专利名称：预防和治疗人前列腺癌的重组蛋白疫苗的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种基因工程重组蛋白疫苗，特别是涉及一种预防和治疗人前列腺癌的重组蛋白疫苗。本发明还涉及编码这两种疫苗的基因。
人前列腺特异性抗原(Prostate specific antigen，PSA)是表达在前列腺癌细胞的一种特异性抗原，已有人在研制治疗和预防人前列腺癌的PSA疫苗方面做了一些工作。如将PSA的基因克隆入哺乳动物细胞表达质粒制成了核酸疫苗，此疫苗在小鼠可诱导针对PSA的体液和细胞免疫(Kim JJ et al.Molecular and immunological analysis of genetic prostatespecific antigen(PSA)vaccine.Oncogene 1998 Dec 17；17(24)3125-35)。还有人将重组PSA和类脂A(lipid A)的混合物以脂质体为载体制成的疫苗在前列腺癌患者诱导了PSA反应性T细胞(Meidenbauer N et al.Generation of PSA-reactive effector cells after vaccination with a PSA-basedvaccine in patients with prostate cancer.Prostate 2000 May 1；43(2)88-100)。
细胞毒性T淋巴细胞(cytotoxic T lymphocyte，CTL)是人体杀伤肿瘤细胞的最高效的免疫细胞。任何一种激发机体抗肿瘤免疫的疫苗是否有效，决定于这种疫苗是否能激发肿瘤特异性CFL。外源性的蛋白类肿瘤抗原在免疫人体后，通常被抗原提呈细胞摄取、加工，进入MHC II类提呈途径，激发体液免疫反应(Heikema A，Agsteribbe E，Wilschut J，Huckriede A.Generation of heat shock protein-based vaccines by intracellularloading of gp96 with antigenic peptides.Immunol Lett 1997 Jun 1；57(1-3)69-74)，但不能有效激活肿瘤特异性的CTL的产生，因而不能产生有效的肿瘤预防和治疗作用。因此，赋予PSA特异性激活CTL的性质就成为研究以PSA为抗原的、预防和治疗前列腺癌疫苗的一个技术关键。
热休克蛋白(heat shock protein，HSP)是存在于多种生物体内的一个分子伴侣蛋白质家族。在免疫应答的过程中，热休克蛋白可表现如下三种基本的功能1、协助抗原性物质进入包括树突状细胞在内的抗原提呈细胞；2、在抗原提呈细胞中和加工处理的抗原物质相互作用使之进入MHC I类抗原提呈途径，进而激活抗原特异性CTL；3、刺激树突状细胞表达协同刺激分子(如B7等)和分泌细胞因子。
近年的研究表明，HSP可使非共键结合的肿瘤抗原在抗原提呈细胞内加工后和MHC I类分子结合并提呈在其表面，有效地激活CTL去高效杀伤表达特异性肿瘤抗原的肿瘤细胞。注射从自体肿瘤提取的热休克蛋白-抗原肽复合物可抑制荷瘤小鼠原发肿瘤的生长、降低肿瘤的转移率，延长荷瘤小鼠的生存时间(Tamura Y，Peng P，Liu K，Daou M，SrivastavaPK.Immunotherapy of tumors with autologous tumor-derived heat shockprotein preparations.Science 1997 Oct 3；278(5335)117-20)。用来源于前列腺肿瘤的热休克蛋白-肽复合物对小鼠的原发和转移的前列腺癌细胞有明显的生长抑制作用(Yedavelli SP，Guo L，Daou ME，Srivastava PK，Mittelman A，Tiwari RK.Preventive and therapeutic effect of tumor derivedheat shock protein，gp96，in an experimental prostate cancer model.Int J MolMed 1999 Sep；4(3)243-8)。
本发明的另一个目的是提供两种编码本发明的疫苗的基因。
本发明提供了一种重组蛋白疫苗，它是由卡介苗热休克蛋白65和1至5个拷贝的人前列腺特异性抗原细胞毒性T淋巴细胞多表位相连接而形成的融合蛋白，其中，所述的人前列腺特异性抗原细胞毒性T淋巴细胞多表位的单拷贝多肽具有SEQ ID NO2所示的氨基酸序列。在本发明的重组蛋白疫苗中，卡介苗热休克蛋白65可以位于该融合蛋白的氨基端，人前列腺特异性抗原细胞毒性T淋巴细胞多表位位于该融合蛋白的羧基端。
在本发明的重组蛋白疫苗中，所述的人前列腺特异性抗原细胞毒性T淋巴细胞多表位的拷贝数可以为2，具有SEQ ID NO4所示的氨基酸序列。
本发明的重组蛋白疫苗最好具有SEQ ID NO6所示的氨基酸序列，或者SEQ ID NO8所示的氨基酸序列。
本发明还提供了编码本发明的重组蛋白疫苗的基因。该基因可以具有SEQ ID NO5或SEQ ID NO7所示的核苷酸序列。
人前列腺特异性抗原细胞毒性T淋巴细胞多表位单拷贝多肽的氨基酸序列如SEQ ID NO2所示，人前列腺特异性抗原细胞毒性T淋巴细胞多表位双拷贝多肽的氨基酸序列如SEQ ID NO4所示。人前列腺特异性抗原细胞毒性T淋巴细胞多表位单拷贝多肽和人前列腺特异性抗原细胞毒性T淋巴细胞多表位双单拷贝多肽分别连接于卡介苗热休克蛋白65融合形成的融合蛋白(序列分别如SEQ ID NO6和SEQ ID NO8所不)在进入人体后均可刺激人体的细胞毒性T细胞(CTL)发动对表达PSA的人前列腺癌细胞的攻击和杀伤，因而对人前列腺癌有预防和治疗的作用。由于人前列腺特异性抗原细胞毒性T淋巴细胞多表位双拷贝多肽比人前列腺特异性抗原细胞毒性T淋巴细胞多表位单拷贝多肽可提供更多的前列腺特异性抗原的抗原信息，因而可产生更强的免疫效果。
卡介苗热休克蛋白65是一种来源于卡介苗的蛋白质，它在和人前列腺特异性抗原细胞毒性T淋巴细胞多表位双拷贝多肽或人前列腺特异性抗原细胞毒性T淋巴细胞多表位单拷贝多肽形成融合蛋白后，可以协助它们进入包括树突状细胞在内的抗原提呈细胞，并进入MHC I类途径加工提呈，进而激活抗原特异性细胞毒性T淋巴细胞(cytotoxic Tlymphocyte，CTL)对表达前列腺特异性抗原的人前列腺癌细胞进行攻击和杀伤。此外，卡介苗热休克蛋白65还可刺激包括树突状细胞在内的抗原提呈细胞表达协同刺激分子(如B7等)和分泌细胞因子，这些协同刺激分子(如B7等)和细胞因子可激活细胞毒性T淋巴细胞的肿瘤细胞杀伤能力。
本发明的重组蛋白疫苗可通过已知的方法进行生产。
本发明的重组蛋白疫苗可通过皮下注射的方式给人接种，接种的剂量为100-500μg。为了加强效果，可进行2-3次的加强免疫。时间间隔可为2周-2月。
提取结核杆菌基因组DNA的方法参照Molecular Cloning一书(J.Sambrook，Isolation of high-molecular-weight DNA from mammalian cells，9.16-9.22，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Molecular cloning，1989)。
采用PCR方法自结核杆菌分离热休克蛋白65(HSP65)结构基因。采用的5′端引物序列为5′CCATG GCC AAG ACA ATT GCG3′(SEQ IDNO9)，3′端引物序列为5′GAAATCCATGCCACCCAT3′(SEQID NO10)。
所述PCR操作程序是在一500(1微量离心管中加入下列试剂模板cDNA 5μl(mmol/L)10(PCR缓冲液(含氯化镁)5μldNTPs(10mmol/L)1μl5′端和3′端引物(0.01mmol/L)各0.5μlTaq DNA聚合酶(5u/μl)0.25μl加去离子水至终体积50μl混合后加入矿物油3滴反应条件94℃，30″；55℃，1′；72℃，2′，30个循环周期后，72℃延伸10分钟。
采用TA克隆方法克隆PCR产物，方法见文献(于永利，麻彤辉，杨贵贞.TA克隆及双链DNA测序介绍一种快速克隆及分析PCR产物的方法.中国免疫学杂志，1994，10(1)5)。
按常规方法(J.Sambrook，Polyacrylamide gel electrophoresis 1.21-1.32，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Molecular cloning，1989)提取质粒，采用双脱氧末端终止法，对插入片段进行序列测定。
用NcoI和HindIII在37℃消化PCR产物，时间为2小时。
消化产物琼经脂糖凝胶电泳分离。电泳的条件是1％琼脂糖凝胶，1(TAE缓冲液，150-200mA，电泳0.5-1小时。20(TAE缓冲液0.8mol/L Tris base0.4mol/L NaOAc0.04mol/L Na2EDTA用冰醋酸调pH 8.3。
在紫外灯下观察并切下琼脂糖凝胶上的DNA电泳带。将含DNA区带的琼脂糖凝胶切下(多少？)，置-70℃冷冻15分钟，然后在65℃水浴中使胶融化；加入等倍体积TE-饱合酚，剧烈振荡30秒钟，然后-70℃冷冻15分钟；室温融化后，12,000rpm离心5分钟，将上层液相移至另一管中，用2-2.5倍乙醇沉淀、洗涤和干燥DNA。
将回收的PCR产物克隆入经限制性内切酶NcoI和HindIII消化的原核细胞表达载体pET-28a(+)质粒(美国Novagen公司)的6聚组氨酸(histidine)密码子的上游。
质粒DNA的消化反应1μg质粒DNA1μl10(缓冲液(见Promega Corporation产品说明书)。1μl限制性内切酶NcoI(10单位/μl)1μl限制性内切酶HindIII(10单位/μl)用双蒸水补齐至10μl混合后37℃温育30-120分钟。
连接反应质粒DNA(0.5μg/μl)2μlDNA插入片段(300ng/μl)5μl10(连接缓冲液(见Protocols and Applications Guide，p57，PromegaCorporation，Second Edition，1991)1μlT4 DNA连接酶1μl用双蒸水补齐至10μl混合后置14-16℃水浴6-12小时。
将含HSP-65基因的重组pET-28a(+)质粒转化大肠杆菌。
感受态细胞的制备方法是将大肠杆菌在LB琼脂培养基上划线，37℃培养12-16小时；次日从琼脂平板上取一单菌落于2ml LB培养基中，37℃以225rpm速度震荡培养12-16小时；取1ml上述培养物接种于100ml LB培养基中，37℃以225rpm的速度震荡培养直至OD值为0.5左右(大约3小时)；将菌液冰浴2小时，然后2,500 Xg，4℃离心20分钟收集菌体；加入100ml冰冷的Trituration缓冲液(100mmol/L CaCl2，70mmol/L MgCl2，40mmol/L醋酸钠，pH5.5)，混匀，置冰上45分钟；1,800 Xg，4℃离心10分钟，弃上清，加入10ml冰冷的Trituration缓冲液悬浮细胞；按每份200ul分装，4C可保存1-2周。若需长期保存，可加甘油至终浓度为15％，置-70℃备用。
转化的方法是将200ul感受态细胞置冰上融化，然后加入3ul DMSO或β-巯基乙醇，混合后，加入3-5μl连接反应液(含重组质粒)，温和混匀，置冰上30分钟；42℃45秒，然后迅速放回冰中1-2分钟；加入2ml LB培养液，37℃以225rpm的速度摇荡培养1小时；4,000 Xg离心10秒钟，弃上清，用200ul LB培养液重悬菌体；将菌液铺于含有适当抗生素的LB琼脂培养板上，涂匀，室温放置20-30分钟，倒置于37℃孵箱中培养12-16小时。用限制性内切酶消化的方法鉴定重组克隆。
重组质粒冰冻保存于-20℃。含重组质粒的菌株在含20-50％甘油培养液中保存于-20℃或-70℃。
卡介苗热休克蛋白65人前列腺特异性抗原细胞毒性T淋巴细胞多表位单拷贝多肽融合蛋白的基因的测序(采用双脱氧末端终止法，具体方法见文献于永利，麻彤辉，杨贵贞.TA克隆及双链DNA测序介绍一种快速克隆及分析PCR产物的方法。中国免疫学杂志，1994，10(1)5)结果表明，所得到的卡介苗热休克蛋白65人前列腺特异性抗原细胞毒性T淋巴细胞多表位单拷贝多肽融合蛋白的基因和设计的完全一致。实施例3 构建人前列腺特异性抗原细胞毒性T淋巴细胞多表位双拷贝融合蛋白疫苗的基因含EcoR1切点和Bgl II切点人前列腺特异性抗原细胞毒性T淋巴细胞多表位单拷贝基因的构建采用5‘端特异性引物[5’GCCGAGAATTCGAGCCTGAAGAGTTCCTGACTCCGAAAAAA3’(SEQ ID NO13)(含EcoR1切点)]和3端特异性引物[5’GGGCGAGATCTACACAGCATGAATTTAGTAACTTTCTGCGG3’(SEQ ID NO14)(含BglII切点)]，以人前列腺特异性抗原细胞毒性T淋巴细胞多表位单拷贝融合蛋白疫苗的基因为模板，做PCR放大，得到含EcoR1切点和BglII切点人前列腺特异性抗原细胞毒性T淋巴细胞多表位单拷贝基因的DNA片段，其序列是GCCGAGAATT CGAGCCTGAA GAG TTCCTGACTC CGAAAAAACT GCAGTGCGTTGACCTGCACG TTATCTCTAA CGACGTTTGC GCTCAGGTTC ACCCGCAGAAAGTTACTAAA TTCATGCTGT GTAGATCTCGCCC(SEQ ID NO15)含BamH I切点和HindIII切点人前列腺特异性抗原细胞毒性T淋巴细胞多表位单拷贝基因的构建采用5‘端特异性引物[5‘GCGTGGATCCGAGCCTGAAGAGTTCCTGACTCCGAAAAAA(SEQ ID NO16)(含BamH I切点)]和3端特异性引物[5’CGCCGAAGCTTGCACAGCATGAATTTAGTAACTTTCTGCGG(SEQID NO17)3’(含BglII切点)]，以人前列腺特异性抗原细胞毒性T淋巴细胞多表位单拷贝融合蛋白疫苗的基因为模板，做PCR放大，得到含含BamH I切点和HindIII切点人前列腺特异性抗原细胞毒性T淋巴细胞多表位单拷贝基因的DNA片段，其序列是GCGTGGATCCGAGCCTGAAGAG TTCCTGACTCCGAAAAAACTGCAGTGCGTTGACCTGCACG TTATCTCTAA CGACGTTTGC GCTCAGGTTC ACCCGCAGAAAGTTACTAAA TTCATGCTGTGCAAGCTTCGGCG (SEQ ID NO18)将上述两个DNA片段分别克隆的到pMD18-T上，一种质粒含含EcoR1切点和Bgl II切点人前列腺特异性抗原细胞毒性T淋巴细胞多表位单拷贝基因，命名为pMD18-T-EcoR1 Bgl II，另一种质粒含BamH I切点和HindIII切点人前列腺特异性抗原细胞毒性T淋巴细胞多表位单拷贝基因，命名为pMD18-T-BamH I HindIII。
将pMD18-T-EcoR1 Bgl II用Bgl II酶切消化，去磷酸化；将pMD18-T-BamH I HindIII用BamH I酶切消化。连接消化物，得到5‘端带EcoR1切点，3’端带HindIII切点的人前列腺特异性抗原细胞毒性T淋巴细胞多表位双拷贝融合蛋白疫苗的基因片段，其序列是GAATTCGAGCCTGAAGAG TTCCTGACTC CGAAAAAACT GCAGTGCGTT16801681 GACCTGCACG TTATCTCTAA CGACGTTTGC GCTCAGGTTC ACCCGCAGAA AGTTACTAAA17401741 TTCATGCTGT GTAGATCCGA GCCTGAAGAG TTCCTGACTC CGAAAAAACT GCAGTGCGTT 18001801 GACCTGCACG TTATCTCTAA CGACGTTTGC GCTCAGGTTC ACCCGCAGAA AGTTACTAAA 18601861 TTCATGCTGT GCAAGCTT(SEQ ID N019)用将EcoR1和HindIII消化此片段，将其克隆入用EcoR1和HindIII双酶切消化的pET28-HSP65-P1质粒，此质粒的插入片段含卡介苗热休克蛋白65人前列腺特异性抗原细胞毒性T淋巴细胞多表位双拷贝融合蛋白疫苗的结构基因。将其转化大肠杆菌得克隆菌。
关于具体的实验操作和实施例2的相似。
用台式超声细胞破碎仪(SANYO，MSE SONIPREP 150)，设8个循环和50％的时间间隔，在冰浴中超声90秒破菌，搅拌10-20min。
加DOC，使终浓度为0.2％(即，加约240ul的20％脱氧胆酸钠(DOC)。混匀，静置10min。20％脱氧胆酸钠(DOC)贮存液应提前1天配制，配方为10g无水DOC，溶于水中，调体积至50ml。得粗制裂解物(A)。
13000rpm，4℃离心10min。轻轻倾出上清。
加18ml缓冲液A和2ml 20％DOC贮存液于包涵体沉淀。用组织破碎器充分重悬沉淀，室温下静置至少10分钟。将悬液于4℃离心10min，13000rpm，加39.4ml缓冲液A和0.6ml 20％十二烷基肌氨酸钠(SKL)储液(SKL净浓度为0.3％)。剧烈搅动使沉淀慢慢溶解。静置至少30分钟。十二烷基肌氨酸钠(SKL)储液的配制方法是10g无水十二烷基肌氨酸钠(SKL)，溶于H2O中，调体积至50ml。
将悬液于4℃离心10min，13000rpm。用缓冲液A+0.3％SKL稀释溶解的蛋白质使其浓度为1mg/ml。用缓冲液A将溶解的蛋白质稀释10倍，使其浓度为0.1mg/ml，SKL的终浓度为0.03％。
在4℃溶解的蛋白质制备物(体积约为400ml)对缓冲液A(体积约为4000ml)透析8小时，同时充分搅拌。然后换新鲜缓冲液并重复。
从透析袋(口径1cm)中移出经透析的蛋白质溶液，4℃、8000rpm离心20min，去除所有的的聚集物。留取上清，做镊-Saphrose-4-B层析分离HSP-65和前列腺特异性抗原(PSA)的T细胞表位的融合基因融合蛋白。
采用常规的SDS-PAGE方法(J.Sambrook，Polyacrylamide gelelectrophoresis 6.36-6.49，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Molecularcloning，1989)。鉴定HSP-65和前列腺特异性抗原(PSA)的T细胞表位的基因融合蛋白的纯度，纯度为98％。
2、实验动物6-8周的雄性C57BL/6小鼠(吉林大学医学部实验动物中心)，疫苗组和对照组各20只。
3、实验方法1)采用DMEM培养基培养C2细胞和PSA-C2细胞。在注射之前，用无血清DMEM将细胞洗三次。每只小鼠注射2.5(106个C2细胞或PSA-C2细胞，注射部位是小鼠两肩胛骨间皮下。在6周以后，测量小鼠肿瘤块基底部的面积。
2)在接种肿瘤30天前和15天前，疫苗组分别腹腔注射100微克结核杆菌热休克蛋白-人前列腺特异性抗原融合蛋白基因工程疫苗；对照组分别腹腔注射同疫苗组同体积生理盐水。4、实验结果及结论动物肿瘤块基底部面积的平均值疫苗组为53mm2，对照组为250mm2。注射后6周测量。
表明所实验药物能明显抑制自发性前列腺肿瘤的生长。二、清除残存前列腺癌细胞实验1、材料C2细胞2、实验动物6-8周的雄性C57BL/6小鼠，疫苗组和对照组各20只3、实验方法1)采用DMEM培养基培养C2细胞和PSA-C2细胞。在注射之前，用无血清DMEM将细胞洗三次。每只小鼠注射2.5(106个C2细胞或PSA-C2细胞，注射部位是小鼠两肩胛骨间皮下。在6周以后，用外科手术的方法切除肿块。在切除肿块后的21天处死小鼠，测量小鼠复发肿瘤块基底部的面积。
2)在手术后的第4、7和10天，疫苗组分别腹腔注射100微克结核杆菌热休克蛋白-人前列腺特异性抗原融合蛋白基因工程疫苗；对照组分别腹腔注射同疫苗组同体积生理盐水。4、实验结果及结论动物肿瘤块基底部面积的平均值疫苗组为36mm2，对照组为252mm2。表明该受试药物能明显清除残存前列腺癌细胞。
序列表<110>北京迪威华宇生物技术有限公司<120>预防和治疗人前列腺癌的重组蛋白疫苗<130>I2001290<160>19<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>90<212>DNA<213>Homo sapiens<220><221>CDS<222>(1)..(90)<223><400>1ttc ctg act ccg aaa aaa ctg cag tgc gtt gac ctg cac gtt atc tct 48Phe Leu Thr Pro Lys Lys Leu Gln Cys Val Asp Leu His Val Ile Ser1 5 10 15aac gac gtt tgc gct cag gtt cac ccg cag aaa gtt act aaa 90Asn Asp Val Cys Ala Gln Val His Pro Gln Lys Val Thr Lys20 25 30<210>2<211>30<212>PRT<213>Homo sapiens<400>2Phe Leu Thr Pro Lys Lys Leu Gln Cys Val Asp Leu His Val Ile Ser1 5 10 15Asn Asp Val Cys Ala Gln Val His Pro Gln Lys Val Thr Lys20 25 30<210>3<211>210<212>DNA<213>Artificial Sequence<220><223>Recombinant Gene<220><221>CDS<222>(1)..(210)<223><400>3ttc ctg act ccg aaa aaa ctg cag tgc gtt gac ctg cac gtt atc tct 48Phe Leu Thr Pro Lys Lys Leu Gln Cys Val Asp Leu His Val Ile Ser1 5 10 15aac gac gtt tgc gct cag gtt cac ccg cag aaa gtt act aaa ttc atg 96Asn Asp Val Cys Ala Gln Val His Pro Gln Lys Val Thr Lys Phe Met20 25 30ctg tgt aga 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1.一种重组蛋白疫苗，它是由卡介苗热休克蛋白65和1至5个拷贝的人前列腺特异性抗原细胞毒性T淋巴细胞多表位相连接而形成的融合蛋白，其中，所述的人前列腺特异性抗原细胞毒性T淋巴细胞多表位的单拷贝多肽具有SEQ ID NO2所示的氨基酸序列。
2.按照权利要求1所述的重组蛋白疫苗，其中，卡介苗热休克蛋白65位于该融合蛋白的氨基端，人前列腺特异性抗原细胞毒性T淋巴细胞多表位位于该融合蛋白的羧基端。
3.按照权利要求1所述的重组蛋白疫苗，其中，所述的人前列腺特异性抗原细胞毒性T淋巴细胞多表位的拷贝数为2，具有SEQ ID NO4所示的氨基酸序列。
4.按照权利要求1所述的重组蛋白疫苗，它具有SEQ ID NO6所示的氨基酸序列。
5.按照权利要求1所述的重组蛋白疫苗，它具有SEQ ID NO8所示的氨基酸序列。
6.编码权利要求1至5中任意一项所述的重组蛋白疫苗的基因。
7.按照权利要求6所述的基因，它们分别具有SEQ ID NO5或SEQ IDNO7所示的核苷酸序列。
全文摘要
本发明提供了一种重组蛋白疫苗,它是由卡介苗热休克蛋白65和1至5个拷贝的人前列腺特异性抗原细胞毒性T淋巴细胞多表位相连接而形成的融合蛋白,其中,所述的人前列腺特异性抗原细胞毒性T淋巴细胞多表位的单拷贝多肽具有SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列,人前列腺特异性抗原细胞毒性T淋巴细胞多表位的双单拷贝多肽具有SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列。本发明的融合蛋白在应用于人体后可有效地预防和治疗前列腺癌。本发明还提供了编码这两种重组蛋白疫苗的基因。
文档编号C12N15/31GK1362263SQ0113493
公开日2002年8月7日 申请日期2001年11月15日 优先权日2001年1月4日
发明者王丽颖, 李大鹏, 于永利 申请人:北京迪威华宇生物技术有限公司