专利名称：一种用于检测卵巢癌易感性的分子标记、试剂盒及其检测方法
技术领域：
本发明涉及一种用于检测卵巢癌易感性的分子标记、试剂盒及其检测方法，具体地涉及GADD45A基因的单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism, SNP)及其与卵巢癌的相关性，及检测这些SNP的方法和试剂盒，属于分子生物学和医学领域。
背景技术：
卵巢癌是致死率最高的女性生殖系统肿瘤，2008年全球新发病例225500人，死亡140200人。由于起病隐匿，症状不明显，多数患者发现时已届晚期，晚期卵巢癌患者5年生存率仅为30 45%左右，预后差，而早期卵巢癌患者5年生存率高达90%，这提示我们提 高卵巢癌患者预后和生存的关键是早诊、早治，因此探讨卵巢癌发生发展的生物学机制，寻找鉴定卵巢癌易感人群的分子标记，卵巢癌患者分子分型和预后预测的分子标记，对于高危人群或易感个体及卵巢癌患者实施有效的早诊、早治和个体化防治具有重要意义。现有技术中，虽然已经有超过200个候选基因和20个遗传区域的1100个遗传变异与卵巢癌易感性相关，但是与卵巢癌相关性很强的遗传变异却很少。并且没有GADD45A基因与卵巢癌相关性的报道，更没有GADD45A基因SNP与卵巢癌相关性的报道。因此，本领域急需进一步寻找卵巢癌易感基因，开发检测卵巢癌高危人群和易感个体的方法、试剂盒，以及相关的治疗药物。
发明内容
针对上述现有技术，本申请的发明人经过深入而广泛的研究，对大量候选基因的SNP进行了测定和分析，首次发现GADD45A和卵巢癌易感性密切相关，可作为卵巢癌易感性检测或者早期诊断的分子标记，因此，本发明提供了一种用于检测卵巢癌易感性的试剂盒及其方法，以及体外检测样品是否存在GADD45A基因的单核苷酸多态性的方法。本发明是通过以下技术方案实现的一种用于检测卵巢癌易感性的分子标记，其核苷酸序列如SEQ ID NO :1所示，其与正常的GADD45A基因相比，区别在于第1098位存在一个单核苷酸多态性G>T，即第1098位的碱基包括碱基G和碱基T两种情形，当为碱基G时，为正常的GADD45A基因，当为碱基T时，为突变的GADD45A基因cagtggctgg taggcagtgg ctgggaggca gcggcccaat tagtgtcgtg cggcccgtgg 60cgaggcgagg tccggggagc gagcgagcaa gcaaggcggg aggggtggcc ggagctgcgg 120cggctggcac aggaggagga gcccgggcgg gcgaggggcg gccggagagc gccagggcct 180gagctgccgg agcggcgcct gtgagtgagt gcagaaagca ggcgcccgcg cgctagccgt 240ggcaggagca gcccgcacgc cgcgctctct ccctgggcga cctgcagttt gcaatatgac 300tttggaggaa ttctcggctg gagagcagaa gaccgaaagg tgagtcggcc tgcggactct 360tccggcccga acttctctta cctaccccgc gctccccggt gcagccgggc tgtggaaggc 420
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进一步地，试剂盒还包括PCR反应液，PCR反应液由dNTP、Mg2+、Taq酶和Buffer组成。PCR反应液中各组分的用量关系为常规的，对所属领域技术人员而言是公知常识。一种体外检测样品是否存在GADD45A基因的单核苷酸多态性的方法，步骤如下(I)用GADD45A基因特异性引物扩增样品的GADD45A基因，得到扩增产物；所述引物为一对，具有SEQ ID NO 2和SEQ ID NO 3的序列；(2)对扩增产物进行序列测定，检测扩增产物中是否存在以下单核苷酸多态性1098G>T ；1098G>T突变位置编号基于SEQ ID NO: I的序列。一种对个体的卵巢癌易感性或患病风险进行检测或诊断的方法，步骤如下检测该个体的GADD45A基因、转录本和/或蛋白，并与正常的GADD45A基因、转录本和/或蛋白进行比较，存在差异就表明该个体患卵巢癌的可能性低于正常人群。所述差异是指是否存在单核苷酸多态性1098G>T ；1098G>T突变位置编号基于SEQ ID NO: I的序 列。本发明的用于检测卵巢癌易感性的分子标记、试剂盒及其方法，以及体外检测样品是否存在GADD45A基因的单核苷酸多态性的方法，检测简单、准确、快速，特异性强，对于高危人群或易感个体及卵巢癌患者实施有效的早诊、早治和个体化防治具有重要意义。
具体实施例方式下面结合实施例对本发明作进一步的说明。实施例I GADD45A基因突变的检测及与卵巢癌的关联分析I. I研究对象选取卵巢癌患者139例，2008年9月 2011年4月于山东大学齐鲁医院确诊治疗，临床资料从病历获得。年龄匹配的对照病人189例，为齐鲁医院健康体检中心健康查体妇女。大部分受试者均为山东省内汉族居民。取受试人员外周血I. 5ml，于-80°C冷藏保存。所有受试人员均按照山东大学齐鲁医院伦理委员会要求征得同意。1.2DNA 提取用常规酚氯仿法提取受试者外周血DNA，具体如下(I)取400ul血加于I. 5ml离心管中。(2)加入 800ul PBS,混匀，3500g，15min，弃上清；重复一遍。(3)加入 400ul 裂解液，37°C，lh。(4)加入蛋白酶 K 4ul，浓度 200ug/ml。(5) 55°C水浴消化过夜(4_12h)。(6)加入400ul的Tris饱和酹，混合摇动lOmin。(7) 5000g，15min，取水相。(8)加入 IOOul NaAc，800ul 无水乙醇，-20°C，20min。(9) 12000g，5min，弃上清。(10) 600ul 70% 冰乙醇，12000g，5min，弃上清，重复一次。(11) 12000rpm离心，10分钟。弃上清，晾干。溶于100 μ I TE。(12)测定浓度和纯度，分装，冻存于_80°C。I. 3引物、PCR扩增和测序
从GenBank下载 GADD45A 基因组序列(GenBank 序列；AY135686. I ；GI: 22122007),用primer premier5. O设计引物。具体引物详细信息见表I。表I引物序列表
引物名称序列SEQ ID NO ~
上游引物 5，AGTTTGCACAGGGCAACTCC3，2
下游引物 5，CCTGCTAAAGGAATTAGTCACG3，3PCR 扩增条件94 °C 3 分钟，(94 V 30 秒，60 V 30 秒，72 V 40 秒)X 35，72 °C 7 分 钟，10°C保温。PCR扩增产物为1255bp。PCR扩增产物送交上海博尚生物技术公司测序，测序结果应用软件Meglign 7.0和ChiOmas 2. 33进行检验和分析，本实施采用了反向测序，经分析，发现存在以下SNP 1098G>T。I. 4SNP分型和关联分析应用卡方(X2)检验对受试人员位点的分布进行统计分析；当一个单元格的期望个数少于5个时应用Fisher精确检验进行分析。所有P值均为双侧概率，当P〈0. 05时认为有显著统计学意义。应用无条件逻辑回归分析对基因型频率、等位基因频率和卵巢癌患病之间的相关性进行评估，计算其比值比(Odds ratio, OR)和95%可信区间(confidenceinterval, Cl)，并应用 SPSS17. O 软件(SPSS Inc. Chicago, Illinois, USA)进行统计分析。结果发现SEQ ID NO : I中的rs2759219 (1098GXT)位点与卵巢癌发病显著相关，其中加性遗传模型(G/G vs.G/T vs T/T)的P值为0.0028。显性遗传模型(G/G+G/T vs T/T)的 P 值为 0. 048 (0R=0. 545，95%CI
)。隐性遗传模型(G/G vs G/T+T/T)的P 值为 0. 000839(OR=O. 470，95%CI
)，T 等位基因为保护性基因(P=0. 0005，OR=O. 569,95%CI
)。详细结果见表 2。表2 1098G>T位点基因型及等位基因在卵巢癌组和健康对照组中的分布
权利要求
1.一种用于检测卵巢癌易感性的分子标记，其特征在于其核苷酸序列如SEQID NOI所示，第1098位存在一个单核苷酸多态性G>T，即第1098位的碱基包括碱基G和碱基T两种情形cagtggctgg taggcagtgg ctgggaggca gcggcccaat tagtgtcgtg cggcccgtgg60cgaggcgagg tccggggagc gagcgagcaa gcaaggcggg aggggtggcc ggagctgcgg120cggctggcac aggaggagga gcccgggcgg gcgaggggcg gccggagagc gccagggcct180gagctgccgg agcggcgcct gtgagtgagt gcagaaagca ggcgcccgcg cgctagccgt240ggcaggagca gcccgcacgc cgcgctctct ccctgggcga cctgcagttt gcaatatgac300 tttggaggaa ttctcggctg gagagcagaa gaccgaaagg tgagtcggcc tgcggactct360tccggcccga acttctctta cctaccccgc gctccccggt gcagccgggc tgtggaaggc420ttgcagggga ggaagctaaa aagtttgcac agggcaactc ccgcccttgc tccctcggga480ctctccgtgg agctcccacg gactgaaaga gcgtgccccc caacccgaac gagccccgcc540ggggcctttg caaagggcag cagtggccgt cgctgcccgt gcggctcccg tggctggcag600cctgtggcag gggcactctc gggacttctc acgggacgcc cggtccttgg gcgtgcaggg660gtcatggggg gtgacggggc cgcgggagcg ccgggttttc gtagagccca ggtgcgcggt720ggtgcttgca ttcgagaggg aggggcgtgg taccggacga ggggggcggc gatggccccg780agggcaccgg ggctgacggg acccctcgcc cttgcccgcg tgtaggatgg ataaggtggg840ggatgccctg gaggaagtgc tcagcaaagc cctgagtcag cgcacgatca ctgtcggggt900gtacgaagcg gccaagctgc tcaacgtgta agtggggccc ttgcgcgtcc cccatggcac960cccttcccgc cccagcccgg gaggtcgcct tggctgggcg cccctcgccc ggccgcgcca1020cttcctgtcg cttttctgcc tgtctcggaa gggagggggc gagcgggccg ggcggcgacc1080 cccagggacc cgggcagrgg ttgagggcgc ccgcgcttct gcgctcactg gccccgcccg11401098ctgcccccag cgaccccgat aacgtggtgt tgtgcctgct ggcggcggac gaggacgacg1200acagagatgt ggctctgcag atccacttca ccctgatcca ggcgttttgc tgcgagaacg1260acatcaacat cctgcgcgtc agcaacccgg gccggctggc ggagctcctg ctcttggaga1320ccgacgctgg ccccgcggcg agcgagggcg ccgagcagcc cccggacctg cactgcgtgc1380tggtgacggt aagggactgg gggactgcag cctgcagggt agagccccgg aaggacggga1440gtcagggctg ggttgcctga ttgtggatct gtggtaggtg ggggtcagga gggtggctgc1500ctttgtccga ctagagtgtg gctggacttt cagccgagat gtgctagttt catcaccagg1560attttctgtg gtacagaaca tgtctaagca tgctggggac tgccagcagc ggaagagatc1620cctgtgagtc agcagtcagc ccagctactc cctacctaca tctgcactgc ctcccgtgac1680taattccttt agcagggcag attagataaa gccaaatgaa ttcctggctc acccctcatt1740aaggagtcag cttcattctc tgccagtcag agctaaaaat agaaattgtg taggagacaa1800accttgttaa ttccctagaa atacattaag aggatagagt ggaatttttt ttctctgcaa1860tcttgcattt ttttaatggc tctttttttt tttcctgata aaaacctttg gtaggtaggg1920aagttatgtt ttcaggggta aatgtgctac ttttgtcttc taaattttgc tcttttttga1980ctggtctagt caagtgacag cccgattatt ttgctactcc ttaaaagtac tattctgtct2040cttggagtat ggttgatggc aattccagtt aactgctgtg cagctctcat ctcattgtgc2100acacagcatg gaaatctttc tcaaaactgt ttcactcagg tcagggtaac aagtttggta 2160gagcaaaccg gtgaatgata ctctcatgca aaactgaaca gatatgcaaa catatgtatg 2220tggttcagct tgggttgcat gggttcagac tttgcaatgt gtagtttaat aggtaattac 2280ccttaacgct tttgcaggga acccaactac cttgaagaaa ctttaatttt tttgtgcttc 2340taatttgtct ccatgtcaca tagccaaaat atagaatgtt caagtgtttt ctcctcaaaa 2400gtataattac tagaatatac tggtttttaa aataagttta tttttataaa tttgtttcca 2460g2461ο
2.一种用于检测卵巢癌易感性的试剂盒，其特征在于包括特异性引物，该引物为一对，具有SEQ ID NO 2和SEQ ID NO 3的序列。
3.根据权利要求I所述的用于检测卵巢癌易感性的试剂盒，其特征在于还包括PCR反应液，PCR反应液由dNTP、Mg2+、Taq酶和Buffer组成。
4.一种体外检测样品是否存在GADD45A基因的单核苷酸多态性的方法，其特征在于 步骤如下 (1)用GADD45A基因特异性引物扩增样品的GADD45A基因，得到扩增产物；所述引物为一对，具有SEQ ID NO 2和SEQ ID NO 3的序列； (2)对扩增产物进行序列测定，检测扩增产物中是否存在以下单核苷酸多态性1098G>T ；1098G>T突变位置编号基于SEQ ID NO: I的序列。
全文摘要
本发明公开了一种用于检测卵巢癌易感性的分子标记，其核苷酸序列如SEQ ID NO1所示，第1098位存在一个单核苷酸多态性G>T。一种用于检测卵巢癌易感性的试剂盒，包括特异性引物，该引物为一对，具有SEQ ID NO2和SEQ ID NO3的序列。一种体外检测样品是否存在GADD45A基因的单核苷酸多态性的方法，步骤如下(1)用特异性引物扩增样品的GADD45A基因，得到扩增产物；(2)对扩增产物进行序列测定，检测扩增产物中是否存在以下单核苷酸多态性1098G>T。本发明的方法，检测简单、准确、快速，特异性强，对于高危人群或易感个体及卵巢癌患者实施有效的早诊、早治和个体化防治具有重要意义。
文档编号C12Q1/68GK102864235SQ20121037659
公开日2013年1月9日 申请日期2012年9月29日 优先权日2012年9月29日
发明者苑存忠, 孔北华, 杨其峰, 闫实, 刘晓燕, 杨宁 申请人:山东大学齐鲁医院