基于微流控芯片的基因治疗乳腺癌的药物的制备方法

专利名称：基于微流控芯片的基因治疗乳腺癌的药物的制备方法
技术领域：
本发明涉及计算机科学、分子生物学、医学及微流控芯片技术。特别提供了一种基
于微流控芯片的基因治疗乳腺癌的药物的制备方法。
背景技术：
癌症是一种基因性疾病，在基因水平进行诊断和治疗是最基本和最准确的方法。 细胞癌变是一个以多种原癌基因的激活和抑癌基因的失活为基础的过程，因此，在进行基 因诊断时，往往需要对多种基因的表达水平进行综合的判断。目前，癌症的诊断往往是在 体外进行，通过对血液和组织检验结果等进行判断，还远远没有达到单细胞水平。并且， 体外诊断和体内治疗是两个相对独立的环节，抗癌药物对正常细胞往往也造成较大的损 伤。如何将抗癌药物特异性的释放到肿瘤细胞，提高治疗的靶向性，是生物医学工作者们 致力解决的难题。迄今为止，有多种方法和技术被应用于药物的靶向释放中，如利用病毒 (文献Cancer Gene Ther即y， 2008， 15， 667-675)、纳米颗粒(文献Gene Ther即y， 2000， 7， 1896-1905)以及微流控芯片(文献Lab On A Chip, 2006， 6， 1384-1386)等携带药物，但由 于这些体系缺少了 "诊断"这一环节，因此还不能做到最为准确的靶向"治疗"。
2004年，Sh即iro小组报道了 一种可控制基因表达的生物分子计算机(文献 Nature, 2004， 429， 423-429)，在试管内模拟了微小的DNA计算机进入细胞后，通过多次的 杂交、酶连、酶切反应，对前列腺癌和肺癌多种相关基因的表达情况依次进行计算，并在诊 断成立时，释放一条较短的单链核酸分子作为药物进行治疗。该计算机首次将诊断和治疗 两个相对独立的环节联系起来，并将诊断和治疗定位在单细胞水平，提高了药物释放的靶 向性，为解决癌症的靶向治疗提供了新的研究方向。但这种DNA计算机如要进一步进行体 内试验尚存在以下几点不足1、该计算机所有的生化反应是在试管中进行的，DNA计算机 要进入体内行使功能，必然需要一种有效的载体携带着DNA分子和酶将其传递到相应的靶 点，防止DNA分子在计算前就被降解掉，显然试管不能成为这种有效的载体；2、对多种癌症 相关基因表达情况采用依次进行(串联)的计算方式，并且每计算一种基因需要引入多种 高浓度的外源性分子，有可能会影响到细胞的正常生理功能；3、该计算机必须要进入细胞 内才能行使功能，增强了操作难度；4、最为重要的一点，该计算机采用限制性内切酶(Fok I 酶)进行酶切反应，限制性内切酶仅存于低等生物内(如细菌、病毒等)，可在特定位点可将 双链DNA分子切断，因此有可能对高等生物的基因组产生影响。综上所述，若要将DNA计算 机应用于基因诊断和治疗中，必须要有更为合理的计算方法和更为理想的平台。另外，上述 体系中所释放的为预先已经存在的药物，一种更为灵活的方法为根据需要合成治疗药物然 后释放(文献NatureBiotechnology，2003，21， 1184-1191)。 乳腺癌是女性最常见的恶性肿瘤，随着经济水平的提高和生活方式的改变，其发 病率逐年上升，并有年轻化趋势，在一些大城市已跃居女性恶性肿瘤的首位。全世界每年约 有120万妇女患乳腺癌，约50万人死于此病，转移和复发是患者常见的死亡原因。目前的 诊断手段主要有体格检查、X线、B超、远红外线扫描、CT、组织穿剌活检等，但多数人在检
5查时已有病灶，甚至已经到了中晚期。目前的治疗手段主要采取手术切除，辅以放疗、化疗、内分泌治疗等，这些方法对病人生理、心理的伤害较大，且5年存活率不高。科学家早已知道，引发癌症的导火索是细胞内基因发生变化。乳腺癌也是一种基因性疾病，其发生和发展是一个多阶段演进、多基因改变的渐进过程。其内在机制在于原癌基因与抑癌基因之间失去平衡，表现为多个原癌基因的异常激活和编码蛋白过度表达以及抑癌的缺失、突变失活导致细胞增殖失控而恶性转化。这些基因变化的相互作用，特别是其叠加作用，是乳腺发生癌变的重要分子基础。因此，在基因水平进行乳腺癌的诊断和治疗，是更为准确、有效、耙向性更强的方法。
乳腺癌等的基因诊断背景知识 1)与乳腺癌相关的原癌基因原癌基因为人体细胞固有的基因，其表达产物在正常状态下为细胞增殖分化所必需，在突变、扩增、重排、过表达等特定条件下，被激活诱导细胞发生恶变，导致抑制细胞凋亡、细胞过度增殖和侵袭转移等。与乳腺癌相关的原癌基因有C-erbB-2、EGFR、c-myc、ras、int-2、bcl-2、BAG-l、BCSG-2、survivin等。其中C-erbB-2已被公认为是乳腺癌肿瘤标志物检测中的一个金标准。它是一种细胞来源的原癌基因，翻译的糖蛋白pl85可以促进细胞分裂和蛋白水解酶的分泌，使DNA合成增加，癌细胞生长加快，并增强细胞的运动能力，从而促进肿瘤侵袭和转移。C-erbB-2在正常乳腺细胞中低表达，而在20X 30X的乳腺癌中有C-erbB-2的扩增和(或)过度表达。其高表达提示细胞增殖旺盛、侵袭力强，患者对化疗、内分泌治疗效果欠佳，预后差。 2)与乳腺癌相关的抑癌基因抑癌基因在突变、缺失、甲基化、低表达等条件下，丧失维持细胞正常生理功能的作用，细胞易发生癌变。与乳腺癌相关的原癌基因有P53、nm23、PTEN、Rb、P16、P21、CHEK2、服CAl、服CA2等。P53是至今发现的与人类肿瘤相关性最为密切的基因。在人类乳腺癌的突变率为15% 60%。 p53基因分为野生型和突变型两种。野生型p53能抑制多种原癌基因，为一种抑癌基因，它能够诱导终末分化、维持基因稳定，触发衰老和诱导细胞凋亡，是负生长调控因子，正常细胞内p53基因为野生型。突变型P53基因失去了野生型p53基因抑制细胞增殖的正常功能，并且具有了癌基因的特性。突变型p53高表达的乳腺癌具有强的侵袭力、转移力，并与淋巴结转移密切相关，预后不良，可作为判断乳腺癌预后的一个重要指标。nm23，又称为肿瘤转移抑制基因，为人类正常基因，广泛存在于机体细胞膜和细胞浆上。目前一般认为nm23是通过影响微管装配、信号转导、翻译调节及细胞黏附而维持细胞的正常分裂状态，从而抑制癌细胞的侵袭、转移。其高表达与淋巴结转移及远处转移呈负相关，与生存率呈正相关，对判断乳腺癌淋巴结转移和评估预后具有重要意义。BRCA1、BRCA2为肿瘤易感基因，这两个基因发生变异的女性，有40X 80%的患乳腺癌的危险，且预后不好。可作为肿瘤预测基因，用于乳腺癌早期监控。
3)基因诊断采用的方法和平台说明 基因诊断主要采用PCR、实时荧光定量PCR(RT-PCR) 、Southern印迹、斑点印迹、荧光原位杂交(FISH)等方法反映基因扩增情况。借助的平台主要为试管、基因芯片和微流控芯片等。 基因芯片又称为生物芯片，采用微阵列的方式，将上万种寡核苷酸或DNA样品，密集排列在硅片、玻片、聚丙烯或尼龙膜等固相支持物上。通过激光共聚焦荧光显微镜获取信息，经电脑系统处理，分析所得资料。基因芯片具有大规模、高通量的优势，能将肿瘤发展过
6程中多个基因作为一个"基因群"来研究。 微流控芯片，又称为芯片实验室，(lab-on-a-chip)，指的是在一块几平方厘米的芯片上构建的化学或生物实验室。它可将单细胞捕获、裂解、DNA固相萃取、PCR、电泳、激光诱导荧光检测等集成在一块几平方厘米的芯片上完成。它不仅具有高通量的优势，更具有了上述基因芯片所不具备的集成化、自动化的优势，在未来的基因诊断中具有广泛的应用前景。 4)基因治疗随着分子生物学技术及免疫学技术的迅猛发展和人类对乳腺癌发病机制认识的不断深入，基因治疗逐渐成为肿瘤生物学治疗中的重要组成部分。基因治疗在乳腺癌的治疗中显示出良好的应用价值，并且取得了一定的效果，将日渐成为一项有前景的治疗选择。 乳腺癌的基因治疗的方法有①抑制原癌基因的活性；②导入抑癌基因；③自杀基因疗法治。自杀基因因为一些来自低等生物的基因编码的酶类，能使一些药物前体发生转化而获得对哺乳动物细胞的毒性。将这种外源性酶解前药基因导入肿瘤细胞，再配伍用相应的药物前体，可使肿瘤细胞表达其编码产物将无毒的前药成分酶解成为有毒性的物质而"自杀"，故称为"自杀基因"(suicidegene)，即药物敏感基因。这类基因包括单纯疱疹病毒胸苷激酶(HSV-tK)基因，水痘-带状疱疹病毒胸苷激酶(VZV-tK)基因，胞嘧啶脱氨酶(cytosine deaminase,CD)基因等。其中研究最深入且与肿瘤基因治疗关系最密切的是HSV-tK基因和CD基因。有报道，HSV-tK能特异性地将核苷类似物更昔洛韦(ganciclovir,GCV)代谢为毒性产物。用GCV治疗已转有HSV-tK基因的乳腺癌大鼠模型，可以观察到肿瘤排斥现象。疱疹病毒的tk基因与哺乳动物细胞内的tk基因不同，它可以催化一些核苷类似物(nucleotide analogs, Nas)的磷酸化，如ACV， GCV等，终产物NasTP可干扰、抑制宿主细胞DNA的合成，最终导致细胞死亡。自杀基因应用到肿瘤治疗，主要由于其能引发有效的"旁观者效应"，是指只要使部分肿瘤细胞导入外源自杀基因，其邻近的即使未导入自杀基因的大部分肿瘤细胞也会被杀死，从而放大了自杀基因对肿瘤的治疗作用。发生的机制比较复杂，目前认为以下因素与其有关(l)细胞间缝隙连接；(2)细胞凋亡与吞噬；(3)免疫炎症反应；(4)抗肿瘤血管生成等。其作用机理如图21所示。 基因治疗中常用的载体利用载体将外源基因转入靶细胞是基因治疗的基础和关键步骤，用于转染基因的载体包括病毒载体和非病毒载体。病毒载体由于具有高效、血清滴度高、容量大、低毒、易于分离等优点而成为基因治疗中应用最为广泛的载体。逆转录病毒载体是目前研究最多、最为成熟的载体，感染效率高，能持续表达，可以把外源基因以前病毒的形式转移到靶细胞基因组中，但其携带外源基因的容量较小，且感染特异性不高，只能转导分裂细胞，重组病毒的滴度较低，不造于治疗大肿瘤。另外，它可被血浆中的补体灭活，也有引起异常突变和激活癌基因的可能。 腺病毒载体是近年来常用的载体。重组腺病毒可有效地将外源基因转移并表达于多种细胞中，感染效率高，可携带的基因较大，致死性和致瘤性低，使用安全。腺病毒介导的基因转染在乳腺癌中显示出极高的基因转染效率。但也有其缺点治疗基因为随机的非特异性转染病毒抗原可诱导机体产生免疫反应，限制了重复使用；重组腺病毒可导致转染细胞毒性及细胞死亡，使基因表达时间受限；对肝细胞有损伤作用。其他可用于基因转导的载体还有腺相关病毒载体、脂质体等。
乳腺癌基因治疗目前存在问题(l)缺乏高效、特异的导向性载体要求降低病毒载体的潜在致瘤性，不损伤正常的细胞。(2)基因表达的可控性问题现在的研究趋向于用组织和肿瘤特异性的基因启动子控制靶基因表达。 人们期望获得一种技术效果更佳的基于微流控芯片的基因治疗乳腺癌的药物的制备方法。

发明内容
本发明的目的是设计一种基于微流控芯片的基因治疗乳腺癌的药物的制备方法。所述基因治疗乳腺癌的抗癌药物具有自动检测且能够在条件满足时自动合成并靶向释放的能力。 我们使用DNA计算机(优选以微流控芯片为载体)，对与乳腺癌相关的多种基因表达情况同时进行计算，并于诊断成立时，自动合成完整的自杀基因作为有效的抗癌药物释放，而在诊断不成立时，释放的仅为无效的片段化的药物。 我们在一块几平方厘米的微流控芯片上，在体外验证了该DNA计算机原理的可行性。模拟了更为微型化的微流控芯片DNA计算机进入体内后，无需进入细胞，可以通过微量的细胞质，即可进行基因诊断并治疗的过程。计算中采用的分子种类和数量均较少，使用的酶为高等生物体内存在的DNA连接酶。随着纳米材料和微加工技术的发展，有望开展进一步的体内试验。 DNA计算机是基于DNA分子生化反应的新型生物计算机。具体地说，就是代表一定信息的DNA分子作为"输入"，经过杂交、变性、酶连、酶解等可控的生化反应进行"计算"，反应后生成的新的或符合某种要求的DNA分子作为"输出"。计算过程中往往需要酶的参与，如限制性内切酶、DNA连接酶、外切核酸酶等。 按照DNA计算机的实现方式，DNA计算机经历了试管(文献Science, 1994,266，1021-1024)、表面(文献Nature, 2000， 403， 175-179)和芯片(文献Lab 0nAChip， 2005， 5，1033-1040)三个阶段。将DNA分子固定在表面上的计算方式，可以克服试管中DNA分子易丢失和操作难、检测难的特点，但多个计算步骤仍须在人工干预下间断进行。微流控芯片具有比表面更为明显的优势，不仅可将计算用的某种DNA分子以三维立体的方式固定在芯片的局部，并且具有高度集成化、自动化、小型化、微型化的特点，DNA计算所需的多个生化反应，均可在一块微小的芯片上连续完成。因此芯片有可能取代试管和表面，成为DNA计算机一种理想的平台。 与传统的电子计算机相比，DNA计算机具有并行性高、运算速度快、信息存储量大等优点，被用于研究解决复杂的数学难题(文献ProceedingsOf The National Academy OfSciences Of The United Stated States OfAmerica，2004， 101，9960-9965)。此夕卜，由于其具有生物相容性，科学家们力图将其应用到生命科学领域中，用于癌症的诊断和治疗(文献ScientificAmerican， 2006， 294， 44-51)。 本发明具体提供了一种基于微流控芯片的基因治疗乳腺癌的药物的制备方法，其特征在于所述基因治疗乳腺癌的抗癌药物具有自动检测且能够在条件满足时自动合成并靶向释放的能力； 所述基因治疗乳腺癌的药物的制备方法具体是使用作为运算介质的生物分子，
8通过生化反应，对与癌症相关的所有原癌基因和抑癌基因中的至少一种或其组合的表达情 况进行计算；当计算结果符合要求时自动合成并靶向释放有效的抗癌药物完整的自杀基 因； 在其所述的计算过程中，所述作为运算介质的生物分子具体是DNA分子和/或 酶； 与乳腺癌相关的原癌基因包含有C-erbB-2、 EGFR、 c-myc、 ras、 int_2、 bcl-2、 BAG-l、BCSG-2、survivin ;与乳腺癌相关的抑癌基因包含有P53、nm23、PTEN、Rb、P16、P21、 CHEK2、BRCA1、BRCA2。 所述基于微流控芯片的基因治疗乳腺癌的药物的制备方法中，作为运算介质的 DNA分子具体为与每种癌症相关基因相对应的计算分子和药物片段分子，以及带有多个 缺口的不完整的自杀基因分子；所述自杀基因分子上缺口的序列和数量与药物片段分子的 序列和数量相对应。所述作为运算介质的DNA分子中，与每种癌症相关基因相对应的计算 分子和药物片段分子为单链DNA分子，带有缺口的不完整的自杀基因分子为双链DNA分子。
所述基于微流控芯片的基因治疗乳腺癌的药物的制备方法中，当被检测对象中对 应的癌症相关基因表达超出正常范围(升高或降低都会超出正常范围)时，超出部分的癌 症相关基因可将全部或部分的药物片段分子从其与计算分子的匹配关系中置换取代下来， 使原有的计算分子与癌症相关基因杂交的结构变为新的更为稳定的结构；
当癌症相关基因的表达不符合诊断标准时，亦即药物片段分子中的部分或者全部 没有从其与计算分子的匹配关系中被置换取代下来时，就不能与带有缺口的不完整的自杀 基因分子结合形成完整的自杀基因分子从而具有抗癌作用。 所述基于微流控芯片的基因治疗乳腺癌的药物的制备方法中所述作为运算介质 的酶为T4DNA连接酶；所述基因治疗乳腺癌的抗癌药物中的药物片段分子与计算分子在结 构上互补，其二者能够实现杂交；具体而言，所述药物片段分子与不完整的自杀基因分子上 的缺口序列相同；药物片段分子在T4DNA连接酶的作用下能够将不完整的自杀基因上的缺 口填补，使其形成完整的自杀基因； 相对于药物片段分子而言，癌症相关基因与计算分子互补序列较长，癌症相关基 因更易于与计算分子杂交而将药物片段分子取代下来。 当癌症相关基因将相应的药物片段分子从其与计算分子的匹配对应关系中取代 下来后，被取代下来的药物片段分子在电场作用下靶向释放到对应的目的区域(其后的输 出单元)；从而与不完整的自杀基因在T4DNA连接酶体系中合成具有抗癌作用的完整药物。
当癌症相关基因将相应的药物片段分子从其与计算分子的匹配对应关系中取代 下来后，从计算单元传递来的药物片段分子被输送到特定的目标区域和不完整的自杀基因 杂交并在T4DNA连接酶的作用下进行酶连反应，将相应的缺口填补；所述的特定目标区域 中包含有不完整的自杀基因； 当癌症相关基因的表达符合要求(即原癌基因表达升高高于正常限制值并且抑 癌基因表达降低低于正常限制值)时，相应的药物片段将不完整的自杀基因上的缺口全部 填补，此时即有完整的自杀基因被合成并作为抗癌药物释放； 只要有一种基因表达不符合诊断标准，缺口就不会被完全填补，对应地就不能有 完整的自杀基因被合成，释放的仅为没有抗癌作用的不完整的自杀基因。
所述基于微流控芯片的基因治疗乳腺癌的药物的制备方法依据载体微流控芯片 实施，所述微流控芯片在结构上具体分为三个功能单元输入单元、计算单元和输出单元； 其中，计算单元布置在输入单元和输出单元之间，这三个单元之间液体流路顺序联接，并在 电场作用下可以形成药物片段分子的定向移动控制；如前所述并可参照附图2理解。作为 载体的微流控芯片，材料可为石英、玻璃、P匿A、PC聚合物等； 所述基于微流控芯片的基因治疗乳腺癌的药物的制备方法中，计算分子固定在作 为载体的微流控芯片的计算单元上；药物片段分子预先杂交在计算分子上；不完整的自杀 基因和T4DNA连接酶体系预先放置在输出单元中。 当原癌基因分子活抑癌基因分子这两类癌症相关基因将相应的药物片段分子从 其与计算分子的匹配对应关系中取代下来时，被取代下来的药物片段分子在电场的作用下 靶向释放到对应的目的区域(其后的输出单元)；从而与不完整的自杀基因在T4DNA连接 酶体系中合成具有抗癌作用的完整药物(当然前提是所有的被取代下来的药物片段分子 能填补不完整的自杀基因的所有缺口使其能形成真正具有抗癌作用的完整药物)。
在微流控芯片的输出单元，从计算单元传递来的药物片段分子和不完整的自杀基 因杂交并在T4DNA连接酶的作用下进行酶连反应，将相应的缺口填补； 当癌症相关基因的表达符合要求(即原癌基因表达升高并且抑癌基因表达降低) 时，相应的药物片段将不完整的自杀基因上的缺口全部填补，此时即有完整的自杀基因被 合成并作为抗癌药物释放； 只要有一种基因表达不符合诊断标准，缺口就不会被完全填补，对应地就不能有 完整的自杀基因被合成，释放的仅为没有抗癌作用的不完整的自杀基因。
药物片段分子与不完整的自杀基因上的缺口序列相同，可在T4DNA连接酶的作用 下将缺口填补。分子之间的关系详见图l。 所述基于微流控芯片的基因治疗乳腺癌的药物的制备方法中，将计算分子固定在 作为载体的微流控芯片的计算单元的具体过程是将末端修饰有丙烯酰胺基团或氨基基团 的计算分子溶解于丙烯酰胺溶液中，终浓度为5 20ym ;经紫外曝光后，固定在丙烯酰胺 水凝胶中。(固定在水凝胶中的计算分子可保持活性，可进行杂交、变性等反应。丙烯酰胺 水凝胶为一种透明的基质，在没有电场作用下，可起到阀的作用；在低压电场作用下，可允 许DNA分子通过。) 所述作为载体的微流控芯片中，输入单元含有多个(根据实际需要确定可用范 围，通常的可用范围是1 300)样品池，样品池的数目依据诊断的需要而定，不同的癌症相 关基因通常分别由不同的样品池输入。 所述微流控芯片中的计算单元具体为分别与各个样品池相连的同等数量的并行 通道；每个通道里含有与癌症相关基因相对应的计算分子和药物片段分子，分别对不同基 因的表达情况进行计算并传递相应药物片段，不同通道的计算是同时独立进行的，互不干 扰； 所述微流控芯片中的输出单元含有一条通道和一个酶连池，酶连池中含有不完整 的自杀基因分子和T4DNA连接酶反应体系；从计算单元不同通道传递来的药物片段分子通 过输出单元的通道汇集到酶连池中进行酶连反应； 在输出单元的通道中固定了一段空白水凝胶，它不仅可以起到阀的作用，并且由
10于水凝胶有浓縮DNA分子的作用，从计算单元传递来的药物片段分子在此处检测要比在酶 连池中检测更为灵敏，参见图2。 所述基于微流控芯片的基因治疗乳腺癌的药物的制备方法还满足下述两种要求 之一 其一，在计算原癌基因表达是否升高并在其升高时能以对应的量取代相应药物片 段的微流控芯片的计算单元的通道中，固定有两块水凝胶；第一段水凝胶中仅固定相应的 计算分子；第二段水凝胶中所固定的计算分子上，还预先杂交有相应的药物片段分子；
当所述原癌基因分子(即含有癌症相关基因的待检测分子中的一类，另一类待检 测分子是抑癌基因)在低压电场作用下，进入第一段水凝胶，和相应的计算分子杂交而被 其捕获；捕获的速度与原癌基因分子的浓度呈相关性； 当基因表达在正常范围的上限时，经过一定时间的电泳，原癌基因恰好走到第一
段水凝胶的另一侧边缘；而当基因表达升高时，由于杂交的速度更快，经过相同时间的电
泳，升高部分的原癌基因可穿过第一段水凝胶，到达其下游，并在电场作用下，进入第二段
水凝胶和计算分子杂交，而将相应的药物片段分子取代下来，取代的量与基因表达升高的
量相对应，取代下来的药物片段分子在电场的作用下进一步传递到输出单元。 其二，在计算抑癌基因表达是否降低并取代相应药物片段的微流控芯片的计算单
元的通道中，固定有两段水凝胶第一段水凝胶中固定相应的计算分子，并预先杂交有相应
的药物片段分子；第二段水凝胶为空白水凝胶，仅起到阀的作用，不参与计算； 所述抑癌基因分子在低压电场作用下，首先进入第一段水凝胶，将相应的药物片
段分子取代下来(取代的速度与抑癌基因分子的浓度呈相关性)； 当抑癌基因表达在正常范围下限时，经过一定时间的电泳，抑癌基因恰好走到第 一段水凝胶的另一侧边缘，将所有的药物片段分子全部取代下来，被取代下来的药物片段 分子随后被弃除；当抑癌基因表达降低时，由于取代速度变慢，经过相同时间的电泳，仍有 一部分药物片段不会被取代下来而保留在水凝胶中，取代下来的部分被弃除。保留在水凝 胶中的部分在改变电泳条件时冲洗下来，这部分的量和基因表达降低的量相对应，在电场 的作用下进一步传递到输出单元。 在作为载体的微流控芯片的输出单元中，当原癌基因表达升高，抑癌基因表达降 低时被传递来的相应的药物片段，可在不完整的自杀基因分子相应的缺口的位置与之杂 交，并在T4DNA连接酶的作用下将药物片段分子与不完整的自杀基因之间的缝隙连接上， 将相应的缺口填补。当所有的缺口都被填补时，没有抗癌活性的不完整的自杀基因分子就 成为完整的自杀基因分子，具有了抗癌活性。 总之，本发明首次采用微流控芯片作为载体将DNA计算机应用于基因治疗乳腺 癌的抗癌药物中，利用微流控芯片高通量的特点，同时计算多种癌症相关基因的表达情况 (原癌基因是否升高、抑癌基因是否降低)，在诊断成立时合成并释放功能性的药物——完 整的自杀基因，在诊断不成立时，释放的仅为无功能的药物片段。该方法与纳米技术和微加 工技术相结合，有助于提高癌症的靶向治疗。 本发明具体使用自杀基因疗法治疗乳腺癌。乳腺癌是多基因改变的结果，今后可 采用不同的基因联合治疗的方法。目前还没有一种基因治疗可代替常规疗法，基因治疗与 常规疗法相结合，是乳腺癌治疗的发展趋势。虽然乳腺癌基因诊断和治疗已经取得了初步的成功，但要根本上应用于临床治疗，还需要(1)继续寻找乳腺癌相关基因；(2)继续开发 靶向性、安全性更高的载体。


下面结合附图及实施方式对本发明作进一步详细的说明 图1为该DNA计算机的分子之间关系示意图； 图2为该DNA计算机的载体——微流控芯片结构示意图(含一条计算原癌基因表
达是否升高的通道和一条计算抑癌基因表达是否降低的通道)； 图3为计算原癌基因表达是否升高的原理示意图之一 ； 图4为计算原癌基因表达是否升高的原理示意图之二 ； 图5为计算原癌基因表达是否升高的原理示意图之三； 图6为计算抑癌基因表达是否降低的原理示意图之一 ； 图7为计算抑癌基因表达是否降低的原理示意图之二 ； 图8为计算抑癌基因表达是否降低的原理示意图之三； 图9为功能性药物连接示意图； 图10为正常范围上限的原癌基因C-erbB-2在第一段水凝胶中的电泳荧光图； 图11为五种不同浓度的原癌基因C-erbB-2的计算结果图； 图12改变电泳条件时药物片段B被洗脱的电泳荧光图； 图13为五种不同浓度的抑癌基因nm23的计算结果图； 图14为不同诊断情况下的药物合成的结果电泳谱图之一 ； 图15为不同诊断情况下的药物合成的结果电泳谱图之二 ； 图16为不同诊断情况下的药物合成的结果电泳谱图制三； 图17为不同诊断情况下的药物合成的结果电泳谱图之四； 图18为不同诊断情况下的药物合成的结果电泳谱图之五； 图19为RNA干扰——抑制原癌基因活性的作用机制示意图； 图20为将治疗基因导入靶细胞的两种途径示意图； 图21为自杀基因的作用机理示意图。
具体实施方式

实施例1 基于微流控芯片的基因治疗乳腺癌的药物的制备方法我们计算了与乳腺癌关系 最为密切的两种基因，即原癌基因C-erbB-2和抑癌基因nm23，表达升高和降低的情况，并 在两者表达均符合诊断标准时，合成完整的自杀基因HSV-tk作为抗癌药物并将其释放。
在体外实验中，我们采用合成的较短的DNA分子来代替较长的原癌基因和抑癌基 因。与原癌基因相对应的为计算分子1和药物片段A，与抑癌基因相对应的为计算分子2和 药物片段B。用与药物片段A和B互补的模板链来代替不完整的自杀基因分子。药物片段 A和B可与模板链相结合，形成杂交双链，并在T4DNA连接酶的作用下连接成完整的双链， 这个完整的双链表示功能性的药物，如图9所示。为了便于检测，在基因分子和药物片段分 子的末端用荧光基团标记，FAM基团在494nm波长激发，522nm波长检测时发出绿色荧光，TAMRA基团在560nm波长激发，582nm波长检测时发出红色荧光。药物片段A和B连接时需 要有磷酸根基团(P04-)的参与。计算分子标记有丙烯酰胺基团(acrylamide-)，可通过共 价键固定在丙烯酰胺水凝胶中。分子的序列和修饰的情况详见表1。
表1DNA计算机所需分子的核苷酸序列及标记
序列(5 ' -3 ')
原癌基因(C-erbB-2)FAM-GGGCATGGTCCACCACAGGCACCGCAGCTCAT
计算分子1acrylamide-ATGAGCTGCGGTGCCTGTGGTGGACCATGCCC
药物片段ATAMRA-GGGCAGGGTCCAC
抑癌基因(nm23)TAMRA-CTGTGATACAGGAACCATGGCCAACTGTGAGC
计算分子2acrylamide- GCTCACAGTTGGCCATGGTTCCTGTATCACAG
药物片段BP04國AGGAACCATGGCCAAC-FAM
药物模板GTTGGCCATGGTTCCTGTGGACCCTGCCC 本实施例所用载体为微流控芯片，具体如图2所示是含有两条并行通道的玻璃 芯片，通道宽200 ii m，深80 ii m，全长(从样品池1或6到酶连池13)约50mrn，通道中固定的 每段水凝胶长度均为lmm，液池的直径为2mm。 将含有10 m计算分子的丙烯酰胺溶液注入通道中，待通道中充满该溶液时，用 黑色不透明胶布将芯片的其他部分遮盖住，仅将需要形成水凝胶的通道部分露出，在紫外 灯下曝光5分钟，暴露的部分就形成了固定有计算分子的水凝胶。将其他部位未形成水凝 胶的丙烯酰胺溶液，通过真空泵从水凝胶两侧的液池吸走。通过此方法，可在计算原癌基因 是否升高的通道中形成两段含有计算分子1的水凝胶，在计算抑癌基因是否降低的通道中 形成一段含有计算分子2的水凝胶和一段空白水凝胶(不含任何计算分子)，在输出单元的 通道内形成一段空白水凝胶(不含任何计算分子)。将药物片段A加入液池4中，在液池4 和5之间施加48v电压，药物片段A进入水凝胶中和计算分子1杂交，经5分钟电泳后，杂 交达到饱和，将液池4和5中的剩余液体弃除，同样可将药物片段B预先杂交在计算分子2 上，各个缓冲液池中均充入高盐的缓冲液1 XTE和0. 5M NaCl。计算的过程在荧光显微镜下 检测。 我们设定l 2ym为基因表达的正常范围。在计算原癌基因是否升高的通道中， 首先考察正常范围上限即2ym的原癌基因C-erbB-2到达第一段水凝胶右侧边缘的时间， 实验证明为3分钟，结果如图IO所示。因此我们将第一步电泳的时间定为3分钟。考察5 种不同浓度的C-erbB-2的计算结果。不同浓度的C-erbB-2分别从液池1中输入，在液池1 和3之间施加48v的电压，电泳时间为3分钟，然后在液池3和5之间施加48v电压4分钟， 再在液池5和13之间施加48v电压5分钟，结果如图11所示经3分钟电泳，C-erbB-2表 达升高时(5和lOiim)，穿过第一段水凝胶，经第二步电泳，进入第二块水凝胶，取代了药物
13片段A，被取代下来的药物片段A经第三步电泳，经过空白水凝胶到达液池13。当C-erbB-2 表达不升高时(l和O. 2iim)，经第一步电泳尚未到达第一段水凝胶的右侧边缘，液池5中不 会出现C-erbB-2，应此不能取代药物片段A。以上结果验证了 ，只有原癌基因表达升高时才 会有相应的药物片段被传递到输出单元。 如图12所示，改变电泳条件时，将电压方向切换，缓冲液由高盐(IXTE和O. 5M NaCl)改为低盐(1XTE)后，经6分钟电泳，药物片段B可全部被冲洗下来。
在计算抑癌基因是否降低的通道中，首先考察正常范围下限即1 y m的抑癌基因 nm23到达第一段水凝胶右侧边缘的时间，也就是将药物片段B全部取代下来的时间，实验 证明为4分钟。考察5种不同浓度nm23的计算结果。不同浓度的nm23分别从样品池6中 输入，在液池6和8之间施加48v的电压，电泳时间为4分钟，然后将液池8中的液体弃去， 重新加入缓冲液1 X TE和0. 5M NaCl ，将样品池6中的液体改为1 X TE，切换液池6和8之 间的电压方向，电泳6分钟，然后再经第三步电泳(液池8和13之间)，时间为8分钟。结 果如图13所示经4分钟电泳，nm23表达降低时(0. 2和0. 02 y m)，尚未到达第一段水凝胶 的右侧边缘，不能将药物片段B完全取代，保留的药物片段B在改变电泳条件时，经第二步 电泳，被冲洗下来，被冲洗下来的药物片段B经过第三步电泳，经过两段空白水凝胶到达液 池13。当nm23表达不降低时(1和0. 2 y m)，经第一步电泳药物片段B被完全取代下来后 并弃除，因此，即使改变电泳条件，也不会有药物片段B被冲洗下来。以上结果验证了，只有 抑癌基因表达降低时才会有相应的药物片段被传递到输出单元。 在液池13中预先存放有药物模板和T4DNA连接酶反应体系，在经过上下两条通道 均完成三步电泳后，于室温下(25t:左右)，在酶连池中进行30分钟的酶连反应。由于药物 片段分子是否连接成完整的双链，仅依靠荧光无法证明，需要通过长度来验证。因此，酶连 结果在另一块十字芯片上，进行芯片电泳，将酶连反应后的不同组分分离后，激光诱导荧光 检测，电泳谱图如图14 18所示。图中B表示药物片段B，AB表示药物片段A和B连接后 的完整的功能性药物，药物片段A标记的荧光在本实验检测条件下被滤掉，因此检测不到 药物片段A的峰。图14为标准样品的电泳谱图；图15为原癌基因升高、并且抑癌基因降低 时药物合成结果的电泳谱图；图16为只有原癌基因升高、抑癌基因表达不降低时药物合成 结果的电泳谱图；图17为只有抑癌基因表达降低、原癌基因不升高时药物合成结果的电泳 谱图；图18为原癌基因不升高、并且抑癌基因也不降低时药物合成结果的电泳谱图。从图 中可以看出，只有原癌基因和抑癌基因表达均符合诊断标准，即诊断成立时，才会有功能性 的药物合成并释放，只要有一种不符合诊断标准，即诊断不成立时，没有功能性的药物合成 并释放，释放的仅为无功能的药物片段。这说明该DNA计算机有助于癌症的靶向治疗。
实施例2 本实施例与实施例1内容基本相同，其不同之处主要在于 1)我们针对下述与乳腺癌相关的原癌基因(C-erbB-2、 EGFR、 c-myc、 ras、 int-2、 bcl-2、 BAG-1、 BCSG-2、 survivin)中的至少一种和与乳腺癌相关的抑癌基因(P53、 nm23、 PTEN、 Rb、 P16、 P21、 CHEK2、 BRCA1、 BRCA2)中的至少一种作为设计依据，进行药物片段分子 的设计工作。 2)我们针对1)中所选的药物片段分子设计带有缺口的不完整的自杀基因分子， 具体为带有与其所选定的药物片段分子相对应的同等序列的缺口的双链DNA分子。
3)作为载体的微流控芯片的计算单元以及计算通道根据上述1) 、2)过程的具体 情况选用，试验参数等也与之匹配。
权利要求
基于微流控芯片的基因治疗乳腺癌的药物的制备方法，其特征在于所述基因治疗乳腺癌的药物的制备方法是使用作为运算介质的生物分子，通过生化反应，对与癌症相关的所有原癌基因和抑癌基因中的至少一种或其组合的表达情况进行计算；当计算结果符合要求时自动合成并靶向释放有效的抗癌药物完整的自杀基因；在其所述的计算过程中，所述作为运算介质的生物分子具体是DNA分子和/或酶；与乳腺癌相关的原癌基因包含有C-erbB-2、EGFR、c-myc、ras、int-2、bcl-2、BAG-1、BCSG-2、survivin；与乳腺癌相关的抑癌基因包含有P53、nm23、PTEN、Rb、P16、P21、CHEK2、BRCA1、BRCA2。
2. 按照权利要求1所述基于微流控芯片的基因治疗乳腺癌的药物的制备方法，其特征 在于所述基因治疗乳腺癌的抗癌药物的制备方法中，作为运算介质的DNA分子具体为与 每种癌症相关基因相对应的计算分子和药物片段分子，以及带有多个缺口的不完整的自杀 基因分子；所述自杀基因分子上缺口的序列和数量与药物片段分子的序列和数量相对应。
3. 按照权利要求2所述基于微流控芯片的基因治疗乳腺癌的药物的制备方法，其特征 在于所述作为运算介质的DNA分子中，与每种癌症相关基因相对应的计算分子和药物片 段分子为单链DNA分子，带有缺口的不完整的自杀基因分子为双链DNA分子。
4. 按照权利要求3所述基于微流控芯片的基因治疗乳腺癌的药物的制备方法，其特征 在于所述基因治疗乳腺癌的抗癌药物的制备过程中，当被检测对象中对应的癌症相关基 因表达超出正常范围时，超出部分的癌症相关基因可将全部或部分的药物片段分子从其与 计算分子的匹配关系中置换取代下来，使原有的计算分子与癌症相关基因杂交的结构变为 新的更为稳定的结构；当癌症相关基因的表达不符合诊断标准时，亦即药物片段分子中的部分或者全部没有 从其与计算分子的匹配关系中被置换取代下来时，就不能与带有缺口的不完整的自杀基因 分子结合形成完整的自杀基因分子从而具有抗癌作用。
5. 按照权利要求4所述基于微流控芯片的基因治疗乳腺癌的药物的制备方法，其特征 在于所述基因治疗乳腺癌的抗癌药物制备方法中所使用的作为运算介质的酶为T4DNA连 接酶；所述药物片段分子与计算分子在结构上互补，其二者能够实现杂交；具体而言，所述药 物片段分子与不完整的自杀基因分子上的缺口序列相同；药物片段分子在T4DNA连接酶的 作用下能够将不完整的自杀基因上的缺口填补，使其形成完整的自杀基因；相对于药物片段分子而言，癌症相关基因与计算分子互补序列较长，癌症相关基因更 易于与计算分子杂交而将药物片段分子取代下来。
6. 按照权利要求5所述基于微流控芯片的基因治疗乳腺癌的药物的制备方法，其特征 在于当癌症相关基因将相应的药物片段分子从其与计算分子的匹配对应关系中取代下来 后，被取代下来的药物片段分子在电场作用下靶向释放到对应的目的区域；从而与不完整 的自杀基因在T4DNA连接酶体系中合成具有抗癌作用的完整药物。
7. 按照权利要求6所述基于微流控芯片的基因治疗乳腺癌的药物的制备方法，其特征 在于当癌症相关基因将相应的药物片段分子从其与计算分子的匹配对应关系中取代下来 后，药物片段分子被输送到特定的目标区域和不完整的自杀基因杂交并在T4DNA连接酶的 作用下进行酶连反应，将相应的缺口填补；所述的特定目标区域中包含有不完整的自杀基因；当癌症相关基因的表达符合要求时，相应的药物片段将不完整的自杀基因上的缺口全 部填补，此时即有完整的自杀基因被合成并作为抗癌药物释放；只要有一种基因表达不符合诊断标准，缺口就不会被完全填补，对应地就不能有完整 的自杀基因被合成，释放的仅为没有抗癌作用的不完整的自杀基因。
8. 按照权利要求1 7其中之一所述基于微流控芯片的基因治疗乳腺癌的药物的制备 方法，其特征在于所述基因治疗乳腺癌的抗癌药物制备过程中要求依据载体实施，所述载体具体是微流 控芯片；微流控芯片在结构上具体分为三个功能单元输入单元、计算单元和输出单元；其 中，计算单元布置在输入单元和输出单元之间，这三个单元之间液体流路顺序联接，并在电 场作用下可以形成药物片段分子的定向移动控制；所述基于微流控芯片的基因治疗乳腺癌的药物的制备方法中，计算分子固定在作为载 体的微流控芯片的计算单元上；药物片段分子预先杂交在计算分子上；不完整的自杀基因 和T4DNA连接酶体系预先放置在输出单元中。
9. 按照权利要求8所述基于微流控芯片的基因治疗乳腺癌的药物的制备方法，其特征 在于将计算分子固定在作为载体的微流控芯片的计算单元的具体过程是将末端修饰有丙 烯酰胺基团或氨基基团的计算分子溶解于丙烯酰胺溶液中，终浓度为5 20 ii m ;经紫外曝 光后，固定在丙烯酰胺水凝胶中；所述作为载体的微流控芯片中，输入单元含有1 300个样品池，不同的癌症相关基因 分别由不同的样品池输入；所述微流控芯片中的计算单元具体为分别与各个样品池相连的同等数量的并行通道； 每个通道里含有与癌症相关基因相对应的计算分子和药物片段分子，分别对不同基因的表 达情况进行计算并传递相应药物片段，不同通道的计算是同时独立进行的，互不干扰；所述微流控芯片中的输出单元含有一条通道和一个酶连池，酶连池中含有不完整的自 杀基因分子和T4DNA连接酶反应体系；从计算单元不同通道传递来的药物片段分子通过输 出单元的通道汇集到酶连池中进行酶连反应；在输出单元的通道中固定了一段空白水凝胶，它不仅可以起到阀的作用，并且由于水 凝胶有浓縮DNA分子的作用，从计算单元传递来的药物片段分子在此处检测要比在酶连池 中检测更为灵敏。
10. 按照权利要求9所述基于微流控芯片的基因治疗乳腺癌的药物的制备方法，其特 征在于所述基因治疗乳腺癌的抗癌药物的制备方法还满足下述两种要求之一 其一，在计算原癌基因表达是否升高并在其升高时能以对应的量取代相应药物片段的 微流控芯片的计算单元的通道中，固定有两块水凝胶；第一段水凝胶中仅固定相应的计算 分子；第二段水凝胶中所固定的计算分子上，还预先杂交有相应的药物片段分子；当原癌基因分子在低压电场作用下，进入第一段水凝胶，和相应的计算分子杂交而被 其捕获；捕获的速度与原癌基因分子的浓度呈相关性；当基因表达在正常范围的上限时，经过一定时间的电泳，原癌基因恰好走到第一段水 凝胶的另一侧边缘；而当基因表达升高时，由于杂交的速度更快，经过相同时间的电泳，升高部分的原癌基因可穿过第一段水凝胶，到达其下游，并在电场作用下，进入第二段水凝胶 和计算分子杂交，而将相应的药物片段分子取代下来，取代的量与基因表达升高的量相对 应，取代下来的药物片段分子在电场的作用下进一步传递到输出单元。其二，在计算抑癌基因表达是否降低并取代相应药物片段的微流控芯片的计算单元的 通道中，固定有两段水凝胶第一段水凝胶中固定相应的计算分子，并预先杂交有相应的药 物片段分子；第二段水凝胶为空白水凝胶，仅起到阀的作用，不参与计算；抑癌基因分子在低压电场作用下，首先进入第一段水凝胶，将相应的药物片段分子取 代下来；当抑癌基因表达在正常范围下限时，经过一定时间的电泳，抑癌基因恰好走到第一段 水凝胶的另一侧边缘，将所有的药物片段分子全部取代下来，被取代下来的药物片段分子 随后被弃除；当抑癌基因表达降低时，由于取代速度变慢，经过相同时间的电泳，仍有一部 分药物片段不会被取代下来而保留在水凝胶中，取代下来的部分被弃除。保留在水凝胶中 的部分在改变电泳条件时被冲洗下来，这部分的量和基因表达降低的量相对应，在电场的 作用下进一步传递到输出单元。
全文摘要
基于微流控芯片的基因治疗乳腺癌的药物的制备方法其使用作为运算介质的生物分子，通过生化反应，对与癌症相关基因表达情况进行计算；结果符合要求时自动合成并靶向释放抗癌药物完整的自杀基因；所述作为运算介质的生物分子具体是DNA分子和/或酶；与乳腺癌相关的原癌基因为C-erbB-2、EGFR、c-myc、ras、int-2、bcl-2、BAG-1、BCSG-2、survivin；与乳腺癌相关的抑癌基因为P53、nm23、PTEN、Rb、P16、P21、CHEK2、BRCA1、BRCA2。本发明在条件成立时合成并释放治疗乳腺癌的抗癌药物完整的自杀基因。该方法与纳米技术和微加工技术相结合，有助于提高治疗效果。
文档编号G06N3/12GK101745121SQ20081022939
公开日2010年6月23日 申请日期2008年12月8日 优先权日2008年12月8日
发明者于浩, 张宇, 林炳承, 秦建华 申请人:中国科学院大连化学物理研究所