一种融合蛋白质、制备方法及其应用的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种融合蛋白质、制备方法及其应用，属于蛋白质生产，分析和应用领域。本发明通过建立钙调素融合蛋白质的分离，纯化，性能分析和利用钙调素融合蛋白质柱来分离提取和浓缩样本中的目标蛋白质和相关的生物分子，介绍了一种新的生物样本配制，前处理和提高生物检测灵敏度的技术和方法。
【专利说明】—种融合蛋白质、制备方法及其应用
【技术领域】
[0001]本发明属于蛋白质生产，分析和应用领域，具体涉及一种融合蛋白质的制备方法及其应用。
【背景技术】
[0002]钙调素蛋白是一种重要的蛋白质，在与细胞内钙离子相关的信息传递中发挥重要的调节作用，具有调解多种酶的功能。市场上，除了作为研究钙调素结合蛋白质需要大量的钙调素蛋白外，利用钙调素和钙调素结合蛋白依赖钙离子存在的关系，近来也有通过添加或消除钙离子的存在来达到结合和分离钙调素结合蛋白质的目的的报道。但是利用融合蛋白(此处是麦芽糖结合蛋白-钙调素蛋白融合蛋白)来达到分离，浓缩样本中的靶物质的方法还没有任何报道。
[0003]最近有报道指出，热休克蛋白90是很好的癌症检测标记物，但还没有一种可以从生物样本中浓缩该热休克蛋白90，便于提高该蛋白质的检测灵敏度的报道。
【发明内容】
[0004]本发明的目的是提供一种通过融合蛋白质来简化蛋白质的生产，纯化，分析过程以及利用融合蛋白质所依附的条件来分离，浓缩相关的蛋白质结合物的方法及其应用。
[0005]本发明所采用的技术方案是:
[0006]一种融合蛋白质的制备方法，包括以下步骤:
[0007](I)将完整的靶基因的cDNA片段克隆到融合蛋白的表达载体，cDNA克隆时，在完整基因的cDNA片段前，起始密码子(ATG)之后，加上Xa因子位点异亮氨酸-谷氨酸-甘氨酸-精氨酸(Ile-Glu-Gly-Arg)的脱氧核糖核酸序列；
[0008](2)将步骤(1)得到的含有完整目的基因的亚克隆表达载体，转型或转染到表达宿主细胞内，使之在宿主细胞内表达所需融合蛋白质，通过接种培养,获得含有完整目的基因载体的纯克隆细胞株；
[0009](3)使用步骤(2)含有完整目的基因载体的纯克隆细胞株，进行量化培养，蛋白表达处理，获得量化的，有目的融合蛋白质的宿主细胞；
[0010](4)将步骤(3)得到的宿主细胞进行裂解，获取细胞裂解液，对蛋白质进行纯化，获得分离，纯化的融合蛋白质；
[0011](5)使用因子Xa处理融合蛋白质，可获得纯化的目的基因蛋白质。
[0012]进一步地，所述步骤(1)中加上Xa因子位点异亮氨酸-谷氨酸-甘氨酸-精氨酸(Ile-Glu-Gly-Arg)的脱氧核糖核酸序列，可以保证所表达的蛋白质在Xa切割后，获得的目的蛋白质的氨基酸顺序是所需的，完整的。
[0013]进一步地，所述步骤(4)和(5)是通过亲和柱来进行蛋白质分离和纯化的。
[0014]优选地，所述一种代表性融合蛋白为钙调素融合蛋白，是以钙调素为目的蛋白质的钙调素蛋白和麦芽糖结合蛋白的融合蛋白质。
[0015]通过上述的制备方法，制备得到的融合蛋白。
[0016]一种融合蛋白质的应用，利用分离纯化获得的融合蛋白，分离、纯化和浓缩目的蛋白质，可用于蛋白质的性能分析和应用。
[0017]进一步地，利用融合蛋白，富集生物样本中的靶分子，达到分离、纯化、浓缩和提高检测灵敏度的目的。
[0018]优选地，所述目的融合蛋白质为麦芽糖结合蛋白-钙调素蛋白的融合蛋白，可用来结合和浓缩样本中的一种靶分子为热休克蛋白90。
[0019]本发明具有以下优点:
[0020]本专利所介绍的融合蛋白质生产，分离纯化和分析方法，以及利用融合蛋白质来分离，浓缩相关的结合蛋白质或蛋白质结合物，达到分离，纯化和提高分析，检测靶分子的灵敏度的目的，是首次提出由融合蛋白质来富集样本中的蛋白质结合物的新方法，其方法和产品，可弥补特定蛋白质和蛋白质结合物的分离，纯化和检测方法等方面的许多不足，或提供更有效的蛋白质生产系统，其应用价值很大。本发明使用融合蛋白质的表达，生产方式，首先可提高可溶性比例，同时又简化了分离纯化的操作过程，降低了成本(利用亲和柱，方法简单，成本低)；利用设计在两种蛋白质连接处切割部位，可以容易地获得符合所需氨基酸顺序的融合蛋白质和目的蛋白质(不多一个氨基酸，也不少一个氨基酸)，便于比较融合蛋白质和目的蛋白质的可利用性能；利用融合蛋白质作为载体来分离，浓缩相关的结合蛋白质或蛋白质的结合物，可用于结合蛋白质的分离，浓缩，性能分析，检测，同时也可以作为提高生物检测灵敏度的一种新的有效方法。例如，钙调素蛋白在有钙离子存在的条件下，可与多种热休克蛋白质结合，而热休克蛋白质特别是肿瘤细胞可以分泌热休克蛋白质90，所以热休克蛋白质90又是癌症检测的重要标记物，利用此发明技术产品，浓缩相关样本中(如:血液等样本)的热休克蛋白质，将有助于癌症的早期的高灵敏度检测。
【专利附图】
【附图说明】
[0021]图1是显不麦芽糖结合蛋白质和钙调素蛋白质融合蛋白质的克隆不意图；
[0022]图2是显不钙调素蛋白质的生广和纯化不意图；
[0023]图3是显示钙调素蛋白质和融合蛋白质钙离子结合实验示意图；
[0024]图4显示钙调素融合蛋白质具有和钙调素相同的，激活磷酸二酯酶的功能；
[0025]图5显示钙调素融合蛋白质和热休克蛋白质90的结合实验；
[0026]图6是用钙调素融合蛋白柱浓缩钙调素蛋白结合蛋白质或结合物实验图；
[0027]图7是利用钙调素融合蛋白质分离，纯化和浓缩钙调素结合蛋白质或结合物的原理图。
【具体实施方式】
[0028]下面结合附图和实施方式对本发明作进一步详细的说明。
[0029] 参照图1，图1是显不麦芽糖结合蛋白质和钙调素蛋白质融合蛋白质的克隆不意图。以大肠杆菌表达载体(pMAL — c2)为实验载体(购于New England B1lab),通过PCR(Polymerase Chain React1n,聚合酶链反应)的探针设计,将钙调素蛋白的完整基因cDNA (Complimentary deoxyribonucleic acid,互补脱氧核糖核酸)复制，复制后的基因片段，既含有完整的钙调素蛋白cDNA，又在其启动密码子之后，加入了因子Xa的DNA(Deoxyribonucleic acid,脱氧核糖核酸)序列。在启动密码子之前和基因序列之后，有克隆酶位点，PCR产物经过酶切后，就可以克隆到载体内。转型到大肠杆菌细胞后，有钙调素蛋白基因插入的，在接种挑选细胞株时，可以获得所需克隆细胞株。
[0030]参照图2，图2是显示钙调素蛋白质的生产和纯化示意图，其中槽I是未诱导处理的大肠杆菌细胞裂解液；槽 2 是 IPTG (Isopropyl β -D-1-Th1galactopyranoside,异丙基-β-D-硫代半乳糖苷)诱导钙调素融合蛋白质表达处理后的大肠杆菌细胞裂解液；槽3是使用直链淀粉亲和柱分离，纯化后的钙调素融合蛋白质(麦芽糖结合蛋白和钙调素蛋白的融合蛋白质)；槽4是对上述融合蛋白质进行因子Xa酶切后，显示麦芽糖结合蛋白和钙调素蛋白的融合蛋白质被切开，分离成麦芽糖结合蛋白质(大)和钙调素蛋白(小)两种蛋白质；槽5是因子Xa酶切后的蛋白质溶液，再次作直链淀粉亲和柱分离处理，麦芽糖结合蛋白质被亲和柱吸附，可获得分离纯化的钙调素蛋白质。与未作诱导处理相比，IPTG诱导后的大肠杆菌细胞裂解液中，钙调素蛋白质的表达量很高(槽2)。经过直链淀粉亲和柱分离，纯化后，获得了高纯度的融合蛋白质(槽3)。用因子Xa切割纯化的融合蛋白质，可获得麦芽糖结合蛋白质和钙调素蛋白质(槽4)。因子Xa切割后的蛋白质溶液，再次经过直链淀粉亲和柱分离纯化后，可获得高度纯化的钙调素蛋白质(槽5)。从图2可以看出，该系统成功生产，分离和纯化出所需融合蛋白质和目的基因的蛋白质。
[0031]参照图3，图3是显示钙调素蛋白质和融合蛋白质钙离子结合实验示意图，其中槽I是钙调素在无EGTA(ethylene glycol tetraacetic acid,乙二醇双(2_氛基乙基醚)四乙酸)和无 CaCl2 (氯化?丐)条件下，在 SDS-PAGE (SDS:Sodium dodecyl sulfate ；PAGE:Polyacrylamide gel electrophoresis ;十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳)胶上，无结构上的变化；槽2是钙调素在5mM EGTA存在但没有CaC12条件下，在SDS-PAGE胶上，也无结构上的变化 ；槽3是钙调素在无EGTA但有5mMCaCl2钙离子存在的条件下，在SDS-PAGE胶上，显示了和钙离子的结合，而产生了结构上的变化。从图3可以看出，不管是钙调素蛋白质本身，还是钙调素蛋白质融合蛋白质，在有钙离子的条件下，都显示了和钙离子结果的功能，在SDS - PAGE胶上，显示了分子结构变化后的超前移动。
[0032]参照图4，图4显示钙调素融合蛋白质具有和钙调素相同的，激活磷酸二酯酶(PDE)的功能。和无激活基质的缓冲液(Buffer)相比，不同浓度的麦芽糖结合蛋白质和钙调素蛋白质的融合蛋白质(MBP-CAM)具有和钙调素蛋白(CAM)本身一样的激活磷酸二酯酶的效果。
[0033]参照图5，图5显示钙调素融合蛋白质和热休克蛋白质90的结合实验。从图5看出，无变性胶同位素显影实验显示，与体外合成的有同位素S35标记的热休克蛋白90相比(槽9)，钙调素融合蛋白质和体外合成的有同位素S35标记的热休克蛋白90形成了特有的结合带(槽2);体外合成的有同位素S35标记的热休克蛋白90也和钙调素蛋白质形成了特有的结合带(槽4)，而麦芽糖结合蛋白质和体外合成的有同位素S35标记的热休克蛋白90之间则没有特别结合的带(槽8)，由此可知，钙调素融合蛋白质具有和钙调素蛋白一样的，和热休克蛋白90结合能力。
[0034]参照图6，图6是用钙调素融合蛋白柱浓缩钙调素蛋白结合蛋白质或结合物实验图。从图6可以看出，本发明生产的钙调素融合蛋白质柱具有浓缩了特定的蛋白质带或结合物带，显示该融合蛋白柱是有功能的。
[0035]参照图7，图7是利用钙调素融合蛋白质分离，纯化和浓缩钙调素结合蛋白质或结合物的原理图。生物样本中，有时某些钙调素结合蛋白质或结合物质的浓度或纯度不够，或在检测时，因为浓度不够或纯度不够，而检测不到时，需要分离，纯化或浓缩来提高其浓度，就可以利用融合蛋白质柱来对生物样本做一次前处理，达到分离，纯化或浓缩靶蛋白质或结合物的目的。
[0036]本专利所介绍的融合蛋白质生产，分离纯化和分析方法，以及利用融合蛋白质来分离，浓缩相关的结合蛋白质或蛋白质结合物，达到分离，纯化和提高分析，检测的灵敏度的目的，是首次提出由融合蛋白质来富集样本中的蛋白质结合物的新方法，其方法和产品，可弥补特定蛋白质和蛋白质结合物的分离，纯化和检测方法等方面的许多不足，或提供更有效的蛋白质生产系统，其应用价值很大。本发明使用融合蛋白质的表达，生产方式，首先可提高可溶性比例，同时又简化了分离纯化的操作过程，降低了成本(利用亲和柱，方法简单，成本低)；利用设计在两种蛋白质连接处切割部位，可以容易地获得符合所需氨基酸顺序的融合蛋白质和目的蛋白质(不多一个氨基酸，也不少一个氨基酸)，便于比较融合蛋白质和目的蛋白质的可利用性能；利用融合蛋白质作为载体来分离，浓缩相关的结合蛋白质或蛋白质的结合物，可用于结合蛋白质的分离，浓缩，性能分析，检测，同时也可以作为提高生物检测灵敏度的一种新的，有效方法。例如，钙调素蛋白在有钙离子存在的条件下，可与多种热休克蛋白质结合，而热休克蛋白质特别是肿瘤细胞可以分泌热休克蛋白质90，所以热休克蛋白质90又是癌症检测的重要标记物，利用此发明技术产品，浓缩相关样本中(如:血液等样本)的热休克蛋白质，将有助于癌症的早期有效检测。
[0037]最后所应说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的精神和范围，其均应涵盖在本发明的权利要求范围当中。
【权利要求】
1.一种融合蛋白质的制备方法，其特征在于，包括以下步骤: (1)将完整的靶基因的CDNA片段克隆到融合蛋白的表达载体，CDNA克隆时，在完整基因的cDNA片段前，起始密码子(ATG)之后，加上Xa因子位点异亮氨酸-谷氨酸-甘氨酸-精氨酸(Ile-Glu-Gly-Arg)的脱氧核糖核酸序列； (2)将步骤(1)得到的含有完整目的基因的亚克隆表达载体，转型或转染到表达宿主细胞内，使之在宿主细胞内表达所需融合蛋白质，通过接种培养，获得含有完整目的基因载体的纯克隆细胞株； (3)使用步骤(2)含有完整目的基因载体的纯克隆细胞株，进行量化培养，蛋白表达处理，获得量化的，有目的融合蛋白质的宿主细胞； (4)将步骤(3)得到的宿主细胞进行裂解，获取细胞裂解液，对蛋白质进行纯化，获得分离，纯化的融合蛋白质； (5)使用因子Xa处理融合蛋白质，可获得纯化的目的基因蛋白质。
2.根据权利要求1所述的融合蛋白质的制备方法，其特征在于，所述步骤(1)中加上Xa因子位点异亮氨酸-谷氨酸-甘氨酸-精氨酸(Ile-Glu-Gly-Arg)的脱氧核糖核酸序列，可以保证所表达的蛋白质在Xa切割后，获得的目的蛋白质的氣基酸顺序是所需的，完整的。
3.根据权利要求1 所述的融合蛋质白的制备方法，其特征在于，所述步骤(4)和(5)是通过亲和柱来进行蛋白质分离和纯化的。
4.根据权利要求1所述的融合蛋白质的制备方法，其特征在于，所述一种代表性融合蛋白为钙调素融合蛋白，是以钙调素为目的蛋白质的钙调素蛋白和麦芽糖结合蛋白的融合蛋白质。
5.一种权利要求1至4任一项所述的制备方法，制备得到的融合蛋白。
6.一种融合蛋白质的应用，其特征在于，利用分离纯化获得的融合蛋白，分离、纯化和浓缩目的蛋白质，可用于蛋白质的性能分析和应用。
7.根据权利要求6所述的融合蛋白质的应用，其特征在于，利用融合蛋白，富集生物样本中的靶分子，达到分离、纯化、浓缩和提高检测灵敏度的目的。
8.根据权利要求6或7所述的融合蛋白质的应用，其特征在于，所述目的融合蛋白质为麦芽糖结合蛋白-钙调素融合蛋白，可用来结合和浓缩样本中的一种靶分子为热休克蛋白90。
【文档编号】C07K1/14GK104164444SQ201410377969
【公开日】2014年11月26日 申请日期:2014年7月31日 优先权日:2014年7月31日
【发明者】邓亚光, 欧阳慭, 邓伟平, 曾支农 申请人:宜昌美光硅谷生命科技有限公司