专利名称：一个人指环蛋白及其编码基因与应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及蛋白及其编码基因与应用，特别是涉及一个人指环蛋白及其编码基因 与其在制备抑制肿瘤细胞侵袭和转移及抗肿瘤药物中的应用。
技术背景1997年，McPherron等从小鼠骨骼肌cDNA文库中克隆到一个新基因，该基因编 码由376个氨基酸残基组成的蛋白质(A.C. McPherron, A.M. Lawler, S.J. Lee, Regulation of skeletal muscle mass in mice by a new TGF-beta superfamily member, Nature 387 (1997) 83-90.)。蛋白质结构分析结果表明该细胞因子具有TGF-P超家 族成员结构上共同的特点，因而将其列为TGF-e超家族中的一类新因子，即Growth and Differentiation Factor-8 (GDF-8) 。 GDF-8基因主要在骨骼肌中表达，该基因 敲除鼠的骨骼肌是正常野生型小鼠的3倍以上，因GDF-8对骨骼肌生长具有抑制作用， 后将其正式命名为肌肉生长抑制素(Myostatin) (A. C. McPherron， A.M. Lawler, S.J. Lee， Regulation of skeletal muscle mass in mice by a new TGF-beta superfamily member, Nature 387 (1997) 83-90.) 。 1998年，Gonzalez-Cadavid等克隆了人的 Myostatin基因组基因，人Myostatin基因全长7. 7kb，由3个外显子和2个内含子 构成，内含子1和内含子2的长度分别为1.8kb和2.4kb， 3个外显子编码的氨基酸 序列长度分别为125aa， 124aa和126aa (N. F. Gonzalez-Cadavid， W. E. Taylor, K. Yarasheski， I. Sinha-Hikim, K. Ma， S. Ezzat， R. Shen， R. Lalani， S. Asa, M. Mamita， G. Nair, S. Arver, S. Bhasin， Organization of the human myostatin gene and expression in healthy men and HIV-infected men with muscle wasting, Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 95 (1998) 14938—14943.)。九十年代末，具有指环结构域的一些蛋白被发现具有泛素连接酶活性(K.L. Lorick， _J. P. Jensen, S. Fang, A.M. 0ng， S. Hatakeyama， A.M. Weissman, RING fingers mediate ubiquitin-conjugating enzyme (E2)-dependent ubiquitination， Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 96 (1999) 11364-11369.)。泛素蛋白酶体系统 是细胞内降解蛋白质的主要途径，大体上可以分为两个步骤i.多个泛素分子共价连 接到目的蛋白上；ii.被泛素标记的蛋白被26S蛋白酶体降解。泛素(ubiquitin)是一 个小肽，含有76个氨基酸残基，分子量为8.5kD。泛素在生物进化过程中十分保守， 从酵母到人只有三个氨基酸残基的差别，说明泛素引导的蛋白质降解途径本身对生物体的生长发育和新陈代谢十分重要。泛素的76个氨基酸残基中有7个赖氨酸残基 (Lysine)，其中第48位Lys残基侧链的e -NH2是形成多聚体的必要基团。除泛素外， 其介导的蛋白质降解体系中还包括泛素激活酶(ubiquitin-activating enzyme, El)， 泛素结合酶(ubiquitin-conjugating enzyme, E2)以及泛素蛋白连接酶(ubiquitin-protein ligase， E3) ， 26S的蛋白酶体是最后降解目的蛋白的蛋白质复合体。目前还 发现了去泛素化酶(deubiquitinase， E4)，该酶在蛋白质降解前将结合的泛素切掉以 利于26S蛋白酶体降解，同时还发现E4可以挽救某些将要被降解的蛋白质的命运， 具体作用正在被人们逐步揭示。将泛素共价连接到底物蛋白是一个三步化的机制，首 先泛素在泛素激活酶El的催化下，由ATP提供能量，其C末端第76位的甘氨酸残基 被激活，使得泛素与E1共价相连，而后泛素被转移到泛素结合酶E2上，最后在泛素 连接酶E3的作用下，将E2上的泛素转移至底物蛋白的Lys残基上。连续过程后，在 底物上形成了一条多泛素链(polyubiquitin chain),多泛素链被26S蛋白酶体识别 而降解。整个体系形成一个分等级的框架 一个泛素激活酶E1可对应多个泛素结合 酶E2，同时一个泛素结合酶E2又与多个泛素连接酶E3相互作用，进而一个E3又可 以有多个底物。泛素蛋白酶体系统参与细胞内多种生物学过程，主要包括细胞周期、 细胞分化、迁移等。此外泛素与蛋白质的共价结合不仅可引起蛋白质的降解，还可以 对蛋白质的分选、受体的内吞以及基因转录起到重要作用。随着蛋白质晶体结构的解 析，作为E3连接酶的指环结构域与某些转录因子的锌指结构域在三维结构上存在很 大差异。泛素介导的蛋白质降解参与到细胞周期，炎症反应，细胞凋亡，抗原提呈等许多 生命过程中。因此，泛素介导的蛋白质降解途径的异常与许多疾病，如恶性肿瘤、肌 肉萎縮等的发生密切相关。肿瘤的侵袭与转移一直是医学肿瘤学研究的热点和难点。 侵袭和转移是恶性肿瘤重要的生物学特征。肿瘤细胞具有许多特性如自主性、可移 植性、侵袭性、转移性、异常分化、失去接触抑制性等，但其最重要的特性是侵袭性 和转移性，是肿瘤的恶性行为。侵袭是指恶性肿瘤细胞侵犯和破坏周围正常组织，进 入循环系统的过程。转移是指侵袭中的癌细胞迁移到特定组织器官并发展成为继发性 癌灶的过程。肿瘤侵袭转移包括多个步骤，可被形象地称为多阶梯瀑布过程。各种肿 瘤侵袭转移的基本过程是相似的，主要步骤包括肿瘤增殖(Proliferation)、血管发 生(Angiogenesis )、运动与侵袭(Motility and Invasion)、栓塞与循环(Embolism and Circulation)、锚定于微血管基层(Arrest in Capillary Beds)、粘附(Adherence)， 溢出循环系统(Extravasation)、对微环境的适应(Response to Microerwironment)、
肿瘤细胞增殖和血管发生(Tumor Cell Proliferation and Angiogenesis)、转移 (Metastasis).恶性肿瘤不同于良性肿瘤的主要生物学特性是侵袭和转移，其过程繁 多而复杂，虽然不同种类肿瘤的侵袭和转移特性有所不同，但侵袭和转移过程中的关 键步骤基本相同。针对肿瘤侵袭转移中的一些关键环节专门设计调节阻断手段，可望 达到遏止肿瘤侵袭和转移的目的。三氧化二砷(AsA)作为临床上治疗白血病的药物已经得到广泛的认同和应用， 但是其作用机制不是特别清楚。目前的研究表明，三价砷发挥效应的机制是与含有相 邻巯基的化合物和蛋白质相互作用，细胞内的巯基成分是三价砷的主要作用位点。高 浓度的八5203能够激活JNK和p38信号通路，但被认为是细胞本身的应激反应，而低浓 度也就是临床应用浓度的AsA主要是使细胞中产生过多的活性氧自由基，主要是HA， 进而引起细胞中线粒体跨膜电位的下降释放细胞色素C激活Caspase，但AsA如何引 起活性氧自由基一直是目前研究的热点。如何提高肿瘤细胞对AsA的敏感性，降低其 对机体的毒副作用也是基础医学和临床研究的重要内容。 发明内容本发明的目的是提供一个具有E3泛素连接酶活性的人指环蛋白。 本发明所提供的人指环蛋白，名称为hCRRF(或hRNF13)，来源于人属人(#oy//0 s SP^/7S)，是下述氨基酸残基序列之一1) 序列表中的SEQ ID N2: 1;2) 将序列表中SEQ ID Na: 1的氨基酸残基序列经过一至十个氨基酸残基的取代、 缺失或添加且具有E3泛素连接酶活性的蛋白质。序列表中的SEQ ID NS: 1由381个氨基酸残基组成，自氨基端(N端)第1-35 位氨基酸残基为信号肽(Signal P印tide)，自N端第58-162位氨基酸残基为蛋白 酶相关结构域(Protease-associated domain, PA domain)，自N端第182-204位 氨基酸残基为跨膜区(Transmembrane, TM)，自N端第209-220位氨基酸残基为核 定位信号(Nuclear Localization Signal, NLS)，自N端第240-281位氨基酸残基 为指环结构域(RING finger domain, RING)，自N端第291-299位氨基酸残基为序 列低复杂度区(Low Complexity)，自N端第336-357位氨基酸残基为酸性氨基酸富 集区。编码上述入指环蛋白的基因"OV^'或M^B)，是下述核苷酸序列之-一1) 序列表中SEQ ID Na: 2的DNA序列;2) 编码序列表中SEQ ID Ns: l的DNA序列；3) 与序列表中SEQIDNa: 2限定的核苷酸序列具有90%以上同源性且在调控肿 瘤细胞的侵袭和转移中起重要作用的核苷酸序列；4)在高严谨条件下可与序列表中的SEQ ID Nq: 2限定的DNA序列杂交的核苷酸 序列。所述高严谨条件为在O. 1XSSPE (或0.1XSSC)、 0.1% SDS的溶液中，65。C条 件下杂交并洗膜。序列表中的SEQ ID Na: 2由2956个碱基组成，其编码序列为自5，端第756-19 Ol位碱基，编码具有序列表中SEQ ID N2: l的氨基酸残基序列的蛋白质。其中，自 5'端第756-860位碱基编码信号肽，自5'端第927-1241位碱基编码蛋白酶相关结 构域，自5'端第1299-1367位碱基编码跨膜区，自5，端第1380-1415位碱基编码 核定位信号，自5，端第1473-1598位碱基编码指环结构域，自5'端第1626-1652 位碱基编码序列低复杂度区，自5'端第1761-1826位碱基编码酸性氨基酸富集区。 含有本发明基因的表达载体、转基因细胞系和宿主菌均属于本发明的保护范围。 扩增力OW,中任一片段的引物对也在本发明的保护范围之内。 本发明提供了一个人指环蛋白hCRRF及其编码基因。实验证明该蛋白具有E3连 接酶活性；免疫组化结果显示hCRRF在肝细胞性肝癌中高表达而在相对正常的肝硬化 中不表达，在恶性的黑色素瘤中表达而在正常的色素痣中不表达；免疫印迹实验结果 显示hCRRF能够在高侵袭能力的食管癌细胞中检测到，但在低侵袭能力的食管癌细胞 中检测不到；此外，体外侵袭实验表明过表达hCRRF的胰腺癌细胞的运动能力提高； 通过酵母二元杂交实验初步筛选到与肿瘤相关的蛋白Metallothionein 2A能够在酵 母中与CRRF相互作用。上述实验结果证明hCRRF参与肿瘤的侵袭和转移过程。另一 方面，在相同浓度的八5203处理下，hCRRF表达丰度较高的胰腺癌细胞P2对As203诱导 的细胞凋亡十分敏感，而不表达hCRRF的胰腺癌细胞Panc-1则能够抵抗；同样在白 血病细胞Jurkat和Raji中，表达hCRRF的Raji细胞在治疗浓度的八5203的诱导下可 以发生凋亡，而不表达hCRRF的Jurkat细胞则产生明显的抵抗现象。此外，实验证 明在Pane-1细胞中过表达hCRRF能够增强细胞对于AsA的敏感性。GST n在Jurkat 和Raji细胞中的表达模式与hCRRF相反，提示hCRRF通过GST n调节八5203介导的细 胞凋亡。本发明的hCRRF蛋白及其基因不仅可作为肿瘤转移检测及预后的指标，而且 可作为抑制肿瘤细胞侵袭、转移及抗肿瘤药物的作用靶标在医学及制药领域发挥重要 作用，应用前景广阔。下面结合具体实施例对本发明做进一步详细说明。
图1为人指环蛋白hCRRF的结构域分析结果 图2A为反应体系完全的GST-hCRRF的体外泛素化检测结果图2B为反应体系不完全的GST-hCRRF的体外泛素化检测结果 图3为hCRRF在肿瘤组织中表达情况的免疫组织化学染色检测结果 图4为hCRRF在侵袭力高和侵袭力低的食管癌细胞系中表达情况的Western blot 检测结果图5为转染空载体pcDNA4 MycHis的胰腺癌细胞Pane-1于划痕后零时及划痕后 30h的生长状态图6为转染重组载体pcDNA4 MycHis-力C必 尸的胰腺癌细胞Panc-l于划痕后零时及划痕后30h的生长状态图7A为共转化酵母菌在Trp—His—Leu Ade—四种氨基酸缺陷的平板上的生长状况图7B为共转化有pGBKT7-PA和候选文库质粒的重组菌中P -Gal活性的检测结果图8A为胰腺癌细胞Pane-1细胞对三氧化二砷敏感程度的检测结果图8B为胰腺癌细胞PC-2细胞对三氧化二砷敏感程度的检测结果图8C为hCRRF在胰腺癌细胞系Aspc-1、Panc-1、Bxpc-3、MiaPaca-2、PC-7、PC-4、PC-3、 PC-2和PC-1中表达情况的Western blot检测结果图9A为Jurkat和Raji经不同浓度AsA作用后的凋亡率检测结果图9B为Jurkat和Raji经2 u M八5203作用后的存活率统计结果图9C为hCRRF在白血病细胞系Jurkat和Raji中表达情况的Western blot检测结果图10为外源表达hCRRF胰腺癌实体瘤细胞Pane-1对As203的敏感性的检测结果 图11为GST ti和hCRRF在Jurkat和Raji细胞中表达情况的Western blot检测结果具体实施方式
下述实施例中所用方法如无特别说明均为常规方法。 实施例l、人指环蛋白hCRRF及其基因序列的获得本发明的发明人用DD-PCR的方法从鸡中克隆到了一个Myostatin上调表达基因c C7W尸(g1icken gancer gelated旦ING ginger gene， NCBI GenBank号NM—205355)， 再根据该基因编码蛋白的氨基酸残基序列，利用blastP程序得到人CRRF (hCRRF， h R固)的氨基酸残基序列，该序列具有序列表中SEQ ID丄、:l的氨基酸残基序列， 序列表中的SEQ ID Nq: 1由381个氨基酸残基组成。对该序列用 ssociated domain, PA domain)，自N端第182-204位氨基酸残基为跨膜区(TM)，自N端第209-220位氨基酸残基为核定位信号(NLS)，自N端第240-281位氨基酸 残基为指环结构域(RING finger domain, RING)，自N端第291-299位氨基酸残基 为低复杂度区(Low Complexity)，自N端第336-357位氨基酸残基为酸性氨基酸富 集区。将编码该人CRRF的基因命名为力QW尸(或力7&V尸7力，可具有序列表中SEQ ID Nq: 2的核苷酸序列，序列表中的SEQ ID Nq: 2由2956个碱基组成，其编码序列为 自5'端第756-1901位碱基，编码具有序列表中SEQ ID N2: 1的氨基酸残基序列的 蛋白质。其中，自5，端第756-860位碱基编码信号肽，自5，端第927-1241位碱基 编码蛋白酶相关结构域，自5'端第1299-1367位碱基编码跨膜区，自5'端第1380 -1415位碱基编码核定位信号，自5'端第1473-1598位碱基编码指环结构域，自5， 端第1626-1652位碱基编码序列低复杂度区，自5'端第1761-1826位碱基编码酸性 氨基酸富集区。实施例2、人指环蛋白hCRRF的原核表达将实施例1获得的人指环蛋白基因力GW成隆入GST (谷光苷肽-S-转移酶)融合表 达载体pGEX-5X-3(Pharmacia公司)多克隆位点的793/^ I和i7 o I酶切位点之间，得 到力CiW^的原核表达载体，命名为pGEX-力CW尸。将pGEX-力GW户转化大肠杆菌BL21(DE3) 感受态细胞(购自北京鼎国生物技术有限公司)，筛选阳性克隆。挑取阳性单克隆， 将其接种于3mL LB液体培养基中，在37'C下培养12-24小时，然后将lmL培养液转入50mL LB液体培养基中，在37。C、 1.0mmol/L IPTG下诱导4小时。培养结束后，对表达产物 进行12% SDS-PAGE检测，检测结果表明经IPTG诱导后，获得了分子量约为70KD的表 达蛋白，与预期结果相符，将该融合蛋白命名为GST-hCRRF。用Glutathione Uniflow Resin (Clontech公司)对表达的GST融合蛋白进行纯化。实施例3、人指环蛋白hCRRF的体外泛素化检测实施例1的结构域分析结果表明人指环蛋白hCRRF的羧基端具有指环结构域 (RING finger domain, RING)，该结构域是泛素蛋白连接酶(ubiquitin-protein ligase， E3)的特征结构，现用体外泛素化实验检测本发明的人指环蛋白hCRRF是否貝有E3泛素蛋白连接酶活性，实验方法如下将lmg纯化的实施例2表达的融合蛋白GST-hCRRF与100 nM El (泛素激活酶， 购自Sigma-Aldrich公司)，1 yME2 (选用不同的泛素连接酶:UbcH2、 UbcH3、 UbcH5a、 UbcH5b、 UbcH5c、 UbcH6、 UbcH7、 UbcHlO，均购自Calbiochem公司)，5 "M ubiquitin(Sigma-Aldrich) ， 50mM Tris HC1 (pH 7. 5) ， 2mM ATP， 2. 5mM MgCL和lmM DTT于 3(TC孵育1小时(反应体系为10ul)，同时以分别缺失ATP、Ubiquitin、El、E2(UbcH5c) 和GST-hCRRF及单独GST作为对照，然后加入10ul 2XSDS上样缓冲液(4%SDS， 20 %甘油，100mMTris， 0. 2%溴酚蓝)终止反应。将样品煮沸后上样进行8。％ SDS-PAGE， 转膜后用抗ubiquitin(P4Dl)的抗体(购自Santa Cruz)进行检测。反应体系完全的GST-hCRRF的体外泛素化检测结果如图2A所示，表明hCRRF具 有E3泛素蛋白连接酶活性，且UbcH5a、 UbcH5c和UbcH6为其三种E2;反应体系不完 全的对照组GST-hCRRF的体外泛素化检测结果如图2B所示("+ "表示添加，"一 " 表示未添加)，表明hCRRF的体外泛素化反应是ATP， Ubiquitin， El和E2任一组分 所依赖的，且指环结构域对于hCRRF具有E3泛素蛋白连接酶活性是充要的。实施例4、免疫组织化学染色检测hCRRF在肿瘤组织中的表达情况 现用免疫组织化学染色的方法检测hCRRF在肝细胞性肝癌组织、黑色素瘤组织和胰腺癌组织中的表达情况，以肝硬化组织、色素痣组织和胰腺癌旁组织为对照，检测 所用的一抗为RNF13多克隆抗体(Abcam4288，购自Abcam公司)，二抗为服P标记兔抗 山羊IgG (购自北京中杉金桥生物技术有限公司)。检测结果如图3所示，hCRRF在肝细胞性肝癌组织和黑色素瘤组织中高表达，而 在肝硬化和色素痣组织中检测不到表达，表明hCRRF与肿瘤的侵袭和转移有关。实施例5、检测hCRRF在具有不同侵袭能力的食管癌细胞系中的表达情况 用Western blot法检测hCRRF在侵袭力高的食管癌细胞系KYSE180、 KYSE450和E.C.9706以及侵袭力低的食管癌细胞系KYSE2、 KYSE410和KYSE510中的表达情况，所用的一抗为RNF13多克隆抗体(Abcam4288，购自Abcam公司)，二抗为HRP标记兔抗山羊IgG (购自北京中杉金桥生物技术有限公司)。Western blot检测结果如图4所示，hCRRF在KYSE180、 KYSE450和E. C. 9706中的表达量显著高于在KYSE2、 KYSE410和KYSE510中的表达量，进一步证明hCRRF与肿瘤的侵袭和转移有关。实施例6、体外侵袭试验现通过体外细胞试验检测hCRRF对肿瘤细胞运动能力的影响，具体方法为实验 分两组，空载体pcDNA4MycHis (购自Invitrogen公司)组和携带有力0!/ 尸的重组载 体(将力CvW尸克隆入载体pcDNA4多克隆位点的A'/^III和J力o I酶切位点之间得到的， 命名为pcDNA4-组，将两种载体转染胰腺癌细胞Panc-1，在相同条件下传代 培养48h，再将长势良好的转化细胞制备成细胞悬液，按2乂106个细胞/孔将细胞加 入6孔板，用含10X小牛血清的RMPI-1640培养基培养至细胞长满。然后用lOwl经 消毒的tip头在细胞层仔细划痕，用PBS洗两遍，去除细胞碎片，此时作为划痕后零 时，再分别于继续培养6、 12、 24、 30、 36h后检测一次，至划痕创面基本愈合。在 倒置显微镜下对划痕前、后的相应区域拍照。每组设3个复孔，进行3次独立实验。 划痕后零时及划痕后30h pcDNA4 MycHis空载体转化细胞的生长状态如图5所示 (A:划痕后零时，B:划痕后30h)，划痕后零时及划痕后30h重组载体转化细胞生 长状态如图6所示(A:划痕后零时，B:划痕后30h)，表明转染力67W尸的胰腺癌细 胞Panc-l的运动能力高于转染空质粒的Pane-1细胞，进一步证明hCRRF与肿瘤的转 移有关。实施例7、酵母双杂交法筛选hCRRF的互作蛋白用酵母双杂交法筛选hCRRF的互作蛋白，具体方法为将hCRRF的蛋白酶相关结 构域(Protease-associated domain, PA)的编码序列(序列表中SEQ ID Na: 1自5， 端第927-1241位碱基)克隆到载体pGBKT7 (购自Clontech公司)多克隆位点的尸W I和TfeoI酶切位点之间，得到诱饵载体，命名为pGBKT7-PA，使在酵母里能够表达 PA结构域与BD (Gal4 DNA binding domain)融合蛋白。采用顺序转化的方法转化酵 母首先将诱饵质粒pGBKT7-PA转化酵母AH109感受态细胞，将转化细胞涂布于Trp— 缺陷平板(MATCHMAKER GAL4 Two-Hybrid System 3 & Libraries User Manual, Clontech)在3(TC下进行培养，将长出的阳性克隆扩增后再次制备感受态酵母菌；然 后将文库质粒(成人骨骼肌、人胚胎期脑，均购自Clontech公司)转入酵母AH109 感受态细胞后涂布于Trp—Hisleu—Ade—四种氨基酸缺陷的平板上(MATCHMAKER GAL4 Two-Hybrid System 3 & Libraries User Manual, Clontech)， 在30。C培养箱中培养一周，长出单菌落后，提质粒，得到单一的文库质粒，依次进行编号；将得到的多个候选文库质粒分别转化上述重组酵母菌感受态细胞中，同时设立转化pGBKT7空载 体的对照，然后将转化细胞涂布于Trp—Hisleu—Ade—四种氨基酸缺陷的平板上进行筛 选，结果如图7A所示(PA为共转化有pGBKT7-PA与No.45文库质粒的重组酵母菌， Vector为作为阴性对照的共转化pGBKT7空质粒和No. 45文库质粒的重组酵母菌，+为 作为阳性对照的共转化已知相互作用的p53 (GenBank号:應—000546)和SV40大T 抗原(GenBank号NP—043127)的重组酵母菌)，最后用P-gal滤纸检测报告基因的激活情况，检测方法包括以下步骤 1) 将直径75mm的滤纸A放在长有待测酵母菌落的培养基上，并用黑墨水做好方 向标记；2) 待滤纸浸湿移下滤纸，将带菌的一面放入液氮中10-15秒；3) 窒温下溶化，再童复冷冻过程一次；4) 将另一张直径75咖的滤纸B在盛有Z buffer/X-Gal (MATCHMAKER GAL4 Two-Hybrid System 3 & Libraries Use:i: Manual, Clontech)的平皿中浸湿；5) 将滤纸A带菌的一面向上盖在滤纸B上，小心不要产生气泡；6) 将平皿密封放入3(TC温箱中反应；7) 阳性对照一般在0.5小时内变蓝，待测组如在8个小时内菌落变蓝为阳性， 超过8小时则多为假阳性。检测结果如图7B所示(PA为待测样品，Vector为阴性对照)，对阳性克隆进行 DNA测序并分析序列，分析结果表明与肿瘤相关的蛋白Metallothionein2A能够在酵 母中与hCRRF相互作用，提示Metallothionein 2A可能是hCRRF的泛素化底物。实施例8、检测胰腺癌实体瘤和白血病细胞中hCRRF的表达水平与细胞对三氧化 二砷的敏感程度一、 检测胰腺癌实体瘤细胞中hCRRF的表达水平与细胞对三氧化二砷的敏感程度 首先用Western blot法检测hCRRF在胰腺癌细胞系Aspc-1 、 Pane-1、 Bxpc-3、MiaPaca-2、 PC-7、 PC-4、 PC-3、 PC-2和PC-1中的表达情况，所用一抗和二抗与实施 例5相同，Western blot检测结果如图8C所示，hCRRF在胰腺癌细胞系Pane-1中不 表达，在PC-2中表达。然后检测Panc-1和PC-2细胞对不同浓度(0yM (对照)、5 uM、 lOuM)及不同作用时间(24h、 48h)的三氧化二砷(As203)的敏感程度，Panc-1 和PC-2细胞系的检测结果分别如图8A和图8B所示，表达hCRRF的PC-2细胞在较低 浓度的AsA的诱导下可以发生凋亡，而不表达hCRRF的Pane-1细胞则产生明显的抵 抗现象，表明hCRRF可提高实体瘤细胞对AsA的敏感程度。二、 检测白血病细胞中hCRRF的表达水平与细胞对三氧化二砷的敏感程度 首先用与步骤一相同的方法检测hCRRF在白血病细胞系Jurkat和Raji中的表达情况，检测结果如图9C所示，hCRRF在白血病细胞系Jurkat中不表达，在Raji中表 达。再检测Jurkta和Rtij丄刘不同浓度(OpM (对照)、lulvl、 2"M、 5pM)及不同 作用时间(1、 2、 3天)的A&0:i的敏感程度，检测方法包括以下步骤1)台盼蓝染色将Jurkat与Raji细胞分别培养在24孔板中，并加入不同浓度 的AsA进行处理，分别在l， 2， 3天进行台盼蓝染色，然后在血细胞计数板中分别对 细胞总数和染蓝色细胞的死细胞进行计数，并计算出活细胞所占比例。2)细胞收集将悬浮细胞直接收集到lOmL的离心管中，每样本细胞数为(l-5) X107mL， 500-1000rpm离心5min，弃去培养液，用孵育缓冲液(137 mM NaCl， 2. 7 raM KC1， 8. 1 mM Na2HPO,， 1. 5 mM KH2P04， pH 7. 2-7. 4)冼涤1次，500-1000rpm离心5min; 用100ul的标记溶液(10mmol/LHEPES/NaOH， PH7. 4, 140mmol/L NaCl， 5mmol/L CaCl2) 重悬细胞，室温下避光孵育10-15min; 500-1000rpm离心5min沉淀细胞孵育缓冲液 洗l次；加入荧光(SA-FLOUS)溶液4'C下孵育20min，避光并不时振动；用流式细 胞仪计数流式细胞仪激发光波长用488nm，用一波长为515nm的通带滤器检测FITC 荧光，另一波长大于560nm的滤器检测PI。凋亡细胞对所有用于细胞活性鉴定的染料 如PI有抗染性，坏死细胞则不能。细胞膜有损伤的细胞的DNA可被PI着染产生红色 荧光，而细胞膜保持完好的细胞则不会有红色荧光产生。因此，在细胞凋亡的早期PI 不会着染而没有红色荧光信号。正常活细胞与此相似。Jurkat和Raji经不同浓度(OuM (对照)、1 y M、 2wM、 5uM) AsA作用后的 调亡率检测结果如图9A所示，该图为双变量流式细胞仪的散点图，左下象限显示活 细胞，为(FITC-/PI-);右上象限是非活细胞，即晚期死亡细胞，为(FITC+/PI+); 而右下象限为早期凋亡细胞，显现(FITC+/PI-)，用2yMAsA作用不同时间(1、 2、 3天)后细胞的存活率统计结果如图犯所示，表达hCRRF的Raji细胞在治疗浓度的 AsA的诱导下可以发生凋亡，而不表达hCRRF的Jurkat细胞则产生明显的抵抗现象， 表明hCRRF与白血病细胞对As20:i的敏感程度相关。实施例9、检测胰腺癌实体瘤细胞Pane-1对As必的敏感性 将空载体pcDNA4 MycHis和携带有力OV 尸的重组载体pcDNA4-力C欣尸分别转染不 表达hCRRF的胰腺癌细胞Panc-l ，转染24小时后用5 y M As必进行处理，以未用As203 处理的细胞为对照，进一步检测胰腺癌实体瘤细胞Panc-l对AsA的敏感性，检测结 果如图10所示，Panc-l细胞中过表达hCRRF后能够提高了细胞对AsA的敏感性，进 一步证明hCRRF可提高实体瘤细胞对AsA的敏感程度。实施例10、检测可降低AsA毒性的GST it蛋白在Jurkat和Raji细胞中的表达模 式与hCKKF表达模式的关系八&03在治疗浓度下引起的细胞凋亡的主要原因是由于细胞内活性氧自由基 (Reactive Oxygen Species, ROS)的产生，而谷胱甘肽S转移酶(Glutathione-S-transferase n )被证明参与其中。现用Western blot法检测GST n和hCRRF在Jurkat 和Raji细胞中的表达情况，以e-actin为参照，检测GST ji的一抗为Glutathione S-Transferase PI-l多克隆抗体(购自Calbiochem公司)，二抗为HRP标记山羊抗兔 IgG(购自北京中杉金桥生物技术有限公司)；检测0-actin的一抗为e-actin(I-19) 多克隆抗体(购自Santa Cruz公司)，二抗为服P标记兔抗山羊IgG (购自北京中杉金 桥生物技术有限公司)，Western blot检测结果如图ll所示，GST it在Jurkat细胞中 表达，在Raji细胞中不表达，表达模式与hCRRF相反，提示hCRRF通过GST n调节As必 介导的细胞凋亡。 <160> 2序列表〈210> 1〈211> 381〈212> PRT〈213〉 人属人(Zfo历o s3/ ie/ 51)〈400〉 1 Met Leu Leu1Thrlie LeuGlu AlaAspLys65ValAsp50GlyLeu丄丄e 145 Glulie 130 ProAsp35Leulie Arg Arg Arg AlaGly 115 SerSerThr 20 lielie Gly 5Val GinPhe LeuPro Pro ProLeu 100 TyrMetSer Va丄Phe Thr Tyrlie Asn70 Val Lys 85Asp CysLys AlaGly SerPhe I丄e 150 Glu Lys 165Met Leu Met Leu Ser Ala Thr Gin Val Tyr 10 15Leu PheLeu Ala Tyr Pro Ala ArgPhe 55 SerAsn40GlyAla 25 PheAsn PheAlaAsn 135 Glylie 120 AspAsp 105 ValPheLeu Asn LeuGlu Asn Ala Tyr Arg LeuLys Pro Glu Asp Asn SerSer 90 lieAsn75GlyPro 60 Alalie Glu ValGlu Ser SerGly Gly His170Ala 155 lieLeu 140 AsnSer45AlaAsp 125 LysLeu 30 GinProThr Phe lieLys Val Leu His Asn ValAsn 110 SerLysSer LeuLeu Val ProVal95AlaAspliel>ysGlu 175ValThr Phe Glu Gly Leu Cys Glu Prolie 80 LeuGinAspAspAsp 160 PheSer Leu Pro Leu Glu Tyr Tyr 180lie Leu lie Vallie Cys Leu 195His Arg Ala ArgAsp Arg 210Lys Leu Pro Val His 225Ala lie Cys LeuPro Cys Lys ThrSerLys 275 AspHis 260 LysGin Gly 290Val Thr Glu His 305Gin Ser Phe GlyGlu Ser Ser Asp 340 AsnAsp 245 AlaLys 230 GluTyrCysArg 215 PheTyrHisLeu lie Pro Phe Leu lie 185lie Phe Met lie Thr 200Asn Arg Leu Arglie 190 PheValValThr Cys ProSer Asp SerAsp ThrPro 310 LeuAsp 295 LeuLys Lys Gly Asp 235Glu Asp Gly Asp 250Cys Lys Cys Val 265Val Cys Lys Gin 280Thr Asp Ser SerLys 220 GluLysAspLysTyrLeuProAsp ArgVallie 255 LeuAsp Ala Glu 355Pro Asn Gly Glu Arg Asp 370Leu Arg Pro Leu 315Ala Leu Ser Glu Ser Arg Ser His Gin Asn325 330Tyr Glu Glu Asp Asp Asn Glu Asp Thr345Glu lie Asn Glu His Asp Val Val 360Asn lie Ala AsnMet 335 SerTyr 375Thr 380Val 365 ValGly GinLys 205Asp Gin Leu LysCys 240 LeuThrTrp 270Val Val Pro Ser 285Gin Glu Glu Asn Glu 300Ala Ser Val SerAla 320 ThrSerAsp 350Gin Leu Gin〈210〉 2 <2丄丄》2956〈212〉 DNA〈213〉 人属人(〃o膨sapj.e/ s0〈400> 2aggtcgggtgagtgtagtgtgc鄉ga卿gacgcgtcagcgccagggccaggcccgccc60gggggC3gCCcggcagccgsatcttgggctactctgtccc犯c3gccggagc3gatcag3120ccgaccggccctgcccgctcggtcccgcgccctccagaccctacggtctccgtttctagg180ggcacatggttagcggcaggcgcccacagccaatccactttgccagcctgccccttcctc240tgccaagagcagcttcttcagccgcgctccagttccgcagacgcctgccccaccctgctc300ttcccttccaggga卿cggatcacgcggccaagaacgagactcgcaaactgggcatttc360tccgagccgggctagagcaagtagcg柳ctccgcgtgagagtgggaaagagccttaaca420ggcaaccatgttgcccagtgggttttctgtgcctttgggtgcggaccaatgaggcgcgtg■gggcgggacttccgcttcgcctaggtgttgtcgtccctgctagtactccgggctgtgggg540gtcggtgcggatattcagtcatgaaatcagggtgLgggacttctcccgcagCgElCgCggCt600ggcaagactgtttgtgUgcgggggccggacttcaagagagaaagag卿gtgggcagac660atcgaagccaaacagcagtatcccggaagcactcatgcaactttggtggcggccactcag720ttttctctgccagtgtctggtgattttacaacgagatgctgctctccatagggatgctca780tgctgtcagccacacaagtctacaccatcttgactgtccagctctttgcattcttaaacc840tactgcctgtag犯gcagacattttagcatataactttgaaaatgcatctcagacatttg■atgacctccctgcaagatttggttatagscttccagctgaaggtttaaagggttttttga960ttaactcaaagcctgtgaacccatagtgcctccaccagtaaaagacaatt1020catctggcactttcatcgtgttaattagaagacttgattgtaattttgat3taaaggttt1080taaMgcacag卿gcagg3tacaaggcagccatagttcacaatgttgattctgatgacc1140tcattagcatgggatccaacg織ttgaggtactaaagaaaattgacattccatctgtct1200ttattggtgaatcatcagctaattctctgaaagatgaattC3cstatgaa磁gggggcc1260accttatcttagttccagaatttagtcttcctttggaatactacctaattcccttcctta1320tceitagtgggcatctgtctcEitcttgatagtcattttcatgatcacaaaatttgtccagg1380atagacatag3gctag犯gaaacagacttcgtaaagatca3cttaagaaa_cttcctgtac1440ataaattcaaga犯gg卿tgagtatgatgtatgtgccatttgtttggatg3g城gaag1500stggagacaaactcagaatccttccctgttcccatgcttatcattgcaagtgtgtagacc1560cttggctaact aaaac c aaaaaaacctgtccagtgtgcaagcaaaaagttgttccttctc1620fcigtic Lctgac:gixiiagaageifcicagaacfcita1680cccctttactgagacctttagcttctgtcagtgcccagtcatttggggcttt3tcgg犯t1740cccgctcacatcagaacatgacagaatcttcagactatgagga卿cgac组g犯gata1800ctgacagtagtgatgc3g犯33tgaaattaatgaacatgstgtcgtggtccagttgcagc1860
ctaatggtgaacgggattacatactgtttgactttcaga^gatgattggt1920ttatttccctttaa犯tg3ttaggtatatactgtaatttg attttttgctcccttcaaag1980atttctgtagaaataacttattttttagtattctacagttactgaaacag2040gacttttgatctggtatttatctgcc犯gattcactaataatagactggt2100gctgtaactcaagcatcaattcagctcttcttttggaatgaa^gtatsgc2160asas &atcctcagt已tagcttgcaatt犯gacctagatcacagtatttaagtgtt2220ttgcgttttatacatgaggtcagtgctacagccacctagcatgaactaacccagcttcca2280cctccataaagttacctagagttgttgsgttgg^tstgttctggcatttacctgacctg2340ggg,ggC33caaggtaattcagcctttcctcctatcagcscaaagaaa2400ctcaaagctgttttttccctttctgttccaaagcagtcttatcctgacaggagcggtcta2460t￡LCt3gtgC3gatttcaacacttttttttaacgttttaattactatagtgttatgtagag2520atttgattgagcagctaatgtttctgaactttacttactaattttcagtgtccttaaggg2580ttctgtagtgttatcaaagctgctgcataaaaat ac c aaacttcagcaac2640tgttaatactcagatcatatacctcttaataa^tagcatcttatgctaattagccctgct2700aaactatgtacagaggaaactgttcaagtattggatttgaaagtaagtgacttatgttta2760scag ctaatgatgtattgaa3cactgtactaaat t atacatcattgta28203Ctatgtagaaagtgtagact犯tgtataatcaaaatgcta^ggatttttatatggcctt2880gt已tg已ggggagtttgaalgtgttttxcactttaagatccagtaaaaaaa2940295权利要求
1、人指环蛋白，是下述氨基酸残基序列之一1)序列表中的SEQ ID №1；2)将序列表中SEQ ID №1的氨基酸残基序列经过一至十个氨基酸残基的取代、缺失或添加且具有E3泛素连接酶活性的蛋白质。
2、 根据权利要求l所述的蛋白，其特征在于所述蛋白具有序列表中SEQ ID Na: l的氨基酸残基序列。
3、 编码权利要求1或2所述的人指环蛋白的基因。
4、 根据权利要求3所述的基因，其特征在于所述基因是下述核苷酸序列之一:1) 序列表中SEQ ID Na: 2的DNA序列;2) 编码序列表中SEQ ID Na: 1的DNA序列；3) 与序列表中SEQIDNs: 2限定的核苷酸序列具有90%以上同源性且在调控肿瘤细胞的侵袭和转移中起重要作用的核苷酸序列；4) 在高严谨条件下可与序列表中的SEQ ID Na: 2限定的DNA序列杂交的核苷酸 序列。
5、 根据权利要求4所述的基因，其特征在于所述基因具有序列表中SEQ ID Nq: 2的DNA序列。
6、 含有权利要求3所述基因的表达载体、转基因细胞系和宿主菌。
7、 权利要求1或2所述的人指环蛋白在制备抑制肿瘤细胞侵袭和转移药物中的 应用。
8、 权利要求1或2所述的人指环蛋白在制备抗肿瘤药物中的应用。
9、 权利要求3所述的编码人指环蛋白的基因在制备抑制肿瘤细胞侵袭和转移药 物中的应用。
10、 权利要求3所述的编码人指环蛋白的基因在制备抗肿瘤药物中的应用。
全文摘要
本发明公开了一个人指环蛋白及其编码基因与应用。其目的是提供一个人指环蛋白及其编码基因与其在制备抑制肿瘤细胞侵袭和转移及抗肿瘤药物中的应用。该蛋白具有下述氨基酸残基序列之一1)序列表中的SEQ ID №1；2)将序列表中SEQ ID№1的氨基酸残基序列经过一至十个氨基酸残基的取代、缺失或添加且具有E3泛素连接酶活性的蛋白质。本发明的蛋白及其基因不仅可作为肿瘤转移检测及预后的指标，而且可作为抑制肿瘤细胞侵袭、转移及抗肿瘤药物的作用靶标在医学及制药领域发挥重要作用，应用前景广阔。
文档编号A61P35/00GK101130571SQ200610112480
公开日2008年2月27日 申请日期2006年8月21日 优先权日2006年8月21日
发明者刘彤华, 孟云霄, 强 张, 蕾 张, 朱大海, 鹏 王, 杰 陈 申请人:中国医学科学院基础医学研究所