专利名称：人造血管胶原蛋白预凝涂层的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种可用来置换、旁路移植或分流人体血管系统任一部分的人造血管假体的预凝涂层方法，尤其是使用混有增塑剂的胶原蛋白溶液涂层人造血管假体，使其不漏血从而免除手术过程中预凝血操作的方法。
背景技术：
使用人造血管假体置换人体的病变血管是一项成熟的外科技术。人造血管有许多不同的类型，并可以由不同的材料构成。可以植入人体的人造血管假体通常是由生物相容性材料构成，同时血管假体植入后能保持开放的管形结构并允许血流通畅无阻运行其中。血管假体可以由生物相容性纤维材料构成，如涤纶或聚四氟乙烯，通过针织或机织而成，可以是单层或双层结构。
人造血管的基底层是由多孔的纤维壁构成，多孔的结构非常重要，因为这能使人造血管对血液保持足够的密封性避免在手术过程中失血过多，同时保持足够的孔隙允许成纤维细胞和平滑肌细胞侵入生长，使得受体组织包裹愈合血管假体。合成的人造血管假体在U.S.Pat.Nos.3,805,301 and No.4,047,252描述为涤纶针织的可延伸的弹性管状结构体。这些血管假体具备足够的孔隙允许受体组织侵入生长。但此类型人造血管在植入体内时需预凝血操作。预凝后的血管植入体内后便不再漏血同时也不妨碍自身组织的侵入生长。然而，外科手术尤其是急诊手术时希望能在植入人造血管时省缺预凝步骤从而节省宝贵的手术时间。
为了免除人造血管假体手术过程中预凝血操作，又保持足够的孔隙便于受体组织的侵入生长并包裹愈合人造血管。许多实验在研究提高人造血管植入时对血液的密封性，通常的办法使用可降解的生物材料(如纤维蛋白，白蛋白，明胶或胶原(R.A.Jonas，F.J.Schoen，R.J.Levy and A.R.Castaneda，“Biologicalsealants and knitted DacronPorosity and histological comparisons ofvascular graft materials with and without collagen and fibrin gluepretreatments，”Ann.Thorac.Surg.，41，657-663(1986)；K.Kottke-Marchant，J.M.Anderson，Y.Umemura，and R.E.Marchant，“Effectof albumin coating on the in vitro blood compatibility of Dacron arterialprostheses，”Biomaterials，10，147-155，(1989)；R.Guidoin，D.Marceau，and J.Couture，“Collagen coating as biological sealants for textilearterial prostheses，”Biomaterials，10，156-165，(1989)))涂层浸渍多孔隙人造血管假体，然后运用戊二醛或甲醛交联固定涂层材料。涂层浸渍并交联后的人造血管在植入人体时不再漏血(United States Patent 4,747,848，UnitedStates Patent 5108424)。但有实验显示，使用戊二醛、甲醛化学交联的血管假体植入后，贴近受体组织的血管假体外壁不断释放这些化学交联剂，即使剂量很低，也能导致受体细胞毒性反应和异物反应而影响周围组织对血管假体侵入生长和生物愈合(Speer DP，Chvapil M，Eskelson CD，Ulreich J，“Biologicaleffects of residual glutaraldehyde in glutaraldehyde-tanned collagenbiomaterials.”J Biomed Mater Res，14，753-64，(1980))。
发明内容
为克服上述困难，本发明采用可降解的生物材料胶原蛋白溶液涂层人造血管假体后采用热交联的方法来交联固定胶原蛋白，避免了使用化学交联的方法，从而达到消除受体细胞毒性反应和异物反应的发生。该人造血管由具生物相容性的纤维材料构成的多孔隙管状合成血管假体与混有增塑剂的胶原蛋白涂渍液交联而成，使得人造血管假体不漏血从而免除手术过程中的预凝血操作。这管状血管假体的多孔隙基底层可以是由涤纶构成，可以是针织或机织而成。
从牛跟腱提炼并通过盐析的方法得到高纯度的胶原蛋白纤维分散液。将混有增塑剂的高纯度胶原蛋白涂渍液均匀覆盖于合成血管假体基底层的内面，使人造血管结构充满弹性而具备较好的操控性和纵向伸展能力。至少运用胶原蛋白涂渍液涂层3遍，干燥后将通过热交联的方法交联固定胶原蛋白。
为了保持人造血管假体在干燥的状态下保持足够柔软而具弹性，在使用胶原蛋白溶液涂层人造血管假体前须混合甘油、山梨醇或其它具生物相容性的增塑剂。在混合涂层材料中胶原蛋白1-5％，增塑剂浓度6-20％(重量比)。同时加入10-25％的乙醇促进水分的蒸发。
合成针织或机织型的人造血管依照本发明的方法使用胶原蛋白和增塑剂的涂渍液涂层后获得最重要的特征是使得原先多孔隙结构的血管基质的渗水率约降至零。作为对照实验，随机取未涂层的20根合成机织型的涤纶血管，平均渗水率为381.4±12.3ml/min*cm2，按照本发明涂层后渗水率降至零。
由此，本发明一个目的是一种制备不漏血合成人造血管假体的方法。
本发明的进一步的目的是提供一种制备胶原蛋白涂层合成血管假体并使其不漏血的方法。
本发明其它的目的和益处将在以下的实例说明中得到清晰的显现。
本发明包含的特征、性质以及相关原理和操作步骤和各步骤之间的关系将在以下具体实例中的细节逐一阐述，而本发明的范围将在权利要求中说明。
为更好的理解本发明，须参考说明书附图及说明图1是按照本发明的方法制备的胶原蛋白涂渍液涂层的直线形人造血管假体部分的横断面；图2是按照本发明的方法制备的胶原蛋白涂渍液涂层的分叉形人造血管假体的部分横断面；图3表示人造血管假体的渗水率随着按照本发明的方法运用胶原蛋白涂层次数增多逐步降低。
具体实施例方式
按照本发明制备的合成人造血管假体01如图1所示包括管状结构主体02，它是由具生物相容性的纤维合成材料，尤其是聚对苯二甲酸乙酯，如涤纶针织或机织而成的基质04构成的多孔隙结构体。有如U.S.Pat.No.4,047,252中的描述基质04具内外侧两层绒面。除涤纶外，管状结构主体02也可以由其它具生物相容性纤维材料针织或机织而成，只要使其具备多孔隙的结构允许受体的组织侵入生长同时保持开放的管腔结构允许血流顺畅通过。在基质04管腔内面覆有胶原蛋白涂渍液涂层06，胶原蛋白涂渍液涂层06需至少运用胶原蛋白和增塑剂的混合涂渍液涂层3遍并通过热交联的方法交联固定而成。
图2演示一分叉形胶原蛋白涂渍液涂层的人造血管假体12，血管假体12包括主管状结构体14和两个分枝管状体16。主管状结构体14和分枝管状体16由涤纶针织或机织而成的基质18构成，基质18内侧绒面覆有胶原蛋白涂渍液涂层20，至少运用胶原蛋白涂渍液涂层3遍。
依据本发明多孔隙结构的人造血管假体基质由涤纶通过针织或机织而成。通常通过涤纶基质针织而成的人造血管假体渗水率范围在2000到3000ml/min*cm2(清洁过滤的水，120mmHg条件下)之间，而由涤纶机织而成的渗水率在300到400ml/min*cm2(清洁过滤的水，120mmHg条件下)之间。交联胶原蛋白的方法是将胶原蛋白和增塑剂的混合涂渍液均匀涂布人造血管假体基质内，去除多余的涂层材料并放置干燥后通过热交联的方法交联固定。按照本发明制备的胶原蛋白涂渍液涂层的人造血管的渗水率(单位ml/min*cm2)接近于零。
以下实例将说明胶原蛋白从牛跟腱中提取和纯化以及依据发明制备胶原蛋白涂渍液涂层人造血管假体的过程。列举实例的目的是阐述专利而不是来限制它的范围。
实例1胶原蛋白液的提取将新鲜牛跟腱去除脂肪、筋膜，在-10℃下冷冻至硬化，取出后再用手术刀剔除牛跟腱表面的残余筋膜，沿着牛跟腱纤维的方向切成1mm×1mm的薄片，运用蒸馏水反复冲洗后称重。用0.1％(质量分数)NaCO3溶液浸泡2小时，用蒸馏水漂洗5次，用不锈钢丝网滤去水溶液，晾干，放入容器中，分别加入含胃蛋白酶(与牛跟腱质量配比为1∶10)的0.3％(质量分数)乙酸溶液(pH＝2-3)适量。0-4℃之间控温缓慢搅拌3-5d，然后用高速冷冻离心机以200r/min离心，取上清液加入1％(质量分数)H2O2溶液，混匀后静置4h。用7％柠檬酸三钠溶液调节pH值到5，滤掉沉淀，在剩余的溶液中加入氯化钠，缓慢搅拌，进行盐析。4℃静置过夜，次日取出沉淀，用Tris(pH＝7)缓冲液在4℃下浸泡24h，再将沉淀装入透析袋内，用质量分数分别为1％、0.5％、0.2％的乙酸溶液各透析1d，再用蒸馏水透析3d，每天换透析液3次，最后得到白色光滑均质浆糊状的高纯度胶原蛋白液，4℃保存。
实例2涂层人造血管假体将含有2％胶原蛋白(按照实例1从牛跟腱中提取)浓度的胶原蛋白混合涂渍液注满50ml的注射器内，该胶原蛋白混合涂渍液同时含有12％的甘油，20％的乙醇和蒸馏水，粘度约31,000厘泊。注射器与合成的机织的人造血管一端相连，胶原蛋白混合涂渍液被推注入人造血管管腔并使涂层液均匀涂布于管腔内壁，多余的胶原蛋白混合涂渍液从人造血管另一端去除。涂层后的人造血管室温下干燥1/2小时，涂层干燥至少反复操作3次。
第3次涂层后，使人造血管置于真空干燥箱中交联，温度控制在90-110℃，交联16-20小时。
实例3人造血管假体涂层前后血液渗透率比较测定按照实例2的方法制备不漏血的胶原蛋白涂层的人造血管检测如下，随机抽取5根直径为8mm长度为12cm涂层后的合成机织人造血管并与储血器相连，在120mmHg的压力下，使肝素化的血液在血管内通过，收集渗漏的血液并计量(单位ml/min*cm2)。检测结果5根人造血管的血液渗透率分别是0.03，0.04，0.03，0.0和0.02，平均血液渗透率为0.024ml/min*cm2，接近于零。
为与未涂层的机织人造血管比较，选取未涂层的人造血管重复上述实验，测得平均血液渗透率为27.8ml/min*cm2。
实例4人造血管假体涂层前后渗水率比较测定人造血管经胶原蛋白涂渍液涂层3次后渗水率降至1％以下。标准的渗水率实验(R.Guidoin，M.King，D.Marceau，and A.Cardou，“Textile arterial prosthesesIs water permeability equivalent to porosity？”J.Biomed.Mater.Res.，21，65-87(1987))测定如下。相当于120mmHg的水柱压力通过2.44cm2面积的圆孔，将人造血管假体的样品固定于圆孔上1min，收集并测定渗漏水量。每个样品分别测定数次，测定结果如下表示渗水率(porosity)＝ml/min*cm2合成的机织人造血管的渗水率是400ml/min*cm2经过不同次数涂层后的渗水率变化如下
在上述实验的每一次涂层使用的胶原蛋白均从牛跟腱中按照实例1描述提纯，涂层方法均按照实例2描述操作。结果如附图3所示。基于此，制备一胶原蛋白涂层人造血管至少需3次涂层胶原蛋白混合液，甚至5次并且在每次涂层之间需待其干燥，最后交联固定胶原蛋白于人造血管基质内。
与未涂层的人造血管相比，胶原蛋白涂层的人造血管不仅降低了渗水率，而且减少了血栓生成。以下的实例证明与对照组相比胶原蛋白涂渍液涂层人造血管假体显著减少了血栓的生成。
实例5人造血管假体涂层前后血栓形成比较(体外实验)采用体外实验(Imai Y，Nose Y.“A new method for evaluation ofantithrombogenicity ofmaterials.”J Biomed Mater Res 6(3)165-72，(1972))来评价涂层前后人造血管假体的抗血栓生成能力。将0.25ml的枸橼酸血混合0.1mmol/L的CaCl225μl注入按照实例2制备的胶原蛋白涂层的人造血管假体管腔内壁，同样体积的上述血液注入未涂层的人造血管假体管腔内壁作为对照。分别在5，10和15分钟时点将5ml蒸馏水倾倒在实验样本上终止凝固反应，并各血管假体标本观测血栓的形成的情况。结果显示两组样本血栓形成有显俄著的差异。以下表格中数据是实验得到的半定量参数结果。
如表格所示，胶原蛋白涂层组在5min时点无纤维蛋白凝块形成，在15min时点胶原蛋白涂层组纤维蛋白凝块形成同样显著少于对照组。在与血液接触时未涂层的人造血管假体几乎是疏水的，需11到15秒血液才浸湿机织的人造血管的纤维，而血液浸湿胶原蛋白涂层的人造血管基质均衡而迅速。
基于上述实验结果，在体外无血流的情况下，胶原蛋白涂层的涤纶血管假体血液浸湿迅速，在5分钟内无血栓形成。在同一时点对照组血管假体显示血栓形成。在10和15分钟时点胶原蛋白涂层组血管假体形成的血栓数量明显少于空白对照组。
实例6人造血管假体涂层前后血栓形成比较(体内实验)胶原蛋白涂层人造血管假体体内(杂种犬)实验如下。全麻下在犬股动静脉之间植入分流管(使用5cm长两短为圆锥形的穿刺管，便于插入连接人造血管假体)。血管假体连接完成后，先缓慢松开静脉端的血管阻断钳，然后再缓慢松开动脉端的阻断钳。使血流在血管假体中运行10分钟和30分钟后阻断分流管两端，取下血管假体。将血管假体腔内多余的血液流出后称重，肉眼观测管腔内壁形成的血栓，然后使用足够的蒸馏水冲洗血管假体(3次)并再次称重。
对照组使用的标准的8mm直径的涤纶血管，在与股动静脉分流管连接前行预凝血操作。如此可提供血管假体体内实验血栓形成的视觉和客观的重量数据证据。实验过程中从血管假体壁泄漏的血液同样被收集并称重进行比较。
胶原蛋白涂层的人造血管无血液渗漏。而预凝组血管与股动静脉分流管连接后，第一个5分钟内，每5cm血管假体平均渗漏31ml血液。第二个5分钟约4-6ml。在对照组一例预凝血管连续测试30分钟，平均每5cm人造血管每分钟渗漏约1.7ml血液。
胶原涂层人造血管假体植入分流管10和30分钟肉眼观测均无血栓形成。在实验组血管假体胶原蛋白涂层表面覆盖一光滑白色有光泽薄纤维蛋白层，经蒸馏水反复冲洗和后在多数血管假体内壁能观察到一连续的纤维蛋白薄膜，无典型的血凝块发现。
在预凝血操作组5例血管假体内壁中，有4例观测到明显的典型血凝块形成，血凝块多位于血流方向的横断面，约占血管假体管周的1/3到1/2。另1例假体内壁形成类似纤维蛋白膜结构。可能由于血管壁持续的血液渗漏，在对照组每例血管假体外壁均有较大的血凝块形成。
基于上述实验结果，胶原蛋白涂层的涤纶人造血管血栓生成显著少于预凝组，这可能与胶原蛋白抗凝减少血栓生成有关，同时是预凝血操作的目的即是需要血凝来防止血管壁漏血的缘故。但是血凝块参与细胞过度反应增生并将被纤维细胞替代，所以减少涤纶人造血管基质血凝块形成对降低血管血栓和栓塞的发生是有益的。
对于植入人体替代病变血管的人造血管假体，按照本发明的方法运用胶原蛋白和增塑剂的混合涂渍液涂层合成机织具多孔隙结构的人造血管假体至少3次，可使血管假体特征获得明显的改善。预期的益处不仅是免除了手术过程中的预凝血操作。尽管许多实验证实多孔隙结构对保持人造血管植入人体后长期通畅是必要的，但同时在手术过程中必须使用患者的血液行预凝血操作来防止术中和术后大量的血液渗漏丢失。事实上，预凝血操作比较耗时并需要一定的技巧和实践经验。另外如患者需急诊手术或有凝血疾患则使得预凝血变得困难或无法操作。
综上所述，胶原蛋白和增塑剂的混合液涂层合成机织具多孔隙结构的人造血管假体免除了手术过程中的预凝血操作同时提供了理想的基质便于受体组织的侵入和包裹生长，另外，胶原蛋白涂层后的血管假体血栓生成明显减少从而降低了人造血管植入后栓塞发生的危险。合成的机织涤纶人造血管按照本发明使用胶原蛋白涂层后使其柔软有弹性具备较好的操控性。
由此依据以上阐述的方法操作，本发明目的能客观有效实现。但在不背离本发明精神和范围情况下，上述的操作具体步骤和某些条款可以有一定改变，因此上述实例描述和附图描绘所涉及的方法和使用的某些物质材料是用来演示阐述发明，而不应理解为限制发明所涵盖的范围。
权利要求
1.一种制备具有预凝涂层的人造血管假体的方法，所述具有涂层的人造血管假体包括人造血管假体和涂在人造血管假体上的涂层，其特征在于所述涂层含有胶原蛋白、增塑剂和促蒸发剂。
2.根据权利要求1所述的的制备人造血管假体的方法，特征在于将含有胶原蛋白、增塑剂和促蒸发剂的涂层溶液均匀涂覆于人造血管内壁，干燥，然后进行热交联，获得所述人造血管假体。
3.根据权利1或2所述的制备人造血管假体的方法，其特征在于增塑剂选自甘油和山梨醇，促蒸发剂选自乙醇。
4.根据权利要求1或2所述的制备人造血管假体的方法，其特征在于人造血管假体由生物相容性材料制成，其为具有弹性多孔隙管型结构的合成织物，可以是针织型或机织型。
5.根据权利要求1或2所述的制备人造血管假体的方法，其特征在于胶原蛋白的浓度为1-5％，增塑剂的浓度为6-20％，促蒸发剂为10-25％，以上浓度均为重量百分比。
6.根据权利要求1或2所述的制备人造血管假体的方法，其中涂覆涂层溶液至少3次。
7.根据权利要求1或2所述的制备人造血管假体的方法，热交联的温度为90-110度，热交联时间为16-20小时。
全文摘要
本发明提供一种人造血管胶原蛋白预凝涂层方法，由一机织或针织弹性多孔隙管型结构的合成血管假体，通过至少使用胶原蛋白涂渍液涂层3遍而成，上述的涂渍液包括胶原蛋白和增塑剂，通过倾注使其均匀涂布于血管假体的基底层内，干燥后运用热交链的方法固定胶原蛋白。
文档编号A61L27/56GK1919355SQ20061011221
公开日2007年2月28日 申请日期2006年8月30日 优先权日2006年8月30日
发明者郑军, 孙立忠, 黄福华 申请人:郑军, 孙立忠, 黄福华