专利名称：Tlr4和tlr9激动剂复方在抑制肿瘤转移中的应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及TLR4和TLR9激动剂复方在抑制肿瘤转移中的应用。
技术背景肿瘤转移是造成肿瘤难以根治的最根本原因，据统计60%以上的 恶性肿瘤患者于初次诊断时已发现有转移。如美国每年诊断约80万实 体癌患者，最初诊断时发现有肿瘤转移者约50万，临床肿瘤患者卯％ 以上死于肿瘤转移。我国每年平均癌发人数约180万到200万，约有 800/ ^90°/。上死于肿瘤转移，如果不加以控制，20年后癌症死亡人数将 翻一番。先天性免疫反应和获得性免疫反应直接参与了肿瘤的发生与发 展。免疫系统在肿瘤的发生和发展中起双重作用[l. Karin E. de Visser， Alexandra Eichten and Li幼M. Coussens. Paradoxical roles of the immune system during cancer development. Nature reviews/ cancer. 2006; 6: 24-37.]。 一方面，免疫系统可通过慢性炎症反应等损伤DNA，释放细 胞因子、趋化因子、生长因子、MMPs等促进新血管生成和组织重构， 抑制抗肿瘤免疫，促进肿瘤的发生和发展；另一方面，免疫系统可产 生抗肿瘤T细胞应答和细胞因子介导地肿瘤细胞裂解作用，从而抑制 肿瘤的发生和发展。因此，在抗肿瘤免疫中，免疫系统的促肿瘤生长 和抗肿瘤生长作用存在着平衡，炎症反应的性质和强度决定了肿瘤的 发展方向[2. Lisa M. Coussens, Zena Werb. Inflammation and cancer. NATURE. 2002; 420(19): 860-867. 3.]。产生少量细胞因子或很多的抗炎 细胞因子，则会产生有限的炎症和新血管生成反应，限制肿瘤生长 很强的炎症反应可以抑制肿瘤新血管生长，使肿瘤消退；大量的趋化因子，适度炎症，可使大量新血管生成，肿瘤快速生长。TLRs是体内先天性免疫的重要组成部分，主要在巨噬细胞和树 突细胞上表达，通过活化DCs，启动特异性获得性免疫应答[l.KarinE. de Visser， Alexandra Eichten and Lisa M. Co咖ens. Paradoxical roles of the immune system during cancer development. Nature reviews/ cancer. 2006; 6: 24-37.]。 TLR的配基是一类免疫性佐剂[3. Pulendr纽B. Modulating vaccine responses with dendritic cells and Toll-like receptors. Immunol Rev. 2004; 199:227-50.]，佐剂的性质决定了下游免疫应答的独 特类型，以此为基础调节免疫反应趋向于CTL应答、抗体应答、特异 类型的Th应答或抗体同等型应答，如CpG激活TLR9，产生强Thl 型和CTL应答，LPS活化TLR4，产生Thl型应答，PG激活TLR2使 免疫平衡趋向于Th2/Treg方向。已有研究表明，50%的肿瘤患者，在 外科手术切除原发肿瘤后，由于手术过程中接触LPS，促进了肿瘤转 移进程。CpG可产生抑制Th2型反应、增强Thl型反应的作用，是通 过促进IFN-y和IL-10的表达产生的；同时IL-10的表达可抑制Thl型 反应过度。CpG单独使用时不能产生明显的抗肿瘤转移作用，作为佐 剂与肿瘤抗原或抗肿瘤药物合用，可产生较明显的抗肿瘤生长和转移 作用[4. Mark M. Whi加ore， et,al. Synergistic Activation of Innate Immunity by Double-Stranded RNA and CpG DNA Promotes Enhanced Antitumor Activity. CANCER RESEARCH. 2004; 64: 5850~5860.5. Kunihiko Kitagaki， 汰al. Immunomodulatory Effects of CpG Oligodeoxynucleotides on Established Th2 Responses. CLINICAL AND DIAGNOSTIC LABORATORY IMMUNOLOGY. 2002; 1260~1269.6. Lucia Sfondrini， et.al. CpG-Oligodeoxynucleotides activate tyrosi鹏e-related protein 2~specific T lymphocytes but do not lead to a protective tumor-specific memory response. Cancer Immunol Immunother. 2004; 53: 697—704.7. Pratesi G et.al. Therapeutic syneigism of gemcitabine and CpG國oligodeoxynucleotides in an orthotopic human pancreatic carcinoma xenograft. Cancer Res. 2005; 65(14):6388-93.]
发明内容
本发明的要解决的技术问题是，提供一种新的抑制肿瘤转移的方法，即TLR4激动剂和TLR9激动剂复方在制备预防肿瘤转移药物中的 应用。根据本发明优选的TLR4激动剂是LPS fr6m Po/p/i"( /mwKW根据本发明优选的的TLR9激动剂五.co/z' 0111:B4 LPS。 根据本发明TLR4激动剂和TLR9激动剂复方预防转移的肿瘤优选 是肺肿瘤。本发明还提供了一种药物组合物，其包括TLR4激动剂和TLR9激动 剂和药剂学上常用的载体。为了解决本发明的技术问题，本发明采用如下技术方案 发明人通过在肿瘤产生前或产生后激活不同的TLR模式识别受 体，增强先天性免疫应答，改变炎症反应的性质和强度，观察对肿瘤 生长和转移的影响，从而研究利用炎症反应中抗肿瘤的活性部分，抑 制它的促肿瘤的活性，在此基础上开发抗肿瘤的免疫性佐剂和治疗性 疫苗。换而言之，本发明的发明人通过对Toll样受体(TLRs)激动剂 对肿瘤生长和转移的影响的系统研究发现TLR4+TLR9激动剂合剂提 前给药显著抑制黑色素瘤所致小鼠肺肿瘤的转移。具体而言，C57BL/6纯系小鼠尾静脉注射黑色素瘤B16F10造成 小鼠肺肿瘤高转移模型，分别于造模前和造模后腹聘注射TLR2激动 剂(LPS-PG)或TLR4 (LPS-EC) +TLR9 (CpG)激动剂合剂，阳性 对照药为环磷酰胺。造模2周后，处死小鼠取小鼠肺计数肺结节数和 RT-PCR检测Thl、 Th2和Treg细胞因子mRNA表达水平。实验结果发现TLR4+TLR9激动剂合剂提前给药显著降低黑色素 瘤所致小鼠肺结节数和肺指数，效果与环磷酰胺相当，而造模后给药 对肺结节数和肺指数无作用。TLR2激动剂预防和治疗给药肺结节数和 肺指数均无作用。RT-PCR结果表明，TLR4+TLR9激动剂合剂显著增 加IFNy/IL-13、 IFNy/TGFP和MMP2/TIMP1比值，而显著降低IL-4的 表达。说明TLR4+TLR9激动剂合剂提前给药显著抑制黑色素瘤所致小 鼠肺肿瘤的转移，使Thl/Th2、Thl/Treg平衡朝向Thl偏移。TLR4+TLR9 激动剂合剂医治肿瘤转移的作用可能与预先升高小鼠体内炎症水平， 抑制肿瘤产生免疫炎症反应有关。
Sham:假手术组 Mod:模型组； CTX:环磷酰胺组； TLR2bef: TLR2提前给药组；(TLR4+TLR9) bef: (TLR4+TLR9)提前给药组； TLR2aft: TLR2治疗给药组；(TLR4+TLR9) aft: (TLR4+TLR9)治疗给药组。 #P<0,05， **P<0.01， ###P<0.001 vs Sham; *P<0.05 ， * *P<0.05 ， * * *P<0.001 vs Mod 。图l. TLRs激动剂对肺转移结节数和肺指数的影响。 图A:小鼠肺照片； 图B:肺指数； 图C:肺结节数。图2.图2-A TLRs激动剂对IFNyiL-13比值的影响。图2-B TLRs激动剂对IFNy/TGFp比值的影响。图2-C TLRs激动剂对IL-4比值的影响。
图2-D TLRs激动剂对MMP2mMPl比值的影响。
具体实施方式
下面的实施例是的本发明的具体说明，不能理解为对本发明的限制。实施例11.试验材料和方法 1.1材料TLR2激动剂LPS-PG (Pgz'wgi'vfl/&LPS，ultrapure)、 TLR4激动剂 LPS-EC (￡. co/z0111:B4LPS，ultrapure)均购自InvivoGen公司。TLR9 激动剂CpG-ODN1826由北京赛百盛基因技术有限公司合成(序列5'-tccatgacgttcctgacgtt-3'，全程硫代修饰，订单号0404-230)。 1.2薷色素癯小鼠肺转移模型的制备1.2.1动物选择C57BL/6纯系小鼠，5~6周龄，雌性，14画16g;1.2.2瘤株高转移的黑素瘤B16F10细胞株；1.2.3瘤细胞的培养B16细胞置于DMEM培养基中培养 (10。/。FBS+青霉素+链霉素)，37'C， 5%C02;1.2.4瘤液的制备用EDTA消化对数生长期B16细扭，PBS冲洗 两遍，重新混悬于PBS中制成2.5xl()S个/ml瘤细胞悬液。1.2.5肿瘤接种方法将制备好的瘤液300nL置于EP管内，无菌 条件下尾静脉注射200pL于C57BL/6小鼠，相当于每只小鼠接种5>< 105 个瘤细胞。 1.3试验方法1.3.1试验分组C57BL/6纯系小鼠分为7组，每组15只。模型组，小鼠尾静脉黑 色素瘤混悬液200nL/只；假手术组，尾静脉注射PBS200nL/只；TLR2 提前给药组，于小鼠造模前第7、 4、 1天腹腔注射LPS-PG 25jig/kg; TLR2治疗组，于小鼠造模后第l、 4、 7天腹腔注射LPS-PG 25ng/kg; TLR4+TLR9合剂提前给药组，于小鼠造模前第7、 4、 1天腹腔注射 12.5Mg/kg LPS-EC +250ng/kg CpG-ODN1826; TLR4+TLR9合剂治疗 组，于小鼠造模后第l、 4、 7天腹腔注射12.5pg/kgLPS-EC+25(Vg/kg CpG-ODN1826;环磷酰胺(CTX)治疗组，于小鼠造模后每天给予CTX 20mg/kg，连续给药2周。造模2周后，处死小鼠。取脾脏、肺脏及血 清，保存待检测。 1.3.2检测指标1.3.2.1肿瘤转移情况(n-10):在末次给药24小时之后，断髄处死， 称肺量，4%多聚甲醛固定，在解剖显微镜下(10倍)记数肺表面瘤结 节数。1.3.2.2小鼠肺免疫环境监测 先天性免疫情况RT-PCR检测TLR2、 TLR4、 TLR9表达水平。 获得性免疫情况 Thl: RT-PCR和ELISA检测IFN个IL-8、 IL-6、 TNF-a、 IL-12、 IL-18细胞因子表达水平； Th2: RT-PCR和ELISA检测IL-4、 IL-5、 IL-13表达水平； Treg: RT-PCR检测TGF-P、 IL-IO、 Foxp3表达水平。2.结果2.1 TLRs激动剂对肿瘤肺转移的影响TLR4+TLR9激动剂合剂提前给药显著降低小鼠肺结节数(P0.001vs模型组)和肺指数(PO.001 vs模型组)，而TLR4+TLR9激动剂合 剂治疗给药对小鼠肺结节数和肺指数无作用。TLR2受体激动剂无论提 前给药还是治疗给药对小鼠肺结节数均无作用。阳性对照药显著降低
小鼠肺结节数(P<0.001 vs模型组)和肺指数(P<0.05 vs模型组)(图 1)。2.2TLRs激动剂对Thl、 Th2和Treg细胞因子表达的影响TLR4+TLR9激动剂合剂提前给药显著增力QIFN下/IL-13比值(P0.05 vs模型组)(图2A)、 IFNyA"GFp比值(P<0.01 vs模型组)(图2C)和 MMP2/TIMP1比值(PO.05vs模型组)(图2D)，而显著降低IL-4的表 达(PO.01vs模型组)(图2B)。 探讨TLRs激动剂对肿瘤转移抑制作用的免疫学机制。讨论TLR4+TLR9激动剂提前给药显著增加IFNy/IL-13比值和IL-4的表 达水平，说明TLR4+TLR9激动剂提前给药可能预先改变小鼠肺微环境 Thl/Th2细胞因子的平衡，使Thl/Th2平衡朝向Thl免疫应答偏移。 TLR4+TLR9激动剂提前给药也显著增加IFNY/TGF卩比值，使Thl/Treg 平衡也朝向Thl免疫应答偏移。这种预先提高体内炎症水平的作用可能 是TLR4+TLR9激动剂抑制肿瘤转移的机制之一。总之，TLR4+TLR9激动剂合剂提前给药显著抑制黑色素瘤所致小 鼠肺肿瘤的转移，使Thl/Th2、 Thl/Treg平衡朝向Thl偏移。TLR4+TLR9 激动剂合剂医治肿瘤转移的作用可能与预先升高小鼠体内炎症水平， 抑制肿瘤产生免疫炎症反应有关。TLR4+TLR9激动剂合剂为预防肿瘤 转移提供了新的治疗方法。
权利要求
1.TLR4激动剂和TLR9激动剂复方在制备预防肿瘤转移药物中的应用。
2. 根据权利要求l的应用，其特征在于，所述的TLR4激动剂是LPS from尸or/ /^ra附owa51 g/"g/voto 。
3. 根据权利要求l的应用，其特征在于，所述的TLR9激动剂是E co// 0111:B4 LPS。
4. 根据权利要求l的应用，其特征在于，所述的肿瘤是肺肿瘤。
5. —种药物组合物，其特征在于，包括TLR4激动剂和TLR9激动剂 和药剂学上常用的载体。
6. —种药物组合物，其特征在于，包括LPS from户w7^,cw70"os g/wg/rafo和E co// 0111:B4 LPS和药剂学上常用的载体。
全文摘要
本发明公开了TLR4激动剂和TLR9激动剂复方在制备预防肿瘤转移药物中的应用，尤其是TLR4激动剂是LPS from Porphyromonas gingivalis和TLR9激动剂E.coli 0111B4 LPS在抑制肺肿瘤转移中的应用。本发明还公开了一种药物组合物，包括TLR4激动剂和TLR9激动剂和药剂学上常用的载体。本发明通过小鼠肺肿瘤高转移模型，分别于造模前腹腔注射TLR2激动剂(LPS-PG)或TLR4(LPS-EC)+TLR9(CpG)激动剂合剂，发现TLR4+TLR9激动剂合剂提前给药显著降低黑色素瘤所致小鼠肺结节数和肺指数，显著增加IFNγ/IL-13、IFNγ/TGFβ和MMP2/TIMP1比值，而显著降低IL-4的表达。使Th1/Th2、Th1/Treg平衡朝向Th1偏移。TLR4+TLR9激动剂合剂提前给药显著抑制黑色素瘤所致小鼠肺肿瘤的转移。
文档编号A61K31/739GK101134046SQ200610112299
公开日2008年3月5日 申请日期2006年9月1日 优先权日2006年9月1日
发明者君 严, 何令帅, 刘含智, 冰 崔, 李平平, 杨红振, 王青青, 胡卓伟, 谢文杰, 辛冰牧, 闫慧敏 申请人:中国医学科学院药物研究所