专利名称：新蛋白质及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及新的分泌蛋白质等。
背景技术：
迄今为止，发现与癌相关的基因有细胞增殖因子，与受体相关的基因有脑肿瘤的PDGF(RossR.，Nature 1993，362801)、乳腺癌的erb-B、erb-B2(Cell1983；35，718，Burden S，Neuron 1997；18，847)等，除此之外，还大量发现与促进信号传导的大肠癌相关的Ki-ras；白血病相关的N-ras；由转录因子激活细胞增殖促进基因而导致的白血病、乳腺癌、胃癌等相关的c-myc(Maheswaran，Mol Cell Biol，1994；14(2)1147)；成神经细胞瘤相关的N-myc(Schwab，Nature 1983；305.245)；肺癌相关的L-myc(Nau，Nature 1985；318，69)；甚至还有与Bcl-2、Bcl-1、MDM2等滤泡B细胞淋巴瘤、乳腺癌、头颈部癌、p53癌抑制蛋白相拮抗的蛋白质等蛋白类基因(Reed，Nature1997；387，773，Donehower，Nature 1992，356，215)等。此外，又发现与所述这类基因不同，它们当中很多都具有抑制癌细胞扩增作用的基因即APC、DPC4、NF-1、NF-2、MTS1、RB、P53、WT1等(Weinberg，ScientificAmerican，1996，September，32)。当发现以上这些基因导致细胞、组织癌症化时分析其表达的特异蛋白质，并根据其氨基酸序列信息进行鉴定，其基因表达的过程是多种多样的。仅仅就现在已经被表达的这些基因来说，仍然不能解释癌的发病机理以及癌症治愈的机制。
最近很多研究还是从人的基因开始分析研究并报道了机能不详的EST碱基序列。
因此，通过机能不详的EST来探索与癌有特异关系的蛋白质基因，丞待开发新的癌症治疗药物或预防药物。
发明公开本发明人为了解决上述课题，经过反复研究，终于以EST碱基序列为基础探索出具有新的碱基序列的分泌型蛋白质基因，并研究出由此编码的分泌型蛋白质在癌细胞中如何进行特异性表达等。
本发明人基于这些研究，经反复探索终于完成了此发明。
即，本发明提供(1)蛋白质或其盐，其特征在于，它含有与SEQ ID NO1所示氨基酸序列相同或基本相同的氨基酸序列；(2)(1)中所述蛋白质或其盐，其中与SEQ ID NO1所示氨基酸序列基本相同的氨基酸序列为SEQ ID NO5所示序列；(3)(1)中所述蛋白质或其盐，其合成于癌细胞；(4)(1)中所述蛋白质的部分肽或其盐；(5)(4)中所述部分肽或其盐，其具有SEQ ID NO1所示氨基酸序列的第26位至第34位的氨基酸序列；(6)(4)中所述部分肽或其盐，其具有SEQ ID NO5所示氨基酸序列的第166位至第190位的氨基酸序列；(7)(1)中所述蛋白质或(4)中所述部分肽或其盐的制造方法，其特征在于，培养经含有编码(1)中所述蛋白质或(4)中所述部分肽的DNA重组载体转化形成的转化体，使之产生该蛋白质或该部分肽；(8)(1)中所述蛋白质或(4)中所述部分肽或其盐的抗体；(9)(8)中所述抗体为单克隆抗体；(10)(8)中所述抗体为(4)中所述部分肽或其盐的抗体，其中部分肽或其盐具有SEQ ID NO1所示氨基酸序列的第26位至第34位氨基酸序列；(11)(8)中所述抗体为(4)中所述部分肽或其盐的抗体，其中部分肽或其盐具有SEQ ID NO5所示氨基酸序列的第166位至第190位氨基酸序列；(12)一种诊断药物，该药物包含(8)中所述抗体；(13)一种药物，该药物包含(1)中所述蛋白质或(4)中所述部分肽或其盐或(8)中所述抗体；(14)筛选能够促进或抑制(1)中所述蛋白质或(4)中所述部分肽或其盐活性的化合物或其盐的方法，其特征在于，应用(1)中所述蛋白质或(4)中所述部分肽或其盐；(15)(14)中所述筛选法，其中所述活性为细胞增殖活性；(16)筛选能够促进或抑制(1)中所述蛋白质或(4)中所述部分肽或其盐活性的化合物或其盐的试剂盒，该试剂盒包含(1)中所述蛋白质或(4)中所述部分肽或其盐；(17)能够促进或抑制(1)中所述蛋白质或(4)中所述部分肽或其盐活性的化合物或其盐，该化合物或其盐通过使用(14)中所述筛选法或(16)中所述筛选试剂盒获得；(18)一种药物包含能够促进或抑制(1)中所述蛋白质或(4)中所述部分肽或其盐活性的化合物或其盐，该化合物或其盐通过使用(14)中所述筛选法或(16)中所述筛选试剂盒获得；(19)(18)中所述药物为治疗或预防癌症之药物。
本发明进一步提供(20)(1)中所述蛋白质或其盐，其中与SEQ ID NO1所示氨基酸序列基本相同的序列其同源性约不低于70％，优选约不低于80％，更优选约不低于90％，最优选约不低于95％的氨基酸序列；(21)(1)中所述蛋白质或其盐，其中与SEQ ID NO1所示氨基酸序列基本相同的氨基酸序列为，①SEQ ID NO1所示氨基酸序列中缺失1-5个氨基酸(优选其中缺失1-3个)、②SEQ ID NO1所示氨基酸序列中附加1-10个氨基酸(优选其中附加1-5个、更优选其中1-3个)、③SEQ ID NO1所示氨基酸序列中被其它氨基酸置换1-5个(优选其中置换1-3个)、或者④由以上所述序列组合形成的氨基酸序列；(22)(14)中所述筛选法，其特征在于，(i)当基质与(1)中所述蛋白质或(4)中所述部分肽或其盐接触时，和(ii)当基质和待测化合物与(1)中所述蛋白质或(4)中所述部分肽或其盐接触时，测定并比较(1)中所述蛋白质或(4)中所述部分肽或其盐的活性；(23)一种药物，它包含能够促进(1)中所述蛋白质或(4)中所述部分肽或它们之盐活性的化合物或其盐，该化合物或其盐通过使用(14)中所述筛选法或(16)中所述筛选试剂盒获得；(24)(23)中所述药物为病变组织摘除后的再生药物；(25)一种药物，它包含能够抑制(1)中所述蛋白质或(4)中所述部分肽或它们盐直活性的化合物或其盐，该化合物或其盐通过使用(14)中所述筛选法或(16)中所述筛选试剂盒获得；(26)(25)中所述药物为治疗或预防癌症之药物；
(27)一种待测溶液中的(1)中所述蛋白质或(4)中所述部分肽或其盐之定量法，其特征在于，使(8)中所述抗体与待测液及标记的(1)中所述蛋白质或(4)中所述部分肽或它们盐之间发生竞争反应，进而测定结合到该抗体上的标记的(1)中所述蛋白质或(4)中所述部分肽或其盐的比例；以及，(28)一种待测溶液中的(1)中所述蛋白质或(4)中所述部分肽或其盐之定量法，其特征在于，使待测液与固相载体的(8)中所述抗体及标记的(8)中所述抗体之间进行同时反应或连续反应，反应后，测定固相载体上的标记试剂之活性。
本发明，又提供(29)一种杂合体，其具有产生(9)中所述单克隆抗体的能力；(30)(8)中所述抗体为中和抗体；(31)(8)中所述抗体为人型抗体；(32)一种药物，包含(31)所述抗体；(33)(32)中所述药物为治疗或预防癌症之药物；(34)一种药物，它所包含的化合物或其盐具有抑制自然杀伤细胞的细胞增殖抑制活性，其中细胞增殖抑制由(1)中所述蛋白质或其盐或(4)中所述部分肽或其盐所致；(35)(34)中所述药物为治疗或预防癌症之药物。
图1表示在实施例1中得到的编码本发明蛋白质的DNA碱基序列以及由该碱基序列推导的氨基酸序列。
图2表示在实施例2实施的Northern印迹电泳图象。在A图(正常组织)中，1为脑、2为心脏、3为骨骼肌、4为大肠、5为胸腺、6为脾脏、7为肾脏、8为肝脏、9为小肠、10为胎盘、11为肺、12为外周血，在B图(癌细胞)中，1为早幼粒细胞性白血病细胞HL-60、2为子宫颈癌Hela细胞、3为慢性骨髓性白血病细胞K-562、4为淋巴肉瘤性白血病细胞MOLT4、5为人体Burkitt淋巴瘤B细胞Raji、6为人体结肠癌细胞SW480、7为人体肺癌细胞A549以及9为黑色素瘤细胞G361。
图3表示在实施例2实施的Northern印迹电泳图象。在C-1图中，1为人肺癌细胞RERF-LC-A1、2为人肺癌细胞NCI-H345、3为人肺癌细胞NCI-H460、4为人肺癌细胞NCI-H1299、5为人胎儿正常成纤维细胞MRC-5、6为人胎儿正常成纤维细胞WI-38、7为大肠癌细胞HT-29、8为大肠癌细胞WiDr、9为乳腺癌细胞MCF-7。
在C-2图中，1为成神经细胞瘤细胞GOTO-P3、2为成神经细胞瘤细胞IMR-32、3为神经胶质瘤细胞U-251、4为神经胶质瘤细胞KNS42、5为神经胶质瘤细胞KNS81。
在C-3图中，1为肺癌细胞NCI-H345、2为成神经细胞瘤细胞IMR-32、3为前列腺癌细胞LNCap、4为前列腺癌细胞PC-3、5为成神经细胞瘤细胞GOTO-P3、6为早幼粒细胞性白血病细胞HL-60、7为黑色素瘤细胞Bowes、8为乳腺癌细胞MCF-7。
图4表示在实施例4中实施的Western印迹电泳图象。图中，1、2为溶胞产物(Cell lysate)、3、4为培养上清液(Culture supernatant)、5为Mock(只含有COS-7细胞的培养上清液)。
图5表示在实施例5中得到的编码本发明蛋白质的DNA碱基序列以及由该碱基序列推导的氨基酸序列。
图6表示在实施例6中实施的Northern印迹电泳图象。图中，9为人胃癌细胞AGS、10为人体胰腺癌细胞PANC-1、11为人体子宫内膜瘤细胞AN3CA、12为人体子宫内膜瘤细胞KLE、13及14为人软骨瘤细胞SW1353、15为人体子宫内膜瘤细胞SKN、16为肾腺癌细胞ACHN。
图7表示在实施例14中测定的小鼠抗血清中抗体效价的结果。
图中分别表示，各孔中加有下列抗血清的吸光度，如■小鼠1抗血清、□小鼠2抗血清、▲小鼠3抗血清、△小鼠4抗血清、●小鼠5抗血清、○小鼠6抗血清、|小鼠7抗血清、◇小鼠8抗血清。
图8表示在实施例17中实施的竞争法-EIA的结果。
图中分别表示由■杂合体No.39-35、□杂合体No.53-16、▲杂合体No.61-2、△杂合体No.76-12、●杂合体No.85-16、○杂合体No.112-3、◆杂合体No.128-18、◇杂合体No.139-26、×杂合体No.151-2产生的单克隆抗体之B/B0值。
又，每个培养上清液的稀释倍率如下No.39-3550倍No.53-1650倍
No.61-2120倍No.76-1260倍No.85-16120倍No.112-3450倍No.128-18450倍No.139-26120倍No.151-260倍图9表示在实施例24中分析的TGC838蛋白及TGC839蛋白的Western印迹结果。
图中1、3、5表示CHO-K1/TGC838N-4培养上清液的电泳带，2、4、6表示CHO-K1/618/839F6-3培养上清液的电泳带。另外，作为第一抗体，1、2使用了128-18抗体(实施例18)、3、4使用了112-3抗体(实施例18)、5、6使用了家兔抗血清(实施例19)。
图10表示在实施例24中分析的TGC838蛋白及TGC839蛋白的Western印迹结果。
图中分别表示，1、2为转染的pCAN618/H838 DNA，3、4为转染pCAN618/H838F DNA，5、6为转染的pCAN618/H839F DNA，7、8为转染的pCAN618DNA的COS7培养上清液电泳带。第一抗体使用了小鼠抗血清(实施例12)。
图11表示在实施例24中分析的TGC838蛋白及TGC839蛋白的Western印迹结果。
图中分别表示，3、4为转染的pCAN618/H838F DNA，5、6为转染的pCAN618/H839F DNA，7、8为转染的pCAN618DNA的COS7培养上清液电泳带。第一抗体使用了抗FLAG小鼠IgG。
图12表示在实施例25中分别使用TGC838蛋白及TGC839蛋白的抗体所进行的免疫沉淀分析。
图中，1、3、5表示转染pCAN618/H838F DNA的COS7细胞培养上清液，2、4、6表示转染pCAN618/H839F DNA的COS7细胞培养上清。1、2又表示使用128-18抗体(实施例18)所进行的免疫沉淀反应，3、4表示使用家兔抗血清(实施例19)所进行的免疫沉淀反应，，5、6表示对照组(未添加抗体)。
图13表示在实施例26中所进行的检验附加糖链的结果。
图中分别表示，1、2为转染的pCAN618/H838 DNA，3、4为转染的pCAN618/H838F DNA，5、6为转染的pCAN618/H839F DNA，7、8为转染pCAN618DNA的COS7培养上清液电泳带。1、3、5又表示经糖苷酶(N-Glycosidase)处理的电泳带。
图14表示在实施例28中所制作的标准曲线。对应于表1。
图15表示在实施例28中所进行的测定TGC838的量。
图中分别表示如下所述各培养上清液中的TGC838量，□为CHO-K1/TGC838N-4，◇为转染pCAN618/H838 DNA的COS7，○为SW1353-1，△为SW1353-2。
图16表示在实施例28中所进行的测定TGC838的量。
图中分别表示各血浆中的TGC838量，○为健康人，◇为肝癌患者，△为大肠癌患者。
图17表示在实施例29中所进行的FACS分析。
图中，实线表示添加有TGC839FLAG蛋白细胞群，虚线表示未添加TGC839FLAG蛋白细胞群。
图18表示在实施例29中所进行的FACS分析。
图中，+FITC-TGC839F表示添加有TGC839FLAG蛋白细胞群，-FITC-TGC839F表示未添加TGC839FLAG蛋白细胞群。
图19表示在实施例31中所进行的TGC839蛋白对NK细胞损伤的测定。
图中分别表示TGC839FLAG的浓度，○为0ng/ml、□为50ng/ml、△为150ng/ml、◇为500ng/ml。
图20表示在实施例31中所进行的TGC839蛋白对NK细胞增殖的测定。
图中，□和○分别表示来自不同个体的外周血。
图21表示在实施例31中所进行的TGC839蛋白对K562细胞增殖的测定。
图22表示在实施例31中所进行的测定培养上清液中的IFN-γ值。
实施发明的最佳方案具有与本发明SEQ ID NO1所示的氨基酸序列相同或基本相同的氨基酸序列之蛋白质(以下称本发明蛋白质)既可来自人或温血动物(例如，豚鼠、大鼠、小鼠、家鸡、兔子、猪、绵羊、牛、猴子等)的细胞[如肝细胞、脾细胞、神经细胞、神经胶质细胞、胰腺β细胞、骨髓细胞、肾小球膜细胞、朗格罕氏细胞、表皮细胞、上皮细胞、内皮细胞、成纤维细胞、纤维细胞、肌细胞、脂肪细胞、免疫细胞(例如，巨噬细胞、T细胞、B细胞、自然杀伤细胞、肥大细胞、嗜中性粒细胞、嗜碱性粒细胞、嗜酸性粒细胞、单核细胞)、巨核细胞、滑膜细胞、软骨细胞、骨细胞、成骨细胞、破骨细胞、乳腺细胞、肝细胞或间质细胞、或这些细胞的前体细胞、干细胞或癌细胞等]或这些细胞所存在的所有组织，例如脑、脑的各部分(例如，嗅球、屏状核、大脑基底神经节、海马、丘脑、丘脑下部、大脑皮质、延髓、小脑)、脊髓、脑垂体、胃、胰腺、肾、肝、生殖腺、甲状腺、胆囊、骨髓、肾上腺、皮肤、肌肉、肺、消化道(例如大肠、小肠)、血管、心脏、胸腺、脾、腭下腺、外周血、前列腺、睾丸、卵巢、胎盘、子宫、骨、关节、骨骼肌等，或者红细胞株的细胞或其培养细胞(例如MEL、M1、CTLL-2、HT-2、WEHI-3、HL-60、JOSK-1、K562、ML-1、MOLT-3、MOLT-4、MOLT-10、CCRF-CEM、TALL-1、Jurkat、CCRT-HSB-2、KE-37、SKW-3、HUT-78、HUT-102、H9、U937、THP-1、HEL、JK-1、CMK、KO-812、MEG-01等)的蛋白质，又可来自合成蛋白质。本发明的蛋白质优选来自人或温血动物(例如，豚鼠、大鼠、小鼠、家鸡、兔子、猪、绵羊、牛、猴子等)的胎儿细胞(特别是胎儿的脑细胞、肺细胞)或癌细胞。
作为一种与SEQ ID NO1所示氨基酸序列基本相同的序列应具有与SEQ ID NO1所示氨基酸序列的同源性约70％以上，优选约80％以上，更优选约90％以上，最优选约95％以上；优选一种与本发明SEQ ID NO1所示氨基酸序列基本相同的蛋白质，例如，其氨基酸序列应与前述的SEQ ID NO1所示氨基酸序列基本相同的氨基酸序列，并且其活性应与前述的SEQ ID NO1所示氨基酸序列的蛋白质活性基本相同。
具体地说，可以举出SEQ ID NO5所示氨基酸序列的蛋白质等。
其中基本相同的活性，例如有细胞增殖活性等。
所述基本相同是指，其活性在性质上(如，生理生化上、或药理学上)相同。因此细胞增殖等活性优选相同的(例如约0.1-100倍、优选约0.5-10倍、更优选约0.5-2倍)，但活性的大小、蛋白质分子量等量化因素可以彼此不同。
所述细胞增殖可以根据公知方法进行检测，例如，以下将要阐述的筛选方法。
本发明的蛋白质可以包括所谓的突变蛋白，可包含下述蛋白质例如①SEQ ID NO1所示氨基酸序列中缺失1-5个氨基酸(优选其中缺失1-3个)、②SEQ ID NO1所示氨基酸序列中附加1-10个氨基酸(优选其中附加1-5个、更优选其中1-3个)、③SEQ ID NO1所示氨基酸序列中插入1-5个氨基酸(优选其中插入1-3个)、④SEQ ID NO1所示氨基酸序列中被其它氨基酸置换1-5个(优选其中置换1-3个)、或⑤由所述序列组合形成的氨基酸序列。
如上所述，在氨基酸序列中被插入、缺失或置换时，其插入、缺失或置换的位置不作特殊限定。
本说明书中的蛋白质按照肽标记惯例，其左端为N末端(氨基端)，右端为C末端(羧基端)。本发明蛋白质主要为SEQ ID NO1所示氨基酸序列的蛋白质，其C末端通常为羧基(-COOH)或羧酸根(-COO-)，但是C末端也可为酰胺(-CONH2)或酯(-COOR)。
此时所示该酯的R有，例如，C1-6烷基包括甲基、乙基、正丙基、异丙基、或正丁基；C3-8环烷基包括环戊基和环己基等；C6-12芳基包括苯基和a-萘基等；C7-14芳烷基如苯基-C1-2烷基或a-萘基C1-2烷基，其中苯基-C1-2烷基又如苯甲基、苯乙基等；a-萘基C1-7烷基又如a-萘甲基等，此外还有广泛适用于口服给药的酯如三甲基乙酰氧甲基。
当本发明蛋白质在C-末端以外的位置上具有一个羧基(或羧酸酯)时，它可被酰胺化或酯化，这种酰胺或酯也可以包括在本发明所述蛋白质的范围之内。所述的酯可以与上述C-末端的酯相同。
本发明蛋白质可以进一步包括下述衍生物，其中N-末端氨基酸残基(如甲硫氨酸残基)的氨基用保护基(C1～6酰基，如甲酰基、乙酰基等C1～6烷酰基)保护；所述N末端在体内切割，形成的谷氨酰残基被焦谷氨酸化；所述蛋白分子中氨基酸侧链上的取代基(例如，-OH，-SH，氨基、咪唑基、吲哚基、胍基等)可被适当的基团(C1～6酰基，如甲酰基、乙酰基等C1～6烷酰基)保护，或结合蛋白质如通过糖链连接的糖蛋白等。
本发明蛋白质的具体实例包括具有SEQ ID NO1所示氨基酸序列的人源蛋白质(图1)，或具有SEQ ID NO5所示氨基酸序列的人源蛋白质(图5)。
本发明蛋白质的特征是，该蛋白质在癌细胞或胎儿的脑、肺等进行特异性表达，优选在癌细胞中的特异性表达。
作为本发明蛋白质的部分肽为前面所述的本发明蛋白质的部分肽，其中优选，只要与前述本发明蛋白质的部分肽具有相同活性(例如，细胞增殖活性等)的均可。例如通常使用具有下述情形的肽，在构成本发明蛋白质的氨基酸序列中至少具有氨基酸序列为20％以上，优选50％以上，尤其优选70％以上，更优选90％以上，最优选95％以上，并且应具有细胞增殖活性。
在所述这类肽中，通常其氨基酸序列包含以下情形的氨基酸序列，例如，SEQ ID NO1所示氨基酸序列的第22-252位、第26-252位或第26-34位(尤其优选第26-252位或26-34位，更优选第26-34位)，SEQ ID NO5所示氨基酸序列的第22-246位、第26-246位、第166-190位(尤其优选第26-246位、第166-190位，更优选166-190位)。
本发明的部分肽还可以在其氨基酸序列中缺失1-5个(优选缺失1-3个)氨基酸，或在其氨基酸序列中附加1-10个(优选附加1-5个，更优选1-3个)氨基酸、或插入1-5个(优选插入1-3个)氨基酸，或被其它氨基酸所置换1-5个(优选置换1-3个)氨基酸。
本发明的部分肽其C末端通常为羧基(-COOH)或羧酸根(-COO-)，正如前面所述的本发明蛋白质一样，其C末端也可为酰胺(-CONH2)或酯(-COOR)(其中R的意义同前)。
本发明的部分肽可以进一步同前面所述的本发明蛋白质一样，它包括下述衍生物，其中N-末端氨基酸残基(如甲硫氨酸残基)的氨基用保护基保护；所述N末端在体内切割，形成的谷氨酰残基被焦谷氨酸化；所述蛋白分子中氨基酸侧链上的取代基可被适当的基团保护，或结合蛋白质如通过糖链连接的糖蛋白等。
另外，本发明的部分肽还可用于形成抗体的抗原，因此该部分肽未必具有细胞增殖活性。
作为本发明的蛋白质或其部分肽之盐可以使用生理上可接受的酸(如无机酸或有机酸)或碱(如碱金属)形成盐，尤其优选生理上可接受的酸加成盐。这类的盐有，与无机酸(例如，盐酸、磷酸、氢溴酸、硫酸)形成的盐，或与有机酸(例如，乙酸、甲酸、丙酸、延胡索酸、马来酸、琥珀酸、酒石酸、柠檬酸、苹果酸、草酸、苯甲酸、甲磺酸、苯磺酸)形成的盐等。
本发明的蛋白质或其盐既可以用所述的人或其它温血动物细胞(尤其是癌细胞等)或组织(胎儿的脑及肺)纯化蛋白质的公知方法来制备，也可以通过培养含有随后所述蛋白质之编码DNA的转化体来制备，也可以用随后叙述的肽合成方法制备蛋白质。
当从人、哺乳动物组织或细胞(尤其是癌细胞、胎儿的脑及肺等)中制备蛋白质时，首先将人或哺乳动物组织或细胞匀浆，然后用酸等抽提，通过反相层析、离子交换层析等多种层析技术的联用来分离纯化该抽提物。
为了合成本发明蛋白质、部分肽或其盐或者它们的酰胺物，可以使用可用于酰胺合成的市售的树脂。这类树脂的实例包括氯甲基树脂、羟甲基树脂、二苯甲胺树脂、氨甲基树脂、4-苄氧基苯甲醇树脂，4-甲基二苯甲胺树脂，PAM树脂，4-羟甲基甲苯乙酰胺甲基树脂，聚丙烯酰胺树脂，4-(2′，4′-二甲氧基苯羟甲基)苯氧基树脂以及4-(2′，4′二甲氧苯基-Fmoc-氨乙基)苯氧基树脂。使用这些树脂时，将那些α-氨基及其侧链上功能基团受到相应保护的氨基酸，在树脂上按目标蛋白质的序列顺序，用本领域公知的各种缩合方法缩合。反应结束时，将蛋白质从树脂上切除下来，同时除去各种保护基团，必要时在高度稀释溶液中实施分子内二硫键形成反应，以获得目标蛋白质或它们的酰胺物。
进行上述受保护氨基酸的缩合反应时，可使用用于蛋白质合成的多种活化试剂，但优选使用碳二亚胺。其碳二亚胺有DCC、N，N′-二异丙基碳二亚胺以及N-乙基-N′-(3-二甲基氨基脯氨酰基)碳二亚胺。用这些试剂活化时，直接在树脂上添加受保护的氨基酸及外消旋抑制剂(例如，HOBt、HOOBt)，或先将受保护的氨基酸活化为对称酸酐、HOBt酯或HOOBt酯，然后添加到树脂上。
适用于受保护氨基酸的活化反应或适用于与树脂的缩合反应的溶剂选自已知可用于蛋白质缩合反应的溶剂。这样的溶剂有酰胺类如N，N-二甲基甲酰胺、N，N-二甲基乙酰胺以及N-甲基吡咯烷酮等；卤化烃类如二氯甲烷和氯仿等；醇类如三氟乙醇等；亚砜类如二甲亚砜等；醚类如吡啶、二噁烷和四氢呋喃等；腈类如乙腈和丙腈等；酯类如乙酸甲酯和乙酸乙酯等；以及这些溶剂的适当混合物。反应温度从已知适用于蛋白质成键反应的范围中选取，通常选约-20℃-50℃。活化的氨基酸衍生物通常以过量1.5～4倍的量使用。用茚三酮反应检验所述缩合反应程度，当所述缩合不充分时，可通过不除去保护基团而重复缩合反应来完成。当即使重复反应后仍未充分缩合时，用乙酸酐或乙酰咪唑将未反应的氨基酸乙酰化，以消除对后续反应的可能负影响。
作为保护初始氨基的保护基团有，例如Z、Boc、叔戊氧基羰基、异冰片基氧羰基、4-甲氧苄氧羰基、Cl-Z、Br-Z、金刚烷(adamantyl)氧基羰基，三氟乙酰基、邻苯二甲酰基、甲酰基、2-硝基苯基亚硫酰基、二苯硫膦基，以及Fmoc等。
羧基可用如下的酯化作用保护，例如烷基酯化(烷基如甲基、乙基、丙基、丁基、叔丁基、环戊基、环己基、环庚基、环辛基和2-金刚烷基等的线性、支链或环状烷基酯)，芳烷基酯化(例如酯化为苄酯、4-硝基苄酯、4-甲氧苄酯、4-氯苄酯以及二苯甲基酯等)，苯甲酰甲基酯化，苄氧羰基酰肼化，叔丁氧羰基酰肼化以及三苯甲基酰肼化等。
丝氨酸的羟基可以通过例如酯化作用或醚化作用来保护。适于酯化作用的基团有低级C1～6烷酰基如乙酰基；芳酰基如苯甲酰基；以及来自碳酸的基团如苄氧羰基和乙氧羰基。适于醚化的基团有苯甲基、四氢吡喃基和叔丁基。
适于保护酪氨酸中酚羟基的基团有，例如Bzl、Cl2-Bzl、2-硝基苄基、Br-Z和叔丁基。
适于保护组氨酸中咪唑基的基团有，例如Tos、4-甲氧-2，3，6-三甲基苯磺酰基、DNP、苄氧甲基、Bum、Boc、Trt和Fmoc等。
活化原始羧基的有，如对应的酸酐、迭氮基、活化酯[与乙醇(五氯苯酚、2，4，5-三氯苯酚、2，4-二硝基苯酚、氰基甲醇、对硝基苯酚、HONB、N-羟甲基琥珀酰亚酰胺、N-羟甲基酞酰亚胺、HOBt)形成的酯]等。活化原始氨基的有与此对应的磷酸胺。
保护基的去除(脱离)方法有，例如在Pd-黑或Pd-碳等催化剂的存在下在氢气流中所进行的催化还原反应；通过氢氟酸酐、甲磺酸、三氟甲磺酸、三氟乙酸或它们的混合液进行酸的处理；二异丙烯乙胺、三乙胺、哌啶、哌嗪等的碱处理；通过液氨中的钠还原反应等等。上述酸处理的脱离反应一般在约-20℃～40℃的温度下进行，在酸处理作用中，添加如甲氧基苯、苯酚、硫代甲氧基苯、间苯甲酚、对甲酚、二甲基硫化物、1，4-丁二硫醇、1，2-乙二硫醇等阳离子捕集剂是有效的。组氨酸咪唑保护基所用的2，4-二硝基苯基通过硫代苯酚除去，色氨酸吲哚保护基的甲酰基除了所述1，2-乙二硫醇、1，4-丁二硫醇等存在下经过酸处理而脱离保护之外，也可以通过碱处理如氢氧化钠稀溶液、稀释氨等除去方法。
从公知的基团中适当选择与初始反应无关的官能团的保护及保护基以及其保护基的脱离，从公知方法中适当选择与反应有关的官能团的活化。
蛋白质胺物的其它获得方法有，如首先将羧基末端氨基酸的α-羧基胺基化保护，再在氨基侧使肽(蛋白质)链增加到所要求的长度，制造2种蛋白质，一种为该肽链只除去N末端α-氨基保护基，另一种为只除去C末端羧基保护基，使这两种蛋白质在所述混合溶剂中缩合。有关缩合反应的详细情况与前述一样。由缩合得到的保护蛋白质经过纯化之后，按照上述方法除去所有的保护基，可以得到粗蛋白。这种粗蛋白通过各种纯化的已知方法，进行冻结干燥主要的组分进而得到蛋白质胺物。
为获得蛋白质的酯物，将如羧基末端氨基酸的α-羧基与要求的乙醇类缩合转换为氨基酸酯后，再与蛋白质胺物的合成一样从而获得所要的蛋白质的酯物。
本发明的部分肽或其盐可按照公知的肽合成方法制备，或可用适当的肽酶切割本发明的蛋白质来制备。其肽的合成法有，例如，固相合成法或液相合成法。即，当够成本发明部分肽的部分肽或氨基酸与其残余部分缩合，其产物有保护基时，通过除去保护基团可以制备目的肽。此时的公知缩合方法或除去保护基团方法例如在下列1)-5)中均有描述1)M.Bodanszky和M.A.Ondetti肽的合成，Interscience Publishers，纽约(1966)2)Schroeder和Luebke肽，Academic Press，纽约(1965)3)泉屋信夫等多肽合成的基础与实验，丸善公司(1975)4)矢岛治明和榊原俊平生物化学实验教材1，蛋白质化学IV，205(1977)5)矢岛治明主编药物开发续篇，卷14，肽合成，广川书店另外，反应后将一般的纯化方法如，溶剂抽提法、蒸馏法、柱层析法、液体层析法、重结晶法等进行组合来纯化回收本发明的部分肽。通过上述方法得到的部分肽若为游离体时，按照公知方法可以适当转换为盐，相反获得其盐时按照公知方法也可以转化为游离体或其它的盐形式。
作为编码本发明蛋白质的DNA只要是编码前述本发明蛋白质的碱基序列均可。它们可以是基因组DNA、基因组DNA基因文库、前述细胞·组织中的cDNA、前述细胞·组织中的cDNA文库、合成DNA。
文库使用的载体包括噬菌体、质粒、粘粒、噬粒等。从所述细胞·组织中制备的总RNA或mRNA组分，用该总RNA或mRNA组分可以直接根据Reverse Transcriptase Polymerase Chain Reaction(下文，简称RT-PCR法)进行扩增。
作为编码本发明蛋白质的DNA，只要符合下列情形的均可进行选择，例如，①含有SEQ ID NO2所示碱基序列的DNA或在高度严谨条件下能与SEQ ID NO2所示碱基序列进行杂交的序列，并且其蛋白质活性基本上与本发明蛋白质的活性相同(例如，细胞增殖活性等)；②含有SEQ ID NO6所示碱基序列的DNA或在高度严谨条件下能与SEQ ID NO6所示碱基序列进行杂交的序列，并且其蛋白质活性基本上与本发明蛋白质的活性相同(例如，细胞增殖活性等)更具体地说，编码所述具有SEQ ID NO1所示氨基酸序列的本发明蛋白之DNA，可以使用具有SEQ ID NO2所示碱基序列的DNA；编码所述具有SEQ ID NO5所示氨基酸序列的本发明蛋白之DNA，可以使用具有SEQID NO6所示碱基序列的DNA等。
作为编码本发明部分肽的DNA，只要含有所述编码本发明部分肽的碱基序列的DNA则任何一种DNA均可。它们可以是基因组DNA、基因组DNA文库、前述细胞·组织中的cDNA、前述细胞·组织中的cDNA文库、合成DNA。
所述编码本发明部分肽的DNA，只要符合下列情形的均可进行选择，例如，①具有部分碱基序列的DNA，该DNA含有SEQ ID NO2所示碱基序列，或具有部分碱基序列的DNA，该DNA在高度严谨条件下能与SEQ IDNO2所示碱基序列进行杂交，并且它所编码的蛋白质基本上与本发明蛋白质的活性相同(例如，细胞增殖活性等)；②具有部分碱基序列的DNA，该DNA含有SEQ ID NO6所示碱基序列，或具有部分碱基序列的DNA，该DNA在高度严谨条件下能与SEQ ID NO6所示碱基序列进行杂交，并且它所编码的蛋白质基本上与本发明蛋白质的活性相同(例如，细胞增殖活性等)作为DNA的克隆方法，该DNA完全编码本发明蛋白质或部分肽(以下，在说明克隆编码这些蛋白质等的DNA及其表达时，通常将这些蛋白质等简称为本发明蛋白质)，按照下列方法进行。即，首先合成含有本发明蛋白质的部分碱基序列的DNA，用该DNA作为引物，再根据公知的PCR法进行完全编码目的DNA的扩增，或者通过与标记物进行杂交筛选，此标记物的使用，编码具有本发明蛋白质的部分或全部的DNA片段或合成DNA，并将其DNA片段插入到合适载体中。杂交反应可以根据分子克隆第二版(J.Sambrook等，冷泉港实验室出版社，1989)描述的方法进行。也可用商品化的文库根据所附说明书进行杂交。
DNA碱基序列置换可以使用公知的试剂盒，例如，MutanTM-G(宝酒造(株))、MutanTM-K(宝酒造(株))等产品，可以按照Gapped duplex法或Kunkel法等的公知方法或其改良方法进行置换。
已经克隆的编码该蛋白质的DNA，既可单独使用，也可根据目的需要，在用限制酶消化后或连接一接头之后使用。该DNA可能在5′端包含ATG作为翻译起始密码子，而在3′端有TAA、TGA或TAG作为翻译终止密码子。这些翻译起始和终止密码子也可加上合适的合成DNA接头。
本发明蛋白质的表达载体可通过以下方法生产，例如，(a)从编码本发明蛋白质的DNA上切割所需DNA片段，(b)将该DNA片段连接到一合适载体上的启动子下游。
可以使用的载体包括来自大肠杆菌的质粒(例如，pBR322、pBR325、pUC12、pUC13)、来自枯草杆菌的质粒(例如，pUB110、pTP5、pC194)、来自酵母的质粒(例如，pSH19、pSH15)、噬菌体如λ噬菌体等、动物病毒如反转录病毒、痘苗病毒、杆状病毒等。另外，本发明所使用的启动子有pA1-11、pXT1、pRc/CMV、pRc/RSV、pcDNAI/Neo等。
作为本发明所使用的启动子，只要是与宿主基因表达相匹配的启动子均可。例如，当动物细胞作为宿主时，有SRα启动子、SV40初期启动子、HIV·LTR启动子、CMV启动子、HSV-TK启动子等。
在这些启动子中优选使用CMV(巨细胞病毒)启动子、SRα启动子等。
当宿主为大肠杆菌属的细菌时，优选的启动子有trp启动子、lac启动子、recA启动子、λPL启动子、lpp启动子、T7启动子等。在使用枯草杆菌属的细菌作宿主时，优选的启动子有SPO1启动子、SPO2启动子和penP启动子等。在用酵母作宿主时，优选的启动子有PHO5启动子、PGK启动子、GAP启动子和ADH启动子等。在使用昆虫细胞作宿主时，优选多角体蛋白启动子、P10启动子。
表达载体除了上述之外，根据需要还可以使用含有增强子、剪接信号、PolyA附加信号、选择标记物、SV40复制起点(以下简称为SV40ori)等的载体。其中选择标记物有二氢叶酸还原酶(以下简称为dhfr)基因[抗氨甲蝶呤(MTX)]、抗氨苄青霉素基因(以下简称为Ampr)、抗新酶素基因(以下简称为Neor、抗G418)等。尤其使用CHO(dhfr-)细胞将dhfr基因作为选择标记物时又可以用不含腺嘌呤脱氧核苷来选择目的基因。
又，根据需要在本发明蛋白质的N-末端加上适合于宿主的信号序列。当宿主为大肠杆菌属细菌时，可以使用Pho A信号序列、Omp A信号序列等；当宿主为杆菌属细菌时可以使用α-淀粉酶信号序列、枯草菌素信号序列等；当宿主为酵母菌时可以使用MFα信号序列、SUC2信号序列等；当宿主为动物细胞时可以使用胰岛素信号序列、α-IL信号序列、抗体分子信号序列等。
使用如此构建的、含有编码本发明蛋白质的DNA载体可以形成转化体。
其宿主有，如大肠杆菌属细菌、杆菌属细菌、酵母菌、昆虫细胞、昆虫、动物细胞等。
具体地说，其大肠杆菌属的例子有大肠杆菌(Escherichia coli)K12DH1[(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)，60卷，160(1968)]、JM103[(Nucleic AcidsResearch)，9卷，309(1981)]、JA221[(Journal of Molecular Biology)，120卷，517(1978)]、HB101[Journal of Molecular Biology)，41卷，459(1969)]、C600[(Genetics)，39卷，440(1954)]等。
其杆菌属有枯草杆菌(Bacillus subtilis)MI114[Gene.24卷，255(1983)]、207-21[(Journal of Biochemistry)，95卷，87(1984)]等。
其酵母菌有，例如酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)AH22、AH22R-、NA87-11A、DKD-5D、20B-12、粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomycespombe)NCYC1913、NCYC2036、巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)KM71等。
其昆虫细胞有，例如病毒为AcNPV时来自草地夜蛾幼虫的细胞株(Spodoptera frugiperda cell，Sf细胞)、来自粉纹夜蛾中肠(Trichoplusia ni)的MG1细胞、来自粉纹夜蛾卵(Trichoplusia ni)的High Five TM细胞、来自Mamestra brassicae的细胞或来自Estigmena acrea的细胞等。病毒为BmNPV时有来自于蚕的细胞株(Bombyx mori N细胞，BmN细胞)等。其中所述Sf细胞，还有如Sf9细胞(ATCC CRL1711)、Sf21细胞(Vaughu，J.L.et al.InVivo.13，213-217(1977))等。
昆虫使用的是家蚕的幼虫[前田等.Nature.315卷，592(1985)]。
动物细胞有，例如猴子细胞COS-7，Vero、中国仓鼠细胞CHO(以下简称为CHO细胞)、dhft基因缺陷中国仓鼠细胞CHO(以下简称为CHO(dhfr-)细胞)、小鼠L细胞、小鼠AtT-20、小鼠骨髓瘤细胞、大鼠GH3、人FL细胞等。进一步也可以使用各种正常人的细胞例如，肝细胞、脾细胞、神经细胞、神经胶质细胞、胰腺β细胞、骨髓细胞、肾小球膜细胞、朗格罕氏细胞、表皮细胞、上皮细胞、内皮细胞、成纤维细胞、纤维细胞、肌细胞、脂肪细胞、免疫细胞(例如，巨噬细胞、T细胞、B细胞、自然杀伤细胞、肥大细胞、嗜中性粒细胞、嗜碱性粒细胞、嗜酸性粒细胞、单核细胞)、巨核细胞、滑膜细胞、软骨细胞、骨细胞、成骨细胞、破骨细胞、乳腺细胞、肝细胞或间质细胞、或这些细胞的前体细胞、干细胞或癌细胞等。
为了转化大肠杆菌属细菌按照[Proc.Natl.Acad.Sci.USA，69卷2110(1972)]和[Gene，17卷，107(1982)]描述的方法进行转换。
为了转化杆菌属细菌按照[Molecular and General Genetics，168卷，11(1979)]描述的方法进行转换。
为了转化酵母菌按照[酶学法，194，182-187(1991)]、[Proc.Natl.Acad.Sci.USA，75卷1929(1978)]描述的方法进行转换。
为了转化昆虫细胞或昆虫按照[Bio/Technology.6，47-55(1988)]描述的方法进行转换。
为了转化动物细胞按照[《细胞工程学增订版8，细胞工程学实验最新方法》秀润出版社，263-267(1995)]、[病毒学.52卷，456(1973)]描述的方法进行转换。
由此，可以获得用含有本发明蛋白质之编码DNA的表达载体转化的转化体。
培养宿主为大肠杆菌属细菌、杆菌属细菌的转化体时，其培养基适用于液体培养基，该转化体的发育含有必要的碳源、氮源、无机物以及其它物质。碳源有葡萄糖、糊精、可溶性淀粉、蔗糖等；氮源有铵盐、硝酸盐、玉米糊、蛋白胨、酪蛋白、肉汁、黄豆饼粉、马铃薯提取液等无机或有机物质；无机物有氯化钙、磷酸二氢钠、氯化镁等。也可以添加酵母提取物、维生素、生长因子等。培养基的pH优选约为5-8。
大肠杆菌属细菌的培养基，优选M9培养基它含有葡萄糖、酪蛋白氨基酸[米勒，Journal of Experiments in Molecular Genetics，431-433，Cold SpringHarbor Laboratory，New York 1972]。根据需要，为使启动子更能发挥有效作用还可以添加如，3β-吲哚丙烯酸之类的药物。
当宿主为大肠杆菌属细菌时，转化体通常在15-43℃培养，时间约3-24小时，必要时可以通气或搅拌。
当宿主为杆菌属细菌时，转化体通常在30-40℃培养，时间约6-24小时，必要时可以通气或搅拌。
当培养宿主为酵母的转化体时，其培养基有Burkholder基础培养基[Bostian，K.L.et al. Proc.Natl.Acad.Sci.USA，77卷，4505(1980)]或含有0.5％酪蛋白氨基酸的SD培养基[Bitter，G.A.et al. Proc.Natl.Acad.Sci.USA，81卷，5330(1984)]。培养基的pH优选为约5-8。转化体通常在20-35℃培养，时间约24-72小时，必要时可以通气或搅拌。
当培养宿主为昆虫细胞或昆虫的转化体时，其培养基可以选用在Grace′sInsecl培养基[Gracc，T.C.C.Nature.195，788(1962)]中适当添加固相化10％牛血清等添加物。培养基的pH优选为约6.2-6.4。转化体通常在27℃培养，时间约3-5天，必要时可以通气或搅拌。
当培养宿主为动物细胞的转化体时，其培养基包括含有约5-20％的胎牛血清的MEM培养基[Science，122卷.501(1952)]、DMEM培养基[Virology，8，396(1959)]、RPMI1640培养基[The Journal of the American MedicalAssociation.199卷，519(1967)]、199培养基[Proceeding of the Society for theBiological Medicine，73卷，1(1950)]等。培养基的pH优选为约6-8。转化体通常在30-40℃培养，时间约15-60小时，必要时可以通气或搅拌。
根据上述，在转化体的细胞外可以制备本发明蛋白质。
为了从上述培养物中分离纯化本发明蛋白质可以采用以下方法实施。
当从培养菌体或细胞中提取本发明蛋白质时，最适宜的方法是，培养后通过公知方法收集菌体或细胞，将其悬浮于适当的缓冲液中，通过超声波、溶菌酶和/或反复冻融法等破碎菌体或细胞，经过离心沉淀和过滤得到本发明蛋白质的粗提取液。缓冲液中也可以加入蛋白变性剂如尿素或盐酸胍等，表面活性剂如Triton X-100TM等。当本发明蛋白质被分泌在培养液中时，结束培养后，按照公知方法离心菌体或细胞，使它们与上清液分开，收集上清液。
上清或包含在所获抽提物中的本发明蛋白质可通过将已知的分离和纯化方法适当组合来进行纯化。这些众所周知的分离纯化方法包括利用溶解性差异的方法如盐析、溶剂沉淀等；主要利用分子量差异的方法如透析、超滤、凝胶过滤、SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳等；利用电荷差异的方法如离子交换层析等；利用特异性亲和力差异的方法如亲和层析等；利用疏水性差异的方法例如反相高效液相色谱等；利用等电点差异的方法如等电聚焦电泳等。
当如此获得的本发明蛋白质为游离形式时，可用众所周知的方法或其改良法将其转换为盐。相反，当获得的本发明蛋白质为盐时，可用众所周知的方法或改良法将其转换为游离形式或另一种盐形式。
重组产生的本发明蛋白质，在纯化前或纯化后，可用相应蛋白修饰酶处理，从而使本发明蛋白质经适当修饰，部分去除一段多肽。这种蛋白修饰酶的例子包括胰酶、胰凝乳蛋白酶、精氨酰内肽酶、蛋白激酶、糖苷酶等。
如此产生的本发明蛋白质或其盐的存在或活性可以通过酶免疫测定法进行检测，该测定使用了与标记配体结合的实验以及特异性抗体。
针对本发明蛋白质或部分肽或其盐的抗体只要是能识别本发明蛋白质或部分肽或其盐的抗体，既可为多克隆抗体或为单克隆抗体。
作为本发明部分肽或其盐的抗体来说，优选其针对具有下述氨基酸序列的部分肽或其盐，例如，①SEQ ID NO1所示氨基酸序列的第22-252位、第26-252位或第26-34位(尤其优选第26-252位或26-34位，更优选第26-34位)，②SEQ ID NO5所示氨基酸序列的第22-246位、第26-246位、第166-190位(尤其优选第26-246位、第166-190位，更优选166-190位)。
针对本发明蛋白质或部分肽或其盐(下文，在说明抗体过程中，通常将这些蛋白质等简称为本发明蛋白质)的抗体，按照公知制备抗体或抗血清的方法进行，并用本发明蛋白质作为抗原。
(a)单克隆抗体生产细胞的制备将本发明的蛋白质，单独或与载体或稀释剂一起给药于温血动物体内能产生抗体的部位。为了增加给药后抗体的产量，可给予完全福氏佐剂或不完全福氏佐剂。有效给药通常约为每2-6周一次，共2-10次。使用的温血动物包括猴子、兔子、狗、豚鼠、小鼠、大鼠、绵羊、山羊、家鸡，优选小鼠和大鼠。
在制备单克隆抗体生产细胞时，从经抗原免疫的温血动物如小鼠中选择抗体效价比较高的动物，在最后一次免疫的2-5天后取脾脏或淋巴结，使其中产生抗体的细胞与同种或异种动物的骨髓瘤细胞融合，获得产生单克隆抗体的杂交瘤细胞。抗血清中抗体效价的测定可以通过使抗血清与标记的随后所述蛋白反应，然后测定标记试剂与抗体结合的活性。可以根据Khler和Milstein(自然，256，495，1975)的方法进行融合。融合加速剂的例子为聚乙二醇(PEG)、仙台病毒等，优选PEG。
温血动物骨髓瘤细胞的例子包括NS-1、P3U1、SP2/0和AP-1，优选P3U1。所用抗体产生细胞(脾脏细胞)同骨髓瘤细胞的比例优选约为1∶1到20∶1，加入浓度约为10％-80％的PEG(优选PEG 1000-6000)。然后在20-40℃保温。为了有效实施细胞融合，优选30-37℃保温约1-10分钟。
可以用各种方法筛选产生单克隆抗体的杂交瘤。这些方法有将作为抗原的蛋白质直接或与载体一起吸附至一种固相载体上(如微量滴定板)，将杂交瘤上清加入到该固相载体上，然后加入用放射性物质或酶标记的抗免疫球蛋白抗体(如果用小鼠细胞作融合，则用抗小鼠的免疫球蛋白抗体)或蛋白A，检测结合到固相载体上的单克隆抗体；另一方法为，将杂交瘤上清加入到吸附有抗免疫球蛋白抗体或蛋白A的固相中，加入用放射性物质或酶标记的蛋白质，检测结合到固相载体上的单克隆抗体。
单克隆抗体的筛选可以根据众所周知的方法或其改进方法进行。一般地，在含有HAT(次黄嘌呤、氨甲喋呤和胸腺嘧啶核苷)的动物细胞培养基中筛选单克隆抗体。只要杂交瘤能够在培养基中生长的，可以使用任何筛选或生长培养基。例如，可以使用含有1％-20％，优选10-20％胎牛血清的RPMI 1640培养基、含有1％-10％胎牛血清的GIT培养基(和光纯药工业株式会社)、不含血清杂交瘤培养基(SFM-101，日水制药株式会社)作为筛选或生长培养基。通常在含5％CO2的条件下，于20-40℃(优选37℃)培养约5天-3周(优选1-2周)。杂交瘤培养上清中抗体效价的测定与上述抗血清中抗体效价的测定方法相同。
(b)单克隆抗体的纯化单克隆抗体的分离和纯化可根据公知方法，例如免疫球蛋白的分离和纯化方法(如盐析、乙醇沉淀、等电点沉淀、电泳、离子交换剂(如DEAE)吸附和去吸附、超离心、凝胶过滤、或一种特异性纯化方法，其包括仅收集与抗原结合固相、蛋白A或蛋白G等已与活化吸附剂相结合的抗体并使之分离以获得该抗体)。
本发明多克隆抗体的制备用众所周知的方法或其改进方法进行。例如，用与上述生产单克隆抗体相似的方法生产免疫原(蛋白质抗原)或配制免疫原与载体蛋白形成的复合物并用其免疫温血动物。从已免疫的动物中收集产物，其中含有本发明蛋白质的抗体，分离和纯化该抗体。
在由免疫原和载体蛋白组成的用于免疫温血动物的复合物中，对载体蛋白的类型和载体同半抗原的混合比率无限定，只要能针对与载体一起免疫的半抗原有效产生抗体。例如，牛血清白蛋白、牛甲状腺球蛋白或匙孔虫戚血蓝蛋白与半抗原以载体比半抗原重量比约0.1-20(优选约1-5)的比率偶联。
不同的缩合剂可用于偶联载体和半抗原。戊二醛、碳二亚胺、马来酰亚胺活化酯和含有巯基或二硫代吡啶基的活化酯试剂可用于偶联。
将缩合产物单独或与载体或稀释剂一起给药于温血动物体内能产生抗体的部位。为了增加给药后抗体的产量，可给予完全福氏佐剂或不完全福氏佐剂。大约每2-6周给药一次，共3-10次。
多克隆抗体从用上述方法免疫的温血动物的血液、腹水等(优选血液)中收集。
抗血清中多克隆抗体效价的测定与上述测定血清抗体效价的方法相同。
可以根据上述用于分离和纯化单克隆抗体的免疫球蛋白分离纯化方法来分离和纯化多克隆抗体。
下面说明本发明蛋白质或部分肽或其盐(以下有时简写为本发明蛋白质)的应用以及针对本发明蛋白质或部分肽或其盐(以下有时简写为本发明抗体)抗体的应用。
(1)与本发明蛋白质等相关的预防与治疗各种疾病的药物因为本发明蛋白质等具有细胞增殖活性，所以本发明蛋白质等可以用于病变组织摘除(包括全部摘除或部分摘除，但优选部分摘除)后作为组织再生剂等药物。
当本发明蛋白质用作所述治疗或预防药物时，优选所用纯度至少90％，优选95％以上，更优选98％以上，最优选99％以上。
例如，本发明的蛋白质可以以片剂(必要时加糖衣)、胶囊、酏剂、微胶囊等剂型口服，或以可注射型制剂如与水或水以外的但药学上允许的溶液形成无菌溶液或悬浮液形式经非胃肠道给药。例如，将本发明的蛋白质等与生理学上可接受的、符合制药规定的已知载体、调味剂、赋形剂、载色剂、防腐剂、稳定剂、粘合剂等混合制成药剂常用单位剂型。控制制剂中的活性成分使得在给定范围内获得合适剂量。
可与片剂、胶囊等混合的添加剂包括，粘和剂如明胶、玉米淀粉、西黄耆胶和金合欢胶；赋形剂如结晶纤维素；膨胀剂如玉米淀粉、明胶和藻酸；润滑剂如硬脂酸镁；甜味剂如蔗糖、乳糖和糖精；加味剂如薄荷、akamonooil和樱桃。当单位剂型为胶囊形式时，可进一步将液体载体如油和脂肪同上述添加剂一起使用。可根据常规制药方法制备注射用无菌组合物，例如将活性成分与天然植物油如芝麻油和椰子油等溶解或悬浮在载体，如注射用的水中来制备药物。
用于注射的液体介质的例子包括，生理盐水、及包含葡萄糖和其它辅助制剂(如D-山梨醇、D-甘露醇和氯化钠等)的等渗溶液，并可以进一步同合适的助溶剂如醇(如乙醇等)、聚醇(如丙二醇和聚乙二醇等)、非离子表面活性剂(如聚山梨酸酯80TM和HCO-50等)等结合使用。油性介质有芝麻油和豆油，它们可与助溶剂如苯甲酸苄酯和苯甲醇结合使用。此外，上述的治疗/预防制剂可进一步与缓冲液(例如磷酸盐缓冲液和乙酸钠缓冲液等)、镇静剂(例如苯扎氯胺和盐酸普鲁卡因等)、稳定剂(如人血清白蛋白、聚乙二醇等)、防腐剂(例如苯甲醇、酚等)、抗氧化剂等结合使用。由此制备的注射液体一般装在合适的安瓿中。
如此所获制剂安全、低毒，因此可用于人或其它温血动物(例如，大鼠、小鼠、豚鼠、兔子、鸡、绵羊、猪、牛、马、猫、狗、猴等)。
本发明蛋白质的剂量依赖于病症、受检者等而异；例如当口服给药本发明蛋白质作为病变组织摘除后的组织再生剂时，一般成年人(体重60kg)的正常剂量为大约0.1-100mg/天，优选大约1.0-50mg/天，更优选1.0-20mg/天。
(2)筛选可作为疾病治疗药物的侯选化合物自然杀伤(NK)细胞具有抑制癌细胞的增殖作用。本发明蛋白质等不会影响正常细胞的繁殖，但由于抑制NK细胞的增殖，所以具有抑制由于本发明蛋白质等抑制NK细胞增殖活性的化合物或其盐可作为以下各种疾病的治疗·预防药物使用例如各种癌(如子宫体癌、子宫内膜肿瘤、乳腺癌、大肠癌、前列腺癌、肺癌、肾癌、神经母细胞瘤、膀胱癌、黑素瘤等)等疾病。
因此，本发明蛋白质可作为一种试剂，它有益于筛选具有抑制由本发明蛋白质而抑制的NK细胞增殖活性的化合物或其盐。
即，本发明提供，(1)①一种筛选方法(在(2)「筛选可作为疾病治疗药物的侯选化合物」中有时也称为本发明筛选法)，其用于筛选具有抑制本发明蛋白质或其部分肽或其盐对NK细胞增殖抑制的活性化合物(在(2)「筛选可作为疾病治疗药物的侯选化合物」中有时简称为抑制剂)，其特征在于，该方法应用本发明蛋白质或其部分肽或其盐；②一种用于筛选抑制剂的试剂盒(在(2)「筛选可作为疾病治疗药物的侯选化合物」中有时也称为本发明筛选试剂盒)，其特征在于，该筛选试剂盒包含本发明蛋白质或其部分肽或其盐；更具体地说，本发明提供，例如(2)①抑制剂的筛选方法，其特征在于(i)当使本发明蛋白质或其部分肽或其盐与NK细胞接触时，和(ii)当使本发明蛋白质或其部分肽或其盐与NK细胞及待测化合物接触时，而进行的比较；②用于筛选抑制剂的试剂盒，其特征在于，该试剂盒包含本发明蛋白质或其部分肽或其盐以及NK细胞。
具体地，所述筛选法和筛选试剂盒的特征为，如在(i)和(ii)的情况下，测定并比较本发明蛋白质等对NK细胞增殖所产生的抑制活性等。
本发明蛋白质等对NK细胞增殖所产生的抑制活性可以按照公知方法或其改良方法等进行测定，优选随后叙述实施例的方法。
待测化合物包括肽、蛋白、非肽化合物、合成的化合物、发酵产物、细胞提取液、植物提取液、动物组织提取液等，这些化合物可为新化合物或已知化合物。
例如，当一种待测化合物在上述(ii)中使本发明蛋白质等对NK细胞增殖产生抑制活性与(i)相比时，抑制至少约20％，优选30％，更优选至少约50％时，该化合物可以作为抑制本发明蛋白质等对NK细胞增殖产生抑制活性的化合物。
通过本发明筛选法或用于筛选的试剂盒获得的化合物或其盐，为所述的待测化合物，该化合物选自如肽、蛋白、非肽化合物、合成化合物、发酵产物、细胞提取液、植物提取液、动物组织提取液、血浆等，其为具有抑制本发明蛋白质等对NK细胞增殖产生抑制活性的化合物。
作为该化合物的盐使用与所述本发明蛋白质之盐相同的盐类。
通过本发明筛选法或用于筛选的试剂盒获得的化合物，当用作所述治疗药物或预防药物时，可以按照常规方法给药。例如，与包含所述本发明蛋白质等药物一样，可将该药物制成片剂、胶囊、酏剂、微胶囊、无菌溶液、悬浮液制剂等。
如此所获制剂安全、低毒，因此可用于人或其它温血动物(例如，大鼠、小鼠、兔子、鸡、绵羊、猪、牛、马、猫、狗、猴等)。
所述化合物或其盐的剂量依赖于其作用、病症、受检者、给药方法等而异；例如以子宫内膜肿瘤为治疗目的，当口服给药具有抑制本发明蛋白质对NK细胞增殖产生抑制活性的化合物时，一般成年人(体重60kg)的正常剂量为大约0.1-100mg/天，优选大约1.0-50mg/天，更优选1.0-20mg/天。当非胃肠给药时，一次该化合物的给药量因给药对象、病症等不同，例如，以子宫内膜肿瘤为治疗目的，当以粉剂形式给药具有抑制本发明蛋白质对NK细胞增殖产生抑制活性的化合物时，一般成年人(体重60kg)的正常剂量为大约0.01-30mg/天，优选大约0.1-20mg/天，更优选0.1-10mg/天，静脉注射更为合适。对于其它动物种类，可以按每60kg体重换算相应给药剂量。
(3)筛选可作为疾病治疗药物的侯选化合物由于本发明蛋白质等具有细胞增殖活性，能够促进本发明蛋白质等机能(如，细胞增殖活性等)的化合物或其盐可作为病变组织摘除后的组织再生剂等药物使用。
另一方面，抑制本发明蛋白质等机能的化合物或其盐可用作以下各种疾病的治疗·预防药物例如各种癌(如子宫体癌、子宫内膜肿瘤、乳腺癌、大肠癌、前列腺癌、肺癌、肾癌、神经母细胞瘤、膀胱癌、黑素瘤等)等疾病。
因此，本发明蛋白质可作为一种试剂，它有益于筛选具有促进或抑制本发明蛋白质等机能的化合物或其盐。
即，本发明提供，(1)①一种筛选方法，其用于筛选促进本发明蛋白质或其部分肽或其盐机能的化合物或其盐(在(3)「筛选可作为疾病治疗药物的侯选化合物」中有时简称为促进剂)，或者用于筛选抑制本发明蛋白质或其部分肽或其盐机能(如，细胞增值活性等)的化合物(在(3)「筛选可作为疾病治疗药物的侯选化合物」中有时简称为抑制剂)，其特征在于，该方法应用本发明蛋白质或其部分肽或其盐；②一种用于筛选促进剂或抑制剂的试剂盒(在(3)「筛选可作为疾病治疗药物的侯选化合物」中有时也称为本发明筛选试剂盒)，其特征在于，该筛选试剂盒包含本发明蛋白质或其部分肽或其盐；更具体地说，本发明提供，例如(2)①促进剂或抑制剂的筛选方法，其特征在于(i)当使本发明蛋白质或其部分肽或其盐与细胞(如，来自所述各种组织(优选人等)的正常细胞或所述癌细胞等)接触时，和(ii)当使本发明蛋白质或其部分肽或其盐与细胞(如，来自所述各种组织(优选人等)的正常细胞或所述癌细胞等)及待测化合物接触时，而进行的比较；②用于筛选促进剂或抑制剂的试剂盒，其特征在于，该试剂盒包含本发明蛋白质或其部分肽或其盐以及细胞(如，来自所述各种组织(优选人等)的正常细胞或所述癌细胞等)。
具体地，所述筛选法的特征为，如在(i)和(ii)的情况下，测定并比较本发明蛋白质等对细胞增殖的活性等。
本发明蛋白质等对细胞增殖的活性可以按照公知方法或其改良方法等进行测定。
所述细胞，可以使用例如，来自所述各种组织(优选人等)的正常细胞或所述癌细胞等待测化合物包括肽、蛋白、非肽化合物、合成的化合物、发酵产物、细胞提取液、植物提取液、动物组织提取液等，这些化合物可为新化合物或已知化合物。
为了实施本筛选方法，首先将本发明蛋白质等悬浮于适合筛选的缓冲液中制成本发明蛋白质等的样品。缓冲液只要不干扰本发明蛋白质等与待测化合物的反应，可为pH约为4-10(优选pH约6-8)的缓冲液如磷酸缓冲液、Tris-盐酸缓冲液等。
例如，一种待测化合物在上述(ii)中使细胞增殖活性比(i)中增加约至少20％，优选30％以上，更优选约50％以上时，该化合物可以选为促进本发明蛋白质等对细胞增殖活性的化合物，另一方面，当一种待测化合物在上述(ii)中使本发明蛋白质等对细胞增殖活性与(i)相比时，抑制至少约20％，优选30％以上，更优选约50％以上时，该化合物可以作为抑制本发明蛋白质等对NK细胞增殖产生抑制活性的化合物。
通过本发明筛选法或用于筛选的试剂盒获得的化合物或其盐，为所述待测化合物，该化合物选自如肽、蛋白、非肽化合物、合成化合物、发酵产物、细胞提取液、植物提取液、动物组织提取液、血浆等，其为促进或抑制本发明蛋白质等功能(如，细胞增殖活性等)的化合物。
作为该化合物的盐使用与所述本发明蛋白质盐相同的盐类。
通过本发明筛选法或用于筛选的试剂盒获得的化合物，当用作所述治疗药物或预防药物时，可以按照常规方法给药。例如，与包含所述本发明蛋白质等药物一样，可将该药物制成片剂、胶囊、酏剂、微胶囊、无菌溶液、悬浮液制剂等。
如此所获制剂安全、低毒，因此可用于人或其它温血动物(例如，大鼠、小鼠、兔子、绵羊、猪、牛、马、鸡、猫、狗、猴等)。
所述化合物或其盐的剂量依赖于其作用、病症、受检者、给药方法等而异；例如以子宫内膜肿瘤为治疗目的，当口服给药具有促进本发明蛋白质等功能的化合物，作为病变组织摘除后的组织再生药物时，一般成年人(体重60kg)的正常剂量为大约0.1-100mg/天，优选大约1.0-50mg/天，更优选1.0-20mg/天。对于其它动物种类，可以按每60kg体重换算相应给药剂量。
另外，以子宫内膜肿瘤为治疗目的，当口服给药具有抑制本发明蛋白质等功能的化合物时，一般成年人(体重60kg)的正常剂量为大约0.1-100mg/天，优选大约1.0-50mg/天，更优选1.0-20mg/天。当非胃肠给药时，一次该化合物的给药量因给药对象、病症等不同，例如，以子宫内膜肿瘤为治疗目的，当以粉剂形式给药具有抑制本发明蛋白质等功能的化合物时，一般成年人(体重60kg)的正常剂量为大约0.01-30mg/天，优选大约0.1-20mg/天，更优选0.1-10mg/天，静脉注射更为合适。对于其它动物种类，可以按每60kg体重换算相应给药剂量。
(4)对本发明蛋白质或其部分肽或其盐进行定量作为本发明蛋白质的抗体(下文通常简称为本发明抗体)，由于它是能够特异识别本发明蛋白质的，因此可用于定量待测溶液中的本发明蛋白质等，尤其是通过夹心免疫测定法进行定量。因此，本发明提供了下述的定量方法(i)一种定量待测液中本发明蛋白质的方法，其包括，使本发明的抗体与待测液以及标记的本发明蛋白质进行竞争反应，测定与该抗体结合的本发明标记蛋白质等的比率；和，(ii)一种定量待测液中本发明蛋白质等的方法，其包括，同时或先后使所述待测液与固定在固相载体上的本发明抗体以及标记的本发明其它抗体反应，测定固相载体上标记试剂的活性。
在上述方法(ii)中，优选一种抗体能识别本发明蛋白质等N-末端区域，而另一抗体能识别本发明蛋白质等C-末端区域。
针对本发明蛋白质的单克隆抗体(以下有时称为本发明单克隆抗体)可用于定量本发明蛋白质。此外，也可通过组织染色来检测本发明蛋白质。为此，可用抗体分子本身或使用抗体分子的F(ab’)2、Fab’或Fab片段。
对使用本发明的抗体进行本发明蛋白质等的定量方法没有特殊限制；可以使用任何方法，只要它涉及以下方法，即根据待测定液中相应抗原含量(例如蛋白质的量)，用化学或物理方法检测抗体、抗原或抗体-抗原复合物的量，然后根据含已知量抗原的标准溶液制作的标准曲线来计算。优选的方法为，例如比浊法(nephrometry)、竞争法、免疫测定法(immunometric)和夹心法；就灵敏度和特异性而言，特别优选后面将要描述的夹心法。
用于分析方法的标记试剂的例子为放射性同位素、酶、荧光物质和化学发光物质等。同位素的例子包括[125I]、[131I]、[3H]、[14C]等。优选酶的例子为稳定、具有高比活的酶，包括β-半乳糖苷酶、β-葡萄糖苷酶、碱性磷酸酶、过氧化物酶和苹果酸脱氢酶。荧光物质的例子包括荧光胺、异硫氰酸荧光素等。化学发光物质的例子包括发光氨、发光氨衍生物、萤光素、光泽精等。此外，也可使用生物素-链霉素系统来对抗原或抗体标记。
为了不使抗原或抗体溶解，可以使用物理吸附。也可使用化学结合方法，即通常使蛋白或酶不溶解并固定于载体上。载体的例子包括，不溶性多糖如琼脂糖、葡聚糖和纤维素；合成树脂如聚苯乙烯、聚丙烯酰胺、硅；或玻璃等。
在夹心法中，使被检液与本非溶性的发明单克隆抗体反应(第一反应)，再进一步使标记的其他本发明单克隆抗体反应(第二反应)，然后根据测定固相载体上的标记试剂活性可以对被检液中的本发明蛋白质进行定量。第一反应和第二反应即可颠倒前后顺序，也可同时进行，或错开时间进行。标记的试剂及固相方法可按照上述的方法实施。在夹心免疫分析法中，用于固相的抗体或标记的抗体未必只有一种抗体，只要能提高测定灵敏度等可以使用两种以上的抗体混合物。
在根据本发明的夹心方法测定本发明蛋白质等时，优选用于第一和第二反应的单克隆抗体与本发明蛋白质等的结合位点彼此不同。因此，在第一和第二反应用的抗体为，当第二反应的抗体识别本发明蛋白质的C端区域时，优选在第一反应中使用能识别除C端区域以外的位点，如N端区域的抗体。
本发明的单克隆抗体可用于除夹心法外的其它分析方法，例如竞争法、免疫测定法和比浊法。
在竞争法中，待测溶液中的抗原和标记抗原竞争与抗体反应，然后将未反应的标记抗原(F)及结合于抗体的标记抗原(B)分离(即B/F分离)，测定B或F的标记量，从而可以测定待测溶液中的抗原量。在此类方法的反应中，有一种液相方法和一种固相方法，前者使用可溶性抗体，加入针对第一抗体的第二抗体后，用聚乙二醇来有效分离B/F；后者可用不溶性抗体作为第一抗体，或用可溶性抗体作为第一抗体但第二抗体为固相抗体。
在免疫测定法中，待测溶液中的抗原和固相抗原竞争性地与给定量的标记抗体反应，然后使液相与固相分离；或待测溶液中的抗原与过量标记抗体反应，然后加入固相抗原，使未反应的标记抗体与该固相结合，然后使液相与固相分离。随后，测定两相的标记量，来测定待测溶液中的抗原量。
在比浊法中，测定抗原-抗体在凝胶或溶液中反应产生的不溶性沉淀的量。即使待测溶液中抗原量很少且仅获得小量的沉淀，利用激光散射的激光比浊法(nephrometry)也可以实施。
本发明应用这些免疫分析方法进行分析时，不需要任何特殊条件和操作。除了每种方法的常规条件和操作外，本领域技术人员可构建测定本发明蛋白质等的分析系统。所述常规技术的细节，参见如入江宽(编)“放射免疫分析”(1974，讲谈社，日本)；入江宽(编)“放射免疫分析，续编”(1979，讲谈社，日本)；石川荣治等(编)“酶免疫分析”(医学书院，1978)；石川荣治等(编)“酶免疫分析，第二版”(医学书院，1982)；石川荣治等(编)“酶免疫分析，第三版”(医学书院，1987)；“酶学方法”卷70(免疫化学技术(A))；同上，卷73(免疫化学技术(B))；同上，卷74(免疫化学技术(C))；同上，卷84(免疫化学技术(D选择性免疫分析))；同上，卷92(免疫化学技术(E单克隆抗体及普通免疫分析方法))；同上，卷121(免疫化学技术(I杂交瘤技术及单克隆抗体))(Academic Press出版)等)。
如上所述，使用本发明的抗体可高度敏感地定量本发明蛋白质等。
此外，使用本发明的抗体可定量本发明蛋白质等的浓度，从而当检出本发明蛋白浓度的增加时，能够诊断出如下各种疾病或者将来对这些疾病的高度易感性如，各种癌(如子宫体癌、子宫内膜肿瘤、乳腺癌、大肠癌、前列腺癌、肺癌、肾癌、神经母细胞瘤、膀胱癌、黑素瘤等)等。
本发明抗体可用于检出体液或者组织等待检体中存在的本发明蛋白质等。又可用于抗体柱的制作，该抗体柱可用于纯化本发明蛋白质等；检出各纯化组分中的本发明蛋白质等；对被检细胞内本发明蛋白质的行踪进行分析等。
(5)含有本发明抗体的药物本发明抗体具有中和本发明蛋白质等活性的作用，该抗体可用作治疗或预防以下各种疾病的药物例如各种癌(如子宫体癌、子宫内膜肿瘤、乳腺癌、大肠癌、前列腺癌、肺癌、肾癌、神经母细胞瘤、膀胱癌、黑素瘤等)等。
针对本发明蛋白质等的本发明人型抗体可用作治疗或预防以下各种疾病的药物例如各种癌(如子宫体癌、子宫内膜肿瘤、乳腺癌、大肠癌、前列腺癌、肺癌、肾癌、神经母细胞瘤、膀胱癌、黑素瘤等)等。
所述该人型抗体的制备可以根据Nat Biotechnol，14，845-851.(1996)；Nat Genet.15，146-156.(1997)；PNAS，97(2)，722-727(2000)等描述的方法实施。
下文，在「(5)含有本发明抗体的药物」中，将本发明的中和抗体及人型抗体统称为本发明抗体。
上述各种疾病的治疗药物或预防药物含有本发明抗体，其可直接以原始液体制剂或作成适当剂型的药物组合物，对人或哺乳动物(例如，大鼠、兔子、绵羊、猪、牛、猫、狗、猴等)经过口服或非胃肠道形式给药。本发明抗体的投药剂量依赖于给药受体、症状和给药方法等而异；当用于治疗或预防成人子宫内膜肿瘤患者时，静脉注射的正常剂量为每天大约0.01-20mg/kg体重，优选0.1-10mg/kg体重，更优选0.1-5mg/kg体重，一天1-5次，优选一天1-3次。其他非肠道给药或经口给药均依据此量。症状特别严重者根据其病症可以增加使用量。
本发明的抗体可以直接给药或者制成适当的医药组合物给药。所述医药组合物包含上述化合物或它们的盐和可药用载体、稀释剂或者赋形剂。这种组合物可以为适于经口或非肠道给药的剂型。
即，适于经口给药的组合物包括固体型制剂或液体型制剂，具体地有片剂(包括糖衣片、薄膜包衣片剂)、丸剂、颗粒剂、粉剂、胶囊(包括软胶囊)、糖浆、乳剂、悬浮剂等。这种组合物可以通过公知的方法生产，其制剂通常包括制药领域常规使用的载体、稀释剂、赋形剂。例如用于片剂的载体或赋形剂有乳糖、淀粉、蔗糖、硬脂酸镁等。
适于非胃肠道给药的组合物有针剂、栓剂等，针剂包含的剂型有静脉注射剂、皮下注射剂、皮内注射剂、肌肉注射剂、点滴注射剂等。这类注射剂根据公知方法，例如将所述抗体或它们的盐溶解、悬浮或者乳化于无菌水性溶液或无菌油性溶液而制备。注射用水溶液有生理盐水、包含葡萄糖及其它辅助制剂的等渗溶液，并还可以进一步与合适的助溶剂如醇(如乙醇)、聚醇(如丙二醇和聚乙二醇)、非离子表面活性剂(如聚山梨酸酯80TM和HCO-50(加氢的蓖麻油的聚氧乙烯(50ml)加成化合物)等结合使用。油性溶液有芝麻油和豆油，它们可与助溶剂如苯甲酸苄酯和苯甲醇结合使用。由此制备的注射液一般装在合适的安瓿中。用于直肠给药的栓剂通过将所述抗体或它们的盐与一般的栓剂基质混合而制备。
上述口服或非口服的医药组合物，最好制成适合于活性成分投药剂量的用药剂型。其投药剂型包括，片剂、丸剂、胶囊、注射制剂(安瓿)、栓剂等，每个单位剂型通常含有上述抗体5-500mg，注射剂优选含5-100mg，其他制剂优选含有10-250mg。
此外，前面所述各种组合物也可含有其它活性成分，只要与上述抗体的结合不发生不利的相互作用。
在说明书和附图中，碱基和氨基酸的代码使用IUPAC-IUB生化命名委员会规定的或本领域通用的代码，如下例所示。对于有光学异构体的氨基酸，除非特别说明，均指L形式。
DNA 脱氧核糖核酸cDNA 互补的脱氧核糖核酸A腺嘌呤T胸腺嘧啶G鸟嘌呤C胞嘧啶I次黄嘌呤核苷R腺嘌呤或鸟嘌呤Y胸腺嘧啶或胞嘧啶M腺嘌呤或胞嘧啶K鸟嘌呤或胸腺嘧啶S鸟嘌呤或胞嘧啶W腺嘌呤或胸腺嘧啶B鸟嘌呤、鸟嘌呤或胸腺嘧啶D腺嘌呤、鸟嘌呤或胸腺嘧啶V腺嘌呤、鸟嘌呤或胞嘧啶RNA 核糖核酸
mRNA 信使核糖核酸dATP 脱氧腺苷三磷酸dTTP 脱氧胸腺嘧啶三磷酸dGTP 脱氧鸟苷三磷酸dCTP 脱氧胞嘧啶三磷酸ATP 腺苷三磷酸Gly 甘氨酸Ala 丙氨酸Val 缬氨酸Leu 亮氨酸Ile 异亮氨酸Ser 丝氨酸Thr 苏氨酸Cys 半胱氨酸Met 蛋氨酸Glu 谷氨酸Asp 天冬氨酸Lys 赖氨酸Arg 精氨酸His 组氨酸Phe 苯丙氨酸Tyr 酪氨酸Trp 色氨酸Pro 脯氨酸Asn 天冬酰胺Gln 谷氨酰胺pGlu 焦谷氨酸用下列符号表示本说明书中多次使用的取代基、保护基以及试剂Me甲基Et乙基Bu丁基
Ph 苯基TC 四氢噻唑-4(R)-羧基酰胺基Tos 对甲苯磺酰基CHO 甲酰基Bzl 苄基Cl2-Bzl 2，6-二氯苄基MBzl 甲氧基苄基MeBzl4-甲基苄基OcHeX环己酯OBzl 苄基酯Bom 苄氧甲基Z苄氧碳基Cl-Z 2-氯苄氧羰基Br-Z 2-溴苄氧羰基Boc 叔丁氧基羰基DNP 二硝基苯酚Trt 三苯甲基Bum 叔丁氧基甲基Fmoc N-9-芴基甲氧基羰基HOBt 1-羟基苯并三唑HOOBt3，4-二羟基-3-羟基-4-氧基-1，2，3-苯并三嗪HONB N-羟基-5-降冰片烯基-2，3-二羧基亚胺DCC N，N′-二环己基碳二亚胺DMF N，N′-甲基甲酰胺TEA 三乙胺WSCD 1-乙基-3(3-二甲基氨丙基)-碳二亚胺EDTA 乙二胺四乙酸SDS 十二烷基硫酸钠本说明书的序列表中的序列编号分别表示如下。
表示来自人的本发明蛋白质(TGC839蛋白质)的氨基酸序列。
表示编码来自人的并具有SEQ ID NO1所示氨基酸序列的本发明蛋白质之DNA序列。
表示在实施例3中使用引物(合成)DNA的碱基序列。
表示在实施例3中使用引物(合成)DNA的碱基序列。
表示来自人的本发明蛋白质(TGC838蛋白质)的氨基酸序列。
表示编码来自人的并具有SEQ ID NO5所示氨基酸序列的本发明蛋白质之DNA序列。
表示在实施例7及实施例20中使用引物(合成)DNA的碱基序列。
表示在实施例7中使用引物(合成)DNA的碱基序列。
表示在实施例20中使用引物(合成)DNA的碱基序列。
在随后所述实施例3中获得的大肠杆菌转化体(Escherichia coli)SURE/pCAN618/H839于1999年3月10日保藏于日本国茨城县筑波市东1-1-3的通商产业省工业技术院生命工学工业技术研究所(NIBH)，保藏编号为FERM BP-6677，于1999年2月25日保藏于日本国大阪府大阪市淀川区十三本町2-17-85的财团法人·发酵研究所(IFO)，保藏编号为IFO 16259。
在随后所述实施例7中获得的大肠杆菌转化体(Escherichia coli)XL10-Gold/pCAN618/H838F于1999年8月2日保藏于通商产业省工业技术院生命工学工业技术研究所(NIBH)，保藏编号为FERM BP-6809，于1999年7月21日保藏于财团法人·发酵研究所(IFO)，保藏编号为IFO 16297。
在随后所述实施例15中获得的杂合体(hybridoma)克隆No.112-3作为839N-112于2000年3月2日保藏于通商产业省工业技术院生命工学工业技术研究所(NIBH)，保藏编号为FERM BP-7068。
在随后所述实施例15中获得的杂合体(hybridoma)克隆No.128-18作为839N-128于2000年3月2日保藏于通商产业省工业技术院生命工学工业技术研究所(NIBH)，保藏编号为FERM BP-7069。
在随后所述实施例22中获得的CHO-K1/TGC838N-4于2000年3月10日保藏于通商产业省工业技术院生命工学工业技术研究所(NIBH)，保藏编号为FERM BP-7088。
在随后所述实施例23中获得的CHO-K1/618/839F6-3于2000年3月10日保藏于通商产业省工业技术院生命工学工业技术研究所(NIBH)，保藏编号为FERMBP-7089。
在随后所述实施例28中获得的杂合体(hybridoma)839-01于2000年3月10日保藏于通商产业省工业技术院生命工学工业技术研究所(NIBH)，保藏编号为FERM BP-7086。
在随后所述实施例28中获得的杂合体(hybridoma)839-02于2000年3月10日保藏于通商产业省工业技术院生命工学工业技术研究所(NIBH)，保藏编号为FERMBP-7087。
下面例举实施例详细叙述本发明，但并非限制本发明的范围。使用大肠杆菌(Escherichia coli)进行基因操作按“分子克隆”的方法进行。
实施例1 通过数据库选择克隆由スミスクラインビ-チヤム(SB)公司提供数据库，从该数据库中选择的克隆应具有蛋白分泌序列特有的氨基酸序列。
也就是说，在把EST碱基序列翻译成氨基酸序列之后，确证5′端存在有Met并且其5′端区域有疏水性的氨基酸序列，进一步选择在其下游有亲水性、疏水性的氨基酸序列，从最前端的Met至10-30的氨基酸中包含分泌性蛋白所必需的信号序列，即EST克隆。将其中的一个定为HGS2772893。由SB公司函寄并定为TGC839。用含有该基因的质粒转化至大肠杆菌E.coli，按照操作指南进行培养，制备纯化的质粒，再用限制酶EcoRI和XhoI切割该基因，分别切割为2个基因片段约0.9kb和约0.5kb，得知该基因片段为约1.4kb。
然后，用T7和T3引物借助于ABI 377 Prism荧光DNA序列分析仪分析了该基因的碱基序列。其碱基序列和氨基酸序列如图1所示。
该基因编码的蛋白质具有252个氨基酸残基，从它的N末端至第25位氨基酸残基(Ala)和第26位氨基酸残基(Gly)之间推测有信号序列被切割。
实施例 2基因表达的确证为了预测在实施例1中得到的基因功能，研究了在人体各种组织和癌细胞株中的基因表达。
首先，用限制酶EcoRI和Xho I将基因切割，断裂片段约为900个碱基DNA，将该DNA片段用作探针，再分别从各种组织、细胞中提取mRNA，然后进行Northern印迹分析。クロンテツク公司提供的人各种组织Northern(MTN)Blot、人的癌细胞株(Human Caner cell line)的mRNA Blot，或者将人的各种癌细胞mRNA转移至尼龙膜上，按照操作指南使它们与同位素标记的DNA探针反应，漂洗尼龙膜后，通过放射自显影图像研究该基因表达的组织和细胞。
所述基因的表达在正常成人的组织中几乎得不到确证，仅在癌细胞、胎儿的脑和肺中确证有该基因的特异性表达(图2、3)。
实施例3 在动物细胞中通过人TGC839蛋白质构建基因表达载体构建基因表达载体是为了使人TGC839蛋白质在动物细胞中能够进行表达。此时，为了后面所进行的表达产物更容易检测出来，在TGC839蛋白质的C端插入由8个氨基酸构成的FLAG序列(DYKDDDDK)。
以下将带有FLAG序列的TGC839蛋白质特称为TGC839FLAG蛋白质。
首先，设计一种合成DNA，该DNA是以编码TGC839蛋白质的cDNA片段为模板，在临近翻译起始密码子ATG的附近有EcoRI限制酶切点，即[5′GCGCTCGAATTCCACCATGGCAGCAGCCGCCGCTACCAAG 3′(SEQID NO3)]和在TGC839蛋白质的C末端有DYKDDDDK所示氨基酸序列，然后再设计一种合成DNA，该DNA有翻译终止密码子、NotI限制酶切点，用[5′GCGGCCGCTCACTTGTCATCGTCGTCCTTGTAGTCCTCTAAAGGACTCTCCTCAGATGCCAGGGAGGATGAAGCAG 3′(SEQ ID NO4)]进行PCR扩增，获得包含TGC839ORF的DNA片段。用限制酶EcoRI(宝酒造公司产品)、EagI(New England Biolabs公司产品)进行双重消化后，将其插入到pCAN618的EcoRI、NotI位点，获得在人TGC839蛋白质的C端带有FLAG序列的TGC839FLAG的动物细胞表达载体pCAN618/H839F。
通过公知方法将该pCAN618/H839F转化至大肠杆菌(Escherichiacoli)SURE株，从而获得Escherichia coli SURE pCAN618/H839F。
实施例4 在COS7培养上清液中进行人TGC839蛋白质分泌表达为了证明人TGC839蛋白质是一种分泌性蛋白质，使用COS-7细胞使TGC839FLAG蛋白质表达，并检验是否分泌于培养基中。在实施例3中制备的表达载体，在转化该表达载体的前一天，将COS-7细胞以4×105cell/well密度播种，其DMEM培养基(Gibco-BRL)含有10％的FBS(Hyclone)，在CO2培养箱中培养24小时。用pCAN618/H839F DNA和Effectene(Qiagen)进行转化，24小时后更换另一种培养基，即Opti-MEM培养基(Bibco-BRL)，该培养基含有1ml的0.1mMABSF[4-(2-氨乙基)-苯硫基氟化物(hydrocloride)](和光纯药)和0.05％CHAPS[3-[(3-胆胺丙基)二甲基氨]-1-丙烷磺酸酯](同仁化学)。继续培养36个小时。培养上清转移至eppendorf样品管中，离心，除去漂浮的细胞，再用centricon-10(Amicon)使之浓缩至1/10，添加含有等量DTT的SDS-PAGE样品缓冲液，上样于SDS-PAGE。Westem blotting第一抗体使用了抗FLAG小鼠IgG单克隆抗体(M125mg/ml，Sigma)，第二抗体使用了HRP(辣根过氧化物酶)标记的抗小鼠IgG抗体(1/2000，Amersham)，显色反应采用ECLwestern blotting kit(Amersham)进行。
其检测结果表明，TGC839FLAG蛋白质在细胞内为约34KDa一条带，而在培养上清液中为比在细胞内所看到的带要大而宽(图4)。从该实验结果可得，TGC839蛋白质其分子内有2个N型附加糖链部位，即在该位点上附加了糖链而被分泌到培养基中。
实施例5 通过数据库选择克隆由スミスクラインビ-チヤム(SB)公司提供数据库，从该数据库中选择的克隆应具有蛋白分泌序列特有的氨基酸序列。
也就是说，在把EST碱基序列翻译成氨基酸序列之后，确证5′端存在有Met并且其5′端区域有疏水性的氨基酸序列，进一步选择在其下游有亲水性、疏水性的氨基酸序列，从最前端的Met至10-30的氨基酸中包含分泌性蛋白所必需的信号序列，即EST克隆。将其中的一个定为HGS951123。由SB公司函寄该克隆并定为TGC838。用含有该基因的质粒转化大肠杆菌E.coli，按照操作指南进行培养，制备纯化的质粒，再用限制酶EcoRI和XhoI切割该基因，其切割分别为2个基因片段约1.0kb和约0.4kb，得知该基因片段为约1.4kb。
然后，用T7和T3引物借助于ABI 377 Prism荧光DNA序列分析仪分析了该基因的碱基序列。其碱基序列和氨基酸序列如图5所示。
该基因编码的蛋白质具有246个氨基酸残基，从它的N末端至第25位氨基酸残基(Ala)和第26位氨基酸残基(Gly)之间推测有信号序列被切割。
实施例6 基因表达的确证为了预测在实施例5中得到的基因功能，研究了在人体各种组织和癌细胞株中的基因表达。
首先，用限制酶EcoRI和XhoI将基因切割，断裂片段约为1.0kbDNA，将该DNA片段用作探针，再分别从各种组织、细胞中提取mRNA，然后进行Northern印迹分析。クロンテツク公司提供的人各种组织Northern(MTN)Blot、人的癌细胞株(Human Caner cell line)的mRNA Blot，或者将人的各种癌细胞mRNA转移至尼龙膜上，按照操作指南使它们与同位素标记的DNA探针反应，漂洗尼龙膜后，通过放射自显影图像研究该基因表达的组织和细胞。
所述基因的表达在正常成人的组织中几乎得不到确证，仅在癌细胞、胎儿的脑和肺中确证有该基因的特异性表达(图6)。
实施例7 在动物细胞中通过人TGC838蛋白质构建基因表达载体构建基因表达载体是为了使人TGC838蛋白质在动物细胞中能够进行表达。此时，为了后面所进行的表达产物更容易检测出来，在TGC838蛋白质的C端插入由8个氨基酸构成的FLAG序列(DYKDDDDK)。
以下将带有FLAG序列的TGC838蛋白质特称为TGC838FLAG蛋白质。
首先，设计一种合成DNA，该DNA是以编码TGC838蛋白质的cDNA片段为模板，在临近翻译起始密码子ATG的附近有EcoRI限制酶切点，即[5′GCGCTGAATTCCCACCATGGCAGCAGCCGCCGCTACCAAGATCCTTCTGTGCCTCCCGCTTCT 3′(SEQ ID NO7)]和在TGC838蛋白质的C末端有DYKDDDDK所示氨基酸序列，然后再设计一种合成DNA，该DNA有翻译终止密码子、NotI限制酶切点，用[5′TTGCGGCCGCTCACTTGTCATCGTCGTCCTTGTAGTCGATGCCAGGGAGGATGAAGCAGGGGAGGATGATG 3′(SEQ ID NO8)]进行PCR扩增，获得包含TGC838OFR的DNA片段。用限制酶EcoRI、NotI进行双重消化后，将其插入到pCAN618的EcoRI、NotI位点，获得在TGC838蛋白质的C末端带有FLAG序列的TGC838FLAG的动物细胞表达载体pCAN618/H838F。
通过公知方法将本发明的质粒pCAN618/H838F转染至大肠杆菌(Escherichia coli)XL10-Gold株，从而获得大肠杆菌转化体Escherichia coliXL10-Gold/pCAN618/H838F。
实施例8 在COS-7细胞培养上清液中纯化人TGC839蛋白质在实施例4中证明，人TGC839蛋白质已分泌在COS-7细胞培养上清液中，因此将人TGC839FLAG蛋白质从COS-7细胞培养上清液中可以实施纯化。在实施例3制备的表达载体，在转化该表达载体的前一天，将COS-7细胞以2×106cell/plate密度播种于直径为10cm的培养皿上(共10个)，其DMEM培养基(Gibco-BRL)含有10％的FBS(Hyclone)，在CO2培养箱中培养24小时。用pCAN618/H839F DNA和Effectene(Qiagen)进行转化，24小时后更换另一种培养基，即Opti-MEM培养基(Bibco-BRL)，该培养基含有4ml的0.1mMABSF(和光纯药)和0.05％CHAPS(同仁化学)。继续培养36个小时。10个培养皿(10cm)的培养上清液收集至50ml离心管内，离心，除去漂浮的细胞，再用0.2μm超滤膜过滤。将20倍浓度的TBS添加至滤液中使终浓度为1倍，两次吸附于ANTI FLAG M2-Agarose Affinity Gel(Sigma)，然后用Glycine-HCl缓冲液(pH3.5)洗脱目的蛋白质。通过去盐层析柱(PD-10，Amershampharmacia)更换该洗脱液的缓冲液，为PBS缓冲液，再用Centriplus-10，Centricon-10(Amicon)浓缩至约60μl得到纯化的样品。将纯化的样品上样于SDS-PAGE，进行CBB染色，同时观察到一条约45KDa较宽的带。
实施例9 对纯化的人TGC839FLAG蛋白质N末端氨基酸序列的分析取2μl实施例8获得的纯化样品，于气相氨基酸测序仪LF3000蛋白质测序仪(ベツクマンコ-ルタ-)分析N末端氨基酸序列。其结果是，从N末端起依次检测出下列各种氨基酸残基1.甘氨酸(5.10pmol)、2.精氨酸(6.53pmol)、3.丙氨酸(3.97pmol)、4.天门冬氨酸(6.92pmol)。
从该分析结果得知，人TGC839蛋白质从其人TGC839蛋白质前体的N末端切割了25个氨基酸残基的信号序列，从第26位精氨酸残基开始的该蛋白质以人TGC839成熟蛋白质分泌于培养基中。
实施例10 制备Gly-Arg-Ala-Asp-Pro-His-Ser-Leu-CysTGC-839肽(26-34)把2.27g Boc-Cys(MBzl)-OBzl作为起始物质，用4N-HCl·乙酸乙酯除去Boc基，用当摩尔TEA中和HCl盐，再用HONB/WSCD·HCl缩合Boc-Leu·H2O。在乙酸乙酯中萃取反应液，用0.1N-HCl、5％-碳酸氢钠水溶液洗涤，经无水硫酸钠干燥后除去溶剂，将其残渣通过乙酸乙酯和己烷过滤获得结晶[2.3g(80.3％)]。同样，用所述Boc-Leu-Cys(MBzl)-OBzl作为起始物质，缩合Boc-Ser(Bzl)、Boc-His(Bom)，从而获得Boc-His(Bom)-Ser(Bzl)-Leu-Cys(MBzl)-OBzl(I)1.23g。以Pro-OBzl为起始物质合成Boc-Asp(OcHex)-Pro-OBzl，催化还原该合成物除去苄基酯，从而获得油状Boc-Asp(OcHex)-Pro-OH(II)。以Ala-OBzl为起始物质使Boc-Arg(Tos)、Boc-Gly缩合，得Boc-Gly-Arg(Tos)-Ala-OBzl，将其催化还原用乙腈和乙醚过滤并得到粉末状的Boc-Gly-Arg(Tos)-Ala-OH(III)。用4N-HCl·乙酸乙酯处理(I)0.407g除去Boc基，然后溶于DMF，用62μl TEA中和后，再用(II)0.23g、HOBt 225mg、WSCD·HCl 160mg缩合。在乙酸乙酯中萃取反应液，用5％-碳酸氢钠水溶液洗涤，经无水硫酸钠干燥后除去溶剂，将其残渣通过乙酸乙酯和己烷过滤获得其结晶，从而得到Boc-Asp(OcHex)-Pro-His(Bom)-Ser(Bzl)-Leu-Cys-(MBzl)-OBzl(IV)338mg(63.8％)。用4N-HCl·乙酸乙酯处理(IV)187mg除去Boc基，然后溶于DMF，用22μl TEA中和后，使(III)90g、HOBt 79mg、WSCD·HCl 56mg缩合。除去溶剂，在乙酸乙酯中得到凝胶状的Boc-Gly-Arg(Tos)-Ala-Asp(OcHex)-Pro-His(Bom)-Ser(Bzl)-Leu-Cys-(MBzl)-OBzl228mg。使117.8mg与p-甲酚974mg和无水氟化氢10ml一起，在0℃下，处理60分钟除去所有保护基团。用50％醋酸溶液灌注的肽级分经过SephadexTMG-25柱(2.0×80cm)分级，进一步将主要级分加样于经过灌注LiChroprepTMRP-18的反相层析柱(2.6×8.0cm)上冻干获得30mg白色粉末。
质谱分析(M+H)+955.4(计算值955.4)HPLC洗脱时间10.5分钟。
柱条件柱子Wakosil 5C18T(4.6×100mm)洗脱剂A液(0.1％TFA溶液)B液(含0.1％TFA的乙腈溶液)按A液到B液95/5-45/55的线性密度梯度洗脱(25分钟)。
流速1.0ml/min实施例11 制备含有TGC-839肽(26-34)的免疫原制备所述实施例10中的TGC-839肽(26-34)和牛甲状腺球蛋白(BTG)的复合物作为免疫原。也就是说，使10.5Mg的BTG溶于0.9ml的0.1M磷酸缓冲液(pH6.7)中，再与含有1.2mg的N-(γ-马来酰亚胺丁酰氧基)琥珀亚酰胺(GMBS)的100ml DMG溶液混合，室温下反应30分钟。用含有2mM EDTA的0.1M磷酸缓冲液(pH6.5)平衡的SephadexG-25柱除去多余的GMBS试剂，然后，使带有马来酰亚胺基的BTG7.5mg和溶解在0.2ml DMF中的TGC-839肽(26-34)1.5mg混合，4℃下反应2天。反应后，用生理盐水4℃下透析2天。
实施例12 免疫用所述实施例11的免疫原TGC-839肽(26-34)-BTG复合物同时与福氏完全佐剂对7周龄雌性小鼠BALB/C进行皮下免疫注射。6周后，再用等量的免疫原与福氏不完全佐剂进行追加免疫注射，1周后采血。
实施例13 制备酶标记的抗原制备辣根过氧化物酶(HRP)标记的TGC-839肽(26-34)
使所述实施例10中的TGC-839肽(26-34)与HRP(用于酶免疫测定法，ベ-リンガ-マンハイム)交联，作为酶免疫测定法(EIA)的标记物。也就是说，将11.6mg的HRP溶解于0.95ml的0.1M磷酸缓冲液(pH6.7)中，再与含有1.2mgGMBS的DMF溶液50μl混合，室温反应30分钟，然后，用0.1M磷酸缓冲液(pH6.5)平衡SephadexG-25柱并上样于该柱进行分级。如上所述带有马来酰亚胺基的HRP2.7mg与实施例1制作的0.38mg TGC-839肽(26-34)混合，4℃下反应1天。反应结束后，用0.1M磷酸缓冲液(pH6.5)平衡超凝胶AcA54(フアルマシア)柱并上样于该柱进行分级，得到标记的HRP TGC-839肽(26-34)。
实施例14 对小鼠免疫TGC839肽(26-34)进而测定抗血清中的抗体效价小鼠抗血清中抗体效价的测定按如下方法实施。为了制作结合抗小鼠免疫球蛋白抗体的微量滴定板，首先将含有100μg/ml的山羊抗小鼠免疫球蛋白抗体(IgG片段，カツペル)的0.1M碳酸缓冲液(pH9.6)分别注入96孔微量滴定板上，每孔为100μl，4℃下放置24小时。然后，将滴定板用磷酸缓冲生理盐水(PBS、pH7.4)漂洗，为了封闭孔内其它结合部位再各自分注300μlPBS(pH7.2)该PBS包含25％封闭剂(ブロツクエ-ス)(雪印乳业)和0.1％NaN3，至少在4℃下反应24小时。
用缓冲液-EC
稀释小鼠抗血清，取稀释的小鼠抗血清100μl添加于上述结合抗小鼠免疫球蛋白抗体微量滴定板上的每个孔，使之在4℃下反应16个小时。进而用PBS(pH7.4)洗涤该滴定板，再用缓冲液-C[1％BSA、0.4M NaCl、以及含有2mM EDTA的0.02M磷酸缓冲液(Ph7.0)]稀释所述实施例13所制备的HRP标记的TGC839肽(26-34)，稀释倍数为120倍，添加该稀释液100μl，室温下使之反应7个小时。然后用PBS(pH7.4)洗涤该滴定板，添加100μl TMB微孔过氧化物酶底物系统(KIRKEGAARD&PERRY LAB.フナコシ药品经销)室温反应10分钟，由此测定固相载体上的酶活性。添加1M磷酸100μl终止反应，用滴定板リ-ダ-(MTP-120，コロナ)测定450nm的吸光度(Abs.450)。其结果如图7所示。对8只经过免疫的小鼠进行测定，结果表示TGC839肽(26-34)抗体效价升高。
实施例15 单克隆TGC839肽(26-34)抗体的制备对显示较高抗体效价的小鼠No.3及No.8进行240μg免疫原TGC839肽(26-34)-BTG静脉注射，从而加强免疫。加强免疫后4天取小鼠脾，用不锈钢网筛压迫过滤，使之悬浮于イ-グルズ极限培养基(MEM)中，获得脾细胞悬浮液。作为融合的细胞，选用来自BALB/C小鼠骨髓瘤细胞P3-X63.Ag8.U1(P3U1)[Current topics in microbiology and immunology，81，1(1978)]。细胞融合依据[Nature，256，495(1975)]最早提出的方法实施。即用不含血清的MEM各自3次洗涤脾细胞及P3U1，以6.6∶1的比率使脾细胞与P3U1混合，以750转速离心15分钟使细胞沉淀。弃去上清液，轻轻去除沉淀，加0.3ml45％聚乙二醇(PEG)6000(コツホライト公司产品)，37℃温水浴静止7分钟进行细胞融合。对融合后的细胞逐渐添加MEM，MEM达到15ml时，再以750转速离心15分钟弃去上清液。使该细胞沉淀物悬浮在含有10％胎牛血清的GIT培养基(和光纯药)(GIT-10％FCS)中使P3U1每1ml有2×105个，用24孔多孔板(リンブロ)每孔各1ml共播种168个孔，播种后，将细胞在37℃下在含有5％CO2的培养箱培养。24小时后，在每个孔内各自添加1ml的含有HAT(次黄嘌呤核苷1×10-4M、氨基蝶呤4×10-7M、胸腺嘧啶核苷6×10-3M)的GIT-10％FCS培养基(HAT培养基)，开始HAT选择培养。HAT选择培养在开始融合后4，7天，弃去1ml原液，然后换用1ml的HAT培养基继续培养。细胞融合后第9天观察到杂交瘤细胞的增殖，并取其上清液。
上清液中抗体效价按照改良实施例14描述的方法进行实施。也就是说，用培养上清液100μl及缓冲液C稀释200倍的HRP标记的TGC839肽(26-34)，取该标记物100μl添加于结合抗小鼠免疫球蛋白抗体的微量滴定板上的每个孔内，使之在4℃下反应过夜。用PBS洗涤该滴定板，然后，按照实施例14描述的方法测定固相载体上的酶活性。其结果为，从168个孔中选择有抗体效价的60个孔，冻存杂交瘤细胞。进一步对9个孔内的杂交瘤细胞，即No.39、No.53、No.61、No.76、No.85、No.112、No.128、No.139、及No.151按照稀释法进行克隆。克隆时，BALA/C小鼠胸腺细胞作为饲养细胞并添加于孔中使每孔细胞为5×105。克隆后，按照同样方法测定上清液中的抗体效价。阳性克隆从No.39起在20个孔中检测出6个孔；No.53在20个孔中检测出2个孔；No.6l在20个孔中检测出5个孔；No.76在20个孔中检测出9个孔；No.85在20个孔中检测出8个孔；No.112在40个孔中检测出3个孔；No.128在50个孔中检测出13个孔；No.139在30个孔中检测出2个孔；及No.151在20个孔中检测出4个孔。
在这些克隆中选择No.39-35、No.53-16、No.61-2、No.76-12、No.85-16、No.112-3、No.128-18、No.139-26、No.151-2作为产生单克隆TGC839肽(26-34)抗体的杂交瘤细胞。
实施例16 分析单克隆抗体的类型及其亚类型按照实施例14描述的方法，制作抗家兔IgG抗体结合微孔滴定板。也就是说，将含有100μg/ml山羊抗家兔免疫球蛋白抗体(IgG片段，カツペル)的0.1M碳酸缓冲液(pH9.6)分别注入100μl至96孔微量滴定板的每个小孔内，4℃下放置24小时。然后，用磷酸缓冲生理盐水(PBS、pH7.4)漂洗滴定板，为了封闭孔内其它结合部位再各自注入300μlPBS(pH7.2)该PBS包含25％封闭剂(ブロツクエ-ス)(雪印乳业)和0.1％NaN3，至少在4℃下处理24小时。在抗家兔IgG抗体结合微孔滴定板中，添加100μl的被包含在缓冲液-EC及バイオラツド公司产品同种型试剂盒所含有的亚型特异抗体，在4℃下反应1天。用PBS pH7.4洗涤滴定板之后，添加上述杂交瘤细胞培养上清液，在4℃下反应1天。用PBS pH7.4洗涤滴定板之后，添加100μl HRP标记的TGC-839肽(26-34)，反应6个小时，该标记物是用所述实施例13中缓冲液C稀释至400倍而制成的。用PBS pH7.4洗涤滴定板之后，按照实施例14描述的方法测定固相载体上的酶活性。其结果是，这些杂交瘤细胞所产生的单克隆抗体的类型及亚类型分别为No.39-35(IgG3)、No.53-16(IgG3)、No.61-2(IgG2、λ)、No.76-12(IgG3)、No.85-16(IgG2b、κ)、No.112-3(IgG1)、No.128-18(IgG1、κ)、No.139-26(IgG1)、No.151-2(IgG2a)。
实施例17 竞争法-EIA根据竞争法-EIA研究所选择的每个单克隆抗TGC839肽(26-34)抗体与TGC839肽(26-34)的竞争性反应。首先，按照实施例14描述的方法测定每个包含单克隆抗体的培养上清液的抗体效价，分析用于竞争法-EIA的抗体浓度。然后，在抗小鼠免疫球蛋白抗体结合微量滴定板中，对所分析的浓度加入50μl用缓冲液-C稀释的抗体溶液、逐步稀释的TGC839肽(26-34)缓冲液-C 50μl，还有50μl HRP标记的TGC839肽(26-34)(用缓冲液-C稀释1500倍)，在4℃下反应1天。反应结束后，用PBS pH7.4洗涤滴定板，然后按照实施例14描述的方法测定固相上的酶活性。如图8所示。由于40ng/ml的TGC839肽(26-34)的缘故而被抑制了33-92％，由此可知所述这些单克隆抗体与HRP标记的TGC839肽(26-34)之间的结合是由于所述抗体与TGC839肽(26-34)反应的结果。尤其是，No.128-18及No.112-3其B/B050％结合抑制值分别为2ng/ml及7ng/ml，显示了高亲和性。另外，B/B0表示，当TGC839肽(26-34)存在时分别与HRP标记的TGC839肽(26-34)抗体的结合量与当TGC839肽(26-34)不存在时分别与HRP标记的TGC839肽(26-34)抗体的结合量之比。
实施例18 由杂交瘤细胞引起小鼠腹水本发明进行了杂交瘤细胞No.128-18及No.112-3引起小鼠腹水的实验。首先，将矿物油0.5ml注入小鼠(BALA/C、雌性)腹腔内，每只小鼠腹腔注射1-3×106个所述杂交瘤细胞，接种后6-20天采集含有抗体的腹水。单克隆抗体由收集到的腹水通过蛋白A柱进行纯化。也就是说，将腹水约25ml用等量的结合缓冲液(3.5M NaCl、含有0.05％NaN3的1.5M甘氨酸pH9.0)稀释，再上样于用结合缓冲液平衡的重组体-蛋白A-琼脂糖(Repligen)层析柱上，用分离缓冲液(含有0.05％NaN3的0.1M枸橼酸缓冲液pH3.0)洗脱特异抗体。于4℃下，用洗脱液对PBS(pH7.4)进行透析两天。用0.22μm滤膜过滤(ミリポア公司产品)除菌，并贮存于4℃或-80℃下。把所得单克隆抗体命名为128-18抗体、112-3抗体。
实施例19 制备能识别TGC838部分肽的家兔抗血清与实施例10方法相同，合成一段由25个氨基酸残基组成的肽，它相当于TGC838蛋白Tyr166-Cys190(将翻译启始密码子的Met作为第一位)。对于8.2mg的肽要使用N-(6-Maleimidocaproyloxy)Succinimide及KeyhokeLympet Hemocyanin 19.7mg，在含有8M尿素和0.9％NaCl的磷酸缓冲液(20mM pH7.4)中，反应15个小时(室温)制作结合物。将该结合物分批与佐剂混合并注射于家兔皮下，经过免疫之后，采血，离心血液，以除去血细胞成分，获得抗血清。
实施例20 建立TGC838的表达载体建立基因表达载体是为了使人TGC838蛋白质在动物细胞中能够进行表达。首先，设计一种合成DNA，该DNA是以编码TGC838蛋白质的cDNA片段为模板，在翻译起始密码子的附近有Eco RI限制酶识别位点，即[5′GCGCTGAATTCCCACCATGGCAGCAGCCGCCGCTACCAAGATCCTTCTGTGCCTCCCGCTTCT 3′(SEQ ID NO7)]和另外一种合成DNA，该DNA在终止密码子之后有Not I识别位点，即[5′TTGCGGCCGCTCAGATGCCAGGGAGGATGAAGCAGGGGAGGATGATG 3’′(SEQ ID No9)]，用这两种DNA进行PCR扩增，得到包含TGC838的ORF片段。用限制酶Eco RI和Not I切割所得DNA片段，并将其插入pCAN618的Eco RI和Not I位点上，以得到在动物细胞内能够表达TGC838蛋白质的pCAN618/H838载体。
实施例21 在COS7细胞内表达TGc838蛋白质及TGC839蛋白质将COS-7细胞以4×105cell/well密度播种在6孔平板之上进行培养，其DMEM培养基(GibcoBRL)含有10％的FBS(胎牛血清)，培养时间为24小时。用LipofectAMINE(GibcoBRL)将实施例20、实施例3或实施例7所得的表达载体pCAN618/H838 DNA、pCAN618/H838F DNA或pCAN618/H839FDNA转导至所述细胞中，继续培养18个小时。然后，将培养基更换为含有0.05％CHAPS的Opti-MEM培养基(Bibco-BRL)，培养24小时，离心以除去漂浮的细胞，回收培养上清液。然后直接浓缩或者经过超滤作用(Centricon-10，Amicon)检测其表达产物。
实施例22 在CHO-K1细胞内表达TGC838蛋白质采用磷酸钙共沉淀技术将TGC838蛋白质表达载体转染至CHO-K1细胞内。首先在包含10％FBS的Ham′s F12培养基(Bibco-BRL)的组织培养皿(10cm)中培养1×105个CHO-K1细胞24小时。用CellPhect TransformationKit(Pharmacia)使在实施例20中得到的pCAN618/H838 DNA与磷酸钙一起沉淀，添加于所述的CHO-K1细胞内。培养12个小时后，用5ml的Ham′s F12培养基(不含FBS)洗涤2次，加3ml甘油溶液(15％甘油、150mM NaCl、20mMHEPES、pH7.4)静止3分钟。再用5ml的Ham′s F12培养基(不含FBS)洗涤1次，再添加含有10％FBS的Ham′s F12培养基培养36个小时。将旧培养基更换为含有500μg/ml的Geneticin(和光纯药)以及10％FBS的Ham′s F12培养基，培养时间为24个小时。然后，通过有限稀释从单个细胞中制备能够表达的细胞克隆，为此，用各种稀释率在96孔含有500μg/ml的Geneticin(和光纯药)以及10％FBS的Ham′s F12培养基的平板上，进行细胞培养。进而获得来自单个细胞并能表达TGC838蛋白质的CHO-K1细胞株CHO-K1/TGC838N-4。将对数期生长的细胞培养基更新为含有0.05％CHAPS的Opti-MEM培养基，经过24小时培养后，回收CHO-K1/TGC838N-4细胞株培养的上清液。离心，除去悬浮的细胞并检测其表达产物。
实施例23 在CHO-K1细胞内表达TGC839蛋白质采用磷酸钙共沉淀技术将TGC839蛋白质表达载体转染至CHO-K1细胞内的方法与实施例22方法相同。把在实施例3中得到的pCAN618/H839FDNA转染至在10cm组织培养皿中培养的CHO-K1细胞内。用Geneticin进行筛选。经过筛选发育的细胞通过菌落筛选表达细胞，再用有限稀释方法从单个细胞中制备能够表达TGC839蛋白质的CHO-K1细胞株CHO-K1/618/839F6-3。回收CHO-K1/618/839F6-3培养上清液的方法与实施例22的方法相同。
实施例24 通过Western Blot分析TGC838蛋白质及TGC839蛋白质把含有2-巯基乙醇的SDS凝胶加样缓冲液加到实施例21-23所得的培养上清液(转染为表达载体pCAN618/H838 DNA或pCAN618/H838F DNA或pCAN618/H839F DNA的COS7细胞或CHO-K1细胞的上清液)中裂解细胞，用Peptide-PAGE(TEFCO)进行电泳，从凝胶上直接把蛋白质电转移至聚偏二氟乙烯(PVDF)膜上(Amersham)。作为第一抗体使用了实施例19所得家兔抗血清(稀释倍数为2000倍)、或实施例12所得小鼠抗血清(稀释倍数为50000倍)、或实施例18所得小鼠IgG(2μg/ml)、或实施例19所得的家兔抗FLAG小鼠IgG(10μg/ml，Sigma)。作为第二抗体来说，使用了HRP(辣根过氧化物酶)标记的抗小鼠IgG抗体(稀释倍数为2000倍，Amersham)、或HRP标记的抗家兔IgG抗体(稀释倍数为2000倍，Amersham)。显色反应采用ECLplus Western Blot Detection System(Amersham)进行。从显色结果可知，TGC838蛋白质及TGC839蛋白质分泌在培养上清液之中(图9)。另外，在转染pCAN618/H838 DNA或pCAN618/H838F DNA的COS7细胞上清液中，从电泳上来看，分泌形成的产物，它们的迁移率是相同的。这些分泌产物用抗FLAG肽抗体无法检测，进一步由此可知所分泌的TGC838蛋白质其C末端已被处理(图10及图11)。
实施例25 通过各自TGC838蛋白质及TGC839蛋白质抗体进行的免疫沉淀用TBS-T/BSA(25mM Tris-HCl(pH7.2)、150mM NaCl、0.05％Tween20、0.01％BSA)处理10μl的蛋白G-Sepharose(Pharmacia)，处理时间为30分钟。然后添加用TBS-T/BSA稀释的10μg小鼠IgG或5μl的家兔抗血清于处理过的蛋白G-Sepharose，使之反应2个小时。用TBS-T/BSA洗涤3次，再添加实施例21所得培养上清液(把转染表达载体pCAN618/H838F DNA或pCAN618/H839F DNA的COS7细胞的上清液通过超滤浓缩形成)，使之反应2个小时。用TBS-T/BSA洗涤4次之后，加入SDS凝胶加样缓冲液，在90℃下，反应2分钟与蛋白质结合并洗脱所述蛋白质。同时加入含有2-Mercaptoethanol等量的SDS凝胶加样缓冲液，用Peptide-PAGE进行电泳，从凝胶上直接把蛋白质电转移至聚偏二氟乙烯(PVDF)膜上(Amersham)，进行Western Blot分析(图12)。作为第一抗体使用了小鼠抗血清(No.8小鼠，如实施例14所述)，作为第二抗体来说，使用了HRP标记的抗小鼠IgG抗体(稀释倍数为2000倍)。显色反应采用ECLplus Western Blot DetectionSystem(Amersham)来进行。
实施例26 确证TGC838蛋白质及TGC839蛋白质上是否带有糖链为了确证在TGC838蛋白质及TGC839蛋白质的氨基酸序列上所推测的2个位置即N型糖链附加部位上是否带有糖链，采用酶处理法以除去这些糖链。通过超滤作用使实施例21所得COS7细胞上清液浓缩10倍，再用N-糖苷酶F Deglycosylation Kit(Boehringer)除去糖链。所得反应产物经过超滤浓缩后，用实施例24方法对其蛋白质进行Western Blot分析。分析结果证实，TGC838蛋白质及TGC839蛋白质的分子量均减少了10KDa，这些蛋白质明显地带有N型糖链(图13)。
实施例27 人软骨肉瘤细胞株(SW1353)的培养和培养上清液的回收SW1353细胞用含有10％FBS的L15培养基(ICN Biochemicals)培养至对数生长期的后期为止，取其培养上清液。离心除去悬浮的细胞，研究上清液中的表达产物。
实施例28 用抗TGC839FLAG单克隆抗体设计EIA通过以下方法制备TGC839FLAG。也就是说，用中空纤维技术将1000ml培养上清液浓缩至20ml，该上清液为实施例23中所得产生TGC839FLAG的细胞CHO-K1/618-839 F 6-3。浓缩液中加入1/10体积的含有1.5M NaCl的500mM MOPS缓冲液(pH7.5)，所得溶液提供于经过含有150mM NaCl的500mM MOPS缓冲液(pH7.5)平衡的Anti-FLAG M2 AffinityGEL(SIGMA)5ml，使TGC839FLAG吸附。用含有150mM NaCl的50mMMOPS缓冲液(pH7.5)充分洗涤之后，再用100mM Glycine-HCl缓冲液(pH3.5)洗脱TGC839FLAG。该洗脱液进一步用1M Tris-HCl缓冲液(pH9.0)中和，用Centricon30(Amicon)浓缩至1ml。通过BCA蛋白质测定试剂(PIERCE)检测所得纯化样品蛋白质的浓度。从而从1000ml的培养上清液中得到约500μg的TGC839FLAG。
产生抗TGC839FLAG单克隆抗体细胞的制备主要根据实施例15进行实施。也就是说，通过上述方法将纯化的TGC839FLAG对小鼠进行免疫，经免疫之后，分离该小鼠的脾细胞。将该细胞与小鼠骨髓瘤细胞P3X63Ag8U.1融合杂交形成杂交瘤。然后，测定其TGC839FLAG抗体效价，从具有抗体效价的克隆中，筛选产生单克隆抗体No.839-01的杂交瘤839-01及产生单免隆抗体No.839-02的杂交瘤839-02作为抗TGC839FLAG单克隆抗体的杂交瘤。
通过以下方法制备抗TGC839FLAG单克隆抗体的EIA系。也就是说，将1/8英寸的聚苯乙烯珠(イムノケミカル公司商品)浸泡在含有抗TGC839FLAG单克隆抗体No.839-01(20μg/ml)的50mM MOPS缓冲液(pH7.5)中，4℃下静止过夜，然后将该珠子用含有1％BSA的50mM MOPS缓冲液(pH7.5)洗涤3次。再将珠子浸泡于含有1％BSA的50mM MOPS缓冲液(pH7.5)中，4℃下静止过夜，进而制备了抗TGC839FLAG单克隆抗体珠子。另外，抗TGC839FLAG单克隆抗体No.839-02按照常规方法(石川英治编，《酶标记法》.学会出版中心(1991)p62所述方法)标记了过氧化物酶(POD、Roche)。
用上述备好的制剂测定FLAG。用全自动化学发光酶免疫测定装置-スフイアライト180(Olympus光学工业)。也就是说，将1个所述抗TGC839FLAG单克隆抗体珠子置于该测定装置内，并与已调配成各种浓度的标准溶液50μl的TGC839FLAG和含有2％BSA的50mM MOPS缓冲液(pH7.5)90μl一起在37℃下，反应7分钟，然后取出珠子用生理盐水冲洗。使该珠子与POD标记抗TGC839FLA单克隆抗体溶液140μl一起在37℃下，反应7分钟，所述抗体溶液用含有2％BSA的50mM MOPS缓冲液(pH6.5)稀释，稀释浓度为5μg抗体/ml。反应结束后，继续用生理盐水洗涤珠子，再与含有5mM氨基苯二酰肼和0.02％过氧化氢50mM Tris-HCl缓冲液(pH8.5)140μl反应，由此测定发光量(cps)(表1)。所得标准曲线如图14所示。
表1
接着，用建立的EIA系在各种细胞株的培养上清液中，测定健康人和癌症患者血浆中的TGC838之量。CHO-K1/TGC838N-4及COS7/TGC838细胞培养上清液的提取方法如下实施。也就是说，把实施例22得到的CHO-K1/TGC838N-4细胞接种在6孔板上培养长满之后，将培养液换为含有0.05％CHAPS的Opti-MEM培养基(ライフテツクオリエンタル)，培养2天。另外，一种COS7/TGC838细胞培养的上清液根据实施例21的方法提取。SW1353细胞的培养上清液用含有10％胎牛血清的MEM培养基经过汇合生长之后而进行提取。实际上，已经对健康人(男(M)5例、女(F)3例)<p>表2
<p>表4
实施例29 使用FACS对TGC839蛋白质结合细胞的鉴定(1)红细胞的制备通过比重密度梯度离心法可获取人外周血的红细胞。用等量的PBS稀释含有40ml的0.1％EDTA 2钠盐的人外周血。将3.5ml的分层液Ficoll-Paque PLUS[Amersham Pharmacia Biotech AB公司(Uppsala，Sweden)17-1440-02]分别装入15ml离心管中，在每个离心管的上部加一层用PBS稀释的血液7ml。经400×g离心30分后，分离回收淋巴细胞和单核细胞组成的红细胞层。在回收的红细胞中加入3倍体积的PBS，离心，回收洗涤的细胞，进一步用PBS洗涤3次，回收红细胞。
(2)对所得红细胞进行染色分别在2×106个细胞中加入100μl含有TGC839-FLAG蛋白质10ng/μl的洗涤液(PBS/0.1％NaN3/1％FBS)或加入只有100μl洗涤液(阴性对照)，使之悬浮，4℃下反应1个小时。反应结束后，离心除去反应液，用500μl洗涤液2次洗涤反应后的红细胞。再次除去反应液，加入100μl含有10ng/μl抗FLAG M2抗体[Sigma(MO，USA)F-3165]的洗涤液使之悬浮，4℃下反应40分钟，用500μl洗涤液洗涤2次。然后加入100μl含有10ng/μlFITC标记-山羊抗小鼠免疫球蛋白抗体[PharMingen(CA，USA)12064D]的洗涤液使之悬浮，暗处4℃下反应40分钟，用500μl洗涤液洗涤2次。再用100μl洗涤液悬浮，然后，加入20μl的PE(Phycoerythrin)标记-抗人CD 56抗体(B159)溶液[PharMingen(CA，USA)31665X]，暗处室温下反应25分钟，用1000μl洗涤液洗涤2次。进一步用500μl洗涤液悬浮，用细胞清除仪除去细胞块等杂质从而供于FACS。
(3)FACS分析FACS采用BECTON DICKINSON公司(NJ，USA)的FACScan，分析软件使用BECTON DICKINSON公司的CellQuest version1.2.2。对每个样品中的1×105个细胞进行分析获得测定数据。
对所有细胞进行了测定，其结果是，X轴为FITC强度，Y轴为细胞数。当分析与TGC839-FLAG蛋白结合的细胞数时，在添加有TGC839-FLAG蛋白的样品里观察到很多被FITC染色的细胞，该染色细胞要比没有添加TGC839-FLAG蛋白的阴性对照组多，由此可以确证与TGC839-FLAG蛋白结合的淋巴细胞的存在(图17)。该分析结果进一步显示，在淋巴细胞中还包括与TGC83蛋白结合的细胞。
另外，关于那些测定的细胞，研究了细胞分布情况，其中X轴为FITC强度，Y轴为SSC(单相散射光)。分拣允许结合有TGC839-FLAG蛋白的细胞群通过(ゲ一トをかけた)(R1)。然后研究R1细胞群的分布，其中X轴为FITC强度，Y轴为PE强度。当把结合有TGC839-FLAG并进行CD56表达的细胞群(R2)和非表达CD56细胞群(R3)分开时，结合有TGC839-FLAG蛋白的所有细胞都显示了CD56的表达现象，并且确证了在NK细胞中TGC839受体能够进行表达(图18及表5)。由此可以提示我们，在NK细胞中TGC838受体也能够进行表达。
表5
实施例30 TGC839蛋白质对NK细胞的细胞损伤性的影响通过Ficoll-Paque(Pharmacia)比重密度梯度离心法分离新鲜的人外周血中的白细胞，用MACS及NK cell Isolation kit(两者均为，Miltenyi Biotec)获得NK细胞。将获取的细胞放在含有10％FBS及IL15(50/ng/ml，R&DSystems)的RPMI1640培养基中培养24小时。把细胞洗涤后，放在含有10％FBS及IL12(1/ng/ml，R&D Systems)及TGC839FLAG(0-500ng/ml)的RPMI1640培养基(GibcoBRL)中培养16小时，再一次洗涤细胞，然后，研究效应细胞的细胞损伤性。另外，靶细胞是用51Cr标记的人白血病细胞株K562(ATCC)。用RPMI1640培养基洗涤5×106细胞K562后，加100μCi的[51Cr]Na2CrO4(NEN)于37℃标记1小时。细胞洗涤后，放在含有10％PBS的RPMI1640培养基中培养1小时。洗涤细胞，以每孔为104个细胞接种于96孔平板上。用1-12倍的比率将所述的效应细胞加入该平板上培养7个小时。细胞的损伤性通过γ计数器(Beckman)测定培养上清液中的游离放射活性，用下式求得(图19)。 实施例31 TGC839蛋白质对NK细胞及K562细胞的细胞增殖影响用实施例1的方法获取人外周血的NK细胞。将获取的细胞放在含有10％FBS及IL15(50/ng/ml)的RPMI1640培养基中培养24小时后，洗涤细胞。在96孔平板上接种所述NK细胞(105/Well)及K562细胞(2×104/Well)，并放在含有10％FBS及IL12(1/ng/ml)和TGC839FLAG(0-500ng/ml)的RPMI1640培养基中培养40个小时。最后的12个小时用BrdU进行标记，利用CellProliferation ELISA(Boehringer)研究细胞增殖情况。在450nm(A450)下，测定其吸光度(图21，图21)。
离心除去细胞之后，用Quantokine IFN-γImmunoassay(R & D Systems)测定培养上清液中的IFN-γ值(图22)。
工业利用例如，本发明蛋白质等具有细胞增殖活性等的特性，因此，它可用于病变组织摘除后的组织再生药物等。本发明蛋白质还可用作筛选能促进或抑制本发明蛋白质活性的化合物或其盐的试剂之用。通过筛选而得的抑制剂可望作为预防或治疗各种癌症(如，子宫体癌、子宫内膜肿瘤、乳腺癌、大肠癌、前列腺癌、肺癌、肾癌、成神经细胞瘤、膀胱癌、黑色素肿瘤等)的药物。
本发明蛋白质的抗体可以特异地识别本发明蛋白质，因此，它可用于定量本发明的待测溶液中的蛋白质，还可用作诊断各种所述癌病的药物。另外，本发明蛋白质人型抗体还可用作预防或治疗各种所述癌病的药物。
序列表<110>武田药品工业株式会社<120>新蛋白质及其应用<130>B00033<150>JP 11-068302<151>1999-03-15<150>JP 11-213635<151>1999-07-28<150>JP 11-222200<151>1999-08-05<160>9<210>1<211>252<212>PRT<213>人<400>1Met Ala Ala Ala Ala Ala Thr Lys Ile Leu Leu Cys Leu Pro Leu Leu1 5 10 15Leu Leu Leu Ser Gly Trp Ser Arg Ala Gly Arg Ala Asp Pro His Ser20 25 30Leu Cys Tyr Asp Ile Thr Val Ile Pro Lys Phe Arg Pro Gly Pro Arg35 40 45Trp Cys Ala Val Gln Gly Gln Val Asp Glu Lys Thr Phe Leu His Tyr50 55 60Asp Cys Gly Asn Lys Thr Val Thr Pro Val Ser Pro Leu Gly Lys Lys65 70 75 80Leu Asn Val Thr Thr Ala Trp Lys Ala Gln Asn Pro Val Leu Arg Glu85 90 95Val Val Asp Ile Leu Thr Glu Gln Leu Arg Asp Ile Gln Leu Glu Asn100 105 110Tyr Thr Pro Lys Glu Pro Leu Thr Leu Gln Ala Arg Met Ser Cys Glu115 120 125Gln Lys Ala Glu Gly His Ser Ser Gly Ser Trp Gln Phe Ser Phe Asp130 135 140Gly Gln Ile Phe Leu Leu Phe Asp Ser Glu Lys Arg Met Trp Thr Thr145 150 155 160Val His Pro Gly Ala Arg Lys Met Lys Glu Lys Trp Glu Asn Asp Lys165 170 175Val Val Ala Met Ser Phe His Tyr Phe Ser Met Gly Asp Cys Ile Gly180 185 190Trp Leu Glu Asp Phe Leu Met Gly Met Asp Ser Thr Leu Glu Pro Ser195 200 205Ala Gly Ala Pro Leu Ala Met Ser Ser Gly Thr Thr Gln Leu Arg Ala210 215 220Thr Ala Thr Pro Ser Ser Phe Ala Ala Ser Ser Ser Ser Ser Pro Ala225 230 235 240Ser Ser Ser Leu Ala Ser Glu Glu Ser Pro Leu Glu245 250 252<210>2<211>756<212>DNA<213>人<400>2ATGGCAGCAG CCGCCGCTAC CAAGATCCTT CTGTGCCTCC CGCTTCTGCT CCTGCTGTCC 60GGCTGGTCCC GGGCTGGGCG AGCCGACCCT CACTCTCTTT GCTATGACAT CACCGTCATC120CCTAAGTTCA GACCTGGACC ACGGTGGTGT GCGGTTCAAG GCCAGGTGGA TGAAAAGACT180TTTCTTCACT ATGACTGTGG CAACAAGACA GTCACACCTG TCAGTCCCCT GGGGAAGAAA240CTAAATGTCA CAACGGCCTG GAAAGCACAG AACCCAGTAC TGAGAGAGGT GGTGGACATA300CTTACAGAGC AACTGCGTGA CATTCAGCTG GAGAATTACA CACCCAAGGA ACCCCTCACC360CTGCAGGCCA GGATGTCTTG TGAGCAGAAA GCTGAAGGAC ACAGCAGTGG ATCTTGGCAG420TTCAGTTTCG ATGGGCAGAT CTTCCTCCTC TTTGACTCAG AGAAGAGAAT GTGGACAACG480GTTCATCCTG GAGCCAGAAA GATGAAAGAA AAGTGGGAGA ATGACAAGGT TGTGGCCATG540TCCTTCCATT ACTTCTCAAT GGGAGACTGT ATAGGATGGC TTGAGGACTT CTTGATGGGC600ATGGACAGCA CCCTGGAGCC AAGTGCAGGA GCACCACTCG CCATGTCCTC AGGCACAACC660CAACTCAGGG CCACAGCCAC CCCCTCATCC TTTGCTGCCT CCTCATCATC CTCCCCTGCT720TCATCCTCCC TGGCATCTGA GGAGAGTCCT TTAGAG 756<210>3<211>40<212>DNA<213>人工序列<220><223><400>3GCGCTCGAAT TCCACCATGG CAGCAGCCGC CGCTACCAAG 40<210>4<211>76<212>DNA<213>人工序列<220><223><400>4GCGGCCGCTC ACTTGTCATC GTCGTCCTTG TAGTCCTCTA AAGGACTCTC CTCAGATGCC60AGGGAGGATG AAGCAG76<210>5<211>246<212>PRT<213>人<400>5Met Ala Ala Ala Ala Ala Thr Lys Ile Leu Leu Cys Leu Pro Leu Leu1 5 10 15Leu Leu Leu Ser Gly Trp Ser Arg Ala Gly Arg Ala Asp Pro His Ser20 25 30Leu Cys Tyr Asp Ile Thr Val Ile Pro Lys Phe Arg Pro Gly Pro Arg35 40 45Trp Cys Ala Val Gln Gly Gln Val Asp Glu Lys Thr Phe Leu His Tyr50 55 60Asp Cys Gly Asn Lys Thr Val Thr Pro Val Ser Pro Leu Gly Lys Lys65 70 75 80Leu Asn Val Thr Thr Ala Trp Lys Ala Gln Asn Pro Val Leu Arg Glu85 90 95Val Val Asp Ile Leu Thr Glu Gln Leu Arg Asp Ile Gln Leu Glu Asn100 105 110Tyr Thr Pro Lys Glu Pro Leu Thr Leu Gln Ala Arg Met Ser Cys Glu115 120 125Gln Lys Ala Glu Gly His Ser Ser Gly Ser Trp Gln Phe Ser Phe Asp130 135 140Gly Gln Ile Phe Leu Leu Phe Asp Ser Glu Lys Arg Met Trp Thr Thr145 150 155 160Val His Pro Gly Ala Arg Lys Met Lys Glu Lys Trp Glu Asn Asp Lys165 170 175Val Val Ala Met Ser Phe His Tyr Phe Ser Met Gly Asp Cys Ile Gly180 185 190Trp Leu Glu Asp Phe Leu Met Gly Met Asp Ser Thr Leu Glu Pro Ser195 200 205Ala Gly Ala Pro Leu Ala Met Ser Ser Gly Thr Thr Gln Leu Arg Ala
210 215 220Thr Ala Thr Thr Leu Ile Leu Cys Cys Leu Leu Ile Ile Leu Pro Cys225 230 235 240Phe Ile Leu Pro Gly Ile245 246<210>6<211>738<212>DNA<213>人<400>6ATGGCAGCAG CCGCCGCTAC CAAGATCCTT CTGTGCCTCC CGCTTCTGCT CCTGCTGTCC 60GGCTGGTCCC GGGCTGGGCG AGCCGACCCT CACTCTCTTT GCTATGACAT CACCGTCATC 120CCTAAGTTCA GACCTGGACC ACGGTGGTGT GCGGTTCAAG GCCAGGTGGA TGAAAAGACT 180TTTCTTCACT ATGACTGTGG CAACAAGACA GTCACACCTG TCAGTCCCCT GGGGAAGAAA 240CTAAATGTCA CAACGGCCTG GAAAGCACAG AACCCAGTAC TGAGAGAGGT GGTGGACATA 300CTTACAGAGC AACTGCGTGA CATTCAGCTG GAGAATTACA CACCCAAGGA ACCCCTCACC 360CTGCAGGCCA GGATGTCTTG TGAGCAGAAA GCTGAAGGAC ACAGCAGTGG ATCTTGGCAG 420TTCAGTTTCG ATGGGCAGAT CTTCCTCCTC TTTGACTCAG AGAAGAGAAT GTGGACAACG 480GTTCATCCTG GAGCCAGAAA GATGAAAGAA AAGTGGGAGA ATGACAAGGT TGTGGCCATG 540TCCTTCCATT ACTTCTCAAT GGGAGACTGT ATAGGATGGC TTGAGGACTT CTTGATGGGC 600ATGGACAGCA CCCTGGAGCC AAGTGCAGGA GCACCACTCG CCATGTCCTC AGGCACAACC 660CAACTCAGGG CCACAGCCAC CACCCTCATC CTTTGCTGCC TCCTCATCAT CCTCCCCTGC 720TTCATCCTCC CTGGCATC738<210>7<211>63<212>DNA<213>人工序列<220><223><400>7GCGCTGAATT CCCACCATGG CAGCAGCCGC CGCTACCAAG ATCCTTCTGT GCCTCCCGCT 60TCT 63<210>8<211>71<212>DNA<213>人工序列<220><223><400>8TTGCGGCCGC TCACTTGTCA TCGTCGTCCT TGTAGTCGAT GCCAGGGAGG ATGAAGCAGG 60GGAGGATGAT G71<210>9<211>47<212>DNA<213>人工序列<220><223><400>9TTGCGGCCGC TCAGATGCCA GGGAGGATGA AGCAGGGGAG GATGATG 4
权利要求
1.蛋白质或其盐，其特征在于，它含有与SEQ ID NO1所示氨基酸序列相同或基本相同的氨基酸序列。
2.权利要求1所述蛋白质或其盐，其中与SEQ ID NO1所示氨基酸序列基本相同的氨基酸序列为SEQ ID NO5所示氨基酸序列。
3.权利要求1所述蛋白质或其盐，其合成于癌细胞。
4.权利要求1所述蛋白质的部分肽或其盐。
5.权利要求4所述部分肽或其盐，其具有SEQ ID NO1所示氨基酸序列的第26位至第34位的氨基酸序列。
6.权利要求4所述部分肽或其盐，其具有SEQ ID NO5所示氨基酸序列的第166位至第190位的氨基酸序列。
7.权利要求1所述蛋白质或权利要求4所述部分肽或其盐的制造方法，其特征在于，培养由含有编码权利要求1所述蛋白质或权利要求4所述部分肽的DNA重组载体转化形成的转化体，使之产生该蛋白质或该部分肽。
8.针对权利要求1所述蛋白质或权利要求4所述部分肽或其盐的抗体。
9.权利要求8所述抗体为单克隆抗体。
10.权利要求8所述抗体是针对权利要求4所述部分肽或其盐的抗体，其中所述部分肽或其盐具有SEQ ID NO1所示氨基酸序列的第26位至第34位氨基酸序列。
11.权利要求8所述抗体是针对权利要求4所述部分肽或其盐的抗体，其中所述部分肽或其盐具有SEQ ID NO5所示氨基酸序列的第166位至第190位氨基酸序列。
12.一种诊断药物，该药物包含权利要求8所述抗体。
13.一种药物，该药物包含权利要求1所述蛋白质或权利要求4所述部分肽或其盐或权利要求8所述抗体。
14.筛选能够促进或抑制权利要求1所述蛋白质或权利要求4所述部分肽或其盐活性的化合物或其盐的方法，其特征在于，应用权利要求1所述蛋白质或权利要求4所述部分肽或其盐。
15.权利要求14所述筛选法，其中所述活性为细胞增殖活性。
16.筛选能够促进或抑制权利要求1所述蛋白质或权利要求4所述部分肽或其盐活性的化合物或其盐的试剂盒，该试剂盒包含权利要求1所述蛋白质或权利要求4所述部分肽或其盐。
17.能够促进或抑制权利要求1所述蛋白质或权利要求4所述部分肽或其盐活性的化合物或其盐，所述化合物或其盐通过权利要求14所述筛选法或权利要求16所述筛选试剂盒获得。
18.一种药物，它包含能够促进或抑制权利要求1所述蛋白质或权利要求4所述部分肽或其盐之活性的化合物或其盐，该化合物或其盐通过权利要求14所述筛选法或权利要求16所述筛选试剂盒获得。
19.权利要求18所述药物为治疗或预防癌症之药物。
20.一种杂合体，其具有产生权利要求9所述单克隆抗体的能力。
21.权利要求8所述抗体为中和抗体。
22.权利要求8所述抗体为人型抗体。
23.一种药物，包含权利要求22所述抗体。
24.权利要求23所述药物为治疗或预防癌症之药物。
25.一种药物，它所包含的化合物或其盐具有能够抑制自然杀伤细胞的细胞增殖抑制活性，其中细胞增殖抑制由权利要求1所述蛋白质或其盐或权利要求4所述部分肽或其盐所致。
26.权利要求25所述药物为治疗或预防癌症之药物。
全文摘要
本发明涉及的范围包括:新的分泌性蛋白质、或其部分肽或其盐;所述蛋白质的制造方法;含有该蛋白质等的药物;所述蛋白质的抗体;促进或抑制所述蛋白活性的化合物或其盐的筛选法和/或筛选试剂盒;通过所述筛选法获得的化合物;含有该化合物的药物等。本发明的蛋白质或其部分肽等,例如可以作为组织病变后之摘除的一种再生药物或用作诊断癌症的药物等。本发明抗体还可用于定量待测溶液中的蛋白质等。本发明蛋白质进一步可用作筛选能够促进或抑制蛋白活性的化合物的试剂。
文档编号G01N33/574GK1368978SQ00806861
公开日2002年9月11日 申请日期2000年3月14日 优先权日1999年3月15日
发明者音田治夫, 大仪和宏, 北田千惠子, 铃木伸宏, 大久保尚一, 新谷靖, 菊地久仁子 申请人:武田药品工业株式会社