专利名称：一种检测冠心病易感性的试剂盒的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种疾病易感性检测用的试剂盒，尤其是一种检测冠心病易感性的试剂盒，通过同时检测三磷酸腺苷结合盒转运体A1基因(ATP-binding cassette，sub-family A，member 1，ABCA1)的单核苷酸多态性(SNP)位点与对氧磷酯酶1基因(paraoxonase 1，PON1)的单核苷酸多态性位点来预测个体对冠心病的易感性。
背景技术：
冠状动脉粥样硬化性心脏病(coronary atherosclerotic heart disease)指冠状动脉粥样硬化使血管腔狭窄或阻塞，或(和)因冠状动脉功能性改变(痉挛)导致心肌缺血缺氧或坏死而引起的心脏病，统称冠状动脉性心脏病(coronary heart disease)，简称冠心病(CHD)，亦称缺血性心脏病(ischemic heartdisease)。
冠状动脉粥样硬化性心脏病是动脉粥样硬化导致器官病变的最常见类型，也是严重危害人民健康的常见病。本病多发生在40岁以后，男性多于女性。发达国家常见，美国约有700万人患本病，每年约50余万人死于本病，占人口死亡数的1/3～1/2，占心脏病死亡数的50％～75％。在我国，近年来呈增长趋势。20世纪70年代北京、上海、广州本病的人口死亡率分别为21.7/10万人口、15.7/10万人口和4.1/10万人口；90年代我国城市男性本病死亡率为49.2/10万人口，女性为32.2/10万人口。
冠心病的发病随年龄的增长而增高，程度也随年龄的增长而加重。有资料表明，自40岁开始，每增加10岁，冠心病的患病率增1倍。男性50岁，女性60岁以后，冠状动脉硬化发展比较迅速，同样心肌梗塞的危险也随着年龄的增长而增长。年轻的男性患者比年轻的女性患者多，但绝经后的女性以及年过六十的妇女，其危险就几乎与男性相等了，甚至大于男性。老年人心脏病发作的可能性较高。
其发病机理是复杂的，综合性的较长过程。可归纳为四个步骤1.心血管内皮细胞损害，平滑肌细胞增生。2.血小板粘附于受损的血管壁后，释放出血清素，血栓素A2、血小板IV、VIII因子等。3.低密度脂蛋白由受损的内皮细胞渗入内膜下的平滑肌细胞，并被吞噬，进入细胞后被细胞内溶酶体的水解酶分解而释放出游离胆固醇，后者与亚油酸结合，成为重要发病环节。4.在上述病理变化基础上，最终发生冠状动脉纤维化、钙化。
冠心病是一种有遗传因素和环境因素相互作用而发病的多基因病，寻找冠心病相关基因进而阐明冠心病发病的遗传机制已经成为目前研究的热点。
三磷酸腺苷结合盒转运体A1基因(ABCA1)蛋白是一种整合膜蛋白，它以ATP为能源，促进细胞内游离胆固醇和磷脂的流出，在胆固醇逆转运(RCT)和HDL生成的起始步骤中起重要作用，被称作RCT守门人。核受体PPARs、LXRs和FXR对abcal蛋白的表达具有调控作用。人体50种组织中存在有ABCA1mRNA，在胰、肝、肺、肾上腺和胎儿组织中ABCA1表达水平最高，ABCA1功能障碍将导致巨噬细胞内大量的胆固醇沉积而成为泡沫细胞，继而浸润血管壁，促进冠心病的发生发展。
PON1为paraoxonase 1(对氧磷脂酶1)编码基因，血清中的对氧磷脂酶1可以作为抗氧化剂，对低密度脂蛋白LPL等生物大分子进行水解并降低氧化水平。从而降低血管内的氧化势，起到对血管的保护作用。基因发生缺陷后，导致对低密度脂蛋白LPL等生物大分子进行水解并降低氧化水平下降，造成对血管壁的损伤，带来心脑血管的疾病。
SNP(single nucleotide polymorphism)，即单核苷酸多态性标记，是一类基于单碱基变异引起的DNA多态性，被遗传学界称为第三代遗传标记。主要是指由基因组核苷酸水平上的变异引起的DNA序列多态性，包括单碱基转换、颠换，以及单碱基的插入/缺失等。它是基因组中最为广泛存在的一类多态性标记，占大约90％。这些基因组序列变异可以导致个体间表型的差异以及不同个体对疾病，特别是复杂疾病的易感性、和对环境因素、药物反应的差异。研究表明，ABCA1基因上的rs2230806号SNP位点(SEQ ID NO1所示序列中136位)的多态性(G/A)会引起基因编码蛋白的的第219个氨基酸发生改变(Arg/Lys)，而其中Lys氨基酸的表达可提高血浆高密度脂蛋白含量，对心脑血管疾病的发生有一定保护作用；PON1基因上的rs662号SNP位点(SEQ ID NO2所示序列中146位)的多态性(A/G)会引起基因编码蛋白的第192个氨基酸由Gln变为Arg，而冠心病患者带有Arg的频率明显高于正常人群，PON1基因的Gln192Arg多态性与冠心病严重性、冠状动脉粥样硬化进展程度、血脂水平和降血脂药物治疗效果相关。国内外的大量的关联分析表明，ABCA1的Lys多态(SNP位点基因型为A)能够降低冠心病的发生；PON1基因的Gln多态(SNP位点基因型为A)能够降低冠心病的易感性、延缓冠状动脉粥样硬化进展程度。这两个SNPs位点的多态性可用于评估个体对冠心病的易感性，目前已通过中国科学院国家生物基因检测技术应用评估认证中心的认证。
发明内容
基于ABCA1基因上的rs2230806号SNP位点与PON1基因上的rs662号SNP位点可用来评估个体对冠心病的易感性的基础上，本发明提供一种检测冠心病易感性的试剂盒。
该试剂盒包括检测ABCA1基因SEQ ID NO1中第136位SNP的特异性引物对及特异性荧光探针、检测PON1基因SEQ ID NO2中第146位SNP的特异性引物对及特异性荧光探针、Taq酶、dNTP混合液、MgCl2溶液、荧光定量PCR反应缓冲液、去离子水。
本试剂盒中所述的特异性引物对是指针对SEQ ID NO1中第136位SNP与SEQ ID NO2中第146位SNP位点而设计，能特异性扩增出SEQ ID NO1中包含第136位SNP位点的DNA片段与SEQ ID NO2中包含第146位SNP位点的DNA片段的引物对。设计这类引物对是本领域技术人员能够轻易完成的。优选地，试剂盒中包含具有SEQ ID NO3和4所示序列的引物对以及具有SEQ ID NO5和6所示序列的引物对。特异性引物对可用常规的合成技术进行合成。本领域的技术人员能够理解，本发明的引物不限于这两对引物。
本试剂盒中所述的特异性荧光探针是指针对SEQ ID NO1中第136位SNP与SEQ ID NO2中第146位SNP位点而设计，能通过荧光定量PCR技术特异性检测出这两个SNPs位点冠心病易感基因型的探针。设计这类探针是本领域技术人员能够轻易完成的。优选地，试剂盒中包含具有SEQ ID NO7和8所示序列的Taqman探针。特异性荧光探针可用常规的合成技术进行合成。本领域的技术人员能够理解，本发明的特异性荧光探针不限于这两条探针，所有可用于荧光定量PCR检测SEQ ID NO1中第136位SNP与SEQID NO2中第146位SNP位点的探针均在本发明范围内。
本发明试剂盒的组分和含量包括1μl 10X荧光定量PCR反应缓冲液，0.1μl 25mM dNTP混合液，0.6μl 25mM MgCl2溶液，0.025μl(5units/μl)Taq DNA聚合酶，20μM特异性引物对(四条)各0.225μl，10μM特异性荧光探针(两条)各0.25μl，去离子水4.875μl。
本试剂盒供一人份检测应用，试剂盒的保存温度为-20℃。
具体实施例方式
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照厂商所建议的条件。
实施例1.检测试剂盒的使用步骤1DNA模板的抽取用硅胶吸附法抽提口腔上皮细胞的基因组DNA。
步骤2荧光定量PCR反应使用可检测冠心病易感性的荧光定量PCR检测试剂盒，其中，含有下列引物对和荧光探针有义引物15’-TGTGCAATGGATCAAAATCAG-3’(SEQ ID NO3)Tm值为54℃反义引物15’-GTGAGCAAGTCTACTCAC-3’(SEQ ID NO4)Tm值为54℃有义引物25’-GGACCTGAGCACTTTTATG-3’(SEQ ID NO5)Tm值为56℃反义引物25’-TTGGACTATAGTAGACAACA-3’(SEQ ID NO6)Tm值为54℃荧光探针15’-ACCAAGGGAGAAACTGGCTGC-3’(SEQ ID NO7)Tm值为66℃荧光探针25’-CGATCCTGGGAGATGTATTTGG-3’(SEQ ID NO8)Tm值为64℃有义引物1，反义引物1和荧光探针1特异地针对检测ABCA1基因上的rs2230806号SNP位点(SEQ IDNO1所示序列中136位)多态性；有义引物2，反义引物2和荧光探针2特异地针对检测PON1基因上的rs662号SNP位点(SEQ ID NO2所示序列中146位)多态性。
荧光定量PCR反应体系为总体积10μl，包含浓度为20ng/μl的DNA模板2μl、1μl 10X荧光定量PCR反应缓冲液、0.1μl 25mM dNTP混合液、0.6μl 25mM MgCl2溶液、0.025μl(5units/μl)Taq DNA聚合酶、20μM的有义引物1和2各0.225μl、20μM的反义引物1和2各0.225μl、10μM的荧光探针1和2各0.25μl，去离子水4.875μl。
在ABI9700型PCR扩增仪上进行反应，反应条件为50℃、2分钟，95℃、10分钟，进行60个循环的95℃、30秒，60℃、1分钟。反应结束后在ABI7900型荧光定量PCR仪上读取样品荧光量。
步骤3SNP基因型分析将荧光定量PCR仪上显示的最终样品荧光量和正常对照相对比，荧光探针1最终的荧光信号明显高于正常对照，说明被检测DNA的ABCA1基因上rs2230806号SNP位点基因型携带有G型，为冠心病易感型；荧光探针2最终的荧光信号与正常对照相差不多，说明被检测DNA的PON1基因上的rs662号SNP位点基因型携带为A型，非冠心病易感型。
实施例2.指导人们主动预防冠心病的服务目前在上海主健生物工程有限公司已经开展了这项服务。
步骤1DNA提取对被检测者进行服务前咨询，由被检测者签署知情同意书，填写生活饮食习惯问卷调查表。依照取样盒中的指示使用口腔采样拭进行口腔上皮细胞取样，采用硅胶吸附法进行口腔上皮细胞的DNA抽提。
步骤2基因分型检测使用本发明提供的试剂盒，对被检测者DNA的ABCA1基因上的rs2230806号SNP位点与PON1基因上的rs662号SNP位点同时进行荧光定量PCR检测，确定这两个SNPs位点的基因型。
步骤3指导人们主动预防冠心病通过对被检测者SNPs基因型的分析，出具基因分型检测报告和被检测者个体化健康指导报告。基因检测报告详细说明了被检测者冠心病易感程度的高低以及患病的概率大小。个体化健康指导报告以被检测者的基因分型检测结果为基础，结合其生活饮食习惯问卷调查结果，评估被检测者冠心病遗传易感的相对风险。同时制定出针对于被检测者的个性化健康行动方案，方案包括在饮食习惯、生活方式上的改进建议等，并为被检测者普及预防冠心病的健康知识。
序列表<110>上海主健生物工程有限公司<120>一种检测冠心病易感性的试剂盒<160>8<210>1<211>300<212>DNA<213>人属，人种(Homo sapiens，human)<400>1ctctttgcat gaaatgcttc caggtatttt tgcaaggcta ccagttacat ttgacaagtc 60tgtgcaatgg atcaaaatca gaagagatga ttcaacttgg tgaccaagaa gtttctgagc120tttgtggcct accaagggag aaactggctg cagcagagcg agtacttcgt tccaacatgg180acatcctgaa gccaatcctg gtgagtagac ttgctcactg gagaaacttc aagcactaat240gctttcggaa tgtgaggctt ttccttggac agcatgactt tgttttgtag aaaagtacgg300<210>2<211>300<212>DNA<213>人属，人种(Homo sapiens，human)<400>2ccagttaata atcctgtaat gttcaatacc ttcaccttat atattatgtg tgtatgtttt 60aattgcagtt tgaatgatat tgttgctgtg ggacctgagc acttttatgg cacaaatgat120cactattttc ttgaccccta cttacaatcc tgggagatgt atttgggttt agcgtggtcg180tatgttgtct actatagtcc aagtgaagtt cgagtggtgg cagaaggatt tgattttgct240aatggaatca acatttcacc cgatggcaag tatgtgaact ctctgaaatg tagtggattt300<210>3<211>21<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物<400>3tgtgcaatgg atcaaaatca g 21
<210>4<211>18<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物<400>4gtgagcaagt ctactcac 18<210>5<211>19<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物<400>5ggacctgagc acttttatg19<210>6<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物<400>6ttggactata gtagacaaca 20<210>7<211>21<212>DNA<213>人工序列
<220>
<223>探针<400>7accaagggag gaactggctg c 21<210>8<211>22<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>探针<400>8cgatcctggg agatgtattt gg2权利要求
1.一种检测冠心病易感性的试剂盒，其特征在于包括同时检测ABCA1基因SEQ ID NO1中第136位SNP位点与PON1基因SEQ ID NO2中第146位SNP位点的特异性引物对及特异性荧光探针、Taq酶、dNTP混合液、MgCl2溶液、荧光定量PCR反应缓冲液、去离子水。
2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于所述的特异性引物对是指针对SEQ ID NO1中第136位SNP与SEQ ID NO2中第146位SNP位点而设计，能特异性扩增出包含SEQ ID NO1中第136位SNP位点的DNA片段与包含SEQ ID NO2中第146位SNP位点的DNA片段的引物对。
3.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于所述的特异性荧光探针是指针对SEQ ID NO1中第136位SNP与SEQ ID NO2中第146位SNP位点而设计，能通过荧光定量PCR技术特异性检测出这两个SNPs位点冠心病易感基因型的探针。
4.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于所含的特异性引物对选自具有SEQ ID NO3和4所示序列的引物对以及具有SEQ ID NO5和6所示序列的引物对。
5.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于所含的特异性荧光探针选自具有SEQ ID NO7和8所示序列的Taqman探针。
6.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于试剂盒的组分和含量包括1μl 10X荧光定量PCR反应缓冲液，0.1μl 25mM dNTP混合液，0.6μl 25mM MgCl2溶液，0.025μl(5units/μl)Taq DNA聚合酶，20μM特异性引物对(四条)各0.225μl，10μM特异性荧光探针(两条)各0.25μl，去离子水4.875μl。本试剂盒供一人份检测应用，试剂盒的保存温度为-20℃。
全文摘要
本发明公开了一种检测冠心病易感性的试剂盒。该试剂盒包括同时检测ABCA1基因SEQ ID NO1中第136位SNP位点和PON1基因SEQ ID NO2中第146位SNP位点的特异性引物对及特异性荧光探针、用于荧光定量PCR检测的常规组件等。本发明的试剂盒通过同时检测分析个体的ABCA1基因与PON1基因上SNPs位点基因携带型来预测个体对冠心病的易感性。
文档编号C12Q1/68GK101093195SQ20061002806
公开日2007年12月26日 申请日期2006年6月23日 优先权日2006年6月23日
发明者冯哲民, 邹祖烨, 楼屹 申请人:上海主健生物工程有限公司