专利名称：用于免疫分析的微球组合物或组件及免疫分析方法
技术领域：
本发明涉及一种用于化学发光免疫分析的微球组合物或微球组件，它具有改进的高发光效率。还涉及使用所述组合物或组件进行免疫分析的方法。
背景技术：
迄今为止，生物体内微量生物活性物质的免疫测定方法已经历了由放射免疫分析(RIA)、荧光免疫分析(FIA)、酶联免疫分析(EIA)，以及化学发光免疫分析等诸阶段。这一衍变过程主要是基于对检测方法的敏感性、准确性、以及操作简捷性需求的不断提高而决定的。
正如放射免疫(RIA)分析技术当年从发明到应用的推陈出新所经过的历程一样，化学发光免疫定量检测法成为现今取代放射免疫分析的有力分析手段和技术。在国际领域内，化学发光免疫定量检测法已成为临床检验的一个非常重要的新技术和检测手段，并将延展至临床检验的各个领域，这也是临床检验界的一致共识。
化学发光免疫分析法是一种利用化学发光物质发射的光波进行检测的方法。化学发光物质作为标记应用于核酸检测与免疫检测中。例如，可通过多种途径将特异结合对中的某一分子与发光物质结合形成发光复合物。该复合物可与样品中被检测物(特异结合对中的另一分子)反应，分配于固相与液相中，且分配比例与检测物的量相关。通过测定固相或液相中发光量，即可得出样品中检测物的相应浓度。
具体地说，在均相条件下，将包被有活性分子并且内部带有染料的感光微球(纳米级)以及包被有活性分子并且内部带有发光化合物的发光微球(纳米级)的混合物作为试剂和有可能含有目标分子的检测样品混合。此时包被有活性分子的纳米感光微球和包被有活性分子的纳米发光微球可迅速有效地捕捉目标分子，纳米感光微球、纳米发光微球和目标分子一起形成近距离的夹心复合物。经激发光照射，纳米感光微球中的染料被诱导激活并释放高能态的活性氧离子(单线态氧)。该高能态的活性氧离子被近距离的纳米发光微球俘获，从而传递能量以激活所述发光微球中的发光化合物。发光微球中的发光化合物可于数微秒后在零背景无干扰的情况下释放出高能级红光。用光子计数器测定这些高能级光子并通过电脑将光子数量换算为目标分子浓度，光子数量的多少即精确地反映了目标分子的浓度。
因此，感光微球和发光微球的发光效率决定了化学发光免疫分析法的检测灵敏度。为了提高感光微球和/或发光微球的发光效率，本领域一般采用提高感光微球中染料的感光效率和/或发光微球中发光化合物的接受光的效率和发光效率的方法。
例如，美国专利5,709,994公开了一种测定目标分子的方法，它包括对可能含有目标分子的组合物进行光辐照的步骤，所述组合物包括非颗粒基质或颗粒基质，所述基质包被有经光辐照会产生单线态氧的光敏剂和可被所述单线态氧活化的化学发光化合物。它还具体公开了所述化学发光化合物选自9-亚烷基-N-甲基吖啶、烯醇醚和烯胺，所述光敏剂选自亚甲基蓝、玫瑰红、卟啉、酞菁和叶绿素。
美国专利5,780,646公开了一种发光组合物，它包括(a)一种至少六配位的金属鳌合物和(b)一种具有两个芳基的带双键的化合物。
虽然采用本领域所述方法可极大地提高化学发光免疫分析法的检测灵敏度，但是仍需要开发一种能在现有技术基础上进一步提高发光效率的方法。
发明的内容本发明的目的是提供一种用于化学发光免疫分析的微球组合物，它具有高的检测灵敏度。
本发明的另一个目的是提供一种用于化学发光免疫分析的微球组件，它具有高的检测灵敏度。
本发明的再一个目的是提供一种化学发光免疫分析法，它具有高的检测灵敏度。
本发明人经过大量研究发现，使感光微球的粒径小于发光微球的粒径可有效地提高化学发光的发光效率。本发明就是在该发现的基础上完成的。
因此，本发明提供一种用于化学发光免疫分析的微球组合物，它包括各自包被有抗体的感光微球和发光微球，其特征在于所述感光微球的粒径小于发光微球的粒径。
本发明还提供一种用于化学发光免疫分析的微球组件，它包括包被有抗体的感光微球包装和包被有抗体的发光微球包装，其特征在于所述感光微球的粒径小于发光微球的粒径。
本发明还提供一种化学发光免疫分析方法，它包括向被分析试样中依次加入上述微球组件中的感光微球和发光微球，或者加入本发明微球组合物。
图1是光激化学发光免疫分析系统(LICA)检测原理图，其中图1a是包被第一抗体并含有光敏试剂的光敏微球的示意图；图1b是加入检测试样后被检测抗原与第一抗体结合的示意图；图1c是加入包被有第二抗体并含有发光组合物的微球的示意图；图1d是光致发光的示意图。
具体实施例方式
在本发明中，术语“粒径”是指微球的平均直径。它是用常规粒径仪测定的。
图1是本发明光激化学发光免疫分析系统(LICA)检测原理图。如图1a所示，纳米级的感光微球10中带有光敏剂，该微球表面包被有第一抗体1。如图1b所示，当将包被有第一抗体1并含有光敏剂的纳米微球加入含被检测抗原2的试样中以后，第一抗体1会与抗原2相结合。如图1c所示，发光微球20是含有发光组合物的纳米微球，它表面包被有第二抗体3。当将所述发光微球20加入上述试样中以后，该发光微球上包被的第二抗体3也会与已经与第一抗体1结合的抗原2相结合，形成夹合体。如图1d所示，当用激光辐照光敏微球以后，感光微球中的光敏剂会放出单线态氧，该单线态氧被发光微球中的发光组合物俘获后，会激发发光组合物中的发光化合物，发出特定波长的光线。通过检测该波长的光线就可测定抗原的量。
下面结合附图更详细地说明本发明。
一.微球基质用作本发明感光微球10和发光微球20的纳米级微球基质是本领域已知的微球基质。用作感光微球的基质和用作发光微球的基质(下面统称为微球基质)无特别的限制，它们可相同或不相同，只要感光微球的粒径小于发光微球的粒径即可。
例如，所述微球基质可以是羧基改性的乳胶颗粒、醛基改性的乳胶颗粒或者环氧基或羟基改性的乳胶颗粒。这种颗粒的详细情况可参见美国专利5,780,646和5,709,994(该文献在此全文引为参考)。
所述微球基质可从市场上购得，例如购自上海朋远泰生物技术有限公司的WQ系列微球产品或者购自美国Bangs Laboratories，Inc。
本发明微球基质也可通过单体聚合的方法得到。常用的方法有乳液聚合或微乳液聚合。在本发明的一个较好实例中，所述微球基质是由具有通式(I)的乙烯基芳香单体 与具体通式(II)的丙烯酸酯单体 通过乳液聚合制得。上述通式中，R1是选自下式的芳基，其中X是H，1-5个碳原子的直链或支链烷基，所述烷基可被氯原子所取代 或者 R2是具有1-6个碳原子的直链或支链烷基取代基，或者具有如下结构的取代基 或者 Y是H或者甲基，所述乳液聚合的聚合条件是本领域众所周知的。例如，在所述乳液聚合中使用的表面活性剂可以是离子型表面活性剂或非离子型表面活性剂或其混合物，常见的有十二烷基磺酸钠(SDS)，吐温-20以及Triton X-100等。
二.感光微球如上所述，用作本发明感光微球10的纳米级微球基质是本领域已知的微球基质。其粒径应小于发光微球的粒径。
在本发明的一个较好实例中，所述感光微球的粒径为20-400nm，较好为40-250nm，更好为80-120nm。
用于感光微球中的光敏剂无特别的限制，它可以是本领域已知的光敏剂，其非限定性例子有例如美国专利5,709,994公开的亚甲基蓝、玫瑰红、卟啉、酞菁和叶绿素。
在感光微球中光敏剂的载带量无特别的限制，它可以是本领域常用的量。适用于本发明的感光微球以及第一抗体的包被方法可例如参见美国专利5,709,994与5,780,646。
用于将光敏剂加入感光微球的方法以及包被该感光微球的方法可以是本领域常用的任何方法。这种方法可例如参见美国专利5,709,994与5,780,646。
三.发光微球如上所述，用作本发明发光微球20的纳米级微球基质是本领域已知的微球基质。其粒径应大于感光微球的粒径。
本发明发光微球中所含的发光组合物可以是本领域常见的发光组合物，例如，美国专利5,780,646所述的发光组合物。
在本发明的一个较好实例中，所述发光组合物包括一种带双丁二酮化合物M作为配位体的铕配合物和一种含不饱和烯键的化合物(参见2005年2月4日提交的中国专利申请200510023820.3)(该文献在此全文引为参考)。所述双丁二酮化合物具有如下通式 其中X是具有1-5个碳原子直链烷基；或者具有下式的芳基，其中Y是1-5个碳原子的直链或支链烷基取代基 或 所述双丁酮化合物较好选自1，1-二(对(1′，1′，1′-三氟-2′，4′-丁二酮-4′-基)苯基)甲烷、1，2-二(对(1′，1′，1′-三氟-2′，4′-丁二酮-4′-基)苯基)乙烷、1，3-二(对(1′，1′，1′-三氟-2′，4′-丁二酮-4′-基)苯基)丙烷、1，6-二(对(1′，1′，1′-三氟-2′，4′-丁二酮-4′-基)苯基)丁烷、4，4′-二(1″，1″，1″-三氟-2″，4″-丁二酮-4″-基)邻联三苯、3-甲基-1，2-二(4-(1′，1′，1′-三氟-2′，4′-丁二酮-4′-基)苯基)苯、4-甲基-1，2-二(4-(1′，1′，1′-三氟-2′，4′-丁二酮-4′-基)苯基)苯、3-乙基-1，2-二(4-(1′，1′，1′-三氟-2′，4′-丁二酮-4′-基)苯基)苯、4-乙基-1，2-二(4-(1′，1′，1′-三氟-2′，4′-丁二酮-4′-基)苯基)苯、2，3-二(4-(1′，1′，1′-三氟-2′，4′-丁二酮-4′-基)苯基)萘、5-庚基-2，3-二(4-(1′，1′，1′-三氟-2′，4′-丁二酮-4′-基)苯基)萘、5-(2″-甲基己基)-2，3-二(4-(1′，1′，1′-三氟-2′，4′-丁二酮-4′-基)苯基)萘、4-甲基-2，3-二(4-(1′，1′，1′-三氟-2′，4′-丁二酮-4′-基)苯基)萘、4-乙基-2，3-二(4-(1′，1′，1′-三氟-2′，4′-丁二酮-4′-基)苯基)萘、5-甲基-2，3-二(4-(1′，1′，1′-三氟-2′，4′-丁二酮-4′-基)苯基)萘、4-丙基-2，3-二(4-(1′，1′，1′-三氟-2′，4′-丁二酮-4′-基)苯基)萘、1，8-二(4-(1′，1′，1′-三氟-2′，4′-丁二酮-4′-基)苯基)萘、5-庚基-1，8-二(4-(1′，1′，1′-三氟-2′，4′-丁二酮-4′-基)苯基)萘、5-(2″-甲基己基)-2，3-二(4-(1′，1′，1′-三氟-2′，4′-丁二酮-4′-基)苯基)萘、4-甲基-1，8-二(4-(1′，1′，1′-三氟-2′，4′-丁二酮-4′-基)苯基)萘、4-乙基-1，8-二(4-(1′，1′，1′-三氟-2′，4′-丁二酮-4′-基)苯基)萘、5-甲基-1，8-二(4-(1′，1′，1′-三氟-2′，4′-丁二酮-4′-基)苯基)萘或4-丙基-1，8-二(4-(1′，1′，1′-三氟-2′，4′-丁二酮-4′-基)苯基)萘。
用所述双丁二酮化合物形成铕配合物的方法是本领域众所周知的。例如，可将化学计量量的双丁二酮化合物与铕化合物混合即可。
所述含烯键化合物具有如下通式 其中，X′是S或NR，R是具有1-10个碳原子的烷基或者6-18个碳原子的芳基；R′是氢原子或者具有1-10个碳原子的烷基；D和D′各自为氢原子或者具有1-20个碳原子的烷基。
在本发明的另一个较好实例中，所述发光组合物包括一种以萘基-三氟丁二酮(Nathyltriflurobutanedione，NTA)作为配位体的铕配合物和上述含不饱和烯键的化合物 这两种组分的含量无特别的限制，只要能使该组合物的发光效率满足最终免疫分析即可。
适用于本发明的发光微球的粒径无特别的限制，只要其大于感光微球的粒径即可。在本发明的一个较好实例中，所述发光微球的粒径为100-400nm，较好为150-350nm，更好为190-210nm。
适用于本发明的发光微球与感光微球的粒径之比无特别的限制，只要其大于1即可。在本发明的一个较好实例中，所述纳米级微球的粒径比为1.05-8.80，较好为1.42-5.00，更好为1.9-2.1。
下面结合实施例进一步说明本发明。
实施例1和比较例1-2合成含烯键化合物合成含不饱和烯键的化合物将34.4g(0.2mol)溴代苯胺溶解在125ml DMF中，加入0.6mol溴代十四烷及0.6mol二异丙基乙胺，反应溶液加热到100℃，然后反应12小时。反应的溶液加入300ml二氯甲烷，水洗三次除去DMF。去除二氯甲烷，产物用乙醇重结晶。得到N，N-二取代的对溴苯胺 (式I化合物)，反应的产率为70％ 向一个装有滴液漏斗、温度计和回流冷凝管的500ml圆底三颈烧瓶中加入100ml干燥的THF，随后加入3g金属镁条，在回流条件下加入少量上面得到的N，N-二取代的对溴苯胺产物(式I化合物)以启动反应，并加入少量的碘以帮助反应启动。将0.11mol上述N，N-二取代的对溴苯胺产物(式I化合物)溶解于50ml干燥的THF中，并置于滴加漏斗中，缓缓地滴加此溶液并保持回流。加液完毕后让反应回流1小时。用冰浴冷却反应体系，在℃时缓缓地滴加0.1mol下式(II)化合物(购自Aldrich/Sigma)的50ml THF溶液。让反应在0℃进行30分钟，然后放置于室温2小时。缓缓地加入0.1N HCl溶液以水解生成的镁盐。加入200mlCH2Cl2，然后用水洗涤有机层2-3次。有机层用无水硫酸钠干燥。用硅胶柱分离所需产品。用20％乙酸乙脂80％正乙烷溶液分离产品，产品的Rf值在0.5左右。(20％乙酸乙脂/80％正乙烷/TLC)纯化后的产品(式III化合物)产率为35％。
R’＝HI II III在一个带有冷凝管的500ml圆底烧瓶中将0.1mol上述式III化合物溶解在100ml甲苯中，加入少量ZnCl2及0.11mol式IV化合物。回流并去除生成的水。反应4小时反应基本完成。用旋转蒸发仪去除多余的甲苯。然后用硅胶柱分离纯化最后的产品(用95％正乙烷，5％乙酸乙脂)，得到化合物A，产率为60％。
III R’＝H，D＝D’＝C14H291H NMR7.0ppm-7.26ppm(多重峰，7H)，6.42ppm-6.44ppm(多重峰，2H)，4.48ppm-4.50ppm(多重峰，2H)，3.16ppm-3.32ppm(多重峰，4H)，1.52ppm-1.57ppm(多重峰，4H)，1.3ppm(多重峰，44H)，0.86ppm(3重峰，6H)。
合成配位体化合物 (1)将2.3g邻苯基联苯溶解在20ml干燥的CH2Cl2溶液中，加入2.94g AlCl3，然后冷却到0℃。在剧烈的搅拌下加入2g的CH3C(O)Cl(购自Aldrich/Sigma)。滴加完成后让反应在室温反应1-2小时。有机溶液用水洗三次，然后用无水硫酸钠干燥。去除溶剂后得到2.6g产物(产率81％)。
1H NMR7.1-7.9ppm(多重峰，12H)，2.3ppm(单重峰，6H)(2)将1.6g上述产物溶解在20ml的无水乙醚中，加入1g的CH3ONa(甲醇钠)及2g CF3-C(O)OEt(三氟乙酸乙酯)。让反应在室温下搅拌2-3小时。然后用水洗三次。有机层用无水硫酸钠干燥，除去有机溶液后得到1.6g产物(产率80％) 1H NMR 7.1-7.9ppm(多重峰，12H)，4.5ppm(单峰，4H)制造发光球用美国专利5,780,646的实施例所述的方法将200mg合成例制得的含烯键化合物A和100mg用上述配位体制得的铕配合物放入197nm的醛基改性的乳胶颗粒(购自上海朋远泰生物技术有限公司)中，形成197nm的发光球。
用同样的方法将含烯键化合物A和铕配合物放入350nm的纳米颗粒(购自上海朋远泰生物技术有限公司)中，形成350nm的发光球。
包被抗体取10mL上述制得的197nm的发光球(20mg/mL，50Mm MES缓冲液，内部染料为所述含烯键化合物与所述铕配合物)离心清洗。Sorvall SA-600转头4℃离心1小时，转速为15,000rpm。离心后弃上清液，以8mL 50mM MES缓冲液重悬浮。重复离心清洗三次。
取上述清洗后得到的发光球(25mg/mL，50mM MES缓冲液，内部染料为所述含烯键化合物与本发明实施例制得的铕配合物)0.04ml，加入5.72mg IgG1，10mgNaCNBH3(50mM MES缓冲液)，37度搅拌反应过夜。反应后，加入20mgBSA(50mM MES缓冲液)37℃反应2小时。反应完毕后，Sorvall SA-600转头4℃离心1小时，转速为15,000rpm。离心后弃上清液，以10mL 50mM MES缓冲液重悬浮。重复离心清洗三次，即制得实施例1所述的本发明醛基改性后的197nm发光球。用同样的方法制得实施例1所述的350nm发光球。
制造感光球用美国专利5,780,646的实施例所述的方法将200mg叶绿素A放入粒径分别为197nm、350nm、140nm、100nm、40nm的纳米颗粒(购自上海朋远泰生物技术有限公司)中，并参照上述包被抗体的方法包被IgG2，形成一组本发明感光球。
发光效率的测定按表1所述组合方式，取等体积500μl的包被有抗体的感光球(50μg)与发光球(6.25μg)，加入50μl抗原与100μl作为检测缓冲液的50mM MES缓冲液(购自Sigma)混合。37℃温育15分钟后，利用PMT光子计数器(购自上海朋远泰生物技术有限公司)读取光子数。结果列于表1。
表1
由表1的结果可见，在其它条件不变的情况下，改变发光微球和感光微球的粒径使发光微球的粒径大于感光微球的粒径，可极大地提高发光效率，从而提高免疫分析的灵敏度。
实施例2和比较例3-4合成含不饱和烯键的化合物将34.4g(0.2mol)溴代苯胺溶解在125ml DMF中，加入0.6mol溴代丁烷及0.6mol二异丙基乙胺，反应溶液加热到100℃，然后反应12小时。反应的溶液加入300ml二氯甲烷，水洗三次除去DMF。去除二氯甲烷，产物用乙醇重结晶。得到N，N-二取代的对溴苯胺(式1化合物)，反应的产率为70％
向一个装有滴液漏斗、温度计和回流冷凝管的500ml圆底三颈烧瓶中加入100ml干燥的THF，随后加入3g金属镁条，在回流条件下加入少量上面得到的N，N-二取代的对溴苯胺产物(式1化合物)以启动反应。将0.11mol上述N，N-二取代的对溴苯胺产物(式1化合物)溶解于50ml干燥的THF中，并置于滴加漏斗中，缓缓地滴加此溶液并保持回流。加液完毕后让反应回流1小时。用冰浴冷却反应体系，在℃时缓缓地滴加0.1mol下式(2)化合物(购自Aldrich/Sigm)的50ml THF溶液。让反应在0℃进行30分钟，然后放置于室温2小时。缓缓地加入0.1N HCl溶液以水解生成的镁盐。加入200mlCH2Cl2，然后用水洗涤有机层2-3次。有机层用无水硫酸钠干燥。用硅胶柱分离所需产品。用20％乙酸乙脂80％正乙烷溶液分离产品，产品的Rf值在0.5左右。(20％乙酸乙脂/80％正乙烷/TLC)纯化后的产品(式3化合物)产率为35％。
在一个带有冷凝管的500ml圆底烧瓶中将0.1mol上述式3化合物溶解在100ml甲苯中，加入少量ZnCl2及0.11mol式4化合物。回流并去除生成的水。反应4小时反应基本完成。用旋转蒸发仪去除多余的甲苯。然后用硅胶柱分离纯化最后的产品(用95％正乙烷，5％乙酸乙脂)，得到化合物B，产率为60％。
1H NMR 7.0ppm-7.26ppm(多重峰，6H)，6.42ppm-6.44ppm(多重峰，2H)，4.48ppm-4.50ppm(多重峰，2H)，3.16ppm-3.32ppm(多重峰，4H)，2.2ppm(单重峰，3H)1.52ppm-1.57ppm(多重峰，4H)，0.86ppm(3重峰，6H)。1.3ppm(多重峰，4H)。
合成配位体化合物 (1)，1.7g二苯甲烷溶解在20干燥的CH2Cl2溶液中，加入2.94gAlCl3，然后冷却到0℃。在剧烈的搅拌下加入2g的CH3C(O)Cl。滴加完成后反应在室温反应1-2小时。有机溶液用水洗三次，然后用无水硫酸钠干燥。去除溶剂后得到1.4g产物(70％产率) 1H NMR7.6-7.9(双重峰，4H)，3.1(单重峰，2H)，2.3(单重峰，6H)(2)上述1.3g上述产物溶解在20ml的无水乙醚中，加入1g的CH3ONa(甲醇纳)及2g CF3-COOEt(三氟乙酸乙酯)。让反应在室温下搅拌2-3小时。然后用水洗三次。有机层用无水硫酸钠干燥，除去有机溶液后得到1.2g产物(产率80％) 1H NMR7.6-7.9(双重峰，4H)，4.5(单重峰，4H)，3.1(单重峰，2H)。
制造发光球用美国专利5,780,646的实施例所述的方法将200mg合成例制得的含烯键化合物A和100mg用上面配位体制得的铕配合物放入197nm的环氧基改性的乳胶颗粒(购自购自上海朋远泰生物技术有限公司)中。
用同样的方法将含烯键化合物A和铕配合物放入350nm的环氧基改性的乳胶颗粒(购自上海朋远泰生物技术有限公司)中。
包被抗体取10mL上述制得的197nm的发光球(20mg/mL，50mM硼酸钠缓冲液，内部染料为所述含烯键化合物与所述铕配合物)离心清洗。Sorvall SA-600转头4℃离心1小时，转速为15,000rpm。离心后弃上清液，以8mL 50mM硼酸钠缓冲液重悬浮。重复离心清洗三次。
取上述清洗后得到的发光球(25mg/mL，50mM硼酸钠缓冲液，内部染料为所述含烯键化合物与本发明实施例制得的铕配合物)0.04ml，加入5.72mgIgG1，37度搅拌反应24小时。反应后，加入20mg BSA(50mM硼酸钠缓冲液)37度反应过夜。反应完毕后，Sorvall SA-600转头4℃离心1小时，转速为15,000rpm。离心后弃上清液，以10mL 50mM MES缓冲液重悬浮。重复离心清洗三次，即制得实施例2所述的本发明环氧基改性后的197nm发光球。
用同样的方法制得实施例2所述的350nm发光球。
制造感光球用美国专利5,780,646的实施例所述的方法将200mg叶绿素A放入粒径分别为197nm、350nm、140nm、100nm、40nm的纳米颗粒(购自上海朋远泰生物技术有限公司)中，并参照上述包被抗体的方法包被IgG2，形成一组本发明感光球。
发光效率的测定按表2所列的组合，取等体积500μl的包被有抗体的感光球(50μg)与发光球(6.25μg)，加入50μl抗原与100μl作为检测缓冲液的50mM MES缓冲液(购自Sigma)混合。37度温育15分钟后，利用PMT光子计数器(购自上海朋远泰生物技术有限公司)读取光子数。结果列于表2表2
由表2的结果可见，在其它条件不变的情况下，改变发光微球和感光微球的粒径使发光微球的粒径大于感光微球的粒径，可极大地提高发光效率，从而提高免疫分析的灵敏度。
实施例3和比较例5和6合成配位体化合物(1)，2.5g甲基邻苯基联苯溶解在20干燥的CH2Cl2溶液中，加入2.94gAlCl3，然后冷却到0℃。在剧烈的搅拌下加入2g的CH3C(O)Cl。滴加完成后反应在室温反应1-2小时。有机溶液用水洗三次，然后用无水硫酸钠干燥。去除溶剂后得到1.4g产物(70％产率) 1H NMR7.6-7.9(多重峰，7H)，2.1(单重峰，3H)，2.3(单重峰，6H)(2)上述1.7g上述产物溶解在20ml的无水乙醚中，加入1g的CH3ONa(甲醇纳)及2g CF3-COOEt(三氟乙酸乙酯)。让反应在室温下搅拌2-3小时。然后用水洗三次。有机层用无水硫酸钠干燥，除去有机溶液后得到1.6g产物(产率80％) 1H NMR7.6-7.9(多重峰，7H)，4.5(单重峰，4H)，2.1(单重峰，3H)。
制造发光球用美国专利5,780,646的实施例所述的方法将200mg本发明实施例1合成制得的含烯键化合物和100mg用上面配位体制得的铕配合物放入197nm的羧基改性后的乳胶颗粒(购自美国Bangs Laboratories，Inc)中。
用同样的方法制得粒径为350nm的发光球。
包被抗体取10mL上述制得的197nm发光球(20mg/mL，50mM MES缓冲液，内部染料为所述含烯键化合物与所述铕配合物)，加入40mg NHS(4％，缓冲体系0.05Mes buffer)，20mg EDAC(4％，缓冲体系50mM MES缓冲液)。室温搅拌反应2小时。Sorvall SA-600转头4℃离心1小时，转速为15,000rpm。离心后弃上清液，以8mL 50mM MES缓冲液重悬浮。重复离心清洗三次。
取上述制备得到的发光球(25mg/mL，50mM MES缓冲液，内部染料为所述含烯键化合物与本发明制得的铕配合物)0.4ml，加入5.72mg IgG1按美国专利5,780,646实施例3所述制得的本发明发光球。
用同样的方法制得实施例3所述的350nm发光球。
制造感光球用美国专利5,780,646的实施例所述的方法将200mg叶绿素A放入粒径分别为197nm、350nm、140nm、100nm、40nm的纳米颗粒(购自美国Bangs Laboratories，Inc)中，并参照上述包被抗体的方法包被IgG2，形成一组本发明感光球。用与实施例1相同的方法测定发光效率，结果列于表3。
表3
由表3的结果可见，在其它条件不变的情况下，改变发光微球和感光微球的粒径使发光微球的粒径大于感光微球的粒径，可极大地提高发光效率，从而提高免疫分析的灵敏度。
实施例4和比较例7和8使用与实施例1相同的方法制得发光微球和感光微球，但是在发光微球中使用下式三氟丁二酮萘作为铕配位体
用与实施例1相同的方法测定发光效率，结果列于表4。
表4
由表3的结果可见，在其它条件不变的情况下，改变发光微球和感光微球的粒径使发光微球的粒径大于感光微球的粒径，可极大地提高发光效率，从而提高免疫分析的灵敏度。
实施例5和比较例9和10用与实施例4相同的方法制得发光微球和感光微球，但是使用羧基改性的微球基质(购自美国Bangs Laboratories，Inc)，结果列于表5表5
实施例6和比较例11和12使用与实施例2相同的方法制得发光微球和感光微球，但是在发光微球中使用下式化合物作为铕配位体
用与实施例1相同的方法测定发光效率，结果列于表5。
表5
由上面数据可见，通过改变发光微球和感光微球这两者的粒径大小，可以增强发光效果。将发光球与感光球的粒径比率由1增加到2，光子计数器的信号提高了近10倍。继续增加两者的粒径比率，信号值仍有一定程度的增加，但增强速率下降。另外，发光微球内部发光组合物、微球基质的组成等对光信号增强趋势无明显影响。
本发明组合物可有效提高化学发光的检测范围，提高检测的灵敏度与准确性，并使降低相关检测仪器的硬件配置成为可能。
权利要求
1.一种用于化学发光免疫分析的微球组合物，它包括各自包被有抗体的感光微球和发光微球，其特征在于所述感光微球的粒径小于发光微球的粒径。
2.如权利要求1所述的微球组合物，其特征在于所述感光微球的粒径为20-400nm，发光微球的粒径为100-400nm，并且发光微球与感光微球的粒径比为1.05-8.80。
3.如权利要求1或2所述的微球组合物，其特征在于所述感光微球的粒径为40-250nm，发光微球的粒径为150-350nm，并且发光微球与感光微球的粒径比为1.42-5.00。
4.如权利要求1或2所述的微球组合物，其特征在于所述感光微球的粒径为80-120nm，发光微球的粒径为190-210nm，并且发光微球与感光微球的粒径比为1.90-2.10。
5.一种用于化学发光免疫分析的微球组件，它包括包被有抗体的感光微球包装和包被有抗体的发光微球包装，其特征在于所述感光微球的粒径小于发光微球的粒径。
6.如权利要求5所述的微球组件，其特征在于所述感光微球的粒径为20-400nm，发光微球的粒径为100-400nm，并且发光微球与感光微球的粒径比为1.05-8.80。
7.如权利要求5或6所述的微球组件，其特征在于所述感光微球的粒径为40-250nm，发光微球的粒径为150-350nm，并且发光微球与感光微球的粒径比为1.42-5.00。
8.如权利要求5或6所述的微球组件，其特征在于所述感光微球的粒径为80-120nm，发光微球的粒径为190-210nm，并且发光微球与感光微球的粒径比为1.90-2.10。
9.一种化学发光免疫分析方法，它包括向被分析试样中加入如权利要求1-4中任一项所述的微球组合物。
10.一种化学发光免疫分析方法，它包括向被分析试样中以任意次序加入如权利要求5-8中任一项所述的微球组件中的感光微球和发光微球。
全文摘要
公开了一种用于化学发光免疫分析的微球组合物或组件，它包括各自包被有抗体的感光微球和发光微球，其特征在于所述感光微球的粒径小于发光微球的粒径。还公开了使用本发明组合物或组件进行免疫分析的方法。
文档编号G01N33/536GK1696695SQ200510025360
公开日2005年11月16日 申请日期2005年4月25日 优先权日2005年4月25日
发明者何元 申请人:上海朋远泰生物技术有限公司