专利名称：增强型蛋白及其应用方法
本申请要求2001年9月17日提交的美国临时申请60/322,461的优先权。上述申请全文引入本文作为参考。
本发明主要涉及植物遗传学和蛋白质化学领域。更具体地，本发明涉及包含了更多必需氨基酸的修饰蛋白。
全面补充氨基酸，在营养上对于所有动物，包括人，都是重要的，并且通常对于产生高质量牲畜和动物产品也是重要的。但是，一般动物膳食可缺乏具体动物不能合成的一或多种氨基酸。因此，所有动物都需要必需氨基酸来进行正常生长和发育。动物与动物之间的氨基酸需求是不同的。典型的氨基酸包括苏氨酸、异亮氨酸、色氨酸、缬氨酸、精氨酸、赖氨酸、甲硫氨酸和组氨酸。
在牲畜的膳食中添加必需氨基酸可以增加动物的商业价值。能提供并吸收充分的营养，对于动物产生具有重要商业价值的产物是十分关键的。在人的膳食中添加必需氨基酸，可以预防由营养不良或蛋白缺陷导致的一些疾病，并促进正常生长和发育。
已经有人尝试改变动物的膳食，来增加动物饲料和人类食物(后文中统称食物)中必需氨基酸的量。例如，食物中常常添加额外的蛋白。
遗传工程技术提供了制造含有更多量的必需氨基酸的强化食物的更有效方法。例如，可以将食物蛋白中的非必需氨基酸替换为必需氨基酸，从而提高食物中该蛋白的营养价值。此外，这种强化蛋白可以在植物或者在掺入食物中的种子中组成型表达。结果是，该强化蛋白以相对较高水平出现在食物中，导致，例如，动物膳食的营养显著改善。
显然该领域存在着对包含更多量的必需氨基酸的强化蛋白的需要。这类蛋白可以显著改进动物饲料的营养价值，从而提高商业化动物产品的质和量。这类蛋白也可以显著改进内人类食物的营养价值，从而减少营养不良和相关健康问题的发生，并促进婴儿和儿童的总体生长和发育。
发明概述本发明包括并提供了一种修饰的多肽，它在具有氨基酸序列SEQ IDNO1的未经修饰的多肽中掺入了一或多个选自异亮氨酸或色氨酸的必需氨基酸的取代，其中所述修饰的多肽能在种子中积累。
本发明包括并提供了一种修饰的多肽，它在未经修饰的氨基酸序列SEQ ID NO1中掺入了一或多个选自苏氨酸，异亮氨酸，色氨酸，缬氨酸，精氨酸，赖氨酸，甲硫氨酸或组氨酸的必需氨基酸的取代，其中所述修饰的多肽能在种子中积累。
本发明包括并提供了一种修饰的β-伴大豆球蛋白(conglycinin)多肽，它在具有氨基酸序列SEQ ID NO1的未经修饰的β-伴大豆球蛋白多肽中掺入了一或多个选自苏氨酸，异亮氨酸，色氨酸，缬氨酸，精氨酸，赖氨酸，甲硫氨酸或组氨酸的必需氨基酸的取代，其中所述修饰的β-伴大豆球蛋白多肽能在种子中积累。
本发明包括并提供了编码修饰的β-伴大豆球蛋白多肽的重组核酸分子，所述多肽在具有氨基酸序列SEQ ID NO1的未经修饰的β-伴大豆球蛋白多肽中掺入了一或多个选自苏氨酸，异亮氨酸，色氨酸，缬氨酸，精氨酸，赖氨酸，甲硫氨酸或组氨酸的必需氨基酸的取代，其中所述修饰的β-伴大豆球蛋白多肽能在种子中积累。
本发明包括并提供了一种细胞，在该细胞中，按照5’到3’的方向，包含异源启动子以及与其可操作相连的重组核酸分子，所述核酸分子编码修饰的β-伴大豆球蛋白多肽，该多肽在具有氨基酸序列SEQ ID NO1的未经修饰的β-伴大豆球蛋白多肽中掺入了一或多个选自苏氨酸，异亮氨酸，色氨酸，缬氨酸，精氨酸，赖氨酸，甲硫氨酸或组氨酸的必需氨基酸的取代，其中所述修饰的β-伴大豆球蛋白多肽能在种子中积累。
本发明包括并提供了一种转基因植物，在该植物中，按照5’到3’的方向，包含异源启动子以及与其可操作相连的重组核酸分子，所述核酸分子编码修饰的β-伴大豆球蛋白多肽，该多肽在具有氨基酸序列SEQ ID NO1的未经修饰的β-伴大豆球蛋白多肽中掺入了一或多个选自苏氨酸，异亮氨酸，色氨酸，缬氨酸，精氨酸，赖氨酸，甲硫氨酸或组氨酸的必需氨基酸的取代，其中所述修饰的β-伴大豆球蛋白多肽能在种子中积累。
本发明包括并提供了一种转基因植物种子，其中，按照5’到3’的方向，包含异源启动子以及与其可操作相连的重组核酸分子，所述核酸分子编码修饰的β-伴大豆球蛋白多肽，该多肽在具有氨基酸序列SEQ ID NO1的未经修饰的β-伴大豆球蛋白多肽中掺入了一或多个选自苏氨酸，异亮氨酸，色氨酸，缬氨酸，精氨酸，赖氨酸，甲硫氨酸或组氨酸的必需氨基酸的取代，其中所述修饰的β-伴大豆球蛋白多肽能在种子中积累，且其中所述植物是苜蓿，苹果，香蕉，大麦，菜豆，花椰菜，甘蓝，胡萝卜，蓖麻，芹菜，柑桔，三叶草，椰子，咖啡，玉米(corn)，棉花，黄瓜，道格拉斯冷杉(Douglas fir)，桉(Eucalyptus)，大蒜，葡萄，亚麻子，火炬松(Loblolly pine)，甜瓜，燕麦，油橄榄，洋葱，棕榈，防风，豌豆，花生，胡椒，杨树，马铃薯，萝卜，Radiatapine，油菜籽，稻，黑麦，高梁，狭叶羽扇豆(Lupinusangustifolius)，Southern pine，菠菜，草莓，甜菜，甘蔗，向日葵，枫香(Sweetgum)，茶，烟草，番茄，turf，或小麦植物。
本发明包括并提供了从转基因植物的种子得到的植物，其中，按照5’到3’的方向，包含异源启动子以及与其可操作相连的重组核酸分子，所述核酸分子编码修饰的β-伴大豆球蛋白多肽，该多肽在具有氨基酸序列SEQID NO1的未经修饰的β-伴大豆球蛋白多肽中掺入了一或多个选自苏氨酸，异亮氨酸，色氨酸，缬氨酸，精氨酸，赖氨酸，甲硫氨酸或组氨酸的必需氨基酸的取代，其中所述修饰的β-伴大豆球蛋白多肽能在种子中积累，且其中所述植物是苜蓿，苹果，香蕉，大麦，菜豆，花椰菜，甘蓝，胡萝卜，蓖麻，芹菜，柑桔，三叶草，椰子，咖啡，玉米(corn)，棉花，黄瓜，道格拉斯冷杉，桉，大蒜，葡萄，亚麻子，火炬松，甜瓜，燕麦，油橄榄，洋葱，棕榈，防风，豌豆，花生，胡椒，杨树，马铃薯，萝卜，Radiata pine，油菜籽，稻，黑麦，高梁，狭叶羽扇豆，Southern pine，菠菜，草莓，甜菜，甘蔗，向日葵，枫香，茶，烟草，番茄，turf，或小麦植物。
本发明包括并提供了含有转基因植物种子的动物饲料，其中，按照5’到3’的方向，包含异源启动子以及与其可操作相连的重组核酸分子，所述核酸分子编码修饰的β-伴大豆球蛋白多肽，该多肽在具有氨基酸序列SEQID NO1的未经修饰的β-伴大豆球蛋白多肽中掺入了一或多个选自苏氨酸，异亮氨酸，色氨酸，缬氨酸，精氨酸，赖氨酸，甲硫氨酸或组氨酸的必需氨基酸的取代，其中所述修饰的β-伴大豆球蛋白多肽能在种子中积累，且其中所述植物是苜蓿，苹果，香蕉，大麦，菜豆，花椰菜，甘蓝，胡萝卜，蓖麻，芹菜，柑桔，三叶草，椰子，咖啡，玉米(corn)，棉花，黄瓜，道格拉斯冷杉，桉，大蒜，葡萄，亚麻子，火炬松，甜瓜，燕麦，油橄榄，洋葱，棕榈，防风，豌豆，花生，胡椒，杨树，马铃薯，萝卜，Radiata pine，油菜籽，稻，黑麦，高梁，狭叶羽扇豆，Southern pine，菠菜，草莓，甜菜，甘蔗，向日葵，枫香，茶，烟草，番茄，turf，或小麦植物。
本发明包括并提供了含有转基因植物的动物饲料，其中，按照5’到3’的方向，包含异源启动子以及与其可操作相连的重组核酸分子，所述核酸分子编码修饰的β-伴大豆球蛋白多肽，该多肽在具有氨基酸序列SEQ IDNO1的未经修饰的β-伴大豆球蛋白多肽中掺入了一或多个选自苏氨酸，异亮氨酸，色氨酸，缬氨酸，精氨酸，赖氨酸，甲硫氨酸或组氨酸的必需氨基酸的取代，其中所述修饰的β-伴大豆球蛋白多肽能在种子中积累，且其中所述植物是苜蓿，苹果，香蕉，大麦，菜豆，花椰菜，甘蓝，胡萝卜，蓖麻，芹菜，柑桔，三叶草，椰子，咖啡，玉米(corn)，棉花，黄瓜，道格拉斯冷杉，桉，大蒜，葡萄，亚麻子，火炬松，甜瓜，燕麦，油橄榄，洋葱，棕榈，防风，豌豆，花生，胡椒，杨树，马铃薯，萝卜，Radiata pine，油菜籽，稻，黑麦，高梁，狭叶羽扇豆，Southern pine，菠菜，草莓，甜菜，甘蔗，向日葵，枫香，茶，烟草，番茄，turf，或小麦植物。
本发明包括并提供了含有从转基因植物种子得到的植物的动物饲料，其中，按照5’到3’的方向，包含异源启动子以及与其可操作相连的重组核酸分子，所述核酸分子编码修饰的β-伴大豆球蛋白多肽，该多肽在具有氨基酸序列SEQ ID NO1的未经修饰的β-伴大豆球蛋白多肽中掺入了一或多个选自苏氨酸，异亮氨酸，色氨酸，缬氨酸，精氨酸，赖氨酸，甲硫氨酸或组氨酸的必需氨基酸的取代，其中所述修饰的β-伴大豆球蛋白多肽能在种子中积累，且其中所述植物是苜蓿，苹果，香蕉，大麦，菜豆，花椰菜，甘蓝，胡萝卜，蓖麻，芹菜，柑桔，三叶草，椰子，咖啡，玉米(corn)，棉花，黄瓜，道格拉斯冷杉，桉，大蒜，葡萄，亚麻子，火炬松，甜瓜，燕麦，油橄榄，洋葱，棕榈，防风，豌豆，花生，胡椒，杨树，马铃薯，萝卜，Radiata pine，油菜籽，稻，黑麦，高梁，狭叶羽扇豆，Southern pine，菠菜，草莓，甜菜，甘蔗，向日葵，枫香，茶，烟草，番茄，turf，或小麦植物。
本发明包括并提供了含有从转基因植物种子得到的植物的人类食物，其中，按照5’到3’的方向，包含异源启动子以及与其可操作相连的重组核酸分子，所述核酸分子编码修饰的β-伴大豆球蛋白多肽，该多肽在具有氨基酸序列SEQ ID NO1的未经修饰的β-伴大豆球蛋白多肽中掺入了一或多个选自苏氨酸，异亮氨酸，色氨酸，缬氨酸，精氨酸，赖氨酸，甲硫氨酸或组氨酸的必需氨基酸的取代，其中所述修饰的β-伴大豆球蛋白多肽能在种子中积累，且其中所述植物是苜蓿，苹果，香蕉，大麦，菜豆，花椰菜，甘蓝，胡萝卜，蓖麻，芹菜，柑桔，三叶草，椰子，咖啡，玉米(corn)，棉花，黄瓜，道格拉斯冷杉，桉，大蒜，葡萄，亚麻子，火炬松，甜瓜，燕麦，油橄榄，洋葱，棕榈，防风，豌豆，花生，胡椒，杨树，马铃薯，萝卜，Radiata pine，油菜籽，稻，黑麦，高梁，狭叶羽扇豆，Southern pine，菠菜，草莓，甜菜，甘蔗，向日葵，枫香，茶，烟草，番茄，turf，或小麦植物。
本发明包括并提供了含有转基因植物的人类食物，其中，按照5’到3’的方向，包含异源启动子以及与其可操作相连的重组核酸分子，所述核酸分子编码修饰的β-伴大豆球蛋白多肽，该多肽在具有氨基酸序列SEQ IDNO1的未经修饰的β-伴大豆球蛋白多肽中掺入了一或多个选自苏氨酸，异亮氨酸，色氨酸，缬氨酸，精氨酸，赖氨酸，甲硫氨酸或组氨酸的必需氨基酸的取代，其中所述修饰的β-伴大豆球蛋白多肽能在种子中积累，且其中所述植物是苜蓿，苹果，香蕉，大麦，菜豆，花椰菜，甘蓝，胡萝卜，蓖麻，芹菜，柑桔，三叶草，椰子，咖啡，玉米(corn)，棉花，黄瓜，道格拉斯冷杉，桉，大蒜，葡萄，亚麻子，火炬松，甜瓜，燕麦，油橄榄，洋葱，棕榈，防风，豌豆，花生，胡椒，杨树，马铃薯，萝卜，Radiata pine，油菜籽，稻，黑麦，高梁，狭叶羽扇豆，Southern pine，菠菜，草莓，甜菜，甘蔗，向日葵，枫香，茶，烟草，番茄，turf，或小麦植物。
本发明包括并提供了含有从转基因植物种子得到的植物的人类食物，其中，按照5’到3’的方向，包含异源启动子以及与其可操作相连的重组核酸分子，所述核酸分子编码修饰的β-伴大豆球蛋白多肽，该多肽在具有氨基酸序列SEQ ID NO1的未经修饰的β-伴大豆球蛋白多肽中掺入了一或多个选自苏氨酸，异亮氨酸，色氨酸，缬氨酸，精氨酸，赖氨酸，甲硫氨酸或组氨酸的必需氨基酸的取代，其中所述修饰的β-伴大豆球蛋白多肽能在种子中积累，且其中所述植物是苜蓿，苹果，香蕉，大麦，菜豆，花椰菜，甘蓝，胡萝卜，蓖麻，芹菜，柑桔，三叶草，椰子，咖啡，玉米(corn)，棉花，黄瓜，道格拉斯冷杉，桉，大蒜，葡萄，亚麻子，火炬松，甜瓜，燕麦，油橄榄，洋葱，棕榈，防风，豌豆，花生，胡椒，杨树，马铃薯，萝卜，Radiata pine，油菜籽，稻，黑麦，高梁，狭叶羽扇豆，Southern pine，菠菜，草莓，甜菜，甘蔗，向日葵，枫香，茶，烟草，番茄，turf，或小麦植物。
图1是pMON39328的图谱。
图2是pMON39329的图谱。
图3是pMON39335的图谱。
序列描述SEQ ID NO1是野生型大豆(Glycine max)7S-β-伴大豆球蛋白亚单位原蛋白氨基酸序列。
SEQ ID NO2是SEQ ID NO1所示野生型大豆(Glycine max)7S-β-伴大豆球蛋白亚单位原蛋白氨基酸序列，但其中的残基1-25和416-439未显示。
SEQ ID NO3 is a wild-type Glycine max 7S-β-伴大豆球蛋白β亚单位的cDNA序列。
SEQ ID NO4是寡核苷酸引物。
SEQ ID NO5是寡核苷酸引物。
SEQ ID NO6是寡核苷酸引物。
SEQ ID NO7是寡核苷酸引物。
SEQ ID NO8是编码FLAG表位的DNA序列。
SEQ ID NO9是FLAG氨基酸表位序列。
SEQ ID NO10是寡核苷酸引物。
SEQ ID NO11是寡核苷酸引物。
SEQ ID NO12是由pMON39328编码的β-伴大豆球蛋白β亚单位的表位(FLAG)-标记形式。
SEQ ID NO13是pMON39328中编码β-伴大豆球蛋白β亚单位的表位(FLAG)-标记形式的核苷酸序列。
SEQ ID NO14是由pMON39329编码的β-伴大豆球蛋白β亚单位氨基酸序列(加上由起始密码子编码的甲硫氨酸)的成熟形式，不带有FLAG表位。
SEQ ID NO15是pMON39329中编码不带有FLAG表位的β-伴大豆球蛋白β亚单位成熟形式的核苷酸序列。
SEQ ID NOs16-83是寡核苷酸引物序列。
SEQ ID NO84是突变体39335-14的编码序列。
SEQ ID NO85是突变体39335-41的编码序列。
SEQ ID NO86是突变体39335-58的编码序列。
SEQ ID NO87是突变体39335-78的编码序列。
SEQ ID NO88是pMON69616中的核苷酸序列。
SEQ ID NO89是pMON69616的氨基酸序列。
SEQ ID NO90是pMON64016中的核苷酸序列。
SEQ ID NO91是pMON64016的氨基酸序列。
SEQ ID NO92是pMON64015中的核苷酸序列。
SEQ ID NO93是pMON64015的氨基酸序列。
SEQ ID NO94是pMON64019中的核苷酸序列。
SEQ ID NO95是pMON019的氨基酸序列。
SEQ ID NO96是pMON69621中的核苷酸序列。
SEQ ID NO97是pMON69621的氨基酸序列。
定义以下定义可以帮助理解对本发明的详细描述。
本文中“序列同一性”是指，两个最佳比对的多核苷酸或肽序列在诸如核苷酸或氨基酸等组分的整个比对窗中保持一致的程度。测试序列和参考序列的比对片段的“同一性分数”，是将这两个比对序列共有的相同组分的数目除以参考序列片段(即整个参考序列或该参考序列的一部分)中组分总数得到的。“同一性百分比”是将同一性分数乘以100得到的。
对于一种具体的生物而言，“必需氨基酸”是该生物本身不能合成、因此必需从其膳食中获得的那些氨基酸。必需氨基酸在不同动物中是不同的，这取决于动物物种，可包括苏氨酸，异亮氨酸，色氨酸，缬氨酸，精氨酸，赖氨酸，甲硫氨酸，组氨酸，亮氨酸和苯丙氨酸中的一或多种。
“抗原性表位”是指分子、蛋白、或核酸中能激发免疫应答、从而导致产生与该抗原性表位反应的抗体的任何不连续的片段。
短语“编码序列”，“开放读框”，“结构序列”以及“结构核酸序列”是指一种包含有序排列的核酸的物理结构。所述核酸以一组核酸三联体的形式排列，其中每一个三联体形成一个密码子。每一密码子编码一种具体的氨基酸。因此，编码序列、结构序列、和结构核酸序列编码一系列氨基酸，这些氨基酸形成蛋白、多肽、或肽序列。编码序列，结构序列，和结构核酸序列可以包含在较大的核酸分子、载体等结构中。此外，这些序列中核酸的有序排列可以用序列表、附图、附表、电子媒介等形式进行描述。
术语“DNA序列”，“核酸序列”和“核酸分子”是指一种包含有序排列的核酸的物理结构。所述DNA序列或核酸序列可以包含在较大的核酸分子、载体等结构中。此外，这些序列中核酸的有序排列可以用序列表、附图、附表、电子媒介等形式进行描述。
术语“表达”是指基因转录，产生相应的mRNA，并翻译该mRNA以产生相应的基因产物(即，肽，多肽，或蛋白)。
术语“反义RNA的表达”是指对DNA进行转录，从而产生第一种RNA分子，后者能与第二种RNA分子杂交。
术语“基因”是指编码肽、多肽、蛋白的染色体DNA、质粒DNA、cDNA、合成的DNA、或其它DNA，或者是RNA分子。
“同源性”是指两个或多个核酸序列或氨基酸序列之间以位置同一性百分比表示的相似性(即，序列相似性或同一性)。
术语“异源”是指两个或更多个不同来源的核酸序列或蛋白序列之间的关系。例如，启动子如果在自然界通常的情况中不与编码序列组合在一起，那么该启动子相对于该编码序列是异源的。此外，一个具体序列可以相对于它插入至其中的细胞或生物为“异源”的(即，并非该具体细胞或生物所天然具有的)。
“杂交”是指一条核酸链与一条互补链通过碱基配对来相连的能力。当两条核酸链中的互补核酸序列在适当条件下彼此相遇，就可发生杂交。
“核酸”是指脱氧核糖核酸(DNA)以及核糖核酸(RNA)。
“表型”是指基因型与环境相互作用导致生物表现出的特性。
“聚腺苷酸化信号”或“polyA信号”是指一种核酸，它位于编码区的3’侧，它能启动腺苷酸添加在由该编码区转录的mRNA的3’末端。
术语“可操作相连”是指两个或更多个核酸区域或核酸序列的功能性空间排列。例如，启动子区相对于核酸序列的位置可以使该核酸序列在该启动子区的指导下进行转录。此时，该启动子区与该核酸序列“可操作相连”。
术语“启动子”或“启动子区”是指通常发现于编码序列上游(5’)的、能指导该核酸序列转录为mRNA的一种核酸序列。启动子或启动子区通常提供RNA聚合酶的识别位点以及转录的正确起始所需的其它因子。本文中，启动子或启动子区包括通过插入或缺失调节区，对启动子进行随机或定点诱变等方式而进行改变的启动子。启动子的活性或强度如下测量将其在细胞或组织中产生的RNA的量，或积累的蛋白的量，与已经评估过转录活性的启动子进行比较。
术语“重组核酸载体”和“重组载体”是指诸如质粒，粘粒，病毒，自我复制序列，噬菌体，线性单链、环状单链、线性双链、或环状双链DNA或RNA核苷酸序列等任何物质。重组载体可以来自任何来源，它能进行基因组整合或自我复制，它包含与一或多个核酸序列可操作相连的启动子核酸序列。重组载体通常用于将所述可操作相连的序列引入适当的宿主。
“再生”是指从植物细胞或植物组织(例如植物原生质体或外植体)生长成植物的过程。
“选择标记”是指一种核酸序列，其表达导致的表型有利于鉴定包含该核酸序列的细胞。选择标记包括赋于对毒性化合物的抗性(例如，氨苄青霉素抗性，卡那霉素抗性)的那些，能弥补营养缺陷的那些(例如，尿嘧啶，组氨酸，亮氨酸)，或者带来可以观察的区别性特征的那些(例如，颜色改变或荧光)。
“转录”是指从DNA模板产生RNA拷贝的过程。
“转基因”是指整合了外源核酸序列的生物。
“载体”是指将外源DNA带入宿主生物中的质粒，粘粒，噬菌体或病毒。
“调节序列”是指位于编码序列上游(5’)、内部或下游(3’)的核苷酸序列。编码序列的转录和表达通常受到调节序列存在与否的影响。
术语“充分同源”(substantially homologous)是指，用本文所述BestFit程序(版本10；Genetics Computer Group，Inc.，University of WisconsinBiotechnology Center，Madison，WI)以默认参数测定，序列同一性至少90％的两个序列。
术语“转化”是指将核酸引入受体宿主的过程。术语“宿主”是指细菌细胞，真菌，动物或动物细胞，植物或种子，或植物的任何部分或组织，包括原生质体，愈伤组织，根，块茎，种子，茎，叶，幼苗，胚和花粉。
本文中术语“转基因植物”是指一种植物，其中所引入的核酸已经稳定引入该植物的基因组，例如，核基因组或质体基因组中。
本文中术语“基本纯”(substantially purified)是指一种分子，它与自然状态下通常与它相伴的基本上所有其它分子分开。更优选基本纯的分子是制剂中的优势种类。基本纯的分子可以是约60％以上，优选约75％以上，更优选约90％以上，最优选约95％以上与天然混合物中其它分子(除了溶剂以外)脱离。术语“基本纯”并不想涵盖处于天然状态的分子。
具体实施方案本发明包括并提供链包含更高水平的必需氨基酸的修饰多肽，其应用方法，设计方法和制备方法。所述修饰多肽的特征在于，与改造前的未修饰多肽相比，营养含量增加。
多肽序列本发明包括并提供链一种修饰的多肽，它所包含的必需氨基酸的水平提高。所述修饰多肽的特征在于，与未修饰的多肽相比，营养含量增加。所述修饰的多肽通常在未修饰多肽的氨基酸序列中添加或取代链至少一个必需氨基酸。所述必需氨基酸选自苏氨酸，异亮氨酸，色氨酸，缬氨酸，精氨酸，赖氨酸，甲硫氨酸，或组氨酸。在一个优选实施方案中，所述修饰的多肽通常在未修饰多肽的氨基酸序列中取代至少一个必需氨基酸。在一个更优选的实施方案中，所述修饰的多肽通常在未修饰多肽的氨基酸序列中取代至少一个色氨酸或异亮氨酸残基。
本文中氨基酸的“取代”是指，将蛋白质中的一种氨基酸用另一种氨基酸代替。故“取代”不改变所修饰的蛋白质中氨基酸的总数。在一个优选实施方案中，所修饰的多肽能在细胞中积累。在另一实施方案中，所修饰的多肽能在种子中积累。本文中“在种子中积累”或者“在细胞中积累”是指，该多肽在种子或细胞中产生和维持的速度大于被降解的速度。在另一个优选实施方案中，所修饰的多肽能形成三聚体。本文中，当一种蛋白在细胞环境中被翻译时能自我装配并三聚体化，则该蛋白“能形成三聚体”。在一个优选实施方案中，所修饰的多肽的三聚体化水平是未修饰的多肽的三聚体化水平的10％，更优选20，30，40，50，60，70，80，90，95，和99％，如下文的实施例6所测定的那样。
修饰的多肽通常可以是适合于掺入动物膳食中的任何多肽。这种多肽优选选自，在给定的植物组织中以相对较高浓度表达的多肽，如种子贮藏蛋白， 营养贮藏蛋白，酶，或结构蛋白。修饰的多肽更优选修饰的β-伴大豆球蛋白，大豆球蛋白，7S贮藏球蛋白，11S贮藏球蛋白，清蛋白，谷醇溶蛋白，arcelin，或豆血红蛋白多肽。
在本发明的一个实施方案中，修饰的多肽在相对于未修饰多肽而言的至少1个，更优选2，3，4，5，6，7，8，9，10，11，12，13，14，15，16，17，18，19，20，21，22，23，24，25，30，35，40，45，或50个氨基酸位置具有赖氨酸残基取代。
在本发明的另一个实施方案中，修饰的多肽在相对于未修饰多肽而言的至少1个，更优选2，3，4，5，6，7，8，9，10，11，12，13，14，15，16，17，18，19，20，21，22，23，24，25，30，35，40，45，或50个氨基酸位置具有甲硫氨酸残基取代。
在本发明的另一个实施方案中，修饰的多肽在相对于未修饰多肽而言的至少1个，更优选2，3，4，5，6，7，8，9，10，11，12，13，14，15，16，17，18，19，20，21，22，23，24，25，30，35，40，45，或50个氨基酸位置具有苏氨酸残基取代。
在本发明的另一个实施方案中，修饰的多肽在相对于未修饰多肽而言的至少1个，更优选2，3，4，5，6，7，8，9，10，11，12，13，14，15，16，17，18，19，20，21，22，23，24，25，30，35，40，45，或50个氨基酸位置具有缬氨酸残基取代。
在本发明的另一个实施方案中，修饰的多肽在相对于未修饰多肽而言的至少1个，更优选2，3，4，5，6，7，8，9，10，11，12，13，14，15，16，17，18，19，20，21，22，23，24，25，30，35，40，45，或50个氨基酸位置具有精氨酸残基取代。
在本发明的另一个实施方案中，修饰的多肽在相对于未修饰多肽而言的至少1个，更优选2，3，4，5，6，7，8，9，10，11，12，13，14，15，16，17，18，19，20，21，22，23，24，25，30，35，40，45，或50个氨基酸位置具有组氨酸残基取代。
在一个优选实施方案中，修饰的多肽在相对于未修饰多肽而言的至少1个，更优选2，3，4，5，6，7，8，9，10，11，12，13，14，15，16，17，18，19，20，21，22，23，24，25，30，35，40，45，或50个氨基酸位置具有色氨酸残基取代。
在一个优选实施方案中，修饰的多肽在相对于未修饰多肽而言的至少1个，更优选2，3，4，5，6，7，8，9，10，11，12，13，14，15，16，17，18，19，20，21，22，23，24，25，30，35，40，45，或50个氨基酸位置具有异亮氨酸残基取代。
在一个更优选方面，修饰的多肽是β-伴大豆球蛋白多肽(SEQ ID NO1)，且该多肽在未修饰的β-伴大豆球蛋白序列(SEQ ID NO1，未显示出末端时就是SEQ ID NO2)中，选自N32；Y35；N40；N50；Y72；H88；Y116；H119；Y132；Y133；P137；Y158；Y172；E200；P239；Y249；P265；P324；Y330；Y346；N368；或Y411的至少1个，更优选2，3，4，5，6，7，8，9，10，11，12，13，14，15，16，17，18，19，20，21，或22个氨基酸位置，具有必需氨基酸色氨酸的取代。
修饰的多肽优选是β-伴大豆球蛋白多肽(SEQ ID NO1)，且该多肽在未修饰的β-伴大豆球蛋白序列(SEQ ID NO1，未显示出末端时就是SEQ IDNO2)中至少两个，更优选选自N32；L36；F46；G51；L56；F59；Q65；L66；Y72；R73；V75；Q76；L85；H88；F94；L95；L96；F97；V98；L99；R102；L105；L107；N117；L118；D121；Q124；R125；P127；Y132；Y133；L134；V135；P137；L143；K147；L148；P151；Y158；F162；Q169；L173；L181；V209；P239；F240；P247；F256；E258；T264；P265；L267；F273；L274；L285；L286；H288；N290；V295；L297；V298；N300；L308；V309；K317；K319；P324；L334；V339；F340；V341；Y346；F348；V350；L356；F358；L359；F361；N368；F372；F393；Y411；F412；或V413的至少2，3，4，5，6，7，8，9，10，11，12，13，14，15，16，17，18，19，20，21，22，23，24，25，26，27，28，29，30，31，32，34，35，36，37，38，39，40，41，42，43，44，45，46，47，48，49，50，51，52，53，54，55，56，57，58，59，60，61，62，63，64，65，66，67，68，69，70，71，72，73，或74，75，76，77，78，79，80，81，82，83，或84个氨基酸位置，具有必需氨基酸异亮氨酸的取代。
在一个优选实施方案中，所述修饰的多肽被进一步修饰，从而至少一种，更优选2，3或4种选自组氨酸，赖氨酸，甲硫氨酸或苯丙氨酸的必需氨基酸的含量增加。也可以产生其它氨基酸取代，以便能增强该多肽的结构和营养。
在本发明另一个优选实施方案中，修饰的多肽在未修饰的β-伴大豆球蛋白序列中，选自N32；Y35；N40；N50；Y72；H88；Y116；H119；Y132；Y133；P137；Y158；Y172；E200；P239；Y249；P265；P324；Y330；Y346；N368；或Y411的至少1个，更优选2，3，4，5，6，7，8，9，10，11，12，13，14，15，16，17，18，19，20，21，或22个氨基酸位置，具有必需氨基酸色氨酸的取代，并且在未修饰的β-伴大豆球蛋白序列中，选自N32；L36；F46；G51；L56；F59；Q65；L66；Y72；R73；V75；Q76；L85；H88；F94；L95；L96；F97；V98；L99；R102；L105；L107；N1 17；L118；D121；Q124；R125；P127；Y132；Y133；L134；V135；P137；L143；K147；L148；P151；Y158；F162；Q169；L173；L181；V209；P239；F240；P247；F256；E258；T264；P265；L267；F273；L274；L285；L286；H288；N290；V295；L297；V298；N300；L308；V309；K317；K319；P324；L334；V339；F340；V341；Y346；F348；V350；L356；F358；L359；F361；N368；F372；F393；Y411；F412；或V413的至少1个，更优选至少2，3，4，5，6，7，8，9，10，11，12，13，14，15，16，17，18，19，20，21，22，23，24，25，26，27，28，29，30，31，32，34，35，36，37，38，39，40，41，42，43，44，45，46，47，48，49，50，51，52，53，54，55，56，57，58，59，60，61，62，63，64，65，66，67，68，69，70，71，72，73，或74，75，76，77，78，79，80，81，82，83，或84个氨基酸位置，具有必需氨基酸异亮氨酸的取代。
在一个优选方面，修饰的β-伴大豆球蛋白多肽相对于未修饰的β-伴大豆球蛋白多肽包含一或多个必需氨基酸取代。在一个更优选的方面，修饰的β-伴大豆球蛋白多肽包括两个或更多个必需氨基酸取代，其中所述必需氨基酸是色氨酸和异亮氨酸。在一个优选方面，修饰的多肽具有至少1个，更优选2，3，4，5，6，7，8，9，10，11，12，13，14，15，16，17，18，19，20，21，22，23，24，25，26，27，28，29，30，31，32，34，35，36，37，38，39，40，41，42，43，44，45，46，47，48，49，50，51，52，53，54，55，56，57，58，59，60，61，62，63，64，65，66，67，68，69，70，71，72，73，74，75，76，77，78，79，80，81，82，83，84，85，86，87，88，89，90，91，92，93，94，95，96，97，98，99，100，101，102，103，104，105，106个色氨酸或异亮氨酸取代，为任意组合，其中色氨酸取代是N32；Y35；N40；N50；Y72；H88；Y116；H119；Y132；Y133；P137；Y158；Y172；E200；P239；Y249；P265；P324；Y330；Y346；N368；和Y411中的一个或更多个，异亮氨酸取代是N32；L36；F46；G51；L56；F59；Q65；L66；Y72；R73；V75；Q76；L85；H88；F94；L95；L96；F97；V98；L99；R102；L105；L107；N117；L1 18；D121；Q124；R125；P127；Y132；Y133；L134；V135；P137；L143；K147；L148；P151；Y158；F162；Q169；L173；L181；V209；P239；F240；P247；F256；E258；T264；P265；L267；F273；L274；L285；L286；H288；N290；V295；L297；V298；N300；L308；V309；K3 1 7；K319；P324；L334；V339；F340；V341；Y346；F348；V350；L356；F358；L359；F361；N368；F372；F393；Y411；F412；和V413中的一个或更多个。
修饰的多肽还可以进一步修饰以便提供额外的所需特性。例如，修饰的多肽可以通过进一步修饰而增加其它必需氨基酸的含量，增强氨基酸序列的翻译，改变翻译后修饰(例如，磷酸化或糖基化位点)，将该多肽转运到细胞内侧或外侧的空间中，插入或删除细胞信号传递基元，等。
在本发明另一个实施方案中，修饰的多肽在相对于未修饰多肽的至少1个，更优选至少2，3，4，5，6，7，8，9，10，11，12，13，14，15，16，17，18，19，20，21，22，23，24，25，约30，约35，约40，约45，或约50个氨基酸位置，具有选自异亮氨酸、赖氨酸、甲硫氨酸、苏氨酸、色氨酸、缬氨酸、精氨酸或组氨酸的一个或更多个，两个或更多个，或者三个或更多个氨基酸残基的取代。
在一个优选实施方案中，修饰的蛋白与未修饰的多肽相比，苏氨酸，异亮氨酸，色氨酸，缬氨酸，或精氨酸，或它们的任意组合，的含量增加超过0.25％，0.5％，1％，2％，3％，5％，7％，10％，15％或20％(重量比)。
在一个优选实施方案中，修饰的β-伴大豆球蛋白多肽未修饰的β-伴大豆球蛋白多肽相比，苏氨酸，异亮氨酸，色氨酸，缬氨酸，或精氨酸，或它们的任意组合，的含量增加超过0.25％，0.5％，1％，2％，3％，5％，7％，10％，15％或20％(重量比)。
核酸分子本发明包括并提供一种编码本发明修饰多肽的重组核酸分子，所述多肽的必需氨基酸水平增加。
核酸杂交是DNA操作领域技术人员已知的技术。一对具体核酸的杂交特性可指示它们的相似性或同一性。
核酸分子优选在低度、中度、或高度严格条件下，与本发明的任何核酸序列杂交。
杂交条件通常包括在0.1X-约10X SSC(由含有3M氯化钠和0.3M柠檬酸钠，pH 7.0的20X SSC原液用蒸馏水稀释而成)，约2.5X-约5XDenhardt溶液(由含有1％(w/v)牛血清白蛋白，1％(w/v)ficoll，和1％(w/v)聚乙烯吡咯烷酮的50X原液用蒸馏水稀释而成)，约10mg/mL-约100mg/mL鱼精DNA，以及约0.02％(w/v)-约0.1％(w/v)SDS中进行核酸杂交，于大约20℃-大约70℃保温数小时到保温过夜。优选杂交条件为6X SSC，5XDenhardt溶液，100mg/mL鱼精DNA，和0.1％(w/v)SDS，55℃保温数小时。
杂交之后通常进行数个洗涤步骤。洗涤组合物通常包含0.1X-约10XSSC，以及0.01％(w/v)-约0.5％(w/v)SDS，约20℃-约70℃保温15分钟。优选地，当在0.1X SSC中65℃洗涤至少一次以后，核酸片段仍保持杂交。例如，洗涤步骤中的盐浓度可以从低度严格条件的约2.0X SSC、50℃到约高度严格条件的0.2X SSC、65℃中选择。此外，洗涤步骤中的温度可以从低度严格条件的室温，约22℃，增加到高度严格条件的约65℃。温度和盐都可以变动，也可以使温度和盐浓度这二者之一保持恒定而改变另一个。
低度严格条件可用于选择与靶核酸序列的序列同一性较低的核酸序列。可以采用诸如如下的条件进行洗涤约6.0X SSC-约10X SSC、约20℃-约55℃，优选核酸分子在约6.0X SSC和约45℃的低度严格条件下与本发明的一或多种核酸分子杂交。在一个优选实施方案中，核酸分子在约2.0X SSC和约65℃的中度严格条件下与本发明的一或多种核酸分子杂交。在一个特别优选的实施方案中，本发明的核酸分子在约0.2X SSC和约65℃的高度严格条件下与上述核酸分子杂交。
本发明的核酸序列优选与编码本文所述任何多肽，其互补序列，或其任意片段的互补核酸序列杂交。
本发明的核酸序列优选在低度严格条件下，与编码本文所述任何多肽，其互补序列，或其任意片段的互补核酸序列杂交。
本发明的核酸序列优选在高度严格条件下，与编码本文所述任何多肽，其互补序列，或其任意片段的互补核酸序列杂交。
序列同一性百分比优选用Sequence Analysis Software PackageTM(版本10；Genetics Computer Group，Inc.，University of Wisconsin BiotechnologyCenter，Madison，WI)的“Best Fit”或“Gap”程序来确定。“Gap”是利用Needleman和Wunsch的算法(Needleman和Wunsch，1970)来找出两个序列的对比排列，它使匹配数最大并使空隙数最小。“BestFit”是对两个序列之间的最相似片段进行最佳对比排列，它还利用Smith和Waterman的局部同源性算法(Smith和Waterman，1981；Smith等，1983)插入空隙以便使匹配数最大。同一性百分比最优选用“Best Fit”程序及其默认参数来确定。
在一个实施方案中，所述片段为本发明核酸分子的3000-1000个连续核苷酸，1800-150个连续核苷酸，1500-500个连续核苷酸，1300-250个连续核苷酸，1000-200个连续核苷酸，800-150个连续核苷酸，500-100个连续核苷酸，300-75个连续核苷酸，100-50个连续核苷酸，50-25个连续核苷酸，或20-10个连续核苷酸。
在另一实施方案中，所述片段包含本发明核酸序列的至少20，30，40或50个连续核苷酸。
启动子在一个优选实施方案中，本文所公开的任何一种核酸分子可以与启动子可操作相连。在一个特别优选的实施方案中，启动子选自11S大豆球蛋白启动子，USP蚕豆(Vicia faba)启动子，或7Sα启动子。在另一个实施方案中，启动子具有组织或器官特异性，优选种子特异性。
在一个方面，如果mRNA在一种组织或器官中的表达水平比在另一种组织或器官中的表达水平高出至少10倍，优选至少约100倍或至少约1,000倍，则认为该启动子是特异于该组织或器官的。mRNA的水平可以在单个时间点测量，也可以在多个时间点测量，从而倍数增加可以是平均倍数增加，或者是从实验测量值外推得到的值。由于这是水平的比较，因此可以使用任何测量mRNA的方法。在一个优选方面，进行比较的组织或器官是种子或带有叶片或叶片组织的种子组织。在另一个优选方面，对多个组织或器官进行比较。优选的多重比较是将种子或种子组织与选自下组的二、三、四或更多种组织或器官进行比较花组织，花原端，花粉，叶，胚，苗，叶原基，苗端，根，根尖，维管组织和子叶。本文中植物器官的例子是，种子，叶，根等，组织的例子是叶原基，苗端，维管组织等。
启动子的活性或强度可用mRNA的量或该RNA所特别产生的蛋白的积累量相对于mRNA或蛋白的总量来定量。所述启动子优选表达可操作连接的核酸序列，其水平占总mRNA的2.5％以上；更优选占5，6，7，8，或9％以上；还更优选占10，11，12，13，14，15，16，17，18，或19％以上；最优选占20％以上。
或者，启动子的活性或强度可表示为已知启动子(其转录活性已经过评估)的相对量。例如，可将目标启动子与报告序列(例如，GUS)可操作相连，并将其引入特定类型的细胞。用类似方法制备已知启动子，将其引入相同的细胞内环境中。通过比较相对于已知启动子而言的报告分子表达量，可确定目标启动子的转录活性。细胞内环境优选大豆。
修饰的结构核酸序列本发明的核酸还可与异源的修饰型结构核酸序列相连。可以对结构核酸序列进行修饰，以便提供各种所需特性。例如，可以对结构核酸序列进行修饰以增加必需氨基酸的含量，促进对氨基酸序列的翻译，改变翻译后修饰(例如，磷酸化位点)，将翻译出的产物转运至细胞的内侧或外侧的空间中，增加蛋白的稳定性，插入或删除细胞信号传递基序，等等。
核酸序列中的密码子应用特点由于遗传密码的简并性，可以用不同的核苷酸密码子编码给定的氨基酸。宿主细胞常常表现出优选的密码子应用模式。优选结构核酸序列经过构建能利用具体宿主细胞的密码子应用模式。这通常能增强该结构核酸序列在转化的宿主细胞中的表达。可对上述任一种核酸和氨基酸序列进行修饰，以反映容纳它们的宿主细胞或生物所优选的密码子应用特性。在植物中修饰结构核酸序列，使密码子应用最优化的方法可参见美国专利5,689,052。
对结构核酸序列的其它修饰上述结构核酸序列中的其它变化可编码出与改造前的蛋白相比等效或更优秀的蛋白。突变包括对基序序列进行缺失，插入，截短，取代，融合，改组等。
对结构核酸序列的突变可通过特定方式或随机方式引入，这两种方式都是分子生物学领域技术人员已知的。定点诱变技术有很多种，它们通常利用寡核苷酸将突变引入结构核酸序列中的特定位置。实例包括单链拯救(Kunkel等，1985)，唯一位点的消除(Deng和Nickloff，1992)，切口(nick)保护(Vandeyar等，1988)，及PCR(Costa等，1996)。随机或非特异性突变可通过化学试剂产生(综述参见，Singer和Kusmierek，1982)，如亚硝基胍(Cerda-Olmedo等，1968；Guerola等，1971)和2-氨基嘌呤(Rogan和Bessman，1970)；或通过生物学方法产生，如由突变株传代(Greener等，1997)。
对核酸序列的修饰可以导致或不导致氨基酸序列中的改变。由于遗传密码简并性导致的改变不影响改变后的密码子所编码的氨基酸。在一个优选实施方案中，编码修饰蛋白的核酸有5-500个这样的改变，更优选10-300个改变，还更优选25-150个改变，最优选1-25个改变。在另一优选实施方案中，本发明核酸分子包括与如此修饰的核酸分子有80，85，90，95或99％的序列同一性的那些核酸分子。在另一实施方案中，本发明的核酸分子包括与如此修饰的核酸分子杂交的那些核酸分子，以及在低度或高度严格条件下与如此修饰的核酸分子杂交的那些核酸分子。
第二种改变包括在核酸序列中进行添加、删除和取代，它们可导致改变氨基酸序列。在一个优选实施方案中，编码修饰蛋白的核酸有5-500个这样的改变，更优选10-300个改变，还更优选25-150个改变，最优选1-25个改变。在另一优选实施方案中，本发明核酸分子包括与如此修饰的核酸分子有80，85，90，95或99％的序列同一性的那些核酸分子。在另一实施方案中，本发明的核酸分子包括与如此修饰的核酸分子杂交的那些核酸分子，以及在低度或高度严格条件下与如此修饰的核酸分子杂交的那些核酸分子。
产生上述改变的其它方法参见Ausubel等(1995)；Bauer等(1985)；Craik(1985)；Frits Eckstein等(1982)；Sambrook等(1989)；Smith等(1981)；Osuna等(1994)。
可以对本发明的蛋白序列以及编码它们的核酸节段进行修饰但保留所述分子的所需特性。以下是关于对蛋白的氨基酸序列进行改变来产生等效，或者可能更优良的第二代分子的讨论。氨基酸改变可以通过改变结构核酸序列的密码子来实现，密码子参见表1。
表1氨基酸的密码子简并性
可以在不明显损失所需活性的前题下，将蛋白序列中特定的氨基酸取代为其它氨基酸。从这一点上来看，可以在所公开的蛋白序列的肽序列，或它们的相应核酸序列中进行多种改变而不明显损失生物活性。
在制造这类改变时，可考虑氨基酸的疏水/亲水倾向性指数。氨基酸的疏水/亲水倾向性指数在赋于蛋白质以交互式生物功能方面的重要性已为领域内广泛理解(Kyte和Doolittle，1982)。可以接受的是，氨基酸的相对疏水/亲水倾向性决定所得蛋白的二级结构，而后者又限定了该蛋白与其它分子，如酶，底物，受体，DNA，抗体，抗原等的相互作用。
每种氨基酸基于其疏水性和荷电特性而分配了一个疏水/亲水倾向性指数。具体是异亮氨酸(+4.5)；缬氨酸(+4.2)；亮氨酸(+3.8)；苯丙氨酸(+2.8)；半胱氨酸/半胱氨酸(+2.5)；甲硫氨酸(+1.9)；丙氨酸(+1.8)；甘氨酸(-0.4)；苏氨酸(-0.7)；丝氨酸(-0.8)；色氨酸(-0.9)；酪氨酸(-1.3)；脯氨酸(-1.6)；组氨酸(-3.2)；谷氨酸/谷氨酰胺/天冬氨酸/天冬酰胺(-3.5)；赖氨酸(-3.9)；精氨酸(-4.5)。
本领域已知，特定氨基酸可以被具有相似疏水/亲水倾向性指数或评分的其它氨基酸取代，所得蛋白质仍具有相似的生物活性，即，仍能获得生物功能性蛋白。在制造这类改变时，疏水/亲水倾向性指数在±2以内的氨基酸的取代为优选，在±1以内的为更优选，在±0.5以内的为最优选。
本领域也能理解，可以在亲水性的基础上有效地进行相似氨基酸的取代。美国专利4,554,101(Hopp，T.P，1985年11月19日授权)称，一种蛋白质上受其邻接氨基酸的亲水性控制的最大局部平均亲水性与该蛋白的生物学特性相关。氨基酸的亲水值如下精氨酸/赖氨酸(+3.0)；天冬氨酸/谷氨酸(+3.0±1)；丝氨酸(+0.3)；天冬酰胺/谷氨酰胺(+0.2)；甘氨酸(0)；苏氨酸(-0.4)；脯氨酸(-0.5±1)；丙氨酸/组氨酸(-0.5)；半胱氨酸(-1.0)；甲硫氨酸(-1.3)；缬氨酸(-1.5)；亮氨酸/异亮氨酸(-1.8)；酪氨酸(-2.3)；苯丙氨酸(-2.5)；色氨酸(-3.4)。
可理解，一种氨基酸可以被具有相似的亲水评分值的另一种氨基酸取代，所得蛋白质仍具有相似的生物活性，即，仍能获得生物功能性蛋白。在制造这类改变时，疏水/亲水倾向性指数在±2以内的氨基酸的取代为优选，在±1以内的为更优选，在±0.5以内的为最优选。
综上所述，氨基酸取代因此是基于氨基酸侧链取代基的相对相似性，例如，它们的疏水性，亲水性，电荷，大小，等等。涉及上述多种特性的取代实例为本领域众所周知，它们包括精氨酸和赖氨酸；谷氨酸和天冬氨酸；丝氨酸和苏氨酸；谷氨酰胺和天冬酰胺；缬氨酸，亮氨酸，和异亮氨酸。对于不能预计有利的那些改变，如果能使所得的蛋白质与原始未经改造的多肽相比，瘤胃抗性增强和/或对蛋白裂解性降解作用的抗性增强，则也可以使用。
重组载体上述任何启动子和结构核酸序列都可提供在重组载体中。重组载体通常按5’至3’方向依次包含能指导结构核酸序列转录的启动子，以及结构核酸序列。重组载体还可根据需要而包含3’转录终止子，3’聚腺苷酸化信号，其它非翻译核酸序列，转位及靶向核酸序列，选择标记，增强子，和操纵子。
制备重组载体的方式为本领域已知。制备特别适于植物转化的重组载体的方法可参见美国专利4,971,908，4,940,835，4,769,061和4,757,011。对这些类型的载体已有综述(Rodriguez等，1988；Glick等，1993)。
用于在高等植物中进行核酸表达的典型载体为本领域已知，包括来自根癌土壤杆菌(Agrobacterium tumefaciens)的肿瘤诱导(Ti)质粒的载体(Rogers等，1987)。其它可用于植物转化的重组载体，包括pCaMVCN转移控制载体，也已有记载(Fromm等，1985)。
重组载体中的附加启动子重组载体中还可提供一个或更多个附加启动子。这些启动子可以，例如，但不限于，与上述任何结构核酸序列可操作相连。或者，所述启动子可与其它核酸序列，如编码转位肽、选择标记蛋白的那些序列、或反义序列，可操作相连。
这些附加启动子可根据载体所要插入的细胞的类型来选择。在细菌、酵母和植物中具有功能的启动子为本领域已知。附加的启动子还可以根据它们的调节特性来选择。这些特性的实例包括对转录活性、诱导能力、组织特异性、以及发育阶段特异性的强化作用。已有文献描述了植物中的诱导型启动子，病毒来源的或合成的启动子，组成型启动子，时间调节型启动子，以及空间调节型启动子(Poszkowski等，1989；Odell等，1985；Chau等，1989)。
常用的组成型启动子包括CaMV 35S启动子(Odell，J.T.等，1985)，增强型CaMV 35S启动子，玄参花叶病毒(FMV)启动子(Richins等，1987)，甘露氨酸合成酶(mas)启动子，胭脂氨酸合成酶(nos)启动子，以及章鱼氨酸合成酶(ocs)启动子。
有用的诱导型启动子包括由水杨酸或聚丙烯酸诱导的启动子(PR-1；Williams，S.W.等，1992)，由于应用安全剂而诱导的启动子(取代的苯磺酰胺除草剂；Hershey and Stoner.，1991)，热休克启动子(Ou-Lee等，1986；Ainley等，1990)，来源于菠菜亚硝酸根还原酶结构核酸序列的硝酸根诱导型启动子(Back等，1991)，激素诱导型启动子(Yamaguchi-Shinozaki等，1990；Kares等，1990)，与RuBP羧化酶和LHCP家族的小亚单位结合的光诱导型启动子(Kuhlemeier等，1989；Feinbaum等，1991；Weisshaar等，199l；Lam and Chua，1990；Castresana等，1988；Schulze-Lefert等，1989)。
有用的组织特异性或器官特异性启动子的实例包括β-伴大豆球蛋白7Sα’启动子(Doyle，J.J.等，1986；Slighton and Beachy，1987)，和其它种子-特异性启动子(Knutzon等，1992；Bustos等，1991；Lam and Chua，1991；Stayton等，1991)。可用于在种子质体中优先表达的植物功能性启动子，包括来自植物贮藏蛋白的启动子，以及来自与含油种子中脂肪酸生物合成有关的蛋白的启动子。这类启动子的实例包括下列结构核酸序列的5’调节区napin(Kridl等，1991)，菜豆蛋白，玉米醇溶蛋白，大豆胰蛋白酶抑制剂，ACP，硬脂酰-ACP去饱和酶，和油质蛋白。对种子-特异性调节作用的描述可参见EP 0 255 378。
另一例种子特异性启动子是凝集素启动子。大豆种子中的凝集素蛋白由单个结构核酸序列(Lel)编码，该序列仅在种子成熟期表达。凝集素结构核酸序列和种子特异性启动子已被鉴定出，并用于指导转基因烟草植物中的种子特异性表达(Vodkin等，1983；Lindstrom等，1990)。
重组载体中特别优选的附加启动子包括携带在根癌土壤杆菌肿瘤诱导质粒上的胭脂氨酸合成酶(nos)启动子，甘露氨酸合成酶(mas)启动子，以及章鱼氨酸合成酶(ocs)启动子；花椰菜花叶病毒(CaMV)19S和35S启动子；增强型CaMV 35S启动子；玄参花叶病毒(FMV)35S启动子；核酮糖-1，5-二磷酸羧化酶(ssRUBISCO)小亚单位的光诱导型启动子；烟草EIF4A启动子(Mandel等，1995)；谷物蔗糖合成酶1(Yang和Russell，1990)；谷醇脱氢酶1(Vogel等，1989)；谷物光收获复合物(Simpson，1986)；谷物热休克蛋白(Odell等，1985)；拟南芥壳多糖酶启动子(Samac等，1991)；花椰菜LTP(脂转移蛋白)启动子(Pyee等，1995)；矮牵牛查耳酮异构酶(Van Tunen等，1988)；菜豆甘氨酸富集蛋白1(Keller等，1989)；土豆patatin(Wenzler等，1989)；玉米遍在蛋白启动子(Christensen等，1992)；以及水稻肌动蛋白启动子(McElroy等，1990)。
附加启动子优选具有种子选择性，组织选择性，为组成型或诱导型。最优选的启动子为胭脂氨酸合成酶(nos)，章鱼氨酸合成酶(ocs)，甘露氨酸合成酶(mas)，花椰菜花叶病毒19S和35S(CaMV19S，CaMV35S)，增强型CaMV(eCaMV)，核酮糖-1，5-二磷酸羧化酶(ssRUBISCO)，玄参花叶病毒(FMV)，CaMV衍生的AS4，烟草RB7，小麦POX1，烟草EIF-4，凝集素蛋白(Lel)，或水稻RC2的启动子。
带有附加的结构核酸序列的重组载体重组载体还可包含一或多个附加的结构核酸序列。这些附加结构核酸序列通常为适于在重组载体中使用的任何序列。这样的结构核酸序列包括，但不限于，上述任一种结构核酸序列及其修饰形式。附加结构核酸序列还可与上述任一种启动子可操作相连。所述一或多个结构核酸序列可分别与不同(separate)启动子可操作相连。或者，多个结构核酸序列可与单个启动子可操作相连(即，单个操纵子)。
附加结构核酸序列优选编码种子贮藏蛋白，除草剂抗性蛋白，疾病抗性蛋白，脂肪酸生物合成酶，维生素E生物合成酶，氨基酸生物合成酶，或杀虫蛋白。优选的结构核酸序列包括，但不限于，γ甲基转移酶、叶绿基异戊烯转移酶、β-酮脂酰-CoA合酶、脂酰CoA还原酶、脂酰CoA脂醇转酰酶、邻氨基苯甲酸合酶、苏氨酸脱氨酶、乙酰羟酸合成酶、天冬氨酸激酶、二羟酸合成酶、天冬氨酸激酶、二氢吡啶甲酸合成酶、硫酯酶、7Sa种子贮藏蛋白、11S种子贮藏蛋白、大豆球蛋白、β-伴大豆球蛋白、菜豆蛋白、玉米球蛋白-1、玉米醇溶蛋白、种子清蛋白、或种子凝集素。
或者，可将第二种结构核酸序列设计成能下调特定的核酸序列。这通常通过将第二种结构氨基酸按照反义方向与启动子可操作相连来实现。本领域技术人员很熟悉这类反义技术。该方法也已在上文中简述。任何核酸序列都可能以这种方式进行负调节。优选的目标核酸序列包含低含量的必需氨基酸、但在特定组织中以相对较高水平表达。例如，β-伴大豆球蛋白和大豆球蛋白都在种子中大量表达，但在营养方面缺少必需氨基酸。这种反义方法也可用于有效除去植物来源的食物中其它不想要的蛋白，如拒食剂(例如，凝集素)，清蛋白，和变应原。
选择标记重组载体还可包含选择标记。能用作选择标记的核酸序列产生细胞表型，使这些细胞比不含该标记的细胞更容易被鉴定。
选择标记的实例包括，但不限于neo基因(Potrykus等，1985)，它编码卡那霉素抗性基因，可用卡那霉素，G418等进行筛选；bar基因，它编码bialaphos抗性；突变的EPSP合成酶基因(Hinchee等，1988)，它编码草甘膦抗性；腈水解酶基因，它赋予对溴苯腈的抗性(Stalker等，1988)；突变的乙酰乳酸合成酶基因(ALS)，它赋予对咪唑啉酮或磺脲的抗性(欧洲专利申请0154204)；绿色荧光蛋白(GFP)；以及氨甲喋呤抗性DHFR基因(Thillet等，1988)。
选择标记的其它实例包括β-葡萄糖醛酸糖苷酶或uidA基因(GUS)，它编码一种酶，该酶的多种显色底物是已知的(Jefferson(I)，1987；Jefferson(II)等，1987)；一种R-座基因，它编码一种产物，该产物调节植物组织中花色素苷(红色)的产生(Dellaporta等，1988)；β-内酰胺酶基因(Sutcliffe等，1978)，它编码一种酶，该酶的多种显色底物是已知的(例如，PADAC，一种显色的头孢菌素)；萤光素酶基因(Ow等，1986)；xy1E基因(Zukowsky等，1983)，它编码一种儿茶酚双加氧酶，此酶可转化显色型儿茶酚；α-淀粉酶基因(Ikatu等，1990)；酪氨酸酶基因(Katz等，1983)，它编码一种能将酪氨酸氧化为DOPA和多巴醌(dopaquinone，进一步浓缩为黑色素)的酶；α-半乳糖苷酶，可使α-半乳糖底物颜色发生转变。
术语“选择标记”还包括编码选择标记的基因，所述选择标记是指其检测可作为鉴定或筛选转化细胞的手段的那些。实例包括编码可通过抗体相互作用予以鉴定的分泌型抗原的标记物，或甚至可通过催化检测的分泌型酶。分泌型选择标记蛋白可分为数类，包括可通过(例如，ELISA)检测的小分子可扩散型蛋白，可在胞外溶液中检测到的小分子活性酶(例如，α-淀粉酶，β-内酰胺酶，膦丝菌素转移酶)，或者插入或陷落在细胞壁中的蛋白(如包含前导序列的蛋白，如发现于延伸的表达单元中的蛋白，或烟草PR-S)。其它可能的选择标记基因对本领域技术人员而言是显而易见的。
选择标记优选为GUS，绿色荧光蛋白(GFP)，新霉素磷酸转移酶II(nptII)，萤光素酶(LUX)，抗生素抗性编码序列，或除草剂(例如，草甘膦)抗性编码序列。选择标记最优选卡那霉素，潮霉素，或除草剂抗性标记。
重组载体中的其它元件各种具有顺式作用的非翻译5’和3’调节序列也可以包括在重组核酸载体中。任何这类调节序列可在重组载体中伴有其它调节序列。可通过设计或改变这类组合来产生所需的调节特征。
3’非翻译区通常提供转录终止信号，聚腺苷酸化信号，后者在植物中能导致腺苷酸添加在mRNA的3’末端。这可通过下述序列的3’区实现胭脂氨酸合成酶(nos)编码序列，大豆7Sα’贮藏蛋白编码序列，Arcelin-5编码序列，清蛋白编码序列，以及豌豆ssRUBISCO E9编码序列。特别优选的3’核酸序列包括Arcelin-5 3’，nos 3’，E9 3’，adr12 3’，7Sα 3’，11 S 3’，USP3’，以及清蛋白3’。
位于距聚腺苷酸化位点数百个碱基对的下游处的核酸序列通常可终止转录。这些区是转录的mRNA进行有效腺苷酸化所必需的。
重组载体中还可掺入翻译增强子。因此，重组载体优选包含一或多个5’非翻译前导序列，以便增强核酸序列的表达。这类增强子序列预计能增强或改变所得mRNA的翻译效力。优选的5’核酸序列包括dSSU 5’，PetHSP705’，和GmHSP17.95’。
重组载体还可包含编码转位肽的核酸序列。这种肽可用于将蛋白引到胞外空间，叶绿体，或细胞内侧或外侧的其它空间中(参见，例如欧洲专利申请公开号0218571)。
重组载体中的结构核酸序列可包含内含子。这些内含子可以与结构核酸序列有不同来源。优选的内含子包括水稻肌动蛋白内含子和谷物HSP70内含子。
融合蛋白上述任一种结构核酸序列及其修饰形式可与附加的核酸序列相连，以编码融合蛋白。所述附加的核酸序列优选编码至少一个氨基酸，肽，或蛋白。融合蛋白的制备是本领域的常规技术，有多种可能的融合组合。
例如，融合蛋白可提供便于检测该融合蛋白的“标记”表位，如GST，GFP，FLAG或polyHIS。这类融合优选编码1-50个氨基酸，更优选5-30个附加的氨基酸，还更优选5-20个氨基酸。
或者，所述融合可提供调节功能、酶活性、细胞信号传递功能、或细胞内转运功能。例如，可添加编码叶绿体转运肽的序列，以便将融合蛋白引向植物细胞内部的叶绿体。这类融合配对物优选编码1-1000个附加的氨基酸，更优选5-500个附加的氨基酸，还更优选10-250个氨基酸。
序列分析本发明中，序列相似性或同一性优选用Sequence Analysis SoftwarePackage(Version 10；Genetics Computer Group，Inc.，University of WisconsinBiotechnology Center，Madison，WI)中的“Best Fit”或“Gap”程序来确定。“Gap”程序利用Needleman和Wunsch的算法(Needleman和Wunsch，1970)寻找两个序列之间能使匹配数最大而使空隙数最小的对比排列。“BestFit”程序是对两个序列之间相似性的最佳节段进行最佳对比排列。用Smith和Waterman的局部同源性算法(Smith和Waterman，1981；Smith等，1983)，通过插入空隙，使匹配数最大化，可找出最佳对比排列。
上述Sequence Analysis Software Package还包含数个另外的序列分析工具，它们可用于鉴定本发明核苷酸和氨基酸序列的同源性。例如，“BLAST”程序(Altschul等，1990)在特定的数据库(例如，National Center forBiotechnology Information(NCBI)，Bethesda，Maryland，USA的数据库)中搜索与查询(query)序列(肽或核酸)相似的序列；“FastA”(Lipman和Pearson，1985；see also Pearson and Lipman，1988；Pearson等，1990)对查询序列与一组相同类型的序列(核酸或蛋白)之间的相似性进行Pearson and Lipman搜索；“TfastA”对查询序列与任意组核苷酸序列之间的相似性进行Pearson andLipman搜索(它先翻译出所有6个读码框中的核苷酸序列，然后进行比较)；“FastX”对核苷酸查询序列与一组蛋白序列之间的相似性进行Pearson andLipman搜索，它考虑了移码效应；“TfastX”对蛋白查询序列与任意组核苷酸序列之间的相似性进行Pearson and Lipman搜索，它考虑了移码效应(它先对核酸序列的两条链都进行翻译，然后进行比较)。
探针和引物本发明中，可制备并利用能与互补核酸序列特异性杂交的短核酸序列。这些短核酸分子可作为探针用于鉴定给定的样品中互补核酸序列的存在。因此，通过构建与特定核酸序列的一小部分互补的核酸探针，可检测和评估该核酸序列的存在。
本文公开的任何核酸序列都可以用作引物或探针。这些探针的应用可大大促进对含本文公开之启动子和结构核酸序列的转基因植物的鉴定。这些探针还可用于在cDNA文库或基因组文库中筛选与本文公开之启动子和结构核酸序列相关或同源的其它核酸序列。
或者，可用上述短核酸序列作为寡核苷酸引物，利用PCR技术使互补核酸序列扩增或突变。这些引物还可促进对相关互补核酸序列的扩增(例如来自其它物种的相关核酸序列)。
短核酸序列可用作探针，尤其是作为PCR探针。PCR探针是在与另一核酸所形成的双链结构中能启动聚合酶活性的核酸分子。确定PCR探针的结构的各种方法以及PCR技术都是本领域已知的。例如，可用诸如Primer3(www.genome.wi.mit.edu/cgi-bin/primer/primer3.cgi)，STSPipeline(www-genome.wi.mit.edu/cgi-bin/www.STS_Pipeline)，或GeneUp(Pesole等，1998)等计算机搜索程序来鉴定潜在的PCR引物。
引物或探针通常与将要被鉴定、扩增、或突变的核酸序列的一部分互补。引物或探针的长度应足以与其互补体形成稳定的序列特异性双链分子。引物或探针的长度优选为约10-200个核苷酸，更优选为约10-100个核苷酸，还更优选为约10-50个核苷酸，最优选为约14-30个核苷酸。
引物或探针可直接化学合成，通过PCR(美国专利4,683,195和4,683,202)制备，或通过从较大的核酸分子中切出特异性核酸片段而制备。
转基因植物和经过转化的植物宿主细胞本发明还涉及转基因植物和转化植物细胞，它们按照5’至3’方向包含启动子以及与其可操作相连的异源结构核酸序列。其它核酸序列也可与上述启动子和结构核酸序列一起引入植物或宿主细胞中。所述其它序列可包括3’转录终止子，3’聚腺苷酸化信号，其它非翻译核酸序列，转位或靶向序列，选择标记，增强子，和操纵子。本发明优选的核酸序列包括重组载体，结构核酸序列，启动子，及其它调节元件，都已在上文中描述。
制备这样的重组载体的方法是本领域已知的。例如，制备特别适于植物转化的重组载体的方法可参见美国专利4,971,908，4,940,835，4,769,061和4,757,011。这些载体已有相关综述(Rodriguez等，1988；Glick等，1993)并且已在上文中描述。
可用细胞和高等植物中的表达的典型载体是本领域已知的，如衍生自根癌土壤杆菌(Agrobacterium tumefaciens)肿瘤诱导(Ti)质粒的载体(Rogers等，1987)。其它可用于植物转化的重组载体也已有描述(Fromm等，1985)。这类重组载体的元件如上文所述。
被转化的植物细胞或植物通常可以是能容于本发明的任何细胞或植物。
植物或植物细胞优选苜蓿，苹果，香蕉，大麦，菜豆，花椰菜，甘蓝，胡萝卜，蓖麻，芹菜，柑桔，三叶草，椰子，咖啡，玉米(corn)，棉花，黄瓜，道格拉斯冷杉，桉，大蒜，葡萄，亚麻子，火炬松，甜瓜，燕麦，油橄榄，洋葱，棕榈，防风，豌豆，花生，胡椒，杨树，马铃薯，萝卜，Radiatapine，油菜籽，稻，黑麦，高梁，狭叶羽扇豆，Southern pine，菠菜，草莓，甜菜，甘蔗，向日葵，枫香，茶，烟草，番茄，turf，或小麦植物或细胞。在还更优选的实施方案中，所述植物或植物细胞是大豆。
大豆细胞或大豆植物优选大豆优良品系。“优良品系”是经过育种和筛选而得到的具有出色的农艺表现的任何品系。优良品系的实例有面向农民或大豆种植者出售的品系，如HARTZTM品种H4994，HARTZTM品种H5218，HARTZTM品种H5350，HARTZTM品种H5545，HARTZTM品种H5050，HARTZTM品种H5454，HARTZTM品种H5233，HARTZTM品种H5488，HARTZTM品种HLA572，HARTZTM品种H6200，HARTZTM品种H6104，HARTZTM品种H6255，HARTZTM品种H6586，HARTZTM品种H6191，HARTZTM品种H7440，HARTZTM品种H4452 Roundup Ready，HARTZTM品种H4994 Roundup Ready，HARTZTM品种H4988 Roundup Ready，HARTZTM品种H5000 Roundup ReadyTM，HARTZTM品种H5147 Roundup ReadyTM，HARTZTM品种H5247 Roundup Ready，HARTZTM品种H5350 RoundupReadyTM，HARTZTM品种H5545 Roundup ReadyTM，HARTZTM品种H5855Roundup Ready，HARTZTM品种H5088 Roundup ReadyTM，HARTZTM品种H5164 Roundup ReadyTM，HARTZTM品种H5361 Roundup ReadyTM，HARTZTM品种H5566 Roundup ReadyTM，HARTZTM品种H5181 Roundup ReadyTM，HARTZTM品种H5889 Roundup ReadyTM，HARTZTM品种H5999 RoundupReadyTM，HARTZTM品种H6013 Roundup ReadyTM，HARTZTM品种H6255Roundup ReadyTM，HARTZTM品种H6454 Roundup ReadyTM，HARTZTM品种H6686 Roundup ReadyTM，HARTZTM品种H7152 Roundup ReadyTM，HARTZTM品种H7550 Roundup ReadyTM，HARTZTM品种H8001 Roundup Ready(HARTZ SEED，Stuttgart，Arkansas，U.S.A.)；A0868，AG0901，A1553，A1900，AG1901，A1923，A2069，AG2101，AG2201，A2247，AG2301，A2304，A2396，AG2401，AG2501，A2506，A2553，AG2701，AG2702，A2704，A2833，A2869，AG2901，AG2902，AG3001，AG3002，A3204，A3237，A3244，AG3301，AG3302，A3404，A3469，AG3502，A3559，AG3601，AG3701，AG3704，AG3750，A3834，AG3901，A3904，A4045 AG4301，A4341，AG4401，AG4501，AG4601，AG4602，A4604，AG4702，AG4901，A4922，AG5401，A5547，AG5602，A5704，AG5801，AG5901，A5944，A5959，AG6101，QR4459和QP4544(Asgrow Seeds，DesMoines，Iowa，U.S.A.)；DeKalb品种CX445(DeKalb，Illinois)。
本发明还涉及制备转化的植物的方法，所述植物包含按照5’至3’方向排列的本发明核酸序列。还可将其它序列与启动子和结构核酸序列一起引入所述植物中。所述其它序列可包括3’转录终止子，3’聚腺苷酸化信号，其它非翻译序列，转位或靶向序列，选择标记，增强子，以及操纵子。优选的重组载体，结构核酸序列，启动子，和其它调节元件，如本文所述。
所述方法通常包括选择合适的植物，用重组载体转化该植物，和获得转化的宿主细胞。
有多种方法可将核酸引入植物。适当的方法包括细菌感染(例如土壤杆菌)，二元细菌人工染色体载体，DNA的直接运送(例如经由PEG-介导的转化，干燥/抑制作用-介导的DNA摄入，电穿孔，用碳化硅纤维进行的搅拌，以及对核酸包被的粒子进行加速，等等(见Potrykus等，1991的综述)。
将核酸引入细胞的技术为本领域技术人员所熟知。这些方法通常被归类为4类(1)化学方法(Graham和van der Eb，1973；Zatloukal等，1992)；(2)物理方法如显微注射(Capecchi，1980)，电穿孔(Wong和Neumann，1982；Fromm等，1985；美国专利5,384,253)和粒子加速(Johnston和Tang，1994；Fynan等，1993)；(3)病毒载体(Clapp，1993；Lu等，1993；Eglitis和Anderson，1988)；以及(4)受体-介导的机制(Curiel等，1992；Wagner等，1992)。或者，可以直接将核酸引入花粉，方法是直接注射植物的繁殖器官(Zhou等，1983；Hess，1987；Luo等，1988；Pena等，1987)。也可以将核酸注入未成熟的胚(Neuhaus等，1987)。
用于转化所述宿主细胞的重组载体通常按5’至3’方向依次包含能指导结构核酸序列转录的启动子，结构核酸序列，3’转录终止子，3’聚腺苷酸化信号。重组载体还可以包含非翻译核酸序列，转位及靶向核酸序列，选择标记，增强子，或操纵子。
适当的重组载体，结构核酸序列，启动子，和其它调节元件如上文所述。
从转化植物的原生质体或外植体再生、发育和培养植物的方法为本领域熟知(Weissbach和Weissbach，1988；Horsch等，1985)，在该方法中，通常在能选择成功转化的细胞并诱导植物苗枝再生的选择培养基存在的条件下培养转化体(Fraley等，1983)。这些苗枝通常在2-4个月内获得。
然后将苗枝转移至合适的根-诱生培养基中，该培养基中包含选择试剂以及阻止细菌生长的抗生素。大多数苗枝将发育出根。然后将它们移植到土壤或其它基质中，以使根继续发育。方法常常根据所用具体植物株系的不同而有变动。
优选再生的转基因植物能自花授粉，从而提供纯合型转基因植物。或者，可将所述再生转基因植物的花粉与非-转基因植物杂交，优选农艺上重要的物种的近交系。反过来，可用非-转基因植物的花粉对所述再生转基因植物授粉。
转基因植物可将编码抗真菌蛋白的核酸传给它的后代。转基因植物优选为抗真菌蛋白的编码核酸的纯合型，能通过有性繁殖将该序列传递给它的所有后代。后代可以从转基因植物所产生的种子发育而成。这些另外的植物然后可通过自花授粉产生纯种植物品系。
可对这些植物的后代进行评估，例如，评估其基因表达。基因表达可通过多种常用方法来检测，如western印迹，northern印迹，免疫沉淀，和EIISA。
种子容器可以将本发明的植物种子或植物放置在容器中。本文中，容器是指任何能够容纳所述种子的物体。容器优选包含1,000，5,000，或25,000个以上的种子，其中至少10，25，50，75或100％的种子来自本发明的植物。
饲料(feed)，粗粉，蛋白和油制品本发明的任何植物或其部分可以经过加工制成饲料，粗粉，蛋白或油制品。为此目的的一个特别优选的植物部分是种子。在一个优选实施方案中，饲料，粗粉，蛋白或油制品是设计用于反刍动物的。制备饲料，粗粉，蛋白和油制品的方法是已知的。参见，例如，美国专利4,957,748、5,100,679、5,219,596、5,936,069、6,005,076、6,146,669和6,156,227。在一个优选实施方案中，所述蛋白制品是高蛋白制品。这种高蛋白制品优选蛋白含量5％w/v以上，更优选10％w/v，还更优选15％w/v。在优选的油制品中，油制品可以是高油制品，其中来源于本发明植物或其一部分的油的含量为5％w/v以上，更优选10％w/v以上，还更优选15％w/v。在一个优选实施方案中，油制品是液体，体积超过1升，5升，10升，或50升。在另一实施方案中，所述油制品可以是混合物，并且可以在该混合物总体积中占10％以上，25％以上，35％以上，50％以上，或75％以上。
其它生物可将上述任一种启动子和结构核酸序列引入任何细胞或生物，如哺乳动物细胞，哺乳动物，鱼的细胞，鱼，鸟的细胞，鸟，藻类的细胞，藻类，真菌的细胞，真菌，或细菌的细胞。优选的宿主和转化体包括真菌细胞如曲霉菌，酵母，哺乳动物(尤其牛和猪)，昆虫，细菌和藻类。特别优选的细菌细胞为土壤杆菌和大肠杆菌。
在另一特别优选的实施方案中，所述细胞选自细菌细胞，哺乳动物细胞，昆虫细胞和真菌细胞。
转化这类细胞或生物的方法是本领域已知的(EP 0238023；Yelton等，1984；Malardier等，1989；Becker和Guarente；Ito等，1983；Hinnen等，1978；Bennett和LaSure，1991)。从这类生物体产生本发明的蛋白的方法也是已知的(Kudla等，1990；Jarai and Buxton，1994；Verdier，1990；MacKenzie等.，1993；Hartl等，1994；Bergeron等，1994；Demolder等，1994；Craig，1993；Gething and Sambrook，1992；Puig and Gilbert，1994；Wang and Tsou，1993；Robinson等，1994；Enderlin and Ogrydziak，1994；Fuller等，1989；Julius等，1984；Julius等，1983).
本发明应用举例本发明的应用包括动物(包括人)的营养添加剂。动物营养添加剂的形式包括饲料配给，粗粉，和源自谷物的蛋白制剂。人类添加剂的形式包括大豆蛋白制剂和婴儿配方食品。
在一个优选实施方案中，本发明的蛋白，种子，和植物应用在人类食品中。本文中“人类食品”是指，适合于人类消费的任何食品。在一个优选实施方案中，人类食品是农业生产获得的任何食品，包括直接的植物产物形式的食品，以及间接由农业植物喂养的动物获得的动物产物形式。在一个更优选的实施方案中，人类食品是来源于本发明的植物或种子的任何食品，包括直接的植物产物形式的食品，以及间接由农业植物喂养的动物获得的动物产物形式。在另一实施方案中，人类食品是来源于本发明大豆植物或种子的任何食品，包括直接的本发明大豆植物产物形式的食品，以及间接由本发明大豆植物喂养的动物获得的动物产物形式。
以下实施例仅用于举例。不应理解为本发明的范围仅限于所举例的实施方案。
实施例以下实施例仅用于举例，并非限制本发明的范围。
实施例1制备早期大豆种子mRNA从大豆种子分离细胞总RNA，其中包含从β-伴大豆球蛋白的β亚单位基因转录得到的mRNA。将未成熟的大豆种子碾成粉末(～180mg)，加入50ml的微量离心管中。加2.5ml TRIZOLTM(Invitrogen，Carlsbad，CA)，混合物在PoltronTM(型号PT 1200，Brinkmann Instruments，Inc.，Westbury，NY)中匀浆20-30秒。经过匀浆的混合物在室温中保温5分钟。向匀浆物中加入0.5ml氯仿，将该试管盖紧。剧烈摇动该试管，并使其在室温中静置2-3分钟。将样品在4℃以12,000Xg离心15分钟。将澄清的水相转移到一个新鲜的50ml试管中，将雾状有机相弃去。在水相中加入1.25ml异丙醇，充分混合，室温保温10分钟。将试管在4℃以12,000Xg离心10分钟。除去上清，将沉淀用2.5ml 75％乙醇洗涤。通过涡旋使沉淀混合在乙醇中。将试管在4℃以7,500Xg离心5分钟。除去上清，将沉淀风干5-10分钟。再将沉淀重新悬浮在400μl DEPC H2O中。将样品稀释1∶100，通过测定OD260/280来确定RNA的浓度。RNA的存在通过进行非变性凝胶电泳并在UV光下观察来证实。
实施例2早期大豆种子mRNA中β-伴大豆球蛋白β亚单位基因的RT-PCR针对出现在实施例1所分离的细胞总RNA中的β-伴大豆球蛋白β亚单位mRNA，用TitanTMOne Tube RT-PCR系统(Boehringer Mannheim，Indianapolis，IN)制备其互补DNA序列。制备以下寡核苷酸引物，将它们脱盐，冻干，以100mM的终浓度重悬在水中，作为原液。
BetaC-5′A
5′-ATA CTA TGA TGA GAG TGC GG-3′(SEQ ID NO4)BetaC-5′B5′-CAC TCC ATG TTT CAT CGT CC-3′(SEQID NO5)BetaC-3′A5′-GTT ATT CAG TAG AGA GCA CC-3′(SEQ ID NO6)BetaC-3′B5′-TCA CGA TGA GCT CTT ACA GC-3′(SEQ ID NO7)为了进行RT-PCR，将引物稀释为最终工作浓度20mM。制备RT-PCR反应的以下反应混合物主混合物11234
主混合物2
将每一份主混合物1样品加入0.2ml厚的PCR试管中。制备另一份不含任何模板RNA的平行反应混合物作为对照。每一试管中加入24μl主混合物2。在PTC-200 Peltier热循环仪中进行RT-PCR，按照以下程序的顺序操作1)50℃30分钟；2)94℃2分钟；3)94℃30秒；4)45℃30秒；5)68℃90秒；6)回到步骤(3)，重复额外9个循环；7)94℃30秒；8)45℃30秒；9)68℃90秒；10)回到步骤7，重复额外9个循环，每个循环加5秒；11)68℃7分钟；12)冷却到4℃，终止程序。
将PCR反应产物在琼脂糖凝胶上分开。从凝胶上切取PCR片段，用标准方法纯化。所得cDNA之一为SEQ ID NO3。该cDNA的翻译产物为SEQID NO1。
实施例3制备含有编码β-伴大豆球蛋白β亚单位的序列的重组核酸载体将实施例2所分离得到的PCR产物用TATM克隆试剂盒(Invitrogen，Carlsbad，CA)连接到pCRIITM载体中。连接反应按照厂家的方案进行，使用以下10μl连接反应混合物
1凝胶纯化的PCR产物2直接PCR产物(未经凝胶纯化)实施例4制备转化的宿主细胞，其包含编码野生型β-伴大豆球蛋白β亚单位的载体将连接而成的包含所述PCR产物的pCRII载体转化到One ShotTM感受态细胞(大肠杆菌INVαF’株)(Invitrogen，Carlsbad，CA)中，按照厂家方案离心。
按照厂家方案从QIAprepTM(Qiagen Inc.，Valencia，CA)微量制备试剂盒制备DNA。将每一份DNA微量制品的样品用EcoRI/XbaI消化，得到DNA片段。EcoRI消化产生3.9，0.58，和0.75kb的片段。XbaI消化或者产生0.59和4.62kb的片段(pMON54419)，或者产生0.72和4.44kb的片段(pMON54418)。与β-伴大豆球蛋白β亚单位基因的DNA片段对应的正确大小的片段的存在通过凝胶电泳证实。选出具有β-伴大豆球蛋白β亚单位基因的DNA微量制品和转化细胞。将β-伴大豆球蛋白β亚单位DNA的序列与已经公开的野生型序列比较，选出与已经公开的野生型β-伴大豆球蛋白β亚单位基因序列100％匹配的序列。
实施例5制备转基因植物和种子设计转化载体，使其能引入编码修饰的β-伴大豆球蛋白β亚单位的核酸序列，所述载体通常包含一或多个目的核酸编码序列，它们的翻译受到5’和3’调节序列的控制。这类载体包含以下元件，它们按照5’-3’的方向可操作相连指导下游结构核酸序列在植物中转录的启动子；5’非翻译序列；编码修饰的β-伴大豆球蛋白β亚单位序列的核酸序列，以及提供聚腺苷酸化信号和终止信号的3’非翻译区。
将每一个修饰的β-伴大豆球蛋白序列插入植物转化载体中，并转化植物组织如大豆子叶。在适当的选择性生长培养基中培养转化的植物组织，以便产生含有修饰的β-伴大豆球蛋白序列的转基因植物。
有多种不同的方法可以用于将这类载体引入植物原生质体、细胞、愈伤组织、叶盘、分生组织，及其它植物组织，从而产生转基因植物。用所述植物载体转化植物细胞或植物组织，方式可以是土壤杆菌介导的转化，粒子枪运送，显微注射，电穿孔，聚乙二醇介导的原生质体转化，脂质体介导的转化，等等(综述见Potrykus，1991)。植物细胞或组织因此而被含有β-伴大豆球蛋白β亚单位序列的植物载体转化。
转基因植物是这样产生的如上所述用植物载体转化植物细胞；选出已经被转化的植物细胞或组织；使已经被转化的植物细胞再生，产生转基因植物；选出表达所需β-伴大豆球蛋白β亚单位序列的转基因植物。
筛选转基因植物中必需氨基酸的含量增加了的所需多肽的蛋白表达。也可以筛选植物中其它必需氨基酸(如组氨酸，赖氨酸，甲硫氨酸，和苯丙氨酸)的含量增加了的多肽。
实施例6在大肠杆菌中表达并自我装配带有表位标签的β-伴大豆球蛋白β亚单位。
为了将β-伴大豆球蛋白β亚单位的修饰形式与积累在未转化的大豆中的内源形式相区别，将“FLAG”表位编码序列与代表β亚单位成熟形式(缺乏信号肽)氨基末端的编码序列连接。FLAG表位由8个残基组成Asp-Tyr-Lys-Asp-Asp-Asp-Asp-Lys(SEQID NO9)(5′GAC TAC AAG GACGAC GAT GAC AAG 3′(SEQ ID NO8)。用pMON54418作为模板，按照厂家(Boehringer Mannheim，Indianapolis，IN，Expand High Fidelity PCR System)建议，通过标准PCR技术，将FLAG编码序列，以及用作翻译起始密码子的附加甲硫氨酸密码子，添加在成熟β亚单位编码序列的氨基末端，所用的引物是5’ATAGCCATGGACTACAAGGACGACGATGACAAGTTAAAGGTGAGAGAGGATGAG 3’(SEQ ID NO10)和5’GTAAAACGA CGGCCAG3’(SEQ ID NO11)。所得1.4kb PCR产物用NcoI+NotI消化，克隆到大肠杆菌表达载体pET21d(+)的NcoI和NotI位点(Novagen，Madison，WI)，得到pMON39328，如图1所示。
由pMON39328编码的带有(FLAG)标签的β-伴大豆球蛋白β亚单位具有氨基酸序列SEQ ID NO12。
pMON39328中编码带有(FLAG)标签的β-伴大豆球蛋白β亚单位的核苷酸序列具有SEQ ID NO13所示序列。
制备第二种质粒pMON39329，如图2所示，它包含pET21d(+)中成熟形式的β亚单位(不带FLAG表位)的编码序列。
由pMON39329编码的成熟形式β-伴大豆球蛋白β亚单位(外加起始密码子编码的甲硫氨酸)具有氨基酸序列SEQ ID NO14。
pMON39329中编码β-伴大豆球蛋白β亚单位成熟形式的核苷酸序列具有SEQ ID NO15所示序列。
按照厂家(Strategene，La Jolla CA)建议，将质粒pMON39328和pMON39329转化到大肠杆菌BL21(DE3)中。用单菌落接种2ml LB培养基。在37℃进行培养，直到细胞密度达到A600＝0.6。加入异丙基-1-硫代-β-D-半乳吡喃糖苷(IPTG)至终浓度为1mM，以便诱导蛋白表达，将培养物在20-37℃以225rpm保温最多20个小时。4℃5,000rpm离心15分钟，收获细胞。将细胞沉淀重悬在蛋白提取液中，所述蛋白提取液组成如下20mMTris-HCI，pH 7.4，0.4M NaCl，0.1％TritonX-100，40μl/ml蛋白酶抑制剂混合物，(原液1片/2ml，Boehringer Mannheim，Indianapolis，IN)。然后在用冰维持的冷环境中，通过超声处理(Branson Sonifier 450，Branson PrecisionProcessing，Danbury，CT)破碎细胞。通过13,000rpm离心5分钟，将可溶性蛋白与不溶的组分分离。考马斯兰染色和用抗-FLAG抗体进行的Western印迹表明，天然形式和FLAG-标记形式的溶解度和表达水平没有差别。当表达在37℃被诱导时，两种蛋白主要以不溶形式积累，当在20℃或30℃诱导时，约有50％的蛋白积累在可溶性级分中。
为了确定大肠杆菌中由pMON39328和pMON39329表达的β亚单位的重组形式是否可以自我装配，形成三聚体，将源自大肠杆菌裂解物的可溶性蛋白级分的等份试样覆盖在12ml 5-25％蔗糖密度梯度的上层，在20℃以36,000rpm离心17.5小时(Sorvall TH-641转子；Sorvall Ultra Pro 80超速离心机)。离心后，用Labconco Autodensi-Flow仪(Labconco，Kansas City，Missouri)将梯度分为多个级分，每个级分用抗-FLAG M2抗体(StratageneCorporation，LaJolla，CA)进行Western印迹分析，确定哪些级分包含β-伴大豆球蛋白β亚单位。7S和11S大豆蛋白级分，以及卵白蛋白(45kD)和醛缩酶(158kD)都作为分子量标志物在不同梯度上运行。结果表明，天然形式和FLAG-标记形式与从大豆分离的7S级分以及与醛缩酶标准品共沉淀，这说明，两种重组蛋白都能自我装配形成三聚体。
实施例7修饰β-伴大豆球蛋白β亚单位序列以便编码水平增加的色氨酸进行定点诱变，在β-伴大豆球蛋白β亚单位序列中的以下一或多个位置进行色氨酸密码子取代N32；Y35；N40；N50；Y72；H88；Y116；H119；Y132；Y133；P137；Y1 58；Y172；E200；P239；Y249；P265；P324；Y330；Y346；N368；和Y411。这些反应中所用的引物见下表，其中序列ID号和相应氨基酸以及密码子取代在右栏中。氨基酸取代是在SEQ ID NO1所示未经修饰的β-伴大豆球蛋白β亚单位序列中进行取代，用以下形式表示被替换的氨基酸的单字母代码/在SEQ ID NO1中的位置/加入的氨基酸的单字母代码。例如，SEQ ID NO16是将SEQ ID NO1中第35位的氨基酸从酪氨酸更换为色氨酸。括号内的核苷酸取代用类似的形式表示，SEQ ID NO3所示β-伴大豆球蛋白β亚单位cDNA中的改变表示为以下形式的三联体取代未经修饰的三联体/SEQ ID NO3中三联体的第一个核苷酸的位置/修饰的三联体。例如，SEQID NO16是将SEQID NO3的位置103，104，和105的三联体TAC变为TGG。
每一色氨酸取代的引物序列
用质粒pMON39328作为所有上述反应的模板。ID从39328-1到39328-28的突变用QuickChangeTM定点诱变试剂盒(Stratagene Corporation，La Jolla，CA)基本按照说明书来制备，ID从39328-31到39328-66的突变用GeneEditorTM体外定点诱变系统试剂盒(Promega Corporation，Madison，WI)来制备。每一诱变引物被设计为将编码色氨酸残基的核苷酸插入上述所列位置。引物从Invitrogen(Invitrogen，Carlsbad，CA)获得，并在5’端磷酸化，经聚丙稀酰胺凝胶电泳纯化。色氨酸突变体和突变位点，按照上述表示法，列于下表中
关于β-伴大豆球蛋白β亚单位编码序列如何经过修饰而包含多重色氨酸取代，下面给出一个实例，它描述了突变体ID 39328-57的制备将2μg质粒pMON39328的DNA与2M NaOH和2mM EDTA混合，室温保温10分钟，使质粒变性。接着，在变性的模板DNA中加入10μl 3M乙酸钠(pH5.2)和75μl 100％乙醇，使DNA沉淀。离心后，将DNA沉淀溶于100μl TE缓冲液中。迅速使变性的DNA与诱变引物杂交，如下将10μl变性的pMON39328与1μl顶端选择引物(top selection primer)(2.9ng/μl，来自试剂盒)，下述诱变引物各1.25pmolSEQ ID NO16，SEQ ID NO21，SEQ ID NO19，SEQ ID NO20，SEQ ID NO22，SEQ ID NO23，SEQ ID NO24，SEQ IDNO26，SEQ ID NO27，SEQ ID NO28，SEQ ID NO29，SEQID NO30，和SEQID NO32，2μl 10x退火缓冲液和ddH2O在20μl反应体积中混合。反应在75℃加热5分钟，然后在桌面上(bench-top)缓慢冷却到37℃。突变链在20μl反应液中合成(并将新合成的DNA链中的缺口连接起来)，所述反应液包含5μl去离子水，3μl 10x合成缓冲液，1μl T4 DNA聚合酶(5-10U)，和1μlDNA连接酶(1-3U)。在37℃反应90分钟。接着，将1.5μl反应液转化到大肠杆菌菌株BMH71-18mutS(Promega Corporation，Madison，WI)中，转化的细胞在4ml LB中培养，所述LB包含50μl GeneEditor抗生素选择混合物(Promega Corporation，Madison，WI)。从该培养物的1.5ml等份试样中分离质粒DNA(用Qiagen Miniprep试剂盒，Qiagen Inc.Valencia，CA)。分离的质粒DNA随后被转化到大肠杆菌JM109中，单个菌落在含有125μg/ml氨苄青霉素和50μl GeneEditor抗生选择混合物(Promega Corporation，Madison，WI)的LB琼脂平板上进行培养。从10个菌落分离质粒DNA(Qiagen Miniprep试剂盒，Qiagen Inc.，Valencia，CA)，测定β-伴大豆球蛋白β亚单位编码区的序列。其中一个序列被鉴定为突变体ID 39328-32。用39328-32作为模板，进行第二轮诱变，所用引物为SEQ ID NO20，SEQ ID NO25，SEQ ID NO28，SEQ ID NO31和SEQ ID NO32。所有操作如上文所述。从该轮产生的突变体中鉴定出突变体ID 39328-57。
实施例8修饰β-伴大豆球蛋白β亚单位序列以编码水平增加的异亮氨酸进行定点诱变，以便用异亮氨酸密码子取代β-伴大豆球蛋白β亚单位序列中的以下一或多个位置N32；L36；F46；G51；L56；F59；Q65；L66；Y72；R73；V75；Q76；L85；H88；F94；L95；L96；F97；V98；L99；R102；L105；L107；N117；L118；D121；Q124；R125；P127；Y132；Y133；L134；V135；P137；L143；K147；L148；P151；Y158；F162；Q169；L173；L181；V209；P239；F240；P247；F256；E258；T264；P265；L267；F273；L274；L285；L286；H288；N290；V295；L297；V298；N300；L308；V309；K317；K319；P324；L334；V339；F340；V341；Y346；F348；V350；L356；F358；L359；F361；N368；F372；F393；Y411；F412；和V413。
这些反应中所用的引物见下表，其中序列ID号和相应氨基酸以及密码子取代在右栏中，说明同实施例7每一异亮氨酸取代的引物序列
突变体ID 39328-67到39328-74用pMON39328作模板来制备，突变体ID 39335-1到39335-81用pMON39335作模板来制备。质粒pMON39335与pMON39328相同，区别仅在于，β-伴大豆球蛋白β亚单位蛋白序列(SEQ IDNO1)中编码Leu24的核苷酸从TTA突变为CTT，产生一个AflII限制酶位点。pMON39335见图3。
所有突变体用GeneEditorTM体外定点诱变系统试剂盒(PromegaCorporation，Madison，WI)基本按照说明书来制备。每一诱变引物被设计为将编码异亮氨酸残基的核苷酸插入上述所列位置。引物从Invitrogen(Invitrogen，Carlsbad，CA)获得，并在5’端磷酸化，经聚丙稀酰胺凝胶电泳纯化。详细的诱变过程如实施例7中引入色氨酸取代的过程一样。
异亮氨酸突变体以及突变位点见下表，说明同实施例7
在约2.5小时内于封闭的小室内评价二氧化氯的产生(ppm)，使用正常的室内荧光照明进行活化并使用电化学电池测定二氧化氯的浓度。数据报道于以下表2。
表2
<p>
关于β-伴大豆球蛋白β亚单位编码序列如何经过修饰而包含多重异亮氨酸取代，下面给出一个实例，它描述了突变体ID 93995-14的制备将双链质粒pMON39335变性，并与以下诱变引物杂交SEQ ID NO37，SEQ IDNO43，SEQ ID NO46，SEQ ID NO52，SEQID NO55，SEQ ID NO58和SEQ ID NO62。将诱变反应的等份试样转化到大肠杆菌菌株BMH 71-18mutS中，从耐受GeneEditor抗生素选择混合物(Promega Corporation，Madison，WI)的细胞中分离质粒，然后转化大肠杆菌菌株JM109。对来自转化体的质粒DNA测序，鉴定出多个修饰形式，其中之一为突变体ID39335-14。
关于β-伴大豆球蛋白β亚单位编码序列如何经过修饰而包含多重异亮氨酸取代，下面给出一个实例，它描述了用突变体ID39335-14作为模板制备突变体ID 39328-57的过程，如下在将包含突变体ID 39335-14的质粒(pMON39334-14)作为第二轮诱变的模板使用之前，回复(restore)氨苄青霉素抗性基因的GeneEditor(Promega Corporation，Madison，WI)抗生素混合敏感形式(mix-sensitive form)(它在第一轮诱变期间转换为GeneEditor抗性形式)。为此，将突变体ID 39335-14的编码序列从pMON39335-14中切出，为一个1.4kb的DNA片段，用它代替pMON39335中的β-伴大豆球蛋白β亚单位编码序列。用所得质粒作为诱变反应(如上述)的模板，用诱变引物SEQ IDNO80进行反应，鉴定出突变体ID 39335-33。
实施例9。证实经过修饰而包含一或多个色氨酸或异亮氨酸残基的β-伴大豆球蛋白β亚单位在大肠杆菌中的折叠和自我装配本实施例证实链修饰型β-伴大豆球蛋白β亚单位克隆的表达的蛋白结构。β亚单位(以突变体ID号表示)的以下修饰形式(各自包含不同的色氨酸取代)的装配特性如所述实施例6确定。按照实施例6所述，用-FLAG抗体对蔗糖梯度级分进行Western印迹分析。结果见下表。
Ile突变体的大肠杆菌装配结果
Trp突变体的大肠杆菌装配结果
实施例10本实施例证实经过修饰而包含多重异亮氨酸残基的β-伴大豆球蛋白β亚单位在转化植物的种子中积累。
载体构建对应于表位(FLAG)-标记的β-伴大豆球蛋白β亚单位编码序列的DNA序列，以及对应于突变体39335-14，39335-41，3933558和39335-78(分别是上述SEQ ID NO84-87)的编码序列的DNA序列，通过将β亚单位前25个残基的编码序列置于FLAG表位编码序列的上游，而进行修饰。加入这25个残基使β亚单位信号肽被恢复，并将修饰的β-伴大豆球蛋白β亚单位靶向植物种子中的蛋白贮藏液泡。所得编码序列然后被克隆到植物转化载体中，受arcelin 5启动子的控制。
举例来说，用于制备pMON64015的克隆技术在本文中简短描述。将质粒pMON39335-41用HindIII和PstI消化。所得1.27kb片段包含β-伴大豆球蛋白β亚单位编码序列，其中有16个异亮氨酸取代，电泳后从琼脂糖凝胶中分离该片段。穿梭载体pMON68006包含Arcelin5启动子-FLAG-βCG-10-Ile-Arc 3’UTR表达盒，它也用HindIII和PstI消化，产生5.7kb的片段。该5.7kb片段缺乏β-伴大豆球蛋白β亚单位成熟形式的编码序列，但保留了arcelin 5启动子的编码序列，β亚单位信号肽，FLAG表位，以及arcelin 5 3’UTR。该5.7kb片段在电泳后从琼脂糖凝胶中分离。然后将来自pMON39335-41的1.27kb片段与该5.7kb片段连接，得到载体pMON64017。再用NotI消化pMON64017，分离出Arc5启动子-FLAG-βCG-16-Ile-Arc3’UTR表达盒，所得3.8kb片段在电泳后从琼脂糖凝胶中分离。用于土壤杆菌介导的转化的植物转化骨架载体pMON38207包含FMV启动子驱动的CP4基因作为选择标记，将它NotI消化，连接来自pMON64017的3.8kb片段，得到质粒pMON64015。
用上述针对pMON64015的策略，制备以下植物转化载体
转基因的序列(arcelin 5启动子-编码序列-arcelin 5 3’非翻译区)和相应的蛋白编码序列显示在序列表中。为了更全面描述这些构建体，本文给出对应于上述质粒的核苷酸序列和氨基酸序列的以下重点说明pMON69616盒DNA序列(SEQ ID NO88)核苷酸1-3808包含在pMON69616中的完整表达盒核苷酸1-1161截短的Arcelin 5启动子核苷酸1174-2523包含FLAG表位的β-伴大豆球蛋白编码序列核苷酸2550-3808Arcelin 5 3’非翻译区(UTR)pMON69616β-伴大豆球蛋白蛋白序列(SEQ ID NO89)氨基酸1-449完整的β-伴大豆球蛋白编码序列，含有信号肽和插入的FLAG表位标签氨基酸1-25野生型β-伴大豆球蛋白的前25个氨基酸，包括信号肽氨基酸26-33FLAG表位氨基酸34-449野生型(未修饰的)β-伴大豆球蛋白的成熟形式pMON64016盒DNA序列(SEQ ID NO90)核苷酸1-3808包含在pMON64016中的完整表达盒核苷酸1-1161截短的Arcelin 5启动子核苷酸1174-2523修饰的β-伴大豆球蛋白编码序列，包含FLAG表位核苷酸2550-3808Arcelin 5 3’非翻译区(UTR)pMON64016β-伴大豆球蛋白蛋白序列(SEQ ID NO91)氨基酸1-449完整的修饰的β-伴大豆球蛋白编码序列，包含信号肽和插入的FLAG表位标签氨基酸1-25β-伴大豆球蛋白的前25个氨基酸，包括信号肽氨基酸26-33FLAG表位氨基酸34-449修饰的β-伴大豆球蛋白的成熟形式，包含10个异亮氨酸取代(对应于突变体39335-14)pMON64015盒DNA序列(SEQ ID NO92)核苷酸1-3808完整表达盒，包含在pMON64015中核苷酸1-1161截短的Arcelin 5启动子核苷酸1174-2523修饰的β-伴大豆球蛋白编码序列，包含FLAG表位核苷酸2550-3809Arcelin 5 3’非翻译区(UTR)pMON64015β-伴大豆球蛋白蛋白序列(SEQ ID NO93)氨基酸1-449完整的β-伴大豆球蛋白编码序列，含有信号肽和插入的FLAG表位标签氨基酸1-25β-伴大豆球蛋白的前25个氨基酸，包括信号肽氨基酸26-33FLAG表位氨基酸34-449修饰的β-伴大豆球蛋白的成熟形式，包含16个异亮氨酸取代(对应于突变体39335-41)pMON64019盒DNA序列(SEQ ID NO94)核苷酸1-3808完整表达盒，包含在pMON64019中核苷酸1-1161截短的Arcelin 5启动子核苷酸1174-2523修饰的β-伴大豆球蛋白编码序列，包含FLAG表位核苷酸2550-3809Arcelin 5 3’非翻译区(UTR)pMON64019修饰的β-伴大豆球蛋白蛋白序列(SEQ ID NO95)氨基酸1-449完整的修饰型β-伴大豆球蛋白编码序列，含有信号肽和插入的FLAG表位标签氨基酸1-25β-伴大豆球蛋白的前25个氨基酸，包括信号肽氨基酸26-33FLAG表位氨基酸34-449修饰的β-伴大豆球蛋白的成熟形式，包含21个异亮氨酸取代(对应于突变体39335-58)pMON69621盒DNA序列(SEQ ID NO96)核苷酸1-3808完整表达盒，包含在pMON69621中核苷酸1-1161截短的Arcelin 5启动子核苷酸1174-2523修饰的β-伴大豆球蛋白编码序列，包含FLAG表位核苷酸2550-3809Arcelin 5 3’非翻译区(UTR)pMON69621β-伴大豆球蛋白蛋白序列(SEQ ID NO97)氨基酸1-449完整的修饰型β-伴大豆球蛋白编码序列，含有信号肽和插入的FLAG表位标签氨基酸1-25β-伴大豆球蛋白的前25个氨基酸，包括信号肽氨基酸26-33FLAG表位氨基酸34-449修饰的β-伴大豆球蛋白的成熟形式，包含21个异亮氨酸取代(对应于突变体39335-78)植物转化拟南芥属植物用上述载体转化，方法采用Bechtold等(CR Acad Sci ParisSciences di la vie/life sciences 3161194-1199，1993)或Clough，S.和Bent，A.(The Plant Journal 16(6)，735-743，1998)所述的标准的根癌土壤杆菌介导性植物转化方法。
简言之，通过将次生木料(secondary bolt)和花瓣(rosette)浸没在根癌土壤杆菌(ABI)溶液中并涡旋10-20秒，来转化28-35日龄的拟南芥(Arabidopsisthaliana)生态型Columbia植物。从在YEP(5g/L氯化钠，10g/L酵母浸出物和10g/L蛋白胨，pH 7.0)上过夜生长的培养物中获得根癌土壤杆菌(ABI)，于次日早晨用保温培养基(5％蔗糖加0.05％Silwet L77表面活性剂)稀释，使600nm的光密度达到约0.8。转化前，用植物繁殖室(plant propagation dome)将植物在高湿度条件中保持24小时，保持水份，共达5天。
然后用亚灌溉方法(sub-irrigation method)将植物培养在标准的一周两次浇水和施肥的条件下。将bolts装在授粉袋中，以便容纳种子。将植物播种后(浸渍约4周后)，从水中取出，使种子干燥约一周，然后收获。接着将种子置于氯气环境中过夜以便进行表面除菌，再置于含有草甘膦(30-50μM)的选择性培养基中或种植于土壤中并用Roundup Ultra(Monsanto Company，St.Louis，MO)喷洒，以便鉴定单个阳性植物。选择平板在4℃培养48小时，然后转移到设定为23.5℃的Percival培养室中(16:8小时光周期)。在约18-21天内，鉴定出具有伸展的初级和次极叶以及分支的根的阳性单个植物。相应的阴性单个植物的初级和次极叶不伸展，且根较矮小。
代表T2代的种子从单个草甘膦抗性植物中收获。用本领域抑制的标准技术从种子中提取蛋白。然后用Western印迹分析所提取的蛋白。用于Western印迹的抗血清是从注射了修饰型β-伴大豆球蛋白β亚单位(10个带有FLAG表位的异亮氨酸取代插入在氨基末端)的兔子中分离的，所述亚单位是从pMON39335-14(Cocalico Biologicals，Inc.，Reamstown，PA)转化的大肠杆菌中分离的。野生型β-伴大豆球蛋白β亚单位，以及代表每一种修饰形式的β亚单位，都在转基因种子中检测到，但每种形式中的积累水平有差异。每种形式的相对积累水平通过检查Western印迹中带的强度来确定，结果见下表。
大豆植物用pMON69616和pMON64016转化，采用Martinell等在美国专利6,384,301中所述的根癌土壤杆菌介导的植物转化方法。从所得转基因植物获得种子，对单个种子进行SDS-PAGE分析，用与FLAG表位反应的抗体(抗-FLAG M2抗体；Stratagene)或者用与野生型β-伴大豆球蛋白β亚单位反应的抗血清(上述)进行Western印迹分析。表位(FLAG)-标记的未修饰形式和修饰形式(10个异亮氨酸取代；突变体39335-14)都是在总提取蛋白的7％以上的水平积累，这可通过对SDS PAGE凝胶进行密度计量，然后用胶体兰染色试剂盒(Colloidal Blue Stain Kit，Invitrogen)染色来评估。密度计量用Biorad Gel Doc仪器实施。
表达修饰β亚单位(对应于突变体39335-14)的转基因种子，用SDS-PAGE进行分析，并用胶体兰染色试剂盒(Invitrogen)来观察。结果表明，修饰蛋白的表达与对一或多个内源性β-伴大豆球蛋白亚单位(α亚单位，α’亚单位，β亚单位)的抑制相关。修饰型β亚单位的积累水平与内源性β亚单位的积累水平之间存在明显的反相关性。故，修饰型β-伴大豆球蛋白在种子中的表达确实代表了一种降低内源性β-伴大豆球蛋白水平的方法。
实施例11修饰β-伴大豆球蛋白β亚单位序列以编码水平增加的苏氨酸、赖氨酸、和甲硫氨酸进行定点诱变，以便在β-伴大豆球蛋白β亚单位编码序列(SEQID NO1)中的一或多个以下位置进行苏氨酸密码子取代S54，S225，S250，S251，S75，S90，S202，S16，S38，S139，S149，S197，S385，A65，A67，A78，A98，A124，A258，A279，A307，A327，A335，A268，A340，A367，V83，V284，V324，V186，V375，L171，L348，N275，N326，N346，N92，N216，N280，N332，N35，N168，Q53，Q303，Q32，R304，K201，K230，E276，E282，D68，D135，D89，D253，D389，D313，F136，P262，P62，P222，P318，P240。
进行定点诱变，以便在β-伴大豆球蛋白β亚单位编码序列(SEQ ID NO1)中的一或多个以下位置进行赖氨酸密码子取代R169，R194，R243，R361，R377，R37，R357，R304，R45，R132，R179，R199，R205，R883，S75，S202，S13，S210，S329，S371，T328，N84，N117，N225，N339，Q192，Q149，Q241，Q116，Q142，Q145，H153，V363，L379，L300，I155，I208，I223，I286，D89，E157，E166，E191，E365，E376。
进行定点诱变，以便在β-伴大豆球蛋白β亚单位编码序列(SEQ ID NO1)中的一或多个以下位置进行甲硫氨酸密码子取代L41，L156，L242，L245，L188，L379，I167，I193，I208，F34，Y386，N239，Q364，Q241。
所有突变体都用GeneEditorTM体外定点诱变系统试剂盒(PromegaCorporation，Madison，WI)基本按照说明书来制备。每一诱变引物被设计为将编码苏氨酸、赖氨酸或甲硫氨酸残基的核苷酸插入上述所列位置。引物从Invitrogen(Invitrogen，Carlsbad，CA)获得，并在5’端磷酸化，经聚丙稀酰胺凝胶电泳纯化。详细的诱变过程如实施例7中引入色氨酸取代的过程一样。
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权利要求
1.一种修饰的多肽，它在具有氨基酸序列SEQ ID NO1的未修饰多肽中包含选自异亮氨酸，赖氨酸，甲硫氨酸，苏氨酸，或色氨酸的一或多个必需氨基酸的取代，其中所述修饰的多肽能在种子中积累。
2.权利要求1的修饰的多肽，其中加入2个或更多个所述必需氨基酸。
3.权利要求1的修饰的多肽，其中所述修饰的多肽中包含，相对于所述未修饰的多肽而言，异亮氨酸，赖氨酸，甲硫氨酸，苏氨酸或色氨酸，或其任意组合增加0.25％(重量比)以上。
4.一种修饰的β-伴大豆球蛋白多肽，它在具有氨基酸序列SEQ IDNO1的未修饰的β-伴大豆球蛋白多肽中包含选自苏氨酸，异亮氨酸，色氨酸，缬氨酸，精氨酸，赖氨酸，甲硫氨酸，或组氨酸的一或多个必需氨基酸的取代，其中所述修饰的β-伴大豆球蛋白多肽能在种子中积累。
5.权利要求4的β-伴大豆球蛋白多肽，其中加入2个或更多个所述必需氨基酸。
6.权利要求4的β-伴大豆球蛋白多肽，其中所述修饰的β-伴大豆球蛋白多肽中包含，相对于所述未修饰的β-伴大豆球蛋白多肽而言，苏氨酸，异亮氨酸，色氨酸，缬氨酸，精氨酸，赖氨酸，甲硫氨酸，组氨酸，或其任意组合增加0.25％(重量比)以上。
7.权利要求4的β-伴大豆球蛋白多肽，其中用色氨酸残基取代所述未修饰的β-伴大豆球蛋白多肽中选自下组的至少一个氨基酸N32，Y35，N40，N50，Y72，H88，Y116，H119，Y132，Y133，P137，Y158，Y172，E200，P239，Y249，P265，P324，Y330，Y346，N368，或Y411。
8.权利要求4的修饰的多肽，其中用异亮氨酸残基取代所述未修饰的β-伴大豆球蛋白多肽中选自下组的至少一个氨基酸N32，L36，F46，G51，L56，F59，Q65，L66，Y72，R73，V75，Q76，L85，H88，F94，L95，L96，F97，V98，L99，R102，L105，L107，N117，L118，D121，Q124，R125，P127，Y132，Y133，L134，V135，P137，L143，K147，L148，P151，Y158，F162，Q169，L173，L181，V209，P239，F240，P247，F256，E258，T264，P265，L267，F273，L274，L285，L286，H288，N290，V295，L297，V298，N300，L308，V309，K317，K319，P324，L334，V339，F340，V341，Y346，F348，V350，L356，F358，L359，F361，N368，F372，F393，Y411，F412，或V413。
9.权利要求4的修饰的多肽，其中用苏氨酸残基取代所述未修饰的β-伴大豆球蛋白多肽中选自下组的至少一个氨基酸S54，S225，S250，S251，S75，S90，S202，S16，S38，S139，S149，S197，S385，A65，A67，A78，A98，A124，A258，A279，A307，A327，A335，A268，A340，A367，V83，V284，V324，V186，V375，L171，L348，N275，N326，N346，N92，N216，N280，N332，N35，N168，Q53，Q303，Q32，R304，K201，K230，E276，E282，D68，D135，D89，D253，D389，D313，F136，P262，P62，P222，P318，或P240。
10.权利要求4的修饰的多肽，其中用赖氨酸残基取代所述未修饰的β-伴大豆球蛋白多肽中选自下组的至少一个氨基酸R169，R194，R243，R361，R377，R37，R357，R304，R45，R132，R179，R199，R205，R883，S75，S202，S13，S210，S329，S371，T328，N84，N117，N225，N339，Q192，Q149，Q241，Q116，Q142，Q145，H153，V363，L379，L300，I155，1208，I223，I286，D89，E157，E166，E191，E365，或E376。
11.权利要求4的修饰的多肽，其中用甲硫氨酸残基取代所述未修饰的β-伴大豆球蛋白多肽中选自下组的至少一个氨基酸L41，L156，L242，L245，L188，L379，I167，I193，I208，F34，Y386，N239，Q364，或Q241。
12.一种编码修饰的β-伴大豆球蛋白多肽的重组核酸分子，所述多肽在具有氨基酸序列SEQ ID NO1的未修饰的β-伴大豆球蛋白多肽中包含选自苏氨酸，异亮氨酸，色氨酸，缬氨酸，精氨酸，赖氨酸，甲硫氨酸，或组氨酸的一或多个必需氨基酸的取代，其中所述修饰的多肽能在细胞中积累。
13.权利要求12的重组核酸分子，还包括，在5’到3’的方向，与所述核酸分子可操作相连的异源启动子。
14.一种细胞，它包含权利要求13的重组分子。
15.权利要求14的细胞，其中所述细胞选自细菌细胞，哺乳动物细胞，昆虫细胞，植物细胞，或真菌细胞。
16.权利要求14的细胞，其中所述细胞是大豆细胞。
17.一种转基因植物，包含权利要求14的细胞。
18.权利要求17的转基因植物，其中所述植物为大豆植物。
19.一种种子，来自权利要求18的转基因植物。
20.一种动物饲料，包含权利要求19的种子。
全文摘要
本发明主要涉及植物遗传学和蛋白质化学领域。更具体地，本发明涉及包含了更多必需氨基酸的修饰蛋白。本发明提供了经过修饰具有更多数量的必需氨基酸的蛋白，编码该强化蛋白的核酸，以及设计、制备和应用该蛋白的方法。本发明还包括含有该强化蛋白的组合物、转化植物细胞、转基因植物和种子，及其制备和应用方法。
文档编号C07K14/415GK1638785SQ02818159
公开日2005年7月13日 申请日期2002年9月17日 优先权日2001年9月17日
发明者威廉·D·拉普, 彭洁心, 高萨姆·纳迪格, 蒂亚马冈德路·文卡泰什 申请人:孟山都技术公司