ttc atc cct ccc gcc cca gtc ctg ccc agc agg gac 1061Ser Pro Arg Ala Phe Ile Pro Pro Ala Pro Val Leu Pro Ser Arg Asp250 255 260aat gag att gta gac agc gcc tca gtt cca gaa acg ccg ctg gac tgc 1109Asn Glu Ile Val Asp Ser Ala Ser Val Pro Glu Thr Pro Leu Asp Cys265 270 275gag gtc tcc ctg tgg tcg tcc tgg gga ctg tgc gga ggc cac tgt ggg 1157Glu Val Ser Leu Trp Ser Ser Trp Gly Leu Cys Gly Gly His Cys Gly
280 285 290agg ctc ggg acc aag agc agg act cgc tac gtc cgg gtc cag ccc gcc 1205Arg Leu Gly Thr Lys Ser Arg Thr Arg Tyr Val Arg Val Gln Pro Ala295 300 305 310aac aac ggg agc ccc tgc ccc gag ctc gaa gaa gag gct gag tgc gtc 1253Asn Asn Gly Ser Pro Cys Pro Glu Leu Glu Glu Glu Ala Glu Cys Val315 320 325cct gat aac tgc gtc taa gaccagagcc ccgcagcccc tggggccccc 1301Pro Asp Asn Cys Val *330ggagccatgg ggtgtcgggg gctcctgtgc aggctcatgc tgcaggcggc cgaggcacag 1361ggggtttcgc gctgctcctg accgcggtga ggccgcgccg accatctctg cactgaaggg 1421ccctctggtg gccggcacgg gcattgggaa acagcctcct cctttcccaa ccttgcttct 1481taggggcccc cgtgtcccgt ctgctctcag cctcctcctc ctgcaggata aagtcatccc 1541caaggctcca gctactctaa attatggtct ccttataagt tattgctgct ccaggagatt 1601gtccttcatc gtccaggggc ctggctccca cgtggttgca gatacctcag acctggtgct 1661ctaggctgtg ctgagcccac tctcccgagg gcgcatccaa gcgggggcca cttgagaagt 1721gaataaatgg ggcggtttcg gaagcgtcag tgtttccatg ttatggatct ctctgcgttt 1781gaataaagac tatctctgtt gctcac 1807<210>40<211>331<212>PRT<213>人<400>40Met Glu Asn Pro Ser Pro Ala Ala Ala Leu Gly Lys Ala Leu Cys Ala1 5 10 15Leu Leu Leu Ala Thr Leu Gly Ala Ala Gly Gln Pro Leu Gly Gly Glu20 25 30Ser Ile Cys Ser Ala Arg Ala Pro Ala Lys Tyr Ser Ile Thr Phe Thr35 40 45Gly Lys Trp Ser Gln Thr Ala Phe Pro Lys Gln Tyr Pro Leu Phe Arg50 55 60Pro Pro Ala Gln Trp Ser Ser Leu Leu Gly Ala Ala His Ser Ser Asp65 70 75 80Tyr Ser Met Trp Arg Lys Asn Gln Tyr Val Ser Asn Gly Leu Arg Asp85 90 95Phe Ala Glu Arg Gly Glu Ala Trp Ala Leu Met Lys Glu Ile Glu Ala100 105 110Ala Gly Glu Ala Leu Gln Ser Val His Ala Val Phe Ser Ala Pro Ala115 120 125Val Pro Ser Gly Thr Gly Gln Thr Ser Ala Glu Leu Glu Val Gln Arg130 135 140Arg His Ser Leu Val Ser Phe Val Val Arg Ile Val Pro Ser Pro Asp145 150 155 160Trp Phe Val Gly Val Asp Ser Leu Asp Leu Cys Asp Gly Asp Arg Trp165 170 175Arg Glu Gln Ala Ala Leu Asp Leu Tyr Pro Tyr Asp Ala Gly Thr Asp180 185 190Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Pro Asn Phe Ala Thr Ile Pro Gln Asp195 200 205Thr Val Thr Glu Ile Thr Ser Ser Ser Pro Ser His Pro Ala Asn Ser210 215 220Phe Tyr Tyr Pro Arg Leu Lys Ala Leu Pro Pro Ile Ala Arg Val Thr225 230 235 240Leu Val Arg Leu Arg Gln Ser Pro Arg Ala Phe Ile Pro Pro Ala Pro245 250 255Val Leu Pro Ser Arg Asp Asn Glu Ile Val Asp Ser Ala Ser Val Pro260 265 270Glu Thr Pro Leu Asp Cys Glu Val Ser Leu Trp Ser Ser Trp Gly Leu275 280 285Cys Gly Gly His Cys Gly Arg Leu Gly Thr Lys Ser Arg Thr Arg Tyr290 295 300Val Arg Val Gln Pro Ala Asn Asn Gly Ser Pro Cys Pro Glu Leu Glu305 310 315 320Glu Glu Ala Glu Cys Val Pro Asp Asn Cys Val325 330<210>41<211>1528<212>DNA
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gtg gtt gtg gtg ata gca gtt gtt gct gga att gtt gtg ctg gtt att 1042Val Val Val Val Ile Ala Val Val Ala Gly Ile Val Val Leu Val Ile275 280 285tcc aga aag aag aga atg gca aag tat gag aag gct gag ata aag gag 1090Ser Arg Lys Lys Arg Met Ala Lys Tyr Glu Lys Ala Glu Ile Lys Glu290 295 300atg ggt gag atg cat agg gaa ctc aat gca taa ctatataatt tgaagattat 1143Met Gly Glu Met His Arg Glu Leu Asn Ala *305 310agaagaaggg aaatagcaaa tggacacaaa ttacaaatgt gtgtgcgtgg gacgaagaca 1203tctttgaagg tcatgagttt gttagtttaa catcatatat ttgtaatagt gaaacctgta 1263ctcaaaatat aagcagcttg aaactggctt taccaatctt gaaatttgac cacaagtgtc 1323ttatatatgc agatctaatg taaaatccag aacttggact ccatcgttaa aattatttat 1383gtgtaacatt caaatgtgtg cattaaatat gcttccacag taaaatctga aaaactgatt 1443tgtgattgaa agctgccttt ctatttactt gagtcttgta catacatact tttttatgag 1503ctatgaaata aaacatttta aactg 1528<210>42<211>314<212>PRT<213>人<400>42Met Ala Pro Pro Gln Val Leu Ala Phe Gly Leu Leu Leu Ala Ala Ala1 5 10 15Thr Ala Thr Phe Ala Ala Ala Gln Glu Glu Cys Val Cys Glu Asn Tyr20 25 30Lys Leu Ala Val Asn Cys Phe Val Asn Asn Asn Arg Gln Cys Gln Cys35 40 45Thr Ser Val Gly Ala Gln Asn Thr Val Ile Cys Ser Lys Leu Ala Ala50 55 60Lys Cys Leu Val Met Lys Ala Glu Met Asn Gly Ser Lys Leu Gly Arg65 70 75 80Arg Ala Lys Pro Glu Gly Ala Leu Gln Asn Asn Asp Gly Leu Tyr Asp85 90 95Pro Asp Cys Asp Glu Ser Gly Leu Phe Lys Ala Lys Gln Cys Asn Gly100 105 110Thr Ser Thr Cys Trp Cys Val Asn Thr Ala Gly Val Arg Arg Thr Asp115 120 125Lys Asp Thr Glu Ile Thr Cys Ser Glu Arg Val Arg Thr Tyr Trp Ile130 135 140Ile Ile Glu Leu Lys His Lys Ala Arg Glu Lys Pro Tyr Asp Ser Lys145 150155 160Ser Leu Arg Thr Ala Leu Gln Lys Glu Ile Thr Thr Arg Tyr Gln Leu165 170 175Asp Pro Lys Phe Ile Thr Ser Ile Leu Tyr Glu Asn Asn Val Ile Thr180 185 190Ile Asp Leu Val Gln Asn Ser Ser Gln Lys Thr Gln Asn Asp Val Asp195 200 205Ile Ala Asp Val Ala Tyr Tyr Phe Glu Lys Asp Val Lys Gly Glu Ser210 215 220Leu Phe His Ser Lys Lys Met Asp Leu Thr Val Asn Gly Glu Gln Leu225 230 235 240Asp Leu Asp Pro Gly Gln Thr Leu Ile Tyr Tyr Val Asp Glu Lys Ala245 250 255Pro Glu Phe Ser Met Gln Gly Leu Lys Ala Gly Val Ile Ala Val Ile260 265 270Val Val Val Val Ile Ala Val Val Ala Gly Ile Val Val Leu Val Ile275 280 285Ser Arg Lys Lys Arg Met Ala Lys Tyr Glu Lys Ala Glu Ile Lys Glu290 295 300Met Gly Glu Met His Arg Glu Leu Asn Ala305 310<210>43<211>1051<212>DNA<213>人<220>
<221>CDS<222>(98)...(274)
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1.一种评估患者是否患有前列腺癌的方法，该方法包括a)测定患者样品中一种标志物的表达水平，其中该标志物选自表1中所列的标志物；b)测定对照样品中该标志物的表达水平；c)比较患者样品中与对照样品中该标志物的表达水平；和d)当患者样品中与对照样品中该标志物的表达水平的显著差异指示该患者患有乳腺癌时，确定该患者患有前列腺癌，如此评估患者是否患有前列腺癌。
2.权利要求1的方法，其中对照样品的表达水平通过选自下组的方法来确定a)由来自非癌患者的前列腺细胞测定的水平；b)由来自良性前列腺增生或无前列腺肿瘤受试者的前列腺细胞测定的水平；和c)使用具有良性前列腺增生或无前列腺肿瘤的受试者群的平均表达水平预先确定的水平。
3.权利要求1的方法，其中所述标志物对应于一种分泌的蛋白质。
4.权利要求1的方法，其中所述标志物包含转录的多核苷酸或其部分。
5.权利要求1的方法，其中所述样品包括选自下组的样品a)从患者获得的细胞；和b)选自血液、淋巴、尿、前列腺液和精液的液体。
6.权利要求3的方法，其中所述标志物蛋白质的存在用特异性结合该蛋白质的试剂来检测。
7.权利要求6的方法，其中所述试剂选自抗体、抗体衍生物和抗体片段。
8.权利要求4的方法，其中通过检测样品中对应于核酸标志物的转录多核苷酸或其部分的存在来评估样品中标志物的表达水平。
9.权利要求8的方法，其中检测转录的多核苷酸包括扩增所述转录的多核苷酸。
10.权利要求8的方法，其中通过检测样品中一种转录的多核苷酸的存在来评估样品中标志物的表达水平，该转录的多核苷酸在严格杂交条件下与一种核酸标志物或者其一部分退火。
11.权利要求1的方法，其中样品中所述标志物的表达水平与未患前列腺癌者中该标志物的正常表达水平相差至少大约2倍或者至少大约5倍。
12.一种评估患者是否患有前列腺癌的方法，该方法包括a)测定样品中至少两种标志物的表达水平，这些标志物独立地选自表1中所列的标志物；b)测定对照样品中每种标志物的表达水平；c)比较患者样品中与来自对照样品中该标志物的表达水平；和d)当至少两种标志物的表达水平相对于这些标志物的相应对照表达水平的显著差异指示该患者患有前列腺癌时，确定该患者患有前列腺癌；如此评估患者是否患有前列腺癌。
13.权利要求12的方法，其中对照样品的表达水平通过选自下组的方法来确定a)由来自非癌患者的前列腺细胞测定的水平；b)由来自良性前列腺增生或无前列腺肿瘤受试者的前列腺细胞测定的水平；和c)使用具有良性前列腺增生或无前列腺肿瘤的受试者群的平均表达水平预先确定的水平。
14.权利要求12的方法，其中测定至少三种标志物的表达。
15.权利要求12的方法，其中测定至少五种标志物的表达。
16.一种监测患者中前列腺癌进展的方法，该方法包括a)在第一时间点测定患者样品中标志物的表达水平，其中该标志物选自表1所列的标志物；b)在后续的时间点测定患者样品中标志物的表达水平；和c)比较在步骤a)和b)中检测的表达水平，从而监测患者中前列腺癌的进展，其中，标志物表达水平的改变指示前列腺癌的进展或消退。
17.权利要求16的方法，其中所述标志物对应于一种分泌的蛋白质。
18.权利要求16的方法，其中所述标志物包含转录的多核苷酸或其部分。
19.权利要求16的方法，其中所述样品包括选自下组的样品a)从患者获得的细胞；和b)选自血液、淋巴、尿、前列腺液和精液的液体。
20.权利要求16的方法，其中所述患者已经在第一时间点和后续时间点之间进行了切除肿瘤的手术。
21.一种鉴定抑制患者中前列腺癌的候选试验化合物的方法，该方法包括a)测定从该患者中获得并且暴露于试验化合物的第一样品中一种标志物的表达，其中该标志物选自表1中所列的标志物，b)测定从该患者中获得的第二样品中该标志物的表达，其中该样品未暴露于该试验化合物，c)比较暴露于试验化合物的样品中与未暴露于试验化合物的样品中该标志物的表达；和d)当暴露于试验化合物的样品中该标志物的表达水平显著低于第二样品指示该试验化合物对抑制患者中的前列腺癌有效时，确定该试验化合物是抑制患者中前列腺癌的候选化合物。
22.权利要求21的方法，其中所述第一和第二样品是从患者中获得的同一样品的部分，或者所述第一和第二样品是从患者中获得的合并样品的部分。
23.一种评估患者是否患有前列腺癌的试剂盒，该试剂盒包括用于评估选自表1所列标志物的至少一种标志物的表达的试剂；其中该试剂盒包括选自下组的试剂a)至少一种核酸探针，其中该探针特异性结合对应于选自表1所列标志物的至少一种标志物的转录多核苷酸；和b)至少一种抗体，其中该抗体特异性结合对应于选自表1所列标志物的至少一种标志物的蛋白质。
24.一种分离的核酸分子，其包含选自SEQ ID NO3，SEQ IDNO5，SEQ ID NO9，SEQ ID NO11，SEQ ID NO13，SEQ ID NO15，SEQ ID NO17，SEQ ID NO21，SEQ ID NO25，SEQ ID NO27，SEQ ID NO29和SEQ ID NO43的核苷酸序列。
25.一种由权利要求24的核酸编码的分离的多肽，其包含选自SEQ ID NO4，SEQ ID NO6，SEQ ID NO10，SEQ ID NO12，SEQID NO14，SEQ ID NO16，SEQ ID NO18，SEQ ID NO22，SEQID NO26，SEQ ID NO28，SEQ ID NO30和SEQ ID NO44的氨基酸序列。
26.一种选择性结合权利要求25的多肽的抗体。
全文摘要
本发明涉及新发现的与前列腺癌包括恶变前状况有关的核酸分子和蛋白质。提供了用于检测、表征、预防和治疗人类前列腺癌的组合物、试剂盒和方法。
文档编号C07H21/04GK101018874SQ200580030863
公开日2007年8月15日 申请日期2005年8月12日 优先权日2004年8月13日
发明者J·E·莫纳汉, S·卡马特卡, S·霍尔施, B·O·戈巴彻瓦, K·格拉特, D·福特, W·O·恩德格, D·L·安德森 申请人:千年药品公司