专利名称：一种用于富集循环肿瘤细胞的纳米磁性免疫微球制备的制作方法
技术领域：
本发明属于生物医学领域，具体涉及一种富集循环肿瘤细胞的纳米磁性免疫微球的制备及其使用方法。
背景技术：
根据肿瘤细胞微转移的途径，在血液或淋巴管中循环的肿瘤细胞称为循环肿瘤细胞(circulating tumor cell，CTC)，由若干循环肿瘤细胞聚集形成的细胞团块被称为循环肿瘤微栓(circulating tumor microemboli，CTM)。CTM是肿瘤细胞的“集体迁移”行为，因其能够抵抗细胞凋亡、保持细胞增殖能力而具有更高的转移潜能。由于循环肿瘤细胞在血液或淋巴液中含量非常少以及缺乏有效的特异性标志物，有关CTC的研究进展比较缓慢。 现有的分离、检测技术方法各有利弊，至今尚未有一个统一的实验方案和标准。CTC在外周血中的含量极少，每IOml血液中可能仅含少数几个CTC或CTM，而IOml 血液则含有大约1亿个白细胞和500亿个红细胞。因此，只有首先对临床血样中的CTC进行富集，然后才能进行检测和生物学性质与基因分析。现有的富集CTC的方法通常有三种1)梯度密度离心法即依据细胞沉降系数不同而进行分离。2)过滤法8μπι孔径的聚碳酸酯膜可使较小的淋巴细胞和中性粒细胞通过，而较大的肿瘤细胞则被阻滞在膜上。该方法不仅操作简单，而且比较敏感，可避免烦琐的多步骤分离造成的稀少细胞的破坏和丢失。3)免疫磁性分离法这是目前最为常用的CTC富集方法。针对上皮细胞抗原EpCAM、BerEP4、CK或器官特异性标志物(如mammoglobul in、 PSA、CEA和HER-2)的抗体通常被用来分离CTC，富集效率可达1 X IO4 2X IO5倍。为了进一步降低血细胞含量，提高富集效率，可以将阴性分选与阳性分选相结合。阴性分选采用的标志物通常是白细胞表达的⑶45或巨噬细胞、血小板表达的⑶61。另外，为了提高CTC 富集的特异性，最近的研究倾向于将物理分离方法和免疫磁性分离方法相结合。如先用 Ficoll-Hypaque离心分离，接着进行免疫磁性阳性、阴性分选，最后在荧光染色的基础上用显微操作技术收集高效富集的前列腺肿瘤细胞。免疫磁性分离法效率高，且在整个过中可避免细胞溶解，使目的细胞的计数成为可能。目前检测血液中肿瘤细胞的存在可以成为癌症早期诊断或在肿瘤活检中帮助鉴别肿瘤是否浸润的有力手段。肿瘤细胞微转移的常用检测方法包括RT-PCR技术、流式细胞技术(flow cytometry, FCM)和免疫细胞化学法(ICC)等等。RT-PCR法虽然敏感性较高， 但具有较高的假阳性率。FCM检测方法价格昂贵而且操作起来费时费力，不能提供有关肿瘤细胞形态方面的信息，还需用肿瘤细胞特异抗体进行ICC染色，难以作为常规检测方法应用于临床。ICC法具有较高的特异性，但捡出率很低。目前，免疫纳米磁性微球的诞生为肿瘤细胞生物诊断提供了先进的分离手段，它具有高特异性、高浓缩性、高分离率，且不影响细胞活性等特点，国外有报道可提高分离率IO3-IO4倍(Martin et al. 1998)。
发明内容
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本发明的目的旨在针对循环肿瘤细胞检测中样品中肿瘤细胞浓度极低，不利于检测的问题，提供一种用于循环肿瘤细胞富集的纳米磁性免疫微球及其使用方法。为了实现上述目的，本发明公布了一种新的纳米磁性免疫微球，它以纳米碳包纯铁磁性微球为内核，连接上皮细胞特异性抗体，与循环肿瘤细胞通过抗原-抗体反应结合在一起，对外周血中存在的肿瘤细胞进行快速富集，与免疫细胞化学方法(ICC)相结合，对患者外周血肿瘤细胞进行检测。使检测灵敏性提高到在5X IO7个细胞中可检测到一个肿瘤细胞。便于发现早期患者隐性微转移、监测术后患者肿瘤复发与转移、评估患者预后以及制定治疗方案。如上所述的纳米磁性微球，其特征是具有超顺磁性的碳包纯铁(FeOC)纳米磁性微球；如上所述的纳米磁性微球，其特征是碳包纯铁可以位于磁性微球的内部的任何地方；如上所述的纳米磁性微球，其特征是磁性微球内部可以有一个或者多个碳包纯铁颗粒。如上所述的纳米磁性微球，其特征是磁性微球的基质可以为壳聚糖、聚苯乙烯、氧化硅、壳聚糖、或者任何其他可以用于做磁性微球基质的材料。如上所述的纳米磁性微球，其特征粒径在10nm-50nm之间的磁性颗粒，它可以是任何形状，优选球形；如上所述的磁性免疫微球，其特征是该磁性微球可以通过共价偶联、疏水作用力或者是分子间作用力与抗体偶联在一起。如上所述的纳米磁性免疫微球，其特征是不仅适用于肿瘤细胞的分离，还适用于分离其它细胞或分子。如上所述的特异性抗体，其特征是能与循环肿瘤细胞表面蛋白(抗原)特异性结合的抗体，它可以是单克隆抗体，也可以是多克隆抗体。为了实现上述目的，本发明还公布了一种用纳米磁性免疫微球富集循环肿瘤细胞的方法，其特征是纳米磁性免疫微球捕获肿瘤细胞，在磁场作用力下将与磁性免疫微球结合样品分离，实现对外周血或体液中各种类型肿瘤细胞的富集。再对磁性免疫微球-肿瘤细胞复合物进行洗涤，去除残留的细胞及细其它杂质，最后得到高浓度的肿瘤细胞-磁性微球复合物。如上所述的富集循环肿瘤细胞的方法，其特征是免疫磁性微球可以通过磁性微球表面固定的抗体与肿瘤细胞表面相应抗原反应，形成磁性微球-抗体-抗原复合物，从而实现免疫磁性微球捕获肿瘤细胞。还可以通过如下方式进行，生物素化的抗体与循环肿瘤细胞表面相应抗原反应，形成生物素-抗体-肿瘤细胞复合物，再加入表面固定有亲和素的磁性微球，磁性微球表面的亲和素与生物素反应，形成磁性微球-亲和素-生物素-抗体-循环肿瘤细胞复合物，从而实现免疫磁性微球对循环肿瘤细胞的捕获。本发明所公开的纳米磁性免疫微球具有磁响应性强，粒径小，易于操作等特点。
具体实施例方式尽管本发明的内容是结合本实例进行说明，但是不能认为是对本发明专利的限制，本发明的范围由所附权利要求书限定。另外，本领域的技术人员在所附权利要求书限定的范围内对本发明进行各种改动或修饰，这些改动或修饰形式同样属本发明的保护范围。实施例1纳米磁性微球的制备将IOOmg海藻酸钠液溶于細1纯水中，加入anl 5% !^OC磁流体溶液，42°C使之充分混勻溶解后，超声15min，用10% Na2CO3调节混合液的pH为10左右，升温至60°C。超声和高速搅拌的条件下，将混合液逐滴加入到温度为60°C的90ml AOT/正庚烷油相中，形成透明的灰黑色反相微乳体系。在超声和搅拌的条件下将30%的4.5ml CaCl2溶液加入到微乳体系中，进行磁分离后，分别用丙酮、乙醇和蒸馏水洗涤，然后离心分选，真空冷冻干燥后保存。实施例2磁性微球-抗体偶联物的制备取Img制备好的磁性微球，用磷酸盐缓冲液洗涤3次，用0. 01mol/L PBS PH7. 0的定容到細1，加入水溶性EDC 5mg和7. 5mg suflo-NHS,充分混勻，室温反应15min，然后加入50mg的6-氨基己酸，室温旋转搅拌3h后，加入500 μ 1 (40 μ g/ml) EpCAM单克隆抗体(BD Wiarmingen，美国)，轻轻搅拌6h，以0. 2M甘氨酸溶液(含0. 2% BSA) Iml封闭，磁分离洗涤，加入储存液4°C保存。透射电镜观察微球呈球形，有很好的分散性，粒径分布于45-89nm之间，平均粒径为56nm。利用Bradford检测法测定纳米免疫磁性微球中蛋白质含量，每毫克免疫磁性微球可连接108. 6μ g抗体。利用免疫荧光染色，流式细胞仪检测显示97. 9%的纳米免疫磁性微球表面连接有EpCAM抗体。实施例3乳腺癌肿瘤细胞富集与检测每份样品中加入纳米免疫磁性微球适量，混勻后室温旋转搅拌30min，磁分离器分离，用PBS或生理盐水洗涤磁性微球若干次，去除杂质，最后将磁性微球重悬于适当的液体中，得到浓缩的、纯的循环肿瘤细胞。实施例3链霉亲和素免疫磁性微球的制备取Img制备好的磁性微球，用磷酸盐缓冲液洗涤3次，用0. 01mol/L PBS PH7. 0的定容到細1，加入水溶性EDC 5mg和7. 5mg suflo-NHS，充分混勻，室温反应15min，然后加入50mg的6-氨基己酸，室温旋转搅拌池后，加入500 μ 1 (40 μ g/ml)链霉亲和素，轻轻搅拌他，以0. 2M甘氨酸溶液(含0. 2% BSA) Iml封闭，磁分离，洗涤，加入储存液4°C保存。实施例4肿瘤细胞的富集往样品中加入生物素化的抗肿瘤细胞表面抗原的抗体，混勻，静置30min，加入适量链霉亲和素磁性微球，涡旋混勻，室温孵育15min，中间多次混勻，磁分离器分离，用PBS 或生理盐水洗涤磁性微球若干次，去除杂质，最后将磁性微球重悬于适当的液体中，得到浓缩的、纯的循环肿瘤细胞。
权利要求
1.本发明公布了一种新的纳米磁性免疫微球，它以纳米磁性微球为内核，连接上皮细胞特异性抗体，与循环肿瘤细胞通过抗原-抗体反应结合在一起，对外周血中存在的肿瘤细胞进行快速富集。
2.如权利1所述的纳米磁性微球，其特征是具有超顺磁性的碳包纯铁(FeOC)纳米磁性微球。
3.如权利1所述的纳米磁性微球，其特征是活性碳包裹纳米纯铁。
4.如权利1所述的纳米免疫磁性微球，其特征是免疫微球内部可以有一个或者多个纳米碳包纯铁微球。
5.如权利1所述的纳米磁性微球，其特征是磁性微球的基质可以为壳聚糖、聚苯乙烯、 氧化硅、壳聚糖、或者任何其他可以用于做磁性微球基质的材料。
6.如权利1所述的纳米磁性微球，其特征粒径在10nm-50nm之间的纳米磁性颗粒，它可以是任何形状，优选球形。
7.如权利1所述的纳米磁性微球，其特征是该磁性微球可以通过共价偶联、疏水作用力或者是分子间作用力与抗体偶联在一起。
8.如权利1所述的纳米磁性免疫微球，其特征是不仅适用于循环肿瘤细胞的分离，还适用于其它细胞或分子的分离。
9.如权利1所述的特异性抗体，其特征是能与循环肿瘤细胞表面蛋白(抗原)特异性结合的抗体，它可以是单克隆抗体，也可以是多克隆抗体。
10.本发明还公布了一种用纳米磁性免疫微球富集循环肿瘤细胞的方法，其特征是免疫磁性微球捕获肿瘤细胞，在磁场作用力下将与磁性免疫微球结合样品分离，实现对外周血或体液中各种类型肿瘤细胞的富集。再对磁性免疫微球-肿瘤细胞复合物进行洗涤，去除残留的细胞及细其它杂质，最后得到高浓度的肿瘤细胞-磁性微球复合物。
11.如权利9所述的富集循环肿瘤细胞的方法，其特征是磁性免疫微球可以通过磁性免疫微球表面固定的抗体与肿瘤细胞表面相应抗原反应，形成磁性微球-抗体-抗原复合物，从而实现磁性免疫微球捕获肿瘤细胞。还可以通过如下方式进行，生物素化的抗体与循环肿瘤细胞表面相应抗原反应，形成生物素-抗体-肿瘤细胞复合物，再加入表面固定有亲和素的磁性微球，磁性微球表面的亲和素与生物素反应，形成磁性微球-亲和素-生物素-抗体-循环肿瘤细胞复合物，从而实现磁性免疫微球对循环肿瘤细胞的捕获。
全文摘要
本发明属生物医学技术领域，公开了一种富集循环肿瘤细胞的纳米磁性免疫微球及其使用方法。以纳米碳包纯铁磁性微球(Fe@C)为内核，连接肿瘤细胞抗体，制备可富集循环肿瘤细胞的纳米磁性免疫微球。用此磁性微球富集循环肿瘤细胞，可以有效以提高循环肿瘤细胞检测的灵敏性。该免疫磁性微球具有磁反应性强、易于操作等特点，可以应用于循环肿瘤细胞的快速富集。
文档编号B01J20/28GK102527353SQ20111043361
公开日2012年7月4日 申请日期2011年12月21日 优先权日2011年12月21日
发明者周汉新, 李富荣, 齐晖 申请人:深圳市老年医学研究所