专利名称：：一种与前列腺癌易感性相关的单核苷酸多态性位点及其应用的制作方法一种与前列腺癌易感性相关的单核苷酸多态性位点及其应用
技术领域：
本发明属于生物技术的基因领域，具体涉及一个与前列腺癌易感性相关的单核苷酸多态性位点及其应用。
背景技术：
：前列腺癌(Prostatecancer,PCa)是男性中第二大常见肿瘤，在癌症相关死因中位于第六位，全球每年预计新发病例91.4万人，病死例数约25.8万人(JemalA,BrayF，CenterMMjFerlayJ，WardE，FormanD.Globalcancerstatistics.CACancerJClin2011;61,69-90.)。前列腺癌的病因大多不是很清楚，目前的研究结果表明，除了年龄和种族，家族史是前列腺癌发病另一主要的高危险因素(GronbergH.Prostatecancerepidemiology.Lancet.2003;361(9360):859-64.)。这种家族聚集性在很大程度上提示了遗传因素对前列腺癌发生风险的影响。在一项双胞胎研究中发现，遗传因素能解释42%前列腺癌的发病风险(LichtensteinP,HolmNV,VerkasaloPK,IliadouA,KaprioJ,KoskenvuoMetal.Environmentalandheritablefactorsinthecausationofcancer—analysesofcohortsoftwinsfromSweden,Denmark,andFinland.NEnglJMed.2000;343,78-85.)。造成差异的遗传物质基础之一就包括SNP(单核苷酸多态性XSNP主要是指在基因组水平上由单个核苷酸的变异所引起的DNA序列多态性。它是人类可遗传的变异中最常见的一种。占所有已知多态性的90%以上。SNP在人类基因组中广泛存在，平均每5001000个碱基对中就有I个，估计其总数可达300万个甚至更多(CollinsF.S.,BrooksL.D.,ChakravartiA.ADNApolymorphismdiscoveryresourceforresearchonhumangeneticvariation.GenomeRes.1998,8(12)，1229-31.)。目前，SNP是研究人类常见疾病遗传变异的重要依据。而全基因组关联研究是系统找出疾病SNP遗传变异的、具有良好前景的分子遗传学研究方法。本发明通过全基因组关联研究，选择9q31.2区域作为所研究的基因，同时选择9q31.2区域上的SNP位点作为所研究的方向。经对国内外文献检索，至今未见有9q31.2遗传区域与前列腺癌相关联的报道，也没有9q31.2区域上多态性位点与前列腺癌的相关性报道。
发明内容本发明的目的在于提供一种与前列腺癌易感性相关的遗传区域9q31.2部分基因序列，通过rs817826单核苷酸多态性位点的遗传研究，提出一个可作为判定前列腺癌高危人群的易感SNP位点，以利于前列腺癌高危人群的筛查，以利于预防和治疗。本发明研究表明，遗传区域9q31.2与前列腺癌的易感性相关。本发明首先提供与前列腺癌易感性相关的遗传区域9q31.2上的部分基因序列，该基因序列的核苷酸序列如SEQ.1D.NO.1所示，其第501位为T/C。本发明还提供与前列腺癌易感性相关的遗传区域9q31.2上的一单核苷多态性位点，rs817826:rs817826位于RAD23B和KLF4基因之间；rs817826碱基为T/C；rs817826的SNP序列通过http://genome,uses,edu/数据库获得，其序列如SEQ.1D.NO.2所不。本发明还提供检测一单核苷酸多态性位点的特异性核酸引物SEQ.1D.NO.3、SEQ.1D.NO.4、SEQ.1D.NO.5，且特异性地扩增出单核苷酸多态性位点的扩增产物。本发明关于与前列腺癌易感性相关的遗传区域9q31.2基因序列，其获得rs817826序列的具体步骤如下通过http://genome,uses,edu/数据库，在遗传区域9q31.2上选择单核苷酸多态性位点rs817826;依据相应的碱基序列合成引物ACGTTGGATGCACTTTATCCTCCTAGTGAA(SEQ.1D.NO.3),ACGTTGGATGACCGTTGAGACTTAGTGTAG(SEQ.1D.NO.4)以及UEP引物cccctCTACAGAGGCCCTAGTAAA(SEQ.1D.NO.5);进行PCR扩增，获取SNPrs817826分型数据。PCR扩增中，PCR反应体系5ul:0.625ul10XTaqBuffer,O.125mMdNTP,O.12ulIOnMPCR引物Mix，O.32525nMMgCl2,0.1ul5U/MLHotstar酶，用ddH20补足5ul；PCR反应条件95°C2min；95°C0.5min,96°C0.5min,72°Clmin，45个循环；72°C5min,25°C⑴min;SAP纯化反应体系2ul:0.17ul10XSAPBuffer,0.3lU/ulSAP酶，用ddH20补足2ul;SAP纯化反应条件37°C40min,85°C5min，25°C^min;单碱基延伸反应体系2ul:0.2IOXiPlexBuffer,0.2iPlexTermination,0.33IOOuM终止引物Mix,0.041iPlexEnzyme,用ddH20补足2ul;单喊基延伸反应条件94°C30s；94°C5s,92°C5s-80°C5s，内部循环5次，外部循环40次；72°C180s；25°C^s;将反应产物共15nL，经树脂纯化后，SpectroCHIP芯片上样；通过MassARRAYMALD1-TOFMassSpectrometry进行质谱检测，并获取SNPrs817826分型数据。本发明还提供所述的与前列腺癌易感性相关的遗传区域9q31.2的应用，通过提取受试者基因组DNA进行单核苷酸多态性位点rs817826的基因分型，其中rs817826碱基为C的个体为前列腺癌易感人群。rs817826碱基为T的个体为前列腺癌非易感人群。具体实施方式以下结合具体实施例，以进一步说明本发明。应理解，以下实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。实施例1通过提取受试者基因组DNA进行单核苷酸多态性rs817826的基因分型，其中rs817826碱基为C的个体为前列腺癌的易感人群。具体做法是1.基因组DNA的提取受试者均由外周静脉血抽取2-3ml，采用QIAampBloodMiniKit250(QIAGEN，德国)试剂盒提取基因组DNA，-20°C保存。2.SNP基因分型根据SNP的序列信息,运用Sequenom公司的引物设计软件MassARRAYAssayDesign3.1(Sequenom,Inc.，SanDiego,CA)设计PCR反应和单碱基扩展引物，并在生物工程(上海)有限公司合成。合成后的引物与样品DNA进行PCR反应，混合后的反应产物在SequenomiPLEX仪器上进行SNP基因分型。具体实验流程如下(1)引物设计运用Sequenom公司的引物设计软件MassARRAYAssayDesign3.1(Sequenom,Inc.,SanDiego,CA)为多重反应自动设计PCR引物(SEQ.1D.NO.3;SEQ.1D.NO.4)和iPLEXGold单碱基延伸引物(SEQ.1D.NO.5)；(2)PCR反应(A)PCR反应液(Mix):按照下表中的顺序从上到下依次加入，单位ul权利要求1.一种与前列腺癌易感性相关的遗传区域9q31.2上的基因序列，其特征在于，核苷酸序列如SEQ.1D.NO.1所示，其第501位为T/C。2.根据权利要求1所述的与前列腺癌易感性相关的遗传区域9q31.2上的基因序列，其特征在于，所述的与前列腺癌易感性相关的遗传区域9q31.2上具有一单核苷多态性位点rs817826,rs817826位于RAD23B和KLF4基因之间；rs817826碱基为T/C；rs817826的SNP序列如SEQ.1D.NO.2所示。3.—种检测一单核苷酸多态性位点rs817826的特异性核酸引物，其特征在于序列为SEQ.1D.NO.3，SEQ.1D.NO.4，SEQ.1D.NO.5，其特异性地扩增出单核苷酸多态性位点的扩增产物。4.从权利要求2所述的与前列腺癌易感性相关的遗传区域9q31.2基因序列，获得rs817826序列的方法,其特征在于具体步骤如下在遗传区域9q31.2上选择单核苷酸多态性位点rs817826;依据相应的碱基序列合成引物SEQ.1D.NO.3，SEQ.1D.NO.4以及UEP引物SEQ.1D.NO.5;进行PCR扩增，获取SNPrs817826分型数据。5.从权利要求4所述的方法，其特征在于PCR反应体系5ul0.625ul10XTaqBuffer,O.125mMdNTP,O.12ulIOnMPCR引物Mix，0.32525nMMgCl2,0.1ul5U/MLHotstar酶，用ddH20补足5ul；PCR反应条件95°C2min；95°CO.5min,96°CO.5min,72°Clmin，45个循环；72°C5min，25°C⑴min;SAP纯化反应体系2ul:0.17ul10XSAPBuffer,0.3lU/ulSAP酶，用ddH20补足2ul；SAP纯化反应条件37°C40min,85°C5min,25°C00min;单喊基延伸反应体系2ul:0.210XiPlexBuffer,0.2iPlexTermination,0.33IOOuM终止引物Mix,0.041iPlexEnzyme,用ddH20补足2ul;单喊基延伸反应条件94°C30s-MV5s,92°C5s-80°C5s，内部循环5次，外部循环40次；72°C180s；25°C①s;将反应产物共15nL，经树脂纯化后，SpectroCHIP芯片上样；通过MassARRAYMALD1-TOFMassSpectrometry进行质谱检测，并获取SNPrs817826分型数据。6.一种权利要求1所述的与前列腺癌易感性相关的遗传区域9q31.2基因序列的应用，其特征在于，通过提取受试者基因组DNA进行单核苷酸多态性位点rs817826的基因分型，其中rs817826碱基为C的个体为前列腺癌易感人群，rs817826碱基为T的个体为前列腺癌非易感人群。全文摘要本发明属于生物技术的基因领域，具体涉及一种与前列腺癌易感性相关的单核苷酸多态性位点及其应用。本发明提供与前列腺癌易感性相关的遗传区域9q31.2上的部分基因序列，其核苷酸序列如SEQ.ID.NO.1所示；还提供遗传区域9q31.2上的单核苷多态性位点rs817826；rs817826碱基为C的个体为前列腺癌易感人群，rs817826碱基为Ｔ的个体为非易感人群；rs817826的SNP序列如SEQ.ID.NO.2所示。还提供检测单核苷酸多态性位点的特异性核酸引物SEQ.ID.NO.3、SEQ.ID.NO.4、SEQ.ID.NO.5，其特异性地扩增出单核苷酸多态性位点的扩增产物。文档编号C12Q1/68GK102994495SQ20121043261公开日2013年3月27日申请日期2012年11月2日优先权日2012年11月2日发明者孙颖浩,徐剑锋,莫曾南,许传亮,任善成,高旭申请人:上海长海医院,复旦大学