专利名称：诊断和监测恶性乳腺癌的方法
背景技术：
本发明总的来说涉及唾液生物标记在诊断乳腺癌方面的用途，更具体地是涉及唾液生物标记在诊断性区分患乳腺癌妇女、患良性肿瘤妇女和健康妇女方面的用途。
乳腺癌是导致美国妇女死亡的第二大病因。大约每10名妇女中有一个在她的生命中会发生乳腺癌。最近的统计估计有44,000名妇女将死于乳腺癌，而在未来的一年中又会有150,000名妇女被诊断为乳腺癌。
已证实乳腺癌的普查能减少乳腺癌的死亡率。研究证明，在50岁及以上的妇女中，采用乳腺造影术和临床乳腺检查鉴定，妇女的乳腺癌死亡率可降低20％-40％。然而，在40-49岁的妇女中，死亡率只降低了13％-23％。这些结果表明更好的鉴定方法将有可能有助于降低更年轻一些的妇女中的死亡率。
尽管体检和乳腺造影术是乳腺癌早期检测有用的鉴定方法，但是这些方法可能产生相当多的假阳性和假阴性结果，尤其对于乳腺实质组织紧密的妇女更是如此。例如，在40-49岁的妇女中，乳腺造影术检查假阴性的概率是20-25％，在50-69岁妇女中是10％。因此，这样的鉴定将导致在大量阴性活组织检查结果中产生高比例的假阳性。同时也证明，在检测较年轻妇女的癌症方面，这些方法缺乏灵敏性，从而导致高比例的假阴性。
很明显，对于日益增加的死亡率，需要有助于诊断较年轻妇女中癌症的鉴定方法。在乳腺造影术领域，日益提高的技术已使较小的乳腺病的检测更为可靠；然而，乳腺癌领域的研究人员在继续寻找其它补充诊断方法以进一步加强癌症鉴定，并由此降低死亡率。
在过去的三十年中，癌症研究人员已广泛使用检测特异生物标记表达的免疫组织化学方法，这些生物标记可在某些肿瘤的诊断中用作补充诊断方法。(Grizzle WE.Biomarkers-The NeW Frontier in thePathology of Invasive and Preinvasive Neoplasias. Biotechnic andHistochemistry，72(2)59-61，1997；Grixxle WE，Myers RB，Manne U.TheUse of Biomarker Expression to Characterize Neoplastic Processes.Biotechnic and Histochemistry72(2)96-104，1997.)一些肿瘤标记如c-erbB-2(erb)和组织蛋白酶-D(CD)已在组织中检测到并表明与扩散性病变有关。已进行的大部分研究已使用组织和血清中的这些标记。
至于唾液中的特异癌抗原，Chien发现，唾液中含有CA125，一种卵巢上皮肿瘤被公认或接受的肿瘤标记。(Chien DX，SchWartz PE，CA125Assays for Detecting Malignant Ovarian Tumors. Obstetrics andGynecology，75(4)701-704，1990).在比较健康对照、患良性病症妇女和患卵巢癌妇女中的唾液CA125浓度时，Chien发现，与非恶性对照相比，卵巢癌组中的CA125浓度明显更高。Boyle使用放射性标记的寡核苷酸在患头颈鳞状细胞癌的个体的手术前唾液样品中检测并鉴定了肿瘤特异性突变，这些发现在所研究的71％的病人中得到证明。(Boyle JO，Mao L，Brennan JA，Koch WM，Eisele DW， Saunders JR，Sidransky D.GeneMutations in Saliva as Molecular Markers for Head and Neck SquamousCell Carcinomas.Am J Surgery.168(5)429-32，1994.)发明概述然而，这样的抗原不能用于诊断乳腺癌，并且没有测试前述生物标记(例如CA125，erb和CD)在唾液中的存在。尽管现有技术的诊断方法已得到广泛改进，但是这些改进没有扩展到所有诊断领域。因此，需要一种方法以更充分地利用最新技术进步并将这些技术用于乳腺癌的检测和治疗。
因此，本发明的一个目的是使用唾液作为诊断介质并且/或者作为非创伤性方法的一部分来检测和差别诊断乳腺癌，由此克服了包括上述那些方法的现有技术的各种不足和缺陷。
本发明的另一目的是鉴定一种或更多种唾液中存在的生物标记，这些生物标记具有诊断价值并且/或者可用于治疗后的监测或治疗。同时，另一目的是提供一种或更多种生物标记作为最初检测的诊断系列的一部分，继续鉴定以检测妇女在接受疾病化疗和/或外科手术治疗之后乳腺癌的复发。
本发明的另一目的是确定用于最初检测的生物标记的一个或更多个适当的浓度区分值(cut-off values)，继续鉴定以检测妇女在接受疾病化疗和/或外科手术治疗之后乳腺癌的复发。
本发明的另一目的是提供一种使用诊断性生物标记的血清和唾液区分浓度以比较检测率和/或灵敏度的方法。同时，本发明的另一目的是提供一种采用受者操作曲线(receiver operator curves)及相关分析以测定对检测和/或治疗乳腺癌有诊断价值的一系列唾液生物标记的区分浓度的方法。
本发明的另一目的是使用唾液作为介质测定已诊断患乳腺癌的病人的结节状态(nodal status)。同时，本发明更进一步的目的是在测定结节状态时鉴定唾液中存在的一种或更多种生物标记。
本发明的另一目的是使用唾液测定其中存在的生物标记的受体状态以作为差别诊断乳腺癌的一部分。同时，本发明也可包括一种使用唾液中存在的生物标记的受体状态作为肿瘤扩散性的指示标记的方法。
本领域熟练技术人员应该理解本发明的一个或更多方面将达到某些目的，而一个或更多其它方面能达到某些其它目的。每一目的不会在所有情况下均匀地适用于本发明的每一方面。因此，考虑到与乳腺癌诊断有关的现有技术，这些目的可看作与本发明任一方面有关的替代方案。
本发明的其它目的、特征、益处和优点在此概述以及下面本发明的实施例中是显而易见，并且对于具有癌生物标记的性质和检测及其在诊断相关疾病中的用途的知识的本领域技术人员来说，也将是非常显而易见的。这些目的、特征、益处和优点在上述内容中并结合相关实施例、表格、数据和所有由此得出的合理推论而显而易见。
部分地看，本发明是一种使用唾液生物标记以差别诊断和/或检测乳腺癌复发的方法。方法包括(1)使用人唾液样品以提供该个体的可诊断乳腺癌的唾液生物标记，(2)将该个体的生物标记与生物标记参照对比，并且(3)通过生物标记对比差别鉴定所显示的个体诊断。生物标记参照可由一组成分组成并且可以用恶性肿瘤，良性肿瘤和对照组人群制备。每一参照成分可结合与相应的个体生物标记相当的一系列数值使用。
在优选的实施方案中，个体生物标记是生物标记组的一个成分，并且参照组包含经鉴定具有诊断价值的一个或更多个生物标记。这样的生物标记可以包含癌抗原15-3、肿瘤抑制剂癌基因蛋白53和癌基因c-erbB-2。在本发明方法高度优选的实施方案中，癌基因c-erbB-2的存在和/或蛋白表达的增加可鉴定一个个体患有恶性肿瘤。
每一个个体生物标记成分可与浓度值相结合以与相应参照成分相比较。在本发明的一个实施方案中，患恶性乳腺肿瘤个体的癌抗原15-3的浓度比患良性肿瘤个体的相应浓度高至少100％。同时，在优选的方法中，患恶性乳腺肿瘤个体的癌基因53的浓度比患良性肿瘤个体低至少约25％。这样的差别鉴定可以单独使用或与一种或更多种测试和检测乳腺癌的诊断方法结合使用。
部分地看，本发明是一种手术后监测肿瘤生长的方法。方法包括提供摘除恶性肿瘤手术后的个体，使用来自该个体的唾液样品制备手术后生物标记组；将该个体的手术后生物标记组与手术前生物标记参照组对比，并且通过监测相关生物标记组中的至少一种成分来鉴定恶性肿瘤的存在。
通常，在此方法优选的实施方案中，对个体进行手术后化疗。化疗可以包括但不限于环磷酰胺、氨甲蝶呤和氟尿嘧啶治疗方法。在优选的实施方案中，两个生物标记组都包含c-erbB-2成分，手术后这一成分的测定表明肿瘤的复发。选择性地，两个生物标记组都可以包含肿瘤抑制剂癌基因蛋白53成分。手术后这一成分的缺少表明肿瘤抑制作用。
部分地看，本发明是一种利用内源编码蛋白浓度以诊断乳腺癌的方法。方法包括使用来自一个个体的唾液样品以提供可诊断乳腺癌的蛋白生物标记，将该个体蛋白生物标记与参照蛋白对比，并且通过测定该个体蛋白生物标记的浓度高于参照蛋白来诊断该个体。在优选的实施方案中，生物标记蛋白组是生物标记组的一个成分。同样，参照蛋白可以是参照组的一个成分。不管怎样，可以使用恶性肿瘤、良性肿瘤和对照组人群制备任何这样的蛋白作为参照。在高度优选的实施方案中，单个蛋白生物标记是癌抗原15-3或选择性地，癌基因c-erbB-2的表达产物。
本发明的生物标记可以包含已经或可以得到生物化学、生理学或结构鉴定的由任何癌基因物质编码的蛋白表达产物、其片断或生物衍生物、或其配体或抗体。
例如，CA15-3已鉴定为粘质糖蛋白并证明为诊断指示剂。更具体性地，CA15-3是由命名为Mab D11-5和Mab DF3的两个单克隆抗体识别的癌相关抗原。Mab D11-5是针对人乳汁脂肪珠膜的抗原制备的，而MabDF3是针对来自人乳腺癌的膜碎片制备的。
已观察到，在一些肿瘤中高水平存在能将细胞转化成恶性的c-erbB-2癌基因(也称为HER-2/neu)。[Zhou et al.，Cancer Research，476123(1987)；Berger et al.，Cancer Research，481238(1988)；Kraus etal.，The EMBO Journal，6(3)605(1987)；and Slamon et al.，Science，235177(1987)]。c-erbB-2癌基因的表达及其在细胞内膜中的定位看来与癌症紧密相关[Kraus et al.，id；Slamon et al.，id；Drebin et al.，Cell，41695(1985)；and Di Fiore et al.，Science，237178(1987)]；实际上，至少在某些病例中，它可能是癌发展过程中的最初事件[Muller et al，Cell，54105(1988)]。c-erbB-2蛋白在正常细胞上的过量表达看来导致这些细胞转化为或成为肿瘤细胞。
当然，可以在紧邻病症的地方找到这样的转化的证据。然而诊断应用的许多方面的基础是一个发现，即过量表达c-erbB-2的细胞将c-erbB-2外结构域插入邻近组织。c-erbB-2的衍生物也在稳定转化的表达细胞的血清中发现。
已鉴定一种分子量为约75千道尔顿(kd)的糖蛋白构成了约185kd糖蛋白(gp185)即c-erbB-2的外结构域。术语“gp75”已由其核苷酸和氨基酸序列精确定义；gp75外结构域包括从大约氨基酸数22(丝氨酸；ser-22)到大约氨基酸数653(丝氨酸；ser-653)的区域及其相应的核苷酸序列。氨基酸序列代表gb75的非糖基化形式，此形式预计具有与其相对应的分子量。
gp75蛋白和多肽由gp75外结构域DNA序列(编码从约ser-22到约ser-653的核苷酸)编码或由该gp75 DNA序列的片段编码。因此短语“gp75蛋白和多肽”定义为包括具有与gp75蛋白和多肽基本上相同的氨基酸序列或其部分和/或基本上相同的生物功能的蛋白和/或多肽。
本发明表明，这样的蛋白物质，一旦在其它地方发现，也可以在唾液中得到鉴定并进一定得到分析。例如在本文中其它地方所讨论的，已经在六个健康、年龄相当的妇女中测定了癌基因HER-2/neu是否存在于刺激整体(Stimulated Whole，SWS)，腮腺(P2)，下颌下/舌下(S2)和/或小腺体(Minor，M2)的唾液分泌中。齿龈缝液体(GCF)也因其与唾液的关系得到测试。HER-2/neu分析通过ELISA进行。分析HER-2/neu在血清中的浓度并与其在唾液中的浓度对比。分析表明，HER-2/neu存在于SWS(40.71单位/ml)，P2(15.71单/ml)和S2(14.08单位/ml)中，而在M2和GCF中仅以痕量存在。与腺分泌物相比，SWS产生最高水平的HER-2/neu。总的来看，正如所预计的，HER-2/neu的最高浓度出现在血清中。然而，当用总蛋白对HER-2/neu的浓度进行校正时，通过比较，更高浓度存在于P2分泌物中(72.78单位/ml)，并且SWS(34.01单位/ml)和S2(34.95单位/ml)中分泌的数量更少。
这样的结果表明，蛋白HER-2/neu存在于唾液中并主要由腮腺转运。结果也表明，HER-2/neu可以从血清被动扩散到间质组织，然后通过唾液分泌到口腔中。有关唾液成分和唾液分泌机理正在不断增加的研究(见唾液分泌的腺体机理，Garrett等(1998)编辑(1999)及其中所引用的参考文献)正在证明本领域与血清和唾液蛋白有关的技术。
根据本发明，除了本文描述的c-erbB-2蛋白，一些与乳腺癌或其它致癌疾病明显相关的蛋白也已经或可能以与上述c-erbB-2癌基因相似的方式得到分析或鉴定。正如本领域熟练技术人员以及随后了解本发明的人员所公知的，这些其它的明显与疾病相关的蛋白表达，不论是否在在紧邻病症的地方得到鉴定或持续被发现，都可以在唾液中得到测定并且如本文所述的可以经鉴定用作诊断相关疾病的唾液生物标记。
生物标记及其相关的本发明的方法可以用于检测乳腺癌并提供一种经济有效的对乳腺造影术的补充诊断测试。而且，这些唾液生物标记也可与内科医生和自我乳腺检查相结合，有助于减少乳腺癌的发病率和死亡率，从而降低国家的健康医疗费用。
附图简述
图1是健康对照、患良性病症个体和患原位肿瘤个体的平均值的对比，比较了唾液和血清介质＝erb对照(唾液)＜erb癌组(唾液)单向样品测试方法t测试(平均值比恒量)t-值＝14.31，p-0.0001；＝erb对照(血清)＜erb癌组(血清)单向样品t-测试(平均值比恒量)t-值＝10.33，p＜0.0001；#＝CA 15-3对照&良性(唾液)＜CA15-3癌组(唾液)Anova p＜0.05；##＝CA15-3对照&良性(血清)＜CA15-3癌组(血清)Anova p＜0.01。
图2是各诊断情况下唾液和血清CA 15-3浓度(单位/mg蛋白)的表格对比。
图3是各诊断情况下唾液和血清erb浓度(单位/mg蛋白)的表格对比。
图4是各诊断情况下唾液和血清EGFR浓度(fmol/mg蛋白)的表格对比。
图5是各诊断情况下唾液和血清总蛋白浓度(mg/ml)的表格对比。
图6是各诊断情况下唾液和血清p53浓度(pmol/mg蛋白)的表格对比。
图7是各诊断情况下唾液和血清CD浓度(pmol/mg蛋白)的表格对比。
图8表示对各种血清和唾液erb特征分析的平均和标准误差值。
图9表示从所示研究组得到的调查数据，证明本发明的效用。
图10表示恶性肿瘤阶段测定的erb值。
图11表示与本发明各种诊断方法相对应的一系列erb和CA15-3浓度的区分值。
图12a表示对照组、诊断患有良性病症的实验组以及诊断患乳腺癌的实验组的唾液c-erbB-2(单位/ml)的图示平均值，95％置信区间以及区分值(110单位/ml)。
图12b表示对照组、诊断患有良性病症的实验组以及诊断患有乳腺癌的实验组的唾液c-erbB-2(单位/mg蛋白)的图示平均值，95％置信区间以及区分值(110单位/ml)。
图13a表示对照组、诊断患有良性病症的实验组以及诊断患乳腺癌的实验组的血清c-erbB-2(单位/ml)的图示平均值，95％置信区间以及区分值(2000单位/ml)。
图13b表示对照组、诊断患有良性病症的实验组以及诊断患乳腺癌的实验组的血清c-erbB-2(单位/mg蛋白)的图示平均值，95％置信区间以及区分值(50单位/ml)。
图14a表示对照组、诊断患有良性病症的实验组以及诊断患乳腺癌的实验组的唾液CA15-3(单位/ml)的图示平均值，95％置信区间以及区分值(4.0单位/ml)。
图14b表示对照组、诊断患有良性病症的实验组以及诊断患乳腺癌的实验组的血清CA15-3(单位/ml)的图示平均值，95％置信区间以及区分值(20单位/ml)。
图15表示唾液c-erbB-2单位/ml(--)、唾液c-erbB-2单位/mg蛋白(...)和唾液CA15-3单位/ml(_.._)的受者操作特征(receiveroperating characteristic，ROC)曲线(灵敏度1-灵敏度)的图示；每条曲线下的面积百分比如下c-erbB-2～76％，约110单位/ml的区分值；c-erbB-2/tp～77％，约100单位/mg蛋白的区分值；CA15-3～71％，约4单位/ml的区分值。
图16图示血清c-erbB-2单位/ml(--)、血清c-erbB-2单位/mg蛋白(...)和血清CA15-3单位/ml(_.._)的受者操作特征(ROC)曲线(灵敏度1-灵敏度)的图示；每条曲线下的面积百分比如下c-erbB-2～77％，约2000单位/ml的区分值；c-erbB-2/tp～76％，约50单位/mg蛋白的区分值；CA15-3～71％，约20单位/ml的区分值。
本发明的实施例以下非限制性实施例和数据举例说明了与本发明方相关的各个方面和特征，包括由此得到的令人惊奇和出乎意料的结果。
对于下面的实施例和数据，研究对象群体由来自普通人群(对照)以及密西西比(Mississippi)大学医疗中心(UMMC)肿瘤学系和外科诊所的21名妇女组成。将来自周围社区的有乳腺肿块的妇女送到UMMC检查。对每个病人进行彻底的体检和乳腺癌鉴定。在临床初诊和接受任何治疗之前从每位妇女身上收集唾液和血清样品，之后的最终病理学诊断评估表明个体或者患有良性肿瘤，或者患有乳腺癌(原位)。调查者最初不了解这些研究对象的诊断结果，直至病理学家给出最后诊断结果并且病人接受进一步治疗。这些研究对象由各种族混合组成，年龄在30-80岁之间。
排除假阳性结果。最初预计现在的方法会分别由于外在的身体和环境因素如雌激素水平和吸烟产生假阳性。然而，已排除这样的因素是导致假阳性结果的因素。也排除了种族、年龄、月经情况、用药情况和健康状况是产生假阳性结果的因素。
如下所示，使用所提及的商用试剂盒及相关试剂、方法和/或技术进行分析。来自Triton Diagnostics的试剂在市场上不再有售。来自CIS BioInternational的试剂盒特别有用并提供增强的灵敏性，对于erb标记尤其如此。实施例1统计分析统计分析使用SPSSTM统计软件包进行。比较对照、良性肿瘤和乳腺癌的平均标记值进行以描述性分析。
不平衡数据差异的单向分析、一般线性模型方法用于比较患乳腺癌人群与非癌人群的平均值。使用一般线性模型拟出的多项式很容易解释说明并适用于所有的样品规模，包括那些太小的样品，以维持适当的多元分析。图基因果分析(Tukey post-hoc analysis)用于重要的线性模型。
考虑到对照和良性病症中未能测到唾液和血清中的erb，进行了单向样品t-测试。由于样品规模小，关于标记组特异性和灵敏度的问题没有涉及，但将会在以后的研究中探讨。实施例2样品收集刺激整体的唾液样品使用一小块石蜡作为刺激剂收集5分钟时间(Navasesh，1982)17。唾液流速由重量分析测定。所有样品都在早晨收集，因此控制了任何生理节奏可能对标记浓度产生的影响。将样品冷冻用于进一步分析。在收集唾液的同时由抽血者抽取血液。在收集样品时没有参加者显出口腔中有癌症或癌症前期病症。
将冷冻的唾液样品化冻并于500-1500G离心20分钟以沉淀细胞和粘液素以便提取生物标记蛋白。对澄清的唾液抽提液和来自血液样品的血清进行总蛋白和生物标记组分析。实施例3总蛋白使用比色分析法测定总蛋白浓度，此方法基于拷马斯亮蓝G-250染料随不同蛋白浓度发生的颜色变化(Bio-Rod试剂盒)。在分光光度计上于595nm测量吸光率。从用牛γ-球蛋白标准绘制的标准曲线上确定样品的总蛋白浓度。实施例4CA15-3CA15-3分析使用EIA试剂盒(CIS Bio International)测定。CA15-3分析是双位点固相酶免疫分析。将CA15-3分子连接在两个单克隆抗体之间，第一个单克隆抗体与ELISA固相结合，第二个抗体与辣根过氧化酶连接(酶共轭物)。洗涤后，酶反应产生与分析中存在的CA 15-3量成正比的颜色。使用分光光度计于490nm读取吸光率并从用已知浓度配体绘制的标准曲线计算浓度。将CA15-3分析用于分析血清样品。以唾液上清替代血清进行唾液CA15-3测定。用于测试的抗体不与其它已知肿瘤标记(CEA，CA19-9CA125)发生交叉反应，并且唾液浓度大大高于分析所需的检测较低限度。CA15-3浓度以单位/mg蛋白表示。实施例5erb和泛嗜p53erb和泛嗜p53分析使用ELISA试剂盒测定(OncogeneResearch，Co.)。在此研究中，以血清和唾液上清代替组织抽提液作为分析样品。对结合水平进行比色测定，并且由酶反应形成的颜色强度与存在的靶蛋白成正比。在微量滴定板分光光度计中于490nm读取吸光率并从标准曲线计算配体浓度。erb和泛嗜p53的数据分别表示为单位/mg蛋白和pmol/mg蛋白。用于测试的抗体不与其它已知肿瘤标记发生交叉反应并且唾液浓度大大高于分析所需的检测较低浓度。实施例6组织蛋白酶-D分析使用酶免疫分析(EIA)试剂盒(Triton Diagnostics，Inc.)。将对CD特异的一种单克隆抗体和一种多克隆抗体与唾液和血清样品同时温育。温育过程中，存在于唾液和血清样品中的CD与两种抗CD抗体结合。单克隆抗体与生物素结合，引起形成的抗原-抗体复合物结合到抗生物素蛋白链霉素覆盖的试管上。洗涤试管以去除未结合的物质。在第二次温育中，将与辣根过氧化酶共轭结合的抗-兔抗体加入试管。然后共轭物结合到复合物上。通过第二次洗涤去除未结合的复合物。然后将试管与TMB底物溶液一起温育以显色。然后加入磷酸终止酶反应。使用分光光度计于450nm测定显出的颜色强度。样品值从曲线确定(pmol/mg蛋白)，曲线通过对针对已知浓度的对照的吸光率值绘图得到。实施例7表皮生长因子受体(EGFR)EGFR分析使用EIA试剂盒(Triton Diagnostics，Inc.)测定。将抗-EGFR共轭物与唾液和血清样品一起温育。温育过程中，EGFR蛋白与抗-EGFR共轭物结合。单克隆抗体之一与辣根过氧化酶结合。在第二次温育过程中，所得免疫复合物通过“连接溶液”结合到涂覆的聚苯乙烯试管上。轻倒去除未结合物质。然后将试管与TMB底物溶液一起温育以显色。然后加入磷酸终止酶反应。使用分光光度计于450nm测定显出的颜色强度。样品值从曲线确定(fmol/mg蛋白)，曲线通过对针对已知浓度的对照的吸光率值绘图得到。
对于所有免疫分析的功能，它们都易受到各种干扰。研究者进行了几个实验室测试以控制这些问题。对于配体回收，研究者能够确定从唾液和血清样品中回收的标记(配体)的量。五个已知标记含量的唾液和血清样品被连续稀释。所有稀释液中的三种标记。针对预期值对数据绘图以测定稀释液的线性度。剂量反应曲线和标准曲线的斜率之间没有显著差异，并且截距与零点之间也没有显著差异。在样品分析过程中，研究者对所有标记的分析使用了适当的阳性和阴性对照。进行分析时，一些测试样品含有与过量配体预保温的初级抗体以控制假阴性。另外，将测试样品与过量的自由初级抗体一起预保温以确定是否信号已被去除。这些额外测试在样品分析过程中提供了额外的质量保证。分析时，所有样品一式三份重复进行。
对照组由15名妇女组成(年龄42.4岁)，良性肿瘤组由8名妇女组成(年龄45.3岁)，而乳腺癌组由12名妇女组成(年龄49岁)。诊断患有良性病症的研究对象由患纤维腺瘤(n＝4)、脂肪瘤(n＝1)和纤维瘤(n＝3)的妇女组成。患乳腺癌的妇女诊断患有小叶癌(n＝1)、渗透性导管癌(n＝9)和原位导管癌(n＝2)。所有患乳腺癌的研究对象为结节(node)阴性并且没有转移的迹象。在癌症组中的五位癌症研究对象是缺齿的，而非癌组中只有2人是缺齿的。其它所有研究对象都是有齿的。三组的平均值在图1中表示，并且在图2-7中图示说明。
如图1和2中所示，对照和良性病症组之中CA15-3的平均值比癌症组的平均值低约45-50％。统计显著度对于唾液在p＜0.05水平，对于血清在p＜0.01水平。
参照图1和3，没有在对照或良性病症组的唾液或血清中检测到erb。相反，癌症组表现出erb的存在，并且t-测试表明显著更高的浓度(p＜0.001)。
另外，与癌症组相比，对照和良性病症组中p53的水平约高25％。(图1和6)。由于p53突变反映癌基因的失效，引起肿瘤抑制，研究者预计，与患乳腺癌的那些妇女相比，对照中的p53值会更高。如随后附图中所示，当交叉比较三组妇女时，CD和EGFR的唾液和血清水平没有表现出象CA 15-3、erb和p53一样的肿瘤特异性。实施例8a对于唾液中标记组的存在，也着手解决了几个技术问题。其中一个问题是确定来自口腔上皮的细胞是否可能与唾液中发现的标记水平有关。为解决这个问题，将唾液样品离心并将上清与沉淀分离。将取自上清的样品置于玻片上，染色并显微检验细胞的存在。检验表明，上清中没有细胞。接着，将沉淀悬浮于磷酸缓冲盐水中。分析上清和悬浮的沉淀中是否存在生物标记。结果表明了上清中生物标记的水平，但悬浮的沉淀中没有生物标记，说明生物标记来源于唾液而不是来自细胞。实施例8b使用分泌性IgA(slgA)作为对照蛋白进行第二项实验以比较患和不患乳腺癌的个体。slgA是唾液中主要的免疫球蛋白，它来自唾液腺，其中腮腺是主要的合成腺。此抗体由存在于大小唾液腺中的免疫细胞合成，为IgA二聚体。因为其减缓病原袭击的作用，slgA被认为是口腔的第一道防线。此唾液蛋白与乳腺癌无关并被选作为对照蛋白。使用ELISA方法，检测来自癌和非癌组的唾液中的SlgA。此检测的结果表明，患癌(χ11.7ng/ml)与不患癌(χ14.3ng/ml)的个体之间没有显著差异，说明只有表现增加的那些蛋白才是与乳腺癌相关的那些标记。实施例8c进行第三项实验以确定口腔健康对标记水平的影响。将患牙周病的少量个体与健康对照和几名缺齿的研究对象对比。结果表明，患牙周病的个体、口腔健康的个体与缺齿的个体之间没有显著差异。实施例8d进行第四项实验以确定月经周期对唾液标记水平的影响。收集两名月经正常的健康妇女的唾液样品，从她们月经周期开始到结束止每天收集。结果表明在月经周期期间，唾液标记的浓度没有明显波动。标记浓度在30天期间保持相对稳定，证明了最小程度的个体差异(数据未显示)。实施例8e进行另一实验以确定唾液腺成分的来源。收集腮腺、下颌下腺、舌下腺及其它小腺体的分泌物。实验结果表明这些标记主要由腮腺分泌。发现腮腺分泌物的浓度比下颌下腺和舌下腺的浓度许多倍。其它小腺的影响几乎不能测定。另外，标记浓度看来与流速无关。
如上所述，可测水平的乳腺癌标记CA15-3、erb、EGFR、CD和p53存在于患恶性乳腺病的妇女的唾液和血清中。这些标记也可在患良性乳腺病的妇女和完全健康的个体的唾液和血清中测到。这些结果表明，与患乳腺癌的个体相比，非癌个体中的CA15-3和erb水平更低(图1)。而p53则相反。
也考虑到并解决了几个可能的混淆因素。因此，可以确定1)来自口腔上皮的细胞与标记无关，2)使用slgA作为对照蛋白，只有增加的那些蛋白才是与乳腺癌相关的那些标记，3)牙周病的存在与标记的水平无关，4)月经周期对唾液标记的水平没有影响，5)标记主要从腮腺分泌出来，以及6)标记与流速无关。
相似的研究包括三组妇女I组是对照组。这一组由来自密西西比大学医学中心(VMMC)的无症状个体组成，对照组的健康状况通过调查确定。
II组(良性肿瘤组)和III组(恶性肿瘤组)由来自周围社区并送由UMMC肿瘤学系内科医生鉴定的有乳腺肿块的连续个体组成。每名病人都接受了彻底的体检和乳腺癌鉴定。在最初临床约见和接受任何治疗之前从每位妇女身上收集唾液和血清样品。得自病理学报告的最终诊断评估确定该个体是应该分到II组(良性肿瘤组)还是分到III组(诊断患有乳腺癌的组)。根据由美国联合癌症委员会制定的标准评定病期和结节状态。
在签署IRB许可的同意书时，对所有参加者进行简要调查。这些数据由面试者收集并包括涉及年龄、种族、吸烟状况、用药史和病史以及月经状况的信息。
与上述方法和/或实施例相似，刺激整体唾液样品使用一小块树脂作为刺激剂、按照标准化收集方法收集5分钟时间。收集后，分装并冷冻样以用于分析。唾液流速由重量分析测定。所有样品都在早晨收集，由此控制任何生理节奏可能对标记浓度产生的影响。在收集唾液的同时，由抽血者抽取血液。
将冷冻的样品化冻，并分析唾液和来自血液样品的血清中的总蛋白和c-erbB-2的浓度。
同时分析样品中的CA15-3。CA15-3作为诊断标记的作用在文献中已有记载并用作参照标记或“诊断金标准”，通过这个标准比较c-erbB-2标记的效力。
使用二辛可宁酸方法(Pierce Chemical，Co.)对唾液样品进行蛋白分析，二辛可宁酸是对亚铜离子高度敏感和高选择性的检测试剂。此方法测定0.5-20mg/ml的蛋白浓度。在此分析中，二辛可宁酸作为Cu+1的螯合剂，在蛋白存在的情况下形成有色螯合物。将小份唾液(100μl)滴于微量滴定板中并向加样孔加入pierce BCS蛋白分析试剂。样品于37℃保温30分钟并在微量滴定板分光光度计中于562nm读取光密度，从标准曲线推算出每一物质的最终浓度，并且数据以mg/ml表示。
使用来自Oncogene Research Products的ELISA试剂盒分析血清和唾液胞外结构域c-erbB-2抗原的水平。以全唾液代替血清作为分析样品。基本分析包括所进行的结合水平的比色分析，并且酶反应形成的颜色强度与存在的靶蛋白成正比。在微量滴定板分光光度计中于490nm读取吸光率并且从标准曲线计算配体浓度。c-erbB-2数据以单位/ml和单位/mg蛋白表示并报道以使这些发现可与先前文献中的结果相比较。
使用来自CIS Bio International的EIA试剂盒测定CA15-3实验。CA15-3分析是双位点固相酶免疫分析。将CA15-3分子连接在两个单克隆抗体之间，第一个单克隆抗体与ELISA固相结合，第二个抗体与辣根过氧化酶连接(酶共轭物)。洗涤后，酶反应产生与分析中存在的CA15-3量成正比的颜色。使用分光光度计于490nm(辣根过氧化酶)读取吸光率并从用已知浓度配体绘制的标准曲线计算浓度。将CA15-3分析用于分析血清样品。以全唾液替代血清进行唾液CA15-3测定。CA15-3浓度以单位/ml表示。
统计分析同样使用SPSSTM统计软件包进行。从四个不同的方面分析这些数据。开始，针对每一组总结唾液和血清标记浓度，并且对来自调查的人口和补充数据进行描述性分析。重点是种族、病史、吸烟状况、用药情况和月经状况与c-erbB-2浓度之间的关系。按肿瘤类型、病期和结节状态总结数据。由于癌症组妇女较少，原发性肿瘤(T)和结节状态(N)亚类的数目有所重叠。将原发性肿瘤类二分为T1和大于T1类，而结节状态分别简化为结节阴性和结节阳性。
差异的单向分析(ANOVA)用于比较三组的乎均标记值，重点是乳腺癌与非癌组的之间的比较。Dunnett’s测试用于校正多项比较。
唾液和血清c-erbB-2水平之间以及唾液和血清中c-erbB-2和CA15-3浓度之间的可能相关性通过Pearson’s相关系数研究。因为这些浓度的一部分的分布是不对称的，所以使用每个数值的平方根转化数据。实施例9进行受者操作特性(ROC)分析以研究每一生物标记的适当区分值。使用对照和癌症组的平均值作为起始区分值，分别将每一标记的浓度记录为二分变量。对于每一标记，评估区分值在平均值的正向(＞χ)和反向(＜χ)方向的增加范围。将乳腺癌二分为阳性和阴性。对于每一区分值，使用Two-by-two表计算每一生物标记检测疾病的灵敏度和特异性值。对唾液和血清中的c-erbB-2和CA15-3浓度绘制ROC曲线(灵敏度1-特异性)。使用形成ROC曲线下最大面积百分比的区分值来确定每一标记的最佳区分值。见Wilcosky TC.，第三章，选择和评估标记的标准。于Hulka BS，Wilcosky TC，GriffithJD，eds流行病学中的生物标记，NewYork，Oxford Universisity Press，1990，pp.36-42；以及SPSS for Windows，release 9.0.chicago；SPSS，1999。实施例10对三组妇女进行调查得来的人口统计和补充数据总结于图8和9。进行种族、吸烟状况、用药情况和月经状况频度比较。三组之间的种族、吸烟状况和月经状况有明显不同。与高加索人相比，更多的非裔美国人患乳腺癌和良性肿瘤病症。同样，与非吸烟者相比，明显更多的吸烟者患乳腺癌和良性肿瘤病症。至于月经状况，与来月经前和绝经后妇女相比，更多的月经期妇女患乳腺癌和良性肿瘤病症。对于每一组，根据健康状况(如对照、良性、癌症)比较平均c-erbB-2值。没有显著的可报道的归因于每组妇女内这些差异(健康状况)的对c-erbB-2浓度的影响。年龄比较没有得出c-erbB-2值的组间显著差异，并且采用回归模型时不与c-erbB-2值线性相关。
进一步分析表明，患乳腺癌妇女产生比良性肿瘤和对照组妇女明显高得多的可检测的c-erbB-2唾液水平。三组唾液标记浓度的平均值、平均值的标准误差以及95％置统区间示于图8，12-14。如图8中所示，对照和良性肿瘤组的c-erbB-2平均值比癌症组的平均值低50％-57％。在这些妇女中存在相关血清c-erbB-2水平的强平行响应，相关范围为55％-64％。尽管在相对于总蛋白校正之前，血清中浓度大约比唾液中浓度高15倍。
良性肿瘤的大部分是纤维腺瘤或纤维囊性肿瘤。患这些良性肿瘤的妇女中，纤维腺瘤和纤维囊性肿瘤中存在的唾液c-erbB-2浓度之间差异极小。两名妇女呈现有充满液体的囊肿，两名妇女有良性钙化。对于充满液体的囊肿，血清和唾液的c-erbB-2值比纤维腺瘤和纤维囊性肿瘤组统计上更低。同样，对于这两组良性肿瘤，血清中的反应与唾液中的反应相似，尽管观察到的平均浓度的排列顺序在纤维腺瘤和纤维囊性组之间相反。
在癌症组中肿瘤的绝大部分是渗透性导管癌(n＝19)。一名妇女患渗透性小叶癌，三名患导管癌，而七名患混合型恶性乳腺癌。这些组的平均唾液和血清c-erbB-2浓度大大高于对良性肿瘤观察到的数值。
至于癌肿瘤的病期，有一名0期(T0N0M0)病人，六名I期(T1N0M0)，八名IIA期(T2N0M0)，三名IIB期。IIB组由一名T2N1M0和二名T3N0M0组成。有二名IIIA期，由一名T3N0M0和一名T3N2M0组成；三名IIIB期，由一名T3N3M0和二名T4N1M0组成；7名病人在得到此实施例数值时尚未分期。
有7名患乳腺癌的研究对象是结节阳性的，16名是结节阴性。所有诊断为癌症的个体都没有远距离转移的迹象。原发性肿瘤的亚类与T1和大于T1以及结节阳性和结节阴性组重叠(图10)。这些分析表明，c-erbB-2唾液和血清浓度没有与肿瘤大小有关的差异，但是无论对于何种诊断介质，结节阳性和结节阴性之间都有更大的c-erbB-2浓度差异(图10)。实施例11第二水平的分析比较了患乳腺癌妇女、患良性病症妇女和健康对照妇女的组平均值。进行了三组之间唾液c-erbB-2不平衡数据的单向ANOVA，并发现在F＝13.83显著；P＜0.0001水平。Dunnett’s C因果分析表明，在癌症组和肿瘤及对照组之间显示有P＜0.001水平的显著差异。
对于三组妇女之间的血清c-erbB-2，也证实了相似的结果。总ANOVA于F＝19.95显著；P＜0.0001水平而因果分析于P＜0.001水平显著(癌症＞两个非癌症组)。
对于CA15-3，总ANOVA于F＝5.94显著；P＜0.04水平而因果分析于P＜0.05水平显著(癌症＞非健康对照组)。相似地，三组妇女之间血清c-erbB-2的结果于F＝20.96显著；P＜0.0001水平而因果分析于P＜0.001水平显著(癌症＞健康对照组)。
相对于总蛋白浓度校正的唾液和血清c-erbB-2水平数据表现与未校正数据相同的结果。唾液c-erbB-2的总ANOVA于F＝13.80显著；P＜0.0001水平而因果分析于P＜0.001水平显著(癌症＞两个非癌症组)。三组妇女之间的血清c-erbB-2结果于F＝14.45显著；P＜0.0001水平而因果分析于P＜0.001水平显著(癌症＞两个非癌症组)。实施例12第三水平的分析(相关系数)揭示了血清和唾液c-erbB-2之间于r＝0.51的显著中度相关性；P＜0.0001水平。在血清c-erbB-2与血清CA15-3浓度之间于r＝0.40有显著的中度相关性；P＜0.001水平。至于用总蛋白校正的血清c-erbB-2浓度及其与CA 15-3的相关性，结果显示出显著的中度相关性r＝0.36；P＜0.001水平。用总蛋白校正的唾液c-erbB-2浓度与用总蛋白校正的血清c-erbB-2浓度之间发现于r＝0.39的轻微关系；P＜0.001水平。实施例13受者操作曲线的比较(第四水平分析)表明，唾液c-erbB-2浓度的区分值是110单位/ml，血清c-erbB-2浓度的区分值是2000单位/ml(图11、12a和13a)。也对用总蛋白校正的唾液和血清c-erbB-2浓度进行了受者操作特性曲线的比较。这些数值对于唾液和血清c-erbB-2浓度是100单位/ml和50单位/ml(图11和12b以及13b)。唾液CA15-3测定得出4.0单位/ml区分值(图11和14a)。与15-40单位/ml的文献值相比，血清CA 15-3的区分值是20单位/ml(图11和14b)。
使用前述区分值，唾液和血清c-erbB-2分别能检测到患癌症研究对象的87％和94％(图11)。用总蛋白校正的唾液和血清c-erbB-2浓度检测到研究对象的77％和84％。这与唾液和血清CA15-3标记的62％和75％相当。CA15-3水平能检测到65％的恶性病症(图11、15和16)。实施例14前面涉及c-erbB-2癌蛋白的研究，在关于病期、肿瘤类型，结节包含和转移存在的研究的各种类型人群中各有不同。另外，各种分析技术已被用于研究组织和血清中的c-erbB-2蛋白。对于血清，大多数研究已使用酶基免疫分析。这些技术在分析灵敏性方面有所不同，并且使用单克隆抗体或多克隆抗体。在文献中使用过的一些试剂盒已经缺货并且不再对研究人员供应。本文的这些发现与使用相似样品大小、病期和分析技术的研究一致。
前面实施例的结果表明，患乳腺癌妇女中的唾液c-erbB-2和血清c-erbB-2水平增高(图8和12-14)。对于乳腺癌病人中增高的血清c-erbB-2水平，本研究的发现与文献中存在的其它发现，特别是那些鉴定非转移癌症的发现一致。文献中只有一次报道涉及患乳腺癌妇女中增高的唾液c-erbB-2浓度，且是本研究作者进行的初步研究，这一早期研究使用ELA(Triton，Co.)分析来测定唾液和血清c-erbB-2浓度。那一研究的结果也揭示了患乳腺癌妇女中显著更高的唾液c-erbB-2浓度。与使用相同样品的第一次研究的分析法相比，本研究中采用的分析法比最初的分析法灵敏五倍。实施例15良性和恶性肿瘤的对比得出了可能有用的信息。患纤维腺瘤和纤维囊性病症的研究对象产生相似的唾液和血清c-erbB-2浓度(图9)。对于血清，这一发现与Breuer(1998)得到的结果一致。在此研究中，诊断患渗透性导管癌的研究对象占癌症人群的大部分。因此，没有进行各种恶性乳腺病症之间的对比。实施例16原发性肿瘤数据的进一步分析揭示，对于T1组和大于T1组，没有实质的唾液或血清c-erbB-2浓度的差异(图10)、这一观察结果确与Watanabe(1994)和Kynast(1993)的发现一致。这一发现也表明，c-erbB-2受体状态可能对肿瘤扩散性有比对肿瘤体积更好的指示性。实施例17对于结节状态，发现结节阳性病人的c-erbB-2水平与结节阴性病人相比有所提高(图9)。实施例18数据表明，可溶性唾液c-erbB-2浓度和血清c-erbB-2水平之间的相关性(r＝0.51；P＞0.0001)。不清楚的可变性可能是因为三组妇女间各类个体的合并以及研究者没有洞悉c-erbB-2蛋白从肿瘤位点移动并进入口腔(扩散、渗漏、主动运输)的真正机制。c-erbB-2蛋白变得可溶的过程也未得到充分了解，可能是一部分不清楚的可变性的解释。目前正在进行的进一步研究就是探究这些疑问。用总蛋白校正的唾液和血清c-erbB-2浓度之间的相关性是r＝0.39；p＜0.001。实施例19发现了血清c-erbB-2浓度和血清CA15-3水平之间的关系(r＝0.40，P＞0.001)。这一相关性与Krainer所报道的结果(r＝0.396；P＞0.002)一致。当用总蛋白浓度校正血清c-erbB-2浓度时，血清c-erbB-2浓度和血清CA15-3水平之间的相关性是r＝0.36，P＜0.001。
另外，前面的实施例数据也表明，作为诊断标记，唾液c-erbB-2和血清c-erbB-2的水平可能与唾液CA15-3和血清CA15-3的水平相当(图11、15和16)。唾液和血清c-erbB-2的浓度可以分别检测到患癌症研究对象的87％和94％。用总蛋白校正的唾液和血清c-erbB-2浓度分别检测到研究对象的77％和84％。这与唾液和血清CA15-3标记的62％和75％相当。CA15-3水平于20单位/ml区分值可检测到75％的恶性病症。制造商建议15单位/ml区分值，并且的确使灵敏度增加到97％；然而，当进行这一调整时，导致如Stenman(1991)所预计的特异性急剧下降(35％)。相反，当区分值升至40单位/ml时，分析法检测癌症的能力降至小于30％。这与Safi(1991)和Stenman(1991)的发现一致。血清c-erbB-2水平，无论是否已相对于总蛋白校正，都保留60％水平的特异性幅度和高于90％的灵敏度。实施例20来自健康调查、涉及年龄、种族、吸烟状况、全身疾病情况、处方药的使用和月经状况的信息也得到分析。这些分析确认了来自以前研究者发表的报道的结果，即这些变化对唾液和血清c-erbB-2没有影响。因此，对年龄(Watanabe，1994)、吸烟状况(Breuer，1998)和月经状况(Breuer，1998)的发现得到其它研究的支持，然而，我们的研究与Breuer(1998)也有不一致的地方，Breuer(1998)观察到与年龄相关的对标记浓度的影响。Breuer(1998)报道了在绝经期妇女中，年龄与c-erbB-2水平显著相关。
作为诊断介质，唾液有几个生物化学优点。唾液是一种澄清、无色液体，而血清可能在患脂血症时变成乳状、在血细胞由于损伤溶血时变成红色以及在有肝病时变成黄疸。这些在正常血清及由于疾病而改变的血清中的颜色波动可能影响比色分析如ELISA，使之难以形成始终如一的空白，并且在与分析标准的稳定透明度相比时，干扰血清分析的真实数值。既然血清含有比唾液更多的蛋白，那么在分析其它痕量因子(即癌基因)时，可能导致更大的非特异性干扰的危险，以及因子和大量血清蛋白之间流体静力学(和其它)相互作用的更大可能性。
从供应角度来说，唾液的收集安全、无创伤(即无针刺)并且相对简单，而且可以重复收集又不会使病人感到不适。
由本发明带来的诊断益处包括妇女中乳腺癌的总体管理。乳腺癌在早期的诊断可以使妇女在选择各种治疗方案时有更多的选择机会。基于唾液的测试也可用于癌症病人的术后管理。肿瘤摘除之后，应伴随预期的标记浓度的下降并且逐渐稳定在正常水平，这预示着病人已经痊愈。相反，唾液标记持续地高水平可能是肿瘤复发或持续的征兆。唾液也是鉴测化疗效果的经济有效的方法。如果治疗方案有效，病人应该会有标记浓度的下降。
尽管本发明的原理已结合具体实施方案得到描述，但是应当清楚地理解，这些描述以及本文所选的表格和数据仅仅是为了举例并不是以任何方式限制本发明的范围。例如，在没有限制的情况下，本文描述的方法可扩展到胆囊、结肠、直肠、胰腺和口腔癌症的诊断和监测。本发明的其它优点和特征将从以下权利要求中变得显而易见，正如本领域熟练技术人员所理解的，其范围由合理的等效物确定。
权利要求
1.一种使用唾液生物标记在人体受检对象中差别诊断乳腺癌的方法，所述方法包括使用来自人体受检对象的唾液样品以提供可诊断乳腺癌的个体唾液生物标记；将上述个体生物标记与生物标记参照组对比，所述参照组包含生物标记成分；并且通过对比差别鉴定所显示的上述受检对象的诊断。
2.权利要求1的方法，其中所述的生物标记参照包括使用恶性肿瘤，良性肿瘤和对照组人群制备的成分组。
3.权利要求1的方法，其中所述的个体生物标记是生物标记组的一个成分，所述生物标记组包含癌抗原15-3，肿瘤抑制剂癌基因蛋白53和癌基因c-erbB-2中的至少一个。
4.权利要求1的方法，其中所述的参照生物标记成分组包括每一所述成分的数值范围。
5.权利要求3的方法，其中癌基因c-erbB-2和所述癌基因c-erbB-2的蛋白表达中至少一个的存在可鉴定所述受检对象患有恶性乳腺癌。
6.权利要求3的方法，其中每一种所述成分与一浓度值相结合。
7.权利要求6的方法，其中所述患恶性乳腺肿瘤的受检对象的癌抗原15-3的浓度比所述患良性肿瘤的受检对象高至少100％。
8.权利要求6的方法，其中所述患恶性乳腺肿瘤的受检对象的癌蛋白53的浓度比所述患良性肿瘤的受检对象低至少25％。
9.权利要求1的方法，其中所述的差别鉴定是对所述受检对象进行乳腺癌检测的初步诊断方法的补充。
10.一种手术后监测肿瘤生长抑制作用的方法，所述方法包括提供人体受检对象，所述对象处于恶性肿瘤摘除手术之后；使用来自所述受检对象的唾液样品制备手术后生物标记组；将所述受检对象的所述手术后生物标记组与之手术前生物标记参照组对比；并且通过监测所述生物标记组中的至少一种成分来测定恶性肿瘤的存在。
11.权利要求10的方法，进一步包括对所述受检对象进行手术后化疗。
12.权利要求11的方法，其中一个所述化疗包括环磷酰胺、氨甲蝶呤和氟尿嘧啶的治疗性剂量。
13.权利要求10的方法，其中所述的手术前和所述的手术后生物标记组包含c-erbB-2生物标记成分。
14.权利要求10的方法，其中所述的手术前和所述的手术后生物标记组包含肿瘤抑制剂癌基因蛋白53生物标记成分。
15.一种采用内源编码蛋白的浓度以诊断乳腺癌的方法，所述方法包括使用来自人体对象的唾液样品以提供可诊断乳腺癌的个体蛋白生物标记；将所述个体蛋白生物标记与参照蛋白浓度对比；并且通过测定所述个体蛋白生物标记的浓度高于所述参照蛋白来诊断所述受检对象。
16.权利要求15的方法，其中所述生物标记蛋白是个体生物标记组的一个成分。
17.权利要求15的方法，其中所述生物标记蛋白是癌抗原15-3。
18.权利要求15的方法，其中所述生物标记蛋白是癌基因c-erbB-2的表达产物。
19.权利要求15的方法，其中所述参照蛋白是分别针对恶性肿瘤、良性肿瘤和对照组人群制备的。
20.权利要求15的方法，其中所述参照蛋白是生物标记组的一个成分。
全文摘要
在1)健康妇女、2)患良性乳腺病的妇女、以及3)已诊断患有乳腺癌的妇女群体的唾液中检测了一组用于诊断和治疗乳腺癌的生物标记。在所有三组妇女的唾液中发现了公认的肿瘤标记c－erbB－2(erb)、癌抗原15－3(CA15－3)以及肿瘤抑制剂癌基因蛋白53(p53),然而经测定,癌症病人中erb和CA15－3的水平远远高于健康对照和良性肿瘤病人的唾液水平。相反,与患乳腺癌和良性肿瘤的那些妇女相比,对照中的泛嗜p53水平更高。
文档编号G01N33/574GK1349611SQ00806967
公开日2002年5月15日 申请日期2000年3月1日 优先权日1999年3月1日
发明者查尔斯·F·斯特雷克福斯, 勒诺·G·比格勒, 詹姆斯·T·西格彭 申请人:密西西比大学医疗中心