专利名称：：一种用于乳腺癌早期诊断的液相芯片试剂盒及其制备方法
技术领域：
：本发明属于医药生物类，具体地是涉及一种用于乳腺癌早期诊断的液相芯片试剂盒及其制备方法。
背景技术：
：乳腺癌是女性最常见的恶性肿瘤之一，全世界每年的新发病例超过一百万，大多数发生在4060岁之间，即更年期前后的女性。全世界乳腺癌发生率正以每年0.23%的幅度上升。在欧美等西方发达国家，乳腺癌己成为女性的主要死因之一，每910名女性中，就有1人患乳腺癌。在中国，乳腺癌是中国妇女最常发生的恶性疾病，占恶性肿瘤的22%，并呈逐年快速上升趋势。在癌症还未扩散时确诊，乳腺癌患者的存活率可高达97%，所以对乳腺癌的早期检测尤其重要。目前临床常用的乳腺癌检查方法主要有近红外线乳腺扫描、乳腺x线检査、乳腺磁共振成像、乳腺彩色多普勒超声检查、脱落细胞检査、乳腺导管造影、乳管内镜检查、针吸细胞学检查(FNA)、乳腺穿刺活检、外科手术活检、冰冻切片检査以及肿瘤标志物的检测。乳腺近红外线扫描检查具有无损害、经济、快速、高效的特点，是防癌普查发现早期乳腺癌的重要手段，但是阳性率较低，同时受干扰因素较多，漏检率高。乳腺x线检查是目前最有效的早期发现乳腺癌的方法，但其检测漏检率高，约为21%，且出现约为7%的假阳性。此外，X线对人体有害，并可能诱发乳腺癌，很多人避免这种筛查检测。磁共振成像(MRI)的作用正日益增加(特别是对那些有乳癌家族病史的年过40的女性)，但其需要向血管内注射造影剂，属干一种创伤性的检査措施；另外，费用昂贵，因此不适宜大规模的人群普査。乳腺的超声检查具有经济、简便、无痛苦无损伤的特点。但该技术要求检査者有一定的操作经验，比较费时；对检查仪的要求也较高，需有较高灵敏度的彩色多普勒超声仪；对小于0.5cm的肿瘤，超声易漏诊。对较小肿瘤超声的鉴别诊断也较困难。乳房触检是有效的检查手段，但被检者会感到非常尴尬。肿瘤标志物的检测是癌症早期诊断的最新、最有效的方法。乳腺癌中的肿瘤标志物对于临床上尚未形成肿块的乳腺癌的早期发现将会比其他任何检查方法都有意义，而且是真正的早期发现。临床上也已广泛开展了肿瘤标志物的检测。血清肿瘤标志物的测定方法主要有放射免疫分析、酶免疫分析、化学发光免疫分析、电化学发光免疫分析等。然而，这些方法都是单指标的检测方法；而对肿瘤进行单一标志物的检测始终存在着特异性不强、灵敏度低等不足，特别是对早期肿瘤的检出率不高，因此可能会造成部分患者漏诊。若想避免这种情况而对每份标本进行多指标分析费用又很昂贵，而且需要的血清量较大。鉴于这种情况，国内外专家认为应从分析技术入手，发展能够同时、快速、准确检测多种肿瘤标志物的综合技术，从而提高肿瘤诊断的敏感性。液相蛋白芯片技术正是这样一种适应高通量，高灵敏度和低样本消耗量检测的蛋白技术平台。作为高通量的新一代分子诊断技术平台，液相芯片技术为癌症早期诊断和检测带来了新的曙光。液相芯片系统是生物芯片领域已经发展成熟的一项技术。液相芯片系统包括Luminex仪器和不同荧光编码的微球等。Luminex仪器是一自动化程度极高的检测和分析仪器。荧光编码的微球目前共有100种，可检测100种与之相偶联的不同种类的目标分子。将这些微球悬浮于一个液相体系中，就可以对同一个样品中的多个不同的检测对象同时进行检测，这种检测技术称为xMAP(flexibleMulti-AnalyteProfiling)技术。在微球的制造过程中，惨入了两种不同的红色荧光染料，根据这两种染料的比例不同，可以把微球分为100种。在液相芯片系统中，为了区分不同的探针，每一种用于标记探针的微球都带有一个独特的荧光编码。不同的微球共价结合了针对不同待检测物的蛋白(抗体或抗原，用于免疫检测)作为探针分子，检测抗体中以生物素标记，并用高灵敏的荧光染料染色。这些微球与待测物、检测抗体、荧光标记物就形成完整的微球检测体系用于Luminex系统的读取。Lmninex阅读系统分别激发红色激光和绿色激光用于微球体系的检测，其中红色激光检测微球表面红色分类荧光的强度，并根据微球中不同色彩而编号分类，从而确定反应的类型；而绿色激光则检测样本中荧光标记物的荧光强度，再通过机器与计算机自动统计分析激光所检测到微球种类、数量，从而判定待测样本多种目标测试物的浓度。乳腺癌中的肿瘤标志物简介1)IL-8细胞因子是由造血系统、免疫系统或炎症反应中的活化细胞产生，能调节细胞分化、增殖和诱导细胞发挥功能，是高活性多功能的多肽蛋白或糖蛋白。白细胞介素8(IL-8)是一种细胞因子，为趋化因子超家族中的一个成员，它可以激活和趋化中性粒细胞从而在炎症反应中发挥其重要作用。但近来越来越多研究证明，IL-8与肿瘤的发生发展有关，并且认为IL-8是一种促血管生成因子，通过内分泌或旁分泌促进肿瘤血管形成。许多学者在黑色素瘤、前列腺癌、肺癌、肝癌等检测出IL-8蛋白质分泌或蛋白表达，而其相应正常组织中没有IL-8表达。已有的研究结果也表明了在乳腺癌组织中IL-8蛋白的高表达与乳腺癌发生有关。2)IL-6白细胞介素6(IL-6)主要是由巨噬细胞、T细胞、B细胞等多种细胞产生的一种糖蛋白。IL-6对肿瘤细胞生长的影响较为复杂，对不同的肿瘤既可以表现为剌激作用，又可以表现为抑制作用。IL-6对乳腺癌细胞的作用又有相应特殊性。Adams等人的研究表明，乳腺成纤维细胞可以分泌一种类似IL-6的生长因子，该生长因子可促使MCF-7细胞内的雌酮转化为高活性的雌二醇，而雌二醇对乳腺癌细胞的增生起着重要的作用。乳腺癌病人组血清IL-6检测水平明显高于正常对照组(PO.01)，因此，可认为IL-6可以间接刺激乳腺癌细胞的增生，可作为诊断乳腺癌的一种相关指标。3)VEGF血管内皮因子(Vascularendothelialgrowthfactor,VEGF)是一种特异的作用于血管内皮细胞的多功能细胞因子。浸润性生长和转移是恶性肿瘤的重要生物学特征，而转移又是癌症患者的主要死亡原因。已有相当直接的证据表明，癌的增殖和转移是血管新生依赖性的，它受正调节和负调节的严格控制，而VEGF是一种正调节因子，对新生血管形成有着重要生物学调节作用，是新生血管的必备条件。血管内皮生长因子(VEGF)被认为是在大多数肿瘤新血管形成中起重要作用的因子。研究发现，VEGF可以作为乳腺癌早期患者的阳性标志物，I期阳性率就可达73.3%。4)TNF-a肿瘤坏死因子(TNF)是由单核巨噬细胞所产生的一种多肽细胞，是参与多种生理和免疫过程的重要介质。它在内源性干扰素、细菌、内毒素及病毒等刺激下，主要由活化的巨噬细胞、单核细胞和T细胞产生，在正常情况下这些细胞对机体具有免疫应答的作用，但如果持续释放过多或与其它细胞因子关系失调，又会引起机体发热，恶液质，参与疾病的发生和发展。己有研究结果显示乳腺癌患者血清TNF检测水平明显高于正常对照组(p0.01)，从而表明TOP参与乳腺癌疾病的发生和发展，导致了病理性机体损伤。5)T-PSA总前列腺特异性抗原(T-PSA)主要由前列腺组织和尿道周围腺体中的柱状上皮细胞分泌，T-PSA在女性乳腺中也存在和分泌。大多数学者认为雌激素在乳腺癌发展中起重要的作用，而乳腺癌中T-PSA可由雄激素调节产生，T-PSA的出现表明雌激素作用抑制或减少，T-PSA对雌激素依赖型乳腺癌起负性生长调节作用，因此乳癌中若T-PSA阳性则表示预后良好，肿瘤多较小，且属早期低级，复发和转移的机会很少，其生存期比T-PSA阴性病人明显延长。因此，T-PSA也作为乳腺癌的肿瘤标志物之一。血清T-PSA浓度的测定可用于乳腺癌的预后分析和判定乳腺癌的临床分期。
发明内容本发明需要解决的技术问题是提供一种用于乳腺癌早期诊断的液相芯片试剂盒，该试剂盒对血清中IL-6，IL-8，VEGF，TNF-a以及T-PSA五个指标进行联合检测。解决上述技术问题的技术方案如下一种用于乳腺癌早期诊断的液相芯片试剂盒，主要包括有1)5-plex包被微球含有分别包被了IL-6捕获抗体的51#微球、包被了IL-8捕获抗体的38#微球、包被了TNF-a捕获抗体的34#微球、包被了T-PSA捕获抗体的20#微球、和包被了VEGF捕获抗体的32#微球；2)5-plex生物素标记检测抗体分别用生物素标记的IL-6、IL-8、TNF-a、T-PSA、VEGF的检测抗体的混合液3)链亲和素藻红蛋白(SA-PE)。其中，所述的捕获抗体和检测抗体均能特异地与其相应的乳腺癌血清标志物(即IL-6，IL-8，TNF-a，T-PSA，VEGF)结合，所述的链亲和素藻红蛋白能与生物素高度特异地结合，因此反应体系中最终形成分别针对IL-6，IL-8，TNF-a，T-PSA，VEGF的"微球-捕获抗体+血清标志物+检测抗体+链亲和素藻红蛋白"的五种复合物。通过Luminex仪器检测，以红色激光激发微球上的红色分类荧光，依据微球的色彩不同确定反应类型，以绿色激光激发藻红蛋白，测定微球上结合的报告荧光分子的数量，用于间接确定微球上结合的乳腺癌血清标志物的含量。本发明的另一需要解决的技术问题是提供一种上述用于乳腺癌早期诊断的液相芯片试剂盒的制备方法。一种制备用于乳腺癌早期诊断的液相芯片试剂盒的方法，主要包括以下步骤(1)相应的捕获抗体包被相应的微球-将50pL微球活化后，^8000g，离心；-吸弃上清，将微球重悬于pH5.0的230-280^L50mM的MES(2[N-Morpholino]ethanesulfonicacid)的溶液中，涡漩振荡20s，超声振荡约20s，后将微球^8000g，离心l-2min;重复上述步骤；-吸弃上清，将微球重悬于100pL50mMpH5.0的MES的溶液中，涡漩振荡约20s，超声约20s;-往悬浮的微球中加入相应的0.8-1.2吗抗体，用50mM的pH5.0的MES溶液将总体积补至450-550^iL;-用涡漩振荡器混匀，室温避光振荡1.5-2.5hr;-偶联抗体后的微球以S8000g的速度，离心l-2min;-吸弃上清，将微球重悬于500nLPBS-TBN(即PBS中含0.1%BSA,0.02%Tween一20，0.05%NaN，pH7.4)溶液中，涡漩振荡约20s，超声振荡约20s;室温避光振荡30min;再于^8000g，离心l-2min;-吸弃上清，将微球重悬于lmLPBS-TBN溶液中，涡漩振荡约20s，超声约20s;微球上8000g，离心l-2min;重复该步骤一次；吸弃上清，将微球重悬于250-100(HiLPBS-TBN溶液中；包被好的微球通过luminex仪器计数后置于2-8'C避光保存；每种抗体偶联的微球单独保存，使用时，依据检测项目选择混合；(2)每种检测抗体的生物素标记-依据检测抗体浓度计算出检测抗体溶液稀释至lmg/ml的体积，视为目标体积，-配置10mg/ml的NHS-Biotin反应液；-按摩尔比l:100于反应管中分别加入检测抗体与NHS-Biotin反应液；-加入体积为目标体积的1/10的NaHC03(pH8.9)溶液；-加入PBS(pH7.4)补至目标体积；-包上铝箔，将反应管置于振荡器上，于25'C恒温箱中避光孵育3-5小时，转速为800rpm-1000rpm;-将反应液转至透析盒内，于PBS缓冲液中透析过夜，以去除未反应的NHS-Biotiii;-使用时根据需要将标记好的每种检测抗体等比例混合。所述活化微球的步骤如下-用涡漩振荡器或者超声波悬浮微球；-取50pL微球(美国Luminex公司)离心l-2min;-去掉上清夜，将微球重悬于100pL的双蒸水中，用涡漩振荡器或者超声波悬浮微球约20s，^8000g离心l一2min;-吸弃上清，加入80pL的磷酸盐缓冲液(pH6.2)，涡漩振荡约20s，超声波悬浮微球约20s;-加入10pL50mg/mLSulfo-NHS，用涡漩振荡器轻轻地混匀；-力口入10(jL50mg/mLEDC(1-Ethyl-3-(3-dimethyllaminopropyl)carbodiimidehydrochloride,1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐)，用涡漩振荡器轻轻地混匀；-室温避光静置20min，每10min用涡漩振荡器轻轻地混匀。本发明基于液相芯片技术平台，通过大量的实验开发了可以对血清中IL-6，IL-8，VEGF，TNF-a以及T-PSA五种肿瘤标志物联合检测的乳腺癌早期诊断液相芯片试剂盒，研究结果表明，对血清中五个指标的联合检测可使乳腺癌的早期诊断准确率高达96%。本发明所述的用于乳腺癌早期诊断液相芯片试剂盒具有无副作用，高通量，多指标并行检测；敏感度高，重复性好，检测快速，准确，费用低等优点，该液相芯片试剂盒制备方法简单可靠，稳定性好。图1是检测IL-6的标准曲线示意图2是检测IL-8的标准曲线示意图3是检测VEGF的标准曲线示意图4是检测TNF-a的标准曲线示意图图5是检测T-PSA的标准曲线示意图。具体实施方式实施例1IL-6捕获抗体为IL-6的单克隆抗体，克隆号为6708;IL-8捕获抗体为IL-8的单克隆抗体，克隆号为6217.111，VEGF捕获抗体为VEGF的单克隆抗体，克隆号为26503.111，T-PSA捕获抗体为T-PSA的单克隆抗体，克隆号为BM215，TNF-a捕获抗体为TNF-a的单克隆抗体，克隆号为28401.111。IL-6检测抗体为IL-6的多克隆抗体，克隆号为SV126053;IL-8检测抗体为IL-8的多克隆抗体，克隆号为OM096021，VEGF检测抗体为VEGF的多克隆抗体，克隆号为XQ096031，T-PSA检测抗体为T-PSA的单克隆抗体，克隆号为M701042，TNF-a检测抗体为TNF-a的单克隆抗体，克隆号为D2。本实施例中，所述各种溶液的配方如下1.50mM的MES缓冲液(pH5.0)配方(250ml):<table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage13</column></row><table>2.PBS配方:<table>tableseeoriginaldocumentpage13</column></row><table>3.PBS-TBN配方(即PBS中含O.1%BSA，0.02%T\|feen-20,0.05%Na3N，pH7.4)<table>tableseeoriginaldocumentpage13</column></row><table>l.用于乳腺癌早期诊断的液相芯片试剂盒，包括有1)5-plex包被微球含有分别包被了IL-6捕获抗体的51#微球、包被了IL-8捕获抗体的3蹄微球、包被了TNF-a捕获抗体的34#微球、包被了T-PSA捕获抗体的20#微球、包被了VEGF捕获抗体的32#微球；2)5-plex生物素标记检测抗体分别用生物素标记的IL-6、IL-8、TNF-a、T-PSA、VEGF的检测抗体的混合液；3)链亲和素藻红蛋白(SA-PE，10ug/ml);还配套包括有4)分析缓冲液；5)5-plex标准品；6)质控液I;7)质控液II;8)血清基质液；9)封口膜；10)滤板。2.制备上述液相芯片试剂盒，包括如下步骤(1)按上述试剂盒的组成，每种捕获抗体包被相应的微球，制备方法相同-用涡漩振荡器或者超声波悬浮微球，大约20S;-取50pL微球(美国Lurainex公司)于1.5ml的离心管中，8,000g以上速度离心2min;-去掉上清夜，将微球重悬于100pL的双蒸水中，用涡漩振荡器或者超声波悬浮微球约20s，8000g(或以上)速度离心2min;-吸弃上清，加入80nL的磷酸盐缓冲液(pH6.2)，涡漩振荡约20s，超声波悬浮微球约20s;-加入10pL50tng/mLSulfo-NHS，用涡漩振荡器轻轻地混匀；-力口入10pL50mg/mLEDC，用涡漩振荡器轻轻地混匀；-室温避光静置20min，每10min用涡漩振荡器轻轻地混匀；-活化后的微球，28000g，离心2min;-吸弃上清，将微球重悬于250^L50mM的MES(pH5.0)的溶液中，涡漩振荡约20s，超声约20s;微球28000g，离心l-2min;重复该步骤一次；-吸弃上清，将微球重悬于lOOpL50mM的MES(pH5.0)的溶液中，涡漩振荡约20s，超声约20s;-往悬浮的微球中加入lpg抗体，用50mM的MES(pH5.0)溶液将总体积补至50(^L;-用涡漩振荡器混匀，室温避光振荡2hr;-偶联抗体后的微球以28000g的速度，离心l-2min;-吸弃上清，将微球重悬于50(HiLPBS-TBN溶液中，涡漩振荡约20s，超声约20s;-室温避光振荡30min;-微球28000g，离心l-2min;-吸弃上清，将微球重悬于lmLPBS-TBN溶液中，涡漩振荡约20s，超声约20s;微球^8000g，离心l-2min;重复该步骤一次；-吸弃上清，将微球重悬于60(^LPBS-TBN溶液中；-包被好的微球通过luminex仪器计数；-包被好的微球置于2-8'C避光保存，每种抗体偶联的微球单独保存，使用时，依据检测项目选择混合。(2)按上述试剂盒的组成，每种检测抗体的生物素标记-依据蛋白浓度计算反应体系，填写表格；-依据蛋白浓度计算抗体溶液稀释至lmg/ml的体积，视为目标体积(V):-配置NHS-Biotin反应液；-按摩尔比l:100于反应管中分别加入检测抗体与NHS-Biotin(10mg/ml)反应液；-加入1/10目标体积的NaHC03(pH8.9)溶液；-加入PBS(pH7.4)补至目标体积；-包上铝箔，将反应管置于振荡器上，于25i:恒温箱中避光孵育4h，转速为900rpm;-将反应液转至透析盒内，于PBS缓冲液中透析过夜，以去除未反应的NHS-Biotin;-测定蛋白浓度。3.用于检测，包括如下歩骤1)使用前先取出所有试剂，放置平衡至室温。2)标准品的稀释分别根据五种血清标志物的血清学浓度的范围，配制5种乳腺癌中的血清标志物的标准品，每个标准品设6个稀释度，然后等比例混合，使各自得终浓度为所需的浓度。各管稀释方法及理论浓度如下表所示:<table>tableseeoriginaldocumentpage15</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage16</column></row><table>注意每个浓度标准品稀释完后均必须用涡旋混合仪彻底混匀后才可用于下一浓度的稀释。混匀过程避免产生泡沫。3)待测样品处理所有样品须用分析缓冲液作1:5稀释后才可用于测定。4)设置96孔板布局，确定96孔板上标准品、质控品、待测样品及空白孔的位置。考虑到仪器读数的顺序是按照从第1列到第12列、从第A行到第H行的顺序纵向读数，在设置96孔板布局时应遵循从第1列到第12列、从第A行到第H行的顺序排列。5)按照设置好的96孔板布局，每孔加25^1分析缓冲液，再分别加入25ul标准品、质控品、待测样品到各自孔中，空白孔加25ul分析缓冲液。6)分别取出上述制备的针对乳腺癌的五种血清标志物的捕获抗体偶联微球，用涡旋混合仪混匀30钞，超声处理30秒，按等比例混合，使混合液中每种捕获抗体偶联的微球浓度均为40个/yl。往每孔中加入五种微球混合的悬液25nl。包被微球应在临用前混匀，且混匀后应立即使用，否则放置过久微球会再沉淀。7)用封口膜封住所有加样孔口，并用锡箔纸包住96孔板以避光，25'C放置在微孔板振荡器上以600转速度震荡，孵育60分钟。8)孵育完成后每孔加入25ul上述制备的生物素标记的检测抗体的混合液(其中所述五种生物素标记的检测抗体事先按等比例混合，摇匀)，用封口膜封住所有加样孔口，并用锡箔纸包住96孔板以避光，25'C放置在微孔板振荡器上以600转速度震荡，再孵育60分钟。9)孵育完成后每孔加入25ul链亲和素藻红蛋白，用封口膜封住所有加样孔口，并用锡箔纸包住96孔板以避光，25t:放置在微孔板振荡器上以600转速度震荡，再孵育30分钟。10)于Luminex系列液相芯片分析仪上读取结果。仪器可自动绘制标准曲线，并计算出待测样品的测值。实验结果如下(请参见图1至图5):<table>tableseeoriginaldocumentpage17</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage18</column></row><table>从附图和上述表中可以看出，IL-6,IL-8，TNF-a，T-PSA，VEGF各指标标准曲线的线性在检测的浓度范围内R2》0.99，用试剂盒测定外来质控品，相对误差《±5%，五个指标联检可使乳腺癌的早期诊断准确率高达96%,反应假阳性率《2%。检测所需的血清量极少(25微升)，并且可在两个小时的时间内完成检测。权利要求1.一种用于乳腺癌早期诊断的液相芯片试剂盒，其特征是，主要包括有(1)5-plex包被微球含有分别包被了IL-6捕获抗体的51#微球、包被了IL-8捕获抗体的38#微球、包被了TNF-α捕获抗体的34#微球、包被了T-PSA捕获抗体的20#微球、和包被了VEGF捕获抗体的32#微球；(2)5-plex生物素标记检测抗体分别用生物素标记的IL-6、IL-8、TNF-α、T-PSA、和VEGF的检测抗体；(3)链亲和素藻红蛋白。2.根据权利要求1所述的用于乳腺癌早期诊断的液相芯片试剂盒，其特征是，所述捕获抗体分别是IL-6捕获抗体为IL-6的单克隆抗体，克隆号为6708;IL-8捕获抗体为IL-8的单克隆抗体，克隆号为6217.111;VEGF捕获抗体为VEGF的单克隆抗体，克隆号为26503.111;T-PSA捕获抗体为T-PSA的单克隆抗体，克隆号为BM215;TNF-a捕获抗体为TW-a的单克隆抗体，克隆号为28401.111。3.根据权利要求1所述的用于乳腺癌早期诊断的液相芯片试剂盒，其特征是，所述检测抗体分别是IL-6检测抗体为IL-6的多克隆抗体，克隆号为SV126053;IL-8检测抗体为IL-8的多克隆抗体，克隆号为OM096021;VEGF检测抗休为VEGF的多克隆抗体，克隆号为XQ096031;T-PSA检测抗体为T-PSA的单克隆抗体，克隆号为M701042;TNF-a检测抗体为TNP-a的单克隆抗体，克隆号为D2。4.-种制备如权利要求1所述的用于乳腺癌早期诊断的液相芯片试剂盒的方法，主要包括以下步骤(1)相应的捕获抗体包被相应的微球-将50nL微球活化后，S8000g，离心；-吸弃上清，将微球重悬于pH5.0的230-280pL50mM的MES的溶液中，涡漩振荡约20s，超声约20s,后将微球于^:8000g，离心l-2min:重复该步骤-吸弃上清，将微球重悬于IO(VL50mMpH5.0的MES的溶液中，涡漩振荡约20s，超声约20s;-往悬浮的微球中加入相应的0.8-1.2叱抗体，用50mM的pH5.0的MES溶液将总体积补至450-550(iL;-用涡漩振荡器混匀，室温避光振荡1.5-2.5hn-偶联了抗体后的微球以3000g的速度，离心l-2min:-吸弃上清，将微球重悬于500pLPBS-TBN溶液中，涡漩振荡约20s，超声振荡约20s;-室温避光振荡30min;再于28000g，离心l-2min;-吸弃上清，将微球重悬于lmLPBS-TBN溶液中，涡漩振荡约20s，超声约20s:微球上8000g，离心l-2min;重复该步骤一次；-吸弃上清，将微球重悬于250-1000nLPBS-TBN溶液中；-每种包被好的微球通过luminex仪器计数后置于2-8'C避光单独保存，使用时，依据检测需要等比例混合；(2)每种检测抗体的生物素标记；-依据检测抗体浓度计算出检测抗体溶液稀释至lmg/ml的体积，视为目标体积；-配置10mg/ml的NHS-Biotin反应液；-按摩尔比1:100于反应管中分别加入检测抗体与NHS-Biotin反应液；-加入体积为目标体积的pH8.9的1/10的NaHC03溶液；-加入pH7.4的PBS补至目标体积；-包上铝箔，将反应管置于振荡器上，于25'C恒温箱中避光孵育3-5小时，转速为細rpm-濯0rpm;-将反应液转至透析盒内，于PBS缓冲液中透析过夜，以去除未反应的NHS-Bbtin;-使用时根据需要将标记好的每种检测抗体等比例混合。5.根据权利要求4所述的乳腺癌早期诊断液相芯片试剂盒的制备方法，其特征是，所述捕获抗体分别是IL-6捕获抗体为IL-6的单克隆抗体，克隆号为6708;IL-8捕获抗体为IL-8的单克隆抗体，克隆号为6217.111;VEGF捕获抗体为VEGF的单克隆抗体，克隆号为26503.111;T-PSA捕获抗体为T-PSA的单克隆抗体，克隆号为BM215;TNF-a捕获抗体为TNF-a的单克隆抗体，克隆号为28401.111。6.根据权利要求4所述的用于乳腺癌早期诊断的液相芯片试剂盒的制备方法，其特征是，所述检测抗体分别是IL-6检测抗体为IL-6的多克隆抗体，克隆号为SV126053;IL-8检测抗体为IL-8的多克隆抗体，克隆号为OM096021;VEGF检测抗体为VEGF的多克隆抗体，克隆号为XQ096031:T-PSA检测抗体为T-PSA的单克隆抗体，克隆号为M701042;TNF-a检测抗体为TNF-a的单克隆抗体，克隆号为D2。7.根据权利要求4所述的用于乳腺癌早期诊断的液相芯片制备方法，其特征是所述活化微球的步骤如下-用涡漩振荡器或者超声波悬浮微球；-取50tiL微球离心l-2min;-去掉上清夜，将微球重悬于10(VL的双蒸水中，用涡漩振荡器或者超声波悬浮微球约20s，，OOg离心1—2min;-吸弃上清，加入pH6.2的80pL的磷酸盐缓冲液，涡漩振荡约20s，超声波悬浮微球约20s;-加入10pL50mg/mLSulfo-NHS，用涡漩振荡器轻轻地混匀；-力口入10pL50mg/mLEDC，用涡漩振荡器轻轻地混匀；-室温避光静置20min，每10min用涡漩振荡器轻轻地混匀。全文摘要本发明公开了一种用于乳腺癌早期诊断的液相芯片试剂盒，主要包括有(1)5-plex包被微球含有分别包被了IL-6捕获抗体的51#微球、包被了IL-8捕获抗体的38#微球、包被了TNF-α捕获抗体的34#微球、包被了T-PSA捕获抗体的20#微球、包被了VEGF捕获抗体的32#微球；(2)分别用生物素标记的IL-6、IL-8、TNF-α、T-PSA、VEGF的检测抗体的混合液；(3)链亲和素藻红蛋白。本发明还公开了该液相芯片试剂盒的制备方法。本发明所述的用于乳腺癌早期诊断液相芯片试剂盒具有无副作用，高通量，多指标并行检测；敏感度高，重复性好，检测快速，准确，费用低等优点。文档编号G01N33/574GK101201357SQ200710031250公开日2008年6月18日申请日期2007年11月5日优先权日2007年11月5日发明者彭臻菲,林一群,许嘉寿申请人:广州益善生物技术有限公司