专利名称：一种检测乳腺癌易感性的试剂盒的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种疾病易感性检测用的试剂盒，尤其涉及一种检测乳腺癌易感性的试剂盒，通过检测CD155的单核苷酸多态性(SNP)位点来预测乳腺癌的易感性。
背景技术：
乳腺癌位列女性恶性肿瘤发生率第一位，我国乳腺癌发病率逐年增高。癌症的发生是一个多因素，多阶段，多基因变异的过程。作为NK细胞活化的关键分子，CD155参与了肿瘤发生发展的各个重要过程。大量的研究表明，肿瘤免疫调控相关基因的单核苷酸多态可以通过改变这些基因的表达水平的方式，影响这些基因在肿瘤发生、发展中的作用。SNP (Single nucleotide polymorphism)，即单核苷酸多态性，是人类基因组作图的第三代遗传标记，主要是指一类基于单碱基变异引起的DNA序列多态性，包括单碱基转换、颠换，以及单碱基的插入/缺失等。它是基因组最广泛存在的一类多态性标记，已成为研究基因组多态性和识别、定位疾病相关的一种工具。1996年成功研制了 SNP检测的实时荧光定量PCR技术，实现了 PCR从定性到定量的飞跃，还实现了判断结果的自动性。可利用荧光定量PCR技术研发检测疾病易感性的试剂盒。⑶155分子(其基因银行的编号为NG_008781. 1)最初作为脊髓灰质炎病毒受体而被发现，随后又发现CD155分子参与了细胞-细胞间、细胞-基质间黏附；与整合素 α νβ3分子相结合的⑶155分子在二聚体化后，可以通过与玻连蛋白、neCtin3的相互作用介导细胞间、细胞与细胞外基质间的黏附(参见=Mueller S，Wimmer E. Recruitment of nectin-3 to cell-cell junctions through trans-heterophi1ic interaction with CD155, a vitronectin and poliovirus receptor that localizes to alpha(v) beta3 integrin—containing membrane microdomains.J Biol Chem. 2003 Aug 15 ； 278 (33) : 31251-60)。另外，通过与其受体CD226分子相互作用，CD155也参与介导了 NK 细胞对肿瘤细胞的杀伤。研究还发现，在许多肿瘤细胞系和多种组织来源肿瘤如脑胶质瘤、结直肠肉瘤和造血系统的恶性肿瘤中，均可以检测出CD155分子的表达水平明显升高。啮齿目动物中存在着CD155的同源分子Tage4，并被认为是人CD155的祖先基因，在啮齿动物肿瘤中同样也具有很高的表达水平(参见=Kakunaga S, Ikeda W, Shingai T, Fujito T, Yamada A, Minami Y, Imai T, Takai Y. Enhancement of serum- and platelet-derived growth factor-induced cell proliferation by Necl_5/Tage4/poliovirus receptor/CD155 through the Ras-Raf-MEK-ERK signaling. J Biol Chem. 2004 Aug 27;279(35):36419-25)。rs203713是位于第18号染色体CD155基因3，UTR区域的一个A>G多态。其在世界人群的频率分布，T占0.62，G占0.38左右。中国人群的分布T占0.45，G占0.25左右。现有技术中，并没有⑶155基因3’ UTR区域的A>G多态与乳腺癌相关性的研究报道，也没有通过检测CD155的单核苷酸多态性(SNP)位点来预测乳腺癌的易感性的报道。
发明内容
本发明的目的在于提供一种检测乳腺癌的试剂盒。本发明的原理为发明人通过分子生物学研究表明，⑶155的rs203713位点上A>G 的替代可增加⑶巧5基因3’ UTR与核蛋白的结合，增加⑶155基因的表达；通过大规模人群的乳腺癌病例对照研究，⑶巧5基因3’UTR区域的A>G多态与乳腺癌发生相关，并且呈基因剂量-反应关系，即使在调整年龄、性别、吸烟、肿瘤家族史等多种混杂因素后，这种相关性仍然存在。因此这个SNP的多态可用于评估个体乳腺癌的易感性。为了实现上述目的，本发明采用的技术方案是一种检测乳腺癌易感性的试剂盒， 包括检测CD155的rs203713号单核苷酸多态性(SNP)位点的特异性引物对及特异性荧光探针对、荧光定量PCR的常规组件。上述技术方案中，所述特异性引物对包括有义引物序列SEQ ID No. 1和反义引物序列SEQ ID No. 2，具体如下所示
SEQ ID NO. 1 有义引物序歹Ij :5，-ACC CTC CCT CTG CAT TGC T _3，，Tm 值为 60 "C ； SEQ ID NO. 2 反义引物序列5，- CAG TCC CAA GTG GAT GT _3，，Tm 值为 58 "C。上述技术方案中，所述特异性荧光探针对包括野生型探针序列和突变型探针序列，具体如下所示
SEQ ID NO. 3 野生型探针序列5，-CAGAGTTGATCTGTAGAAT-3，，Tm 值为 66 "C ； SEQ ID NO. 4 突变型探针序列5，-TTAGACAGAGTTGATCTATAGA-3，，Tm 值为 67 "C。上述技术方案中，所述特异性引物是针对⑶155基因上的rs203713号SNP位点而设计，能特异性扩增出包含针对⑶巧5基因上的rs203713号SNP位点的DNA引物对，本领域技术人员能理解，特异性引物对可用常规的合成技术合成。优选的技术方案中，所述检测乳腺癌的试剂盒包括具有SEQ ID NO. 1和SEQ ID N0. 2所示序列的引物对。本发明的引物不限于这对引物。上述技术方案中，所述特异性荧光探针是针对⑶155基因上的rs203713号SNP位点而设计，能特异性检测rs203713这个乳腺癌一个基因型的DNA探针对；优选地，本试剂盒包括具有SEQ ID N0. 3和SEQ ID N0. 4所示序列的荧光探针对。特异荧光引物对可用常规的合成技术合成。本领域技术人员能理解，本发明的引物不限于这对荧光探针。所有可用于荧光定量PCR检测⑶155基因上的rs203713号SNP位点的探针均在本发明范围内。上述技术方案中，所述荧光定量PCR的常规组件包括Taq DNA聚合酶、dNTP混合液、MgCl2溶液、荧光定量PCR反应缓冲液和去离子水；所述荧光定量PCR的常规组件的成分及其制备方法均为现有技术。具体地，一种检测乳腺癌易感性的试剂盒，每10 μ 1的PCR体系中包括10 μ M特异性引物对两条各0.225 μ 1，5 μ M特异性荧光探针两条各0. 1μ 1 ； (5unit/y l)Taq DNA 聚合酶 0. 02 μ 1 ；20mM dNTP 混合液 0. 1 μ 1 ；25 mM MgCl2 溶液 0. 5 μ 1 ；5 X 荧光定量 PCR 反应缓冲液2 μ 1 ；去离子水补足；上述试剂盒的保存温度为-20°C。本发明同时要求保护上述的试剂盒检测通过荧光定量PCR法检测丝裂原活化蛋白激酶激酶4的rs203713号单核苷酸多态性位点基因型的应用。即当个体携带A等位基因时其罹患乳腺癌的风险将显著增高。
采用上述检测乳腺癌的试剂盒检测待测DNA的⑶155基因上的rs203713号SNP 位点的基因型，其中，PCR反应条件为50 V 2 min, 95 V 10 min，再进行40 55个PCR循环92 V 15 s,60 V 1 min;反应结束后在；采用荧光定量PCR仪读取荧光量，区分基因型被检测DNA的⑶155基因上的rs203713号SNP位点携带有G时，为乳腺癌易感型。由于上述技术方案的使用，本发明和现有技术相比，具有以下优点
由于本发明所述试剂盒中包含的特异性引物对是针对CD155基因上的rs203713号SNP 位点而设计，能特异性扩增出包含针对⑶155基因上的rs203713号SNP位点的DNA引物对；所述的特异性荧光探针是针对CD155基因上的rs203713号SNP位点而设计，能特异性扩增出包含针对⑶155基因上的rs203713号SNP位点的DNA探针对；因此，可以检测DNA 的⑶155基因上的rs203713号SNP位点的基因型，从而检测个体乳腺癌的易感性。
具体实施例方式下面结合实施例对本发明作进一步说明 实施例一
一种检测乳腺癌的试剂盒，包括检测⑶巧5基因上的rs203713号SNP位点的特异性引物对及特异性荧光探针对、Taq DNA聚合酶、dNTP混合液、MgC12溶液、荧光定量PCR反应缓冲液和去离子水；
所述检测⑶155基因上的rs203713号SNP位点的特异性弓|物对的序列如序列表SEQ ID NO. 1所示，有义引物序列的Tm值为60 °C，反义引物序列的Tm值为58 °C;所述检测⑶155 基因上的rs203713号SNP位点的特异性荧光探针对的序列如序列表SEQ IDN0. 2所示，野生型探针序列的Tm值为66 °C，突变型探针序列的Tm值为67 °C ；具体如下所示SEQ ID NO. 1 有义引物序列5’ -ACC CTC CCT CTG CAT TGC T _3，，Tm 值为 60 °C;SEQ ID NO. 2 反义引物序列5，- CAG TCC CAA GTG GAT GT _3，，Tm 值为 58 "C。 所述的特异性引物，能特异性扩增出包含针对⑶155基因上的rs203713 号SNP位点的DNA引物对和DNA探针对，具体如下所示SEQ ID NO. 3野生型探针序列5，-CAGAGTTGATCTGTAGAAT-3，，Tm 值为 66 "C ；SEQ ID NO. 4 突变型探针序列 5，-TTAGACAGAGTTGATCTATAGA-3，，Tm 值为 67 "C。以供检测一人份使用试剂盒为例，该试剂盒中各物质的含量为10μΜ特异性引物对两条各0.225 μ 1，5 μ M特异性荧光探针两条各0. 1μ 1 ； (5unit/y l)Taq DNA聚合酶 0. 02 μ 1 ； 20mM dNTP 混合液 0. 1 μ 1 ；25 mM MgCl2 溶液 0. 5 μ 1 ；5Χ 荧光定量 PCR 反应缓冲液2μ 1 ；去离子水4. 1μ 1。在ABI 7900ΗΤ型荧光定量PCR仪中进行反应，反应条件为50 V 2 min, 95 V 10 min，再进行 40 55 个 PCR 循环92 "C 15 s，60 "C 1 min。反应结束后在 ABI 7900HT 型荧光定量PCR仪读取荧光量。步骤3 基因型分析及确定基因型
采用 ABI 7900HT 型荧光定量PCR仪自带软件 SDSGequence Detection Systems)V2. 3 判读基因型，自动分析结果。被检测DNA的⑶155基因上的rs203713号SNP位点携带有G 时，为乳腺癌易感型。实施例二步骤1 :DNA的提取
对被检测者进行服务前咨询，由被检测者签署知情同意书，填写生活饮食习惯问卷表。 常规方法抽取被检测者EDTA抗凝血5ml。用硅胶吸附法提取血液标本的基因组DNA。步骤2 基因分型检测
使用实施例一所述试剂盒，对被检测者DNA的⑶155基因上的rs203713号SNP位点进行荧光定量PCR检测，确定该位点的基因型。步骤3 指导人们主动预防乳腺癌
通过对被检测者基因型的分析，出具基因分型检测报告和对被检测者个体化健康指导报告。基因分型检测报告详细说明了被检测者乳腺癌易感程度的高低以及患病概率大小。 个体化健康指导报告以被检测者的基因分型检测结果为基础，结合其生活饮食习惯问卷调查结果，评估被检测这乳腺癌遗传易感的相对风险。同时制定出针对被检测者的个性化健康行动方案，包括在饮食习惯、生活方式生活的改进建议等，并为被检测者普及预防乳腺癌的健康知识。实施例三
采用实施例一所述检测乳腺癌的试剂盒，采用实施例二的检测方法，对522例乳腺癌患者和712例正常对照进行基因分型，所得结果参见表一。表一显示通过我们设计的方法对522例乳腺癌患者和712例正常对照进行基因分型后我们发现携带CD155 rs203713 AA基因型的个体比携带CD155 rs203713 GG基因型的个体罹患乳腺癌的风险要高2. 28倍，携带⑶155 rs203713 AG基因型的个体比⑶155 rs203713 GG基因型的个体罹患乳腺癌的风险要高1. 49倍(趋势检验差异均具有显著性# < 0.05)。表一、⑶155基因rs203713单核苷酸多态与乳腺癌风险
权利要求
1.一种检测乳腺癌易感性的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括检测CD155的 rs203713号单核苷酸多态性位点的特异性引物对及特异性荧光探针对、荧光定量PCR的常规组件。
2.根据权利要求1所述检测乳腺癌易感性的试剂盒，其特征在于，所述特异性引物对包括有义引物序列SEQ ID No. 1和反义引物序列SEQ ID No. 2，具体如下所示SEQ ID NO. 1 有义引物序歹Ij :5，-ACC CTC CCT CTG CAT TGC T _3，，Tm 值为 60 "C ；SEQ ID NO. 2 反义引物序列5，- CAG TCC CAA GTG GAT GT _3，，Tm 值为 58 "C。
3.根据权利要求1所述检测乳腺癌易感性的试剂盒，其特征在于，所述特异性荧光探针对包括野生型探针序列和突变型探针序列，具体如下所示SEQ ID NO. 3 野生型探针序歹Ij :5，-CAGAGTTGATCTGTAGAAT-3，，Tm 值为 66 "C ；SEQ ID NO. 4 突变型探针序列5，-TTAGACAGAGTTGATCTATAGA-3，，Tm 值为 67 "C。
4.根据权利要求1所述检测乳腺癌易感性的试剂盒，其特征在于，所述荧光定量PCR的常规组件包括Taq DNA聚合酶、dNTP混合液、MgCl2溶液、荧光定量PCR反应缓冲液和去离子水。
5.根据权利要求1所述检测乳腺癌易感性的试剂盒，其特征在于，每10μ1的PCR体系中包括10μΜ特异性引物对两条各0. 225μ 1，5μΜ特异性荧光探针两条各0. 1μ 1 ； 5unit/ μ 1 Taq DNA 聚合酶 0. 02 μ 1 ；20mM dNTP 混合液 0. 1 μ 1 ;25 mM MgCl2 溶液 0. 5 μ 1 ； 5 X荧光定量PCR反应缓冲液2 μ 1 ；去离子水补足。
6.权利要求1所述试剂盒检测通过荧光定量PCR法检测丝裂原活化蛋白激酶激酶4 的rs203713号单核苷酸多态性位点基因型的应用。
全文摘要
本发明公开了一种疾病易感性检测用的试剂盒，尤其涉及一种检测乳腺癌的试剂盒，通过检测CD155的单核苷酸多态性位点来预测乳腺癌的易感性。所述试剂盒包括检测CD155的rs203713号单核苷酸多态性位点的特异性引物对及特异性荧光探针对、荧光定量PCR的常规组件。本发明所述试剂盒可以检测DNA的CD155基因上的rs203713号SNP位点的基因型，从而检测个体乳腺癌的易感性，也适用于对胃癌、前列腺癌及卵巢癌的预后检测，更可广泛应用于医疗研究。
文档编号C12Q1/68GK102296125SQ20111028590
公开日2011年12月28日 申请日期2011年9月23日 优先权日2011年9月23日
发明者周翊峰, 姜岚, 游永鹤, 邓杰琼, 郑健 申请人:苏州大学