专利名称：：乳腺癌标志基因群及其应用方法
技术领域：
：本发明涉及功能基因组学的疾病相关基因的表达谱研究和标志基因群筛选。具体讲是在人功能基因组范围内筛选乳腺癌的标志基因群，并用基因芯片，分子杂交和RT-PCR等方法检测这些基因的mRNA表达水平，根据mRNA表达水平鉴别乳腺肿瘤的良、恶性。
背景技术：
：乳腺癌是女性最常见的恶性肿瘤，是妇女健康的重大威胁，早期诊断是提高乳腺癌治愈率和生存率的关键。肿瘤是多基因异常的疾病，而且肿瘤组织细胞具有异质性生物学特征，在乳腺癌的发生过程中涉及包括癌基因的激活和抑癌基因的失活、细胞代谢和细胞周期讽控的紊乱，细胞凋亡的抑制等复杂的生物学过程。目前已发现百余种肿瘤促进基因如K-ras，c-myc，c-erbB-2等和几十种肿瘤抑制基因如P53、Rb、P16等与癌发生相关，但单个基因检测或部分已知基因的联合检测尚不能对乳腺癌组织标本与正常组织标本进行诊断和鉴别诊断。基因芯片技术可以高通量平行检测数千到数万个基因的表达水平，从而可以从基因组范围内对组织细胞的基因表达傳进行研究，筛选得到恶性肿瘤区别于正常组织的标志基因群，用于肿瘤的诊断和鉴别诊断。
发明内容本发明采用高通量的人表达谱基因芯片通过比较多病例的乳腺原发癌及其配对的癌旁正常乳腺组织基因表达差异，筛选得到一组乳腺癌的标志基因群，用基因芯片、分子杂交、RT-PCR等方法检测标志基因群中的一个、多个或全部基因的mRNA水平，进而对乳腺肺瘤作出鉴别诊断。主要发明如下1.一组乳腺癌标志基因群，其特征为该组基因群中的一个、多个或全部基因的组合可以用于鉴别乳腺良、恶性肺瘤，基因群中120个基因的名称、序列号及主要功能描述见表1。2.权利要求1所述基因的多个或全部基因的组合制备成基因芯片用于良、恶性乳腺肿瘤的鉴定，其特征在于将这些基因的cDNA或寡核苷酸探针固定成微阵列，其中每个基因探针可以特异性地与来源于组织样本中相应基因的cDNA或其扩增产物杂交，按分类，微阵列可以是平板、微珠、细针或膜相阵列，可以是固相、液相；可以是寡核苷酸、多核苷酸或者cDNA阵列。3.权利要求1所述基因的单个或多个基因作为核酸分子杂交的探针、或RT-PCR扩增的目的基因检测组织标本中的mRNA表达量，根据mRNA表达水平鉴定良、恶性肿瘤，核酸分子杂交可以是提取的RNA及其反转录的cDNA在固相支持物上的杂交、也可以是组织切片的原位杂交，RT-PCR可以是定量方法、半定量方法、定性方法。4.利用权利要求2所述的基因芯片鉴别乳腺癌与正常组织或良性肿瘤的方法(1)乳腺肿瘤组织或正常组织样本的cDNA或其扩增产物荧光标记后与包含乳腺癌标志基因群的多个或全部基因的基因芯片杂交，基于各基因的荧光强度值，利用非监督聚类分析方法即得到能将乳腺癌组织和正常组织准确分类的基因表达谱；(2)使用基因表达图语对乳腺肿瘤进行鉴别诊断，包括以下步骤包括以下步骤a)从乳腺肿瘤患者的手术切除样本或针吸活检样本中提取总RNA并反转录为cDNA;b)对样本的cDNA或其扩增产物进行荧光标记；c)用标记后的样本与权利要求2中所述的基因芯片杂交d)用非监督聚类分析样本基因表达语，与权利要求4中所述的基因图谦比较对患者组织标本的良、恶性作出鉴定。图1是基于差异基因群对9例乳腺原发癌和配对正常乳腺组织的聚类；图2是基于差异基因群对验证样本与训练样本的聚类结果。具体实施例方式1技术措施1.1病例选择和标本处理'24例乳腺癌患者为天津医科大学附属肿瘤医院收治的行乳腺癌根治术的病例，病理类型均为浸润性导管癌(WH0分类)，肿瘤大小均为2-5厘米(T2期)；组织学分级I级1例，1I级19例，11I级4例；淋巴结转移阳性15例，阴性10例；ER阳性17例，阴性6例；PR阳性11例，阴性12例。癌組织样本经组织病理学诊断证实，癌旁正常乳腺组织取距离肿瘤边缘5cm以上的正常腺体组织，标本取材后经液氮速冻于-8(TC保存。另外，取32例乳腺肿瘤患者的正常乳腺组织，提取总RNA后等量混合作为基因芯片杂交的对照样本。1.2基因芯片杂交1.2.1总RM提取:釆用Trizol(Invitrogen公司,美国)一步法提取组织细胞的总飄，RNeasyminispincolumnKit(Qiagen公司，美国)纯化RNA，紫外分光光度法测定RNA的纯度，琼脂糖凝胶电泳检测RNA的完整性。1.2.2双链cDNA合成取10|ig总RNA，以T7-01igo(dT)15，(5'-AAACGACGGCCAGTGAATTGTAATACGACTCACTATAGGCGCTTTTTTTTTTTTTTTTV-3，V为G、C和A,上海博亚生物技术有P艮^^司)为引物，用cDNASynthesisKit(TaKaRa，中国)合成双链cDNA,QIAquickPCRPurificationKit(Qiagen7^司，美国)纯4匕双链cDNA。1.2.3体外转录合成c飄:用T7RiboMAXExpressLargeScaleRNAProductionSystem(Promega7>司，美国)将双链cDNA进行体外转录合成cRNA，并使用RNeasyMiniKit(Qiagen7:司，美国)纯化。.1.2.4cRNA的反转录取2jigcRNA，用随才几引物和SuperscriptII反转录酶(Invitrogen乂>司，美国)进4亍反转录，QIAquickPCRPurificationKit纯化反转录产物。1.2.5cDNA的荧光标记取1jigcRNA反转录产物，RandomPrimerDMLabelingKit(TaKaRa，中国)标记荧光，Cy3标记正常对照样本，Cy5标记实验组样本(Cy5-dCTP、Cy3-dCTP，AmershamPharmaciaBiotech,美国)。QIAquickPCRPurificationKit纯化标记产物。1.2.6基因芯片杂交人表达潜基因芯片为北京博奥生物芯片有限公司制备的人01igo芯片。芯片上所有基因取自Qiagen公司的人类基因70merOligo库，点样在一张75x25mm、经过化学修饰的载玻片上，含约23232个基因点，21329个人功能基因，还包括人的12个看家基因作为阳性对照，12个人工合成的与人基因没有同源性的70merOligoDM作为'阴性对照，以及拟南芥的3个基因作为外标。整个点阵分成48个亚阵，每个亚阵有22行，22列。点间距为185jum,点的直径约为140jam。基因芯片经65。C水合，250mJ紫外交联，0.5%SDS和无水乙醇清洗，离心甩干后用于杂交。将Cy3和Cy5荧光标记的产物混合溶于30yL杂交液(3xSSC，0.2%SDS，5xDenhart，s，25%曱酰胺)中,42口杂交过夜。将杂交后的基因芯片依次在含O.2%SDS的2xSSC、0.2xSSC和纯水中洗片，离心甩干后进行焚光强度扫描。1.2.7芯片扫描和数据分析荧光标记的基因芯片用ScanArrayExpress双通道激光扫描仪(PackardBioscience公司，美国)扫描。采用GenePixPro4.0图像分析软件(Axon公司，美国)对芯片图像进行分析，荧光强度采用Lowess方法进行标准化。Cy3或Cy5之一的荧光强度值大于100的为有效表达基因。1.3差异基因筛选筛选9例分析样本原发癌与其配对的正常乳腺组织中至少6对样本中有3.0倍以上相同差异表达趋势的基因为差异表达基因。用GoMiner软件检索差异表达基因的功能[2]。1.4系统聚类分4斤(Hierachicalclustering):采用cluster软件同时对9例乳腺癌原发癌与配对的癌旁正常乳腺组织的18个训练样本基于差异基因群进行平均聚类分析。应用另外15例乳腺原发癌作为验证样本与18个分析样本共同聚类以验证差异基因群对癌组织样本分类的可靠性。'2结果判定2.1差异表达基因9例乳腺原发癌与其配对的癌旁正常乳腺组织基因表达谱比较6例以上大于3.O倍有共同差异表达趋势的基因120个，其中35个上调，85个下调；34个基因与细胞生长代谢相关，22个与信号传导及转录调节相关，12个与细胞粘附运动相关，5个与细胞分化相关，5个与才几体免疫能力相关，还有8个其它功能的基因和34个未知功能的基因。见表l。2.2差异表达基因对样本聚类分析结果2.2.1基于120个差异表达基因群可以准确地将9例乳腺癌的18个分析样本中的17个样本准确分为正常和乳腺癌两组，只有1个正常样本被分在了癌组。结果见图1。.2.2.3基于120个差异表达基因群将15例乳腺原发癌的验证样本与18个分析样本同时进行系统聚类分析，结果15例验证病例被准确分类在乳腺癌组，如图2。验证结果证实基于待检组织该基因群的基因表达语可以准确对样本作出判断。技术优势肿瘤细胞的发生和发展涉及了复杂的生物学过程，功能基因表达的异常改变是细胞表型恶性转化的基础，本发明是通过比较乳腺癌患者癌与癌旁正常乳腺组织基因表达差异，筛选在多病例中有共同表达趋势的差异基因，它们涉及了细胞生长代谢、信号传导及转录调节、细胞粘附运动、细胞分化和机体免疫等肿瘤细胞发生发展的重要生物学过程。构成了一组乳腺癌的标志基因群，能将乳腺癌与正常组织准确分类在不同两组。该项发明的基因群是一组在多病例的乳腺癌组织与癌旁正常组织有'共同差异表达趋势的癌相关基因，该组基因群能体现人类乳腺癌组织基因异常的生物学共性，基于其中单个、多个或全部基因建立的mRNA表达水平的检测方法可以用于乳腺癌的分子诊断和良、恶性肿瘤的鉴别诊断。<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>ABCB1SCGB2A2ZAP70CDCA1FLX3NTRK2DCXCXCL10COUA2COL11A1FN1COL5A1COU0A1SRPXMYBPC1ATP1A2CX3CL1CXCX2M^P3C110RF8LILRB4SAA4UBDAOX1CLDN8DNER羅EPIK3C2GCD3DCXCL9ANGPTL1ID4TCN1BAIAP1MEGF10NM—000927画—002411L05148NM_031423M60502AJ420458NM—000555NM—001565画—000089画—001854'画一002026丽—000093画—000493NM—006307画—002465NM—000702画—002996NM—002089画—002422画—001584画—006847NM—006512NM—006398画—001159AK022269AL137311雨—007289NM一004570NM—000732画—002416画—004673BCO14941NM—001062AK023358画032446ATP-bindingcassette,sub-familyB(MDR/TAP)，member1Mammaglobin1Zeta-chain(TCR)associatedproteinkinase(70kD)HypotheticalproteinNUF2RFilaggrinHomosapiensmRNAfoillengthinsertcDNAcloneEUROIMAGE1630957Doublecortex:lissencephaly,X陽linked(doublecortin)SmallinduciblecytokinesubfamilyB(Cys陽X-Cys)，member10Collagen,typeI,alpha2Collagen,typeXI,alpha1Fibronectin1Collagen,typeV，alpha1Collagen,typeX,alphal(Schmidmetaphysealchondrodysplasia)Sushi-repeat-containingprotein,XchromosomeMyosinbindingproteinC，slowtypeATPase,Na+/K+transporting,alpha2(+)polypeptideSmallinduciblecytokinesubfamilyD(Cys-X3-Cys),member1(fractalkine，neurotactin)GR02oncogeneMatrixmetalloproteinase3(stromelysin1，progelatinase)Chromosome11openreadingframe8Leukocyteimmunoglobulin-likereceptor,subfamilyB(withTMandITIMdomains),member4SerumamyloidA4，constitutiveDiubiquitinAldehydeoxidase1Claudin8HomosapiensmRNA;cDNADKFZp761G02121(fromcloneDKFZp761G02121);partialcdsMembranemetallo-endopeptidase(neutralendopeptidase，enkephalinase,CALLA,CD10)Phosphoinositide-3-kinase，class2,gammapolypeptideCD3Dantigen,deltapolypeptide(TiT3complex)MonokineinducedbygammainterferonAngiopoietin-like1InhibitorofDNAbinding4,dominantnegativehelix-loop-helixproteinTranscobalaminI(vitaminB12bindingprotein,Rbinderfamily)HomosapienscDNAFLJ13296fis,cloneOVARC1001261MEGF10proteinPIGRAK026320ARHEBC012513LAIR2NM—002288OGN画—033014LEPRU50748ADAMDEClNM一014479XLKD1NM—006691CCL28画—019846HCXS1NM—005335LDB2画—0012卯KLF5NM—001730KCNJ16NM—018658SYNP02AK021484KRT17NM—000422KRT5NM—000424MYH11NM一022844FABP4NM—001442NM—000063MATN2NM一002380FLJ30296AK054858TU3A画—007177CTHRC1BC014245DKFZP586HAK0278412123FLJ32771AK057333DKFZP586C0AL137734721MGC21981BC015417LOC338769BCO17984C20ORF82BCO17997BPAG1NM—001723KRT15画—002275B7-H4画—024626FLJ13710画—024817ECRG4NM一032411ODZ2AB032953HN1NM016185HomosapienscDNA:FLJ22667fis，cloneHSI08385Rashomologgenefamily,memberELeukocyte-associatedIg-likereceptor2Osteoglycin(osteoinductivefactor,mimecan)LeptinreceptorADAM-like，decysin1Extracellularlinkdomain-containing1CCchemokineCCL28Hematopoieticcell-specificLynsubstrate1LIMdomainbinding2Kruppel-likefactor5(intestinal)Potassiuminwardly-rectifyingchannel,subfamilyJ，member16HomosapienscDNAFLJl1422fis，cloneHEMBA1001008Keratin17Keratin5(epidermolysisbullosasimplex,Dowling-Meara/Kobner/Weber-Cockaynetypes)Myosin,heawpolypeptide11，smoothmuscleFattyacidbindingprotein4，adipocyteComplementcomponent2Matrilin2HomosapienscDNAFLJ30296fis，cloneBRACE2003110,weaklysimilartoPATCHEDPROTEINHOMOLOG1TU3AproteinHomosapiens,SimilartoRIKENcDNA1110014B07gene,doneMGC:20766IMAGE:4586039,mRNA，completecDKFZP586H2123proteinHomosapienscDNAFLJ32771fis,cloneTESTI2001950HomosapiensmRNA;cDNADKFZp586C0721(fromcloneDKFZp586C0721);partialcdsHomosapiens,cloneMGC:21981IMAGE:4396073，mRNA，completecdsHomosapiens,cloneIMAGE:4245930，mRNAHomosapiens,cloneIMAGE:4252124,mRNA,partialcdsBullouspemphigoidantigen1(230/240kD)Keratin15HypotheticalproteinFLJ22418HypotheticalproteinFLJ13710Esophagealcancerrelatedgene4proteinOddOz/ten-mhomolog2(Drosophila，mouse)Hematologicalandneurologicalexpressed1PROL1NM—021225Proline-rich1BKLHD2AB037730KIAA1309proteinZNF204AF033199Zincfmgerprotein204FL'J21069AK023505HomosapienscDNAFLJ13443fis，clonePLACE1002853AK025953HomosapienscDNA:FLJ22300fis，cloneHRC04759AK027294HomosapienscDNAFLJ14388fis,cloneHEMBA1002716AK057678HomosapienscDNAFLJ33116fis,cloneTRACH2001339LOC147463AK057782HomosapienscDNAFLJ25053fis，cloneCBL04266BCO15907Homosapiens,cloneIMAGE:3922927，mRNAMLAT4NM_018192HypotheticalproteinFLJ10718BLAME画—020125BCM-likemembraneproteinprecursorAD024NM—020675AD024proteinHCAP-GNM—022346ChromosomecondensationproteinGMGC2376丽—023930HypotheticalproteinMGC2376MGC3265NM—024028HypotheticalproteinMGC3265SCDGF-BNM—025208Spinalcord-derivedgrowthfactor-BDKFZP434F0318NM—030817HypotheticalproteinDKFZp434F0318MGC13057NM—032321HypotheticalproteinMGC1305权利要求1.一组乳腺癌标志基因群，其特征为该组基因群中的一个、多个或全部基因的组合可以用于鉴别乳腺良、恶性肿瘤，基因群中120个基因的名称、序列号及主要功能描述见表1。2.权利要求1所述基因的多个或全部基因的组合制备成基因芯片用于良、恶性乳腺肿瘤的鉴定，其特征在于将这些基因的cDNA或寡核苷酸探针固定成微阵列，其中每个基因探针可以特异性地与来源于组织样本中相应基因的cDNA或其扩增产粉杂交，按分类，微阵列可以是平板、微珠、细针或膜相阵列，可以是固相、液相，可以是寡核苷酸、多核苷酸或'者cDNA阵列。3.权利要求1所述基因的单个或多个基因作为核酸分子杂交的探针、或RT-PCR扩增的目的基因检测组织标本中的mRNA表达量，根据mRNA表达水平鉴定良、恶性肿瘤，核酸分子杂交可以是提取的RNA及其反转录的cDNA在固相支持物上的杂交、也可以是组织切片的原位杂交，RT-PCR可以是定量方法、半定量方法、定性方法。4.利用权利要求2所述的基因芯片鉴别乳腺癌与正常组织或良性肿瘤的方法(1)乳腺肿瘤组织或正常组织样本的cDNA或其扩增产物焚光标记后与包含乳腺癌标志基因群的多,.个或全部基因的基因芯片杂交，基于各基因的荧光强度值，利用非监督聚类分析方法即得到能将乳腺癌组织和正常组织准确分类的基因表达谱；(2)使用基因表达图语对乳腺肿瘤进行鉴别诊断，包括以下步骤包括以下步骤a)从乳腺肿瘤患者的手术切除样本或针吸活4企样本中提取总RNA并反转录为cDNA;b)对样本的cDNA或其扩增产物进行焚光标记；c)用标记后的样本与权利要求2中所述的基因芯片杂交d)用非监督聚类分析样本基因表达谱，与权利要求4中所述的基因图i普比较对患者组织标本的良、恶性作出鉴定。全文摘要本发明公开了一组乳腺癌标志基因群及由该组基因群中的一个、多个或全部基因的组合用于乳腺良、恶性肿瘤鉴别诊断的应用方法。该基因群有120个基因，这些基因涉及细胞生长和代谢、细胞信号传导、细胞粘附运动和机体免疫等与乳腺癌发生相关的重要生物学过程。应用方法可以是基因芯片，分子杂交和RT-PCR等方法检测组织样本中这些基因的mRNA表达水平，根据这些基因的表达水平对患者组织标本的良、恶性作出鉴定。文档编号C40B40/06GK101104871SQ20071012612公开日2008年1月16日申请日期2007年6月5日优先权日2006年6月7日发明者冯玉梅,孙保存,李晓青,郝希山申请人:天津医科大学附属肿瘤医院