Brca基因易感snp位点检测组合物的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及基因检测领域，特别是涉及BRCA基因SNPA位点检测的组合物。
【背景技术】
[0002] 乳腺癌是一种严重影响妇女身体健康甚至危及生命的最常见的恶性肿瘤之一。据 资料统计，其发病率占全身各种恶性肿瘤的7-10%，在妇女中仅次于子宫癌。乳腺癌的发病 常与遗传有关，另外，40-60岁之间，绝经期前后的妇女发病率较高。
[0003] 乳腺癌可分为散发性和遗传性两大类。其中遗传性乳腺癌约占乳癌发病率的 5%-10%。乳腺癌易感基因 BRCA1(the first familial breast and ovarian cancer susceptibility gene)和 BRCA2(the second familial breast cancer susceptibility gene)存在可遗传突变，BRCA1或BRCA2突变基因携带者一生中患乳腺癌的危险性估计为 90%。此外，BRCA1和BRCA2的突变也和卵巢癌有关。不论有无家族史还是发病年龄，所有 卵巢癌中2-6%有BRCA1的突变，3-4%有BRCA2的突变。因此，筛选BRCA基因的突变也来 越受到研究者的关注。
[0004] BRCA1和BRCA2基因分别定位于17ql2_21和13ql2_13,编码序列分别为5711bp和 10987bp，其表达有一定的组织特异性。BRCA1和BRCA2蛋白分别由1863个氨基酸和3418 个氨基酸组成，这两个蛋白都具有Granin蛋白的某些特征。BRCA1/2是两种具有抑制恶性 肿瘤发生的基因，在调节人体细胞的复制、遗传物质DNA损伤修复、细胞的正常生长方面有 重要作用。拥有这个基因突变的家族倾向于具有高乳腺癌发生率，通常发生在较年轻时，病 人的两侧乳房都患癌，且同时患有卵巢癌。如果BRCA1/2基因的结构发生了某些改变，那么 它所具有的抑制肿瘤发生的功能就会受影响。截止2013年，已发现的BRCA1/2的突变有数 百种之多。有学者总结了 BRCA1和BRCA2基因突变相关的癌症的终身风险，显示有BRCA1 基因突变者，患乳腺癌和卵巢癌的风险分别是50%~85%和15%~45%，有BRCA2基因突 变者，患乳腺癌和卵巢癌的风险分别是50%~85%和10%~20%。
[0005] 通过对BRCA1/2的检测，可以反映乳腺癌的发生发展，也可筛检出乳腺癌、卵巢癌 及其他相关恶性肿瘤的高危人群，利于该类疾病的早期诊断治疗。
[0006]目前，普遍应用的BRCA基因突变检测方法主要有以下几种：荧光定量PCR技术，该 技术灵敏度高、特异性强、自动化程度高，但是会存在样品污染、假阳性高的情况，并且每次 只能检测一种类型。限制小片段长度多态性分析法（RFLP发）用于检测酶切位点改变的基 因，可直接判断基因型，但是不能用于没有产生新酶切位点的基因检测；此外，RFLP实验操 作繁琐，检测周期长，成本高，假阳性，非闭管操作，易于污染，难以满足临床检测要求。DNA 一代测序法，两端靠近引物的序列容易测不准，且测序周期较长，操作复杂，易于污染，成本 昂贵，所以该方法很难满足实际应用的需要。
[0007] 因此，急需能够相对方便、快捷、检测周期短、针对性强、检测结果准确可靠的检测 手段。
【发明内容】
[0008] 为达到上述目的，本发明提供一种BRCA基因热点SNP位点检测组合物，该组合物 检测通量高且灵敏度特异性强，一次检测能够覆盖2000多个热点SNP位点。
[0009] 本发明的技术方案是：BRCA基因易感SNP位点检测组合物，所述BRCA基因易感 SNP位点检测组合物包括SEQ N0 :1~SEQ N0 :448的引物；
[0010] 所述SEQ N0 :1~SEQ N0 :448的引物序列见表1。
[0011] 优选的，所述BRCA基因易感SNP位点检测组合物的组成是：Master Mix 11 ill、包 含所述SEQ NO :1~SEQ NO :448引物的引物panel 5. 5 ill、待测DNA样品4. 5 ill。
[0012] 所述SEQ NO :1~SEQ NO :448引物在引物panel的浓度均为100nM。
[0013]所述 Master Mix 组成为：PCR buffer(5X)4ii 1、MgCl2l. 1、Taq 酶 1. 1、 ddH20 4 u 1 〇
[0014] 优选的，所述BRCA基因易感SNP位点检测组合物的PCR反应条件为：92~97°C 预变性3~10分钟，聚合酶链式反应扩增阶段：92~97°C变性10~20s，50~65°C退火 10~30s，70~75°C延伸10~20s，并进行10~15个循环。
[0015] 待测DNA样品采用多重PCR酶进行扩增后构建文库与上机质控品一起进行大规模 平行测序（二代测序），仪器获得的结果经数据处理和生物信息学分析，得出样本中含有的 SNP位点等信息。
[0016] 所述质控品为加入的1% control particles。是一种商品化试剂，包含在上机测 序的试剂盒PGM Sequencing 0T2kit中，作为上机测序实验的内参，对测序情况进行评估和 质控，如果测序结果中不包含1%的control particles结果，说明上机实验失败，结果不 可靠。
[0017] 所述待测DNA样品为人类基因组DNA。
[0018] 多重PCR过程同时进行阴性对照实验，所用阴性样本为正常人基因组DNA。
[0019] 待测DNA样品为人类细胞DNA、肿瘤组织基因组DNA、外周血细胞DNA、体液DNA或 排泄物细胞DNA。
[0020] 本发明的检测基因为BRCA1、BRCA2基因，包括其全部外显子和部分内含子中热点 SNP位点（见表2)。
[0021] 本发明所称的BRCA基因包含BRCA1和BRCA2基因的所有外显子和部分内含子 易感 SNP 位点，包括 BRCA1 基因位点 chrl7 :41219666(rs80357862)，BRCA2 基因 chrl3 : 32888473 (rs206115)等 2007 个易感 SNP 位点（表 2)。
[0022] 本发明组合物中的引物是针对BRCA1和BRCA2基因易感SNP位点可能的某一段序 列进行设计。引物经优化设计和修饰后，偏向性扩增的程度降低，各引物之间相互干扰性 小，特异性强，扩增效果好。这些引物以混合物形式溶解于一管中，在实验中同时加入。
[0023] 测序反应体系的组成为：DNA模板多重PCR反应、模板文库构建、上机模板准备和 富集反应、上机测序反应和测试数据处理分析。
[0024] 上机模板准备和富集反应过程包括模板油包水扩增和阳性模板富集，所述两个过 程中试剂组成包括 Ion PGM Beads、PGM Template 0T2Solutions、l% control particle 等、仪器组成主要包含Ion OneTouch和Ion OneTouch ES。上机模板准备和上机过程中 用到的试剂和耗材与Ion Torrent二代测序平台相配套，包括PGM Template 0T2kit、PGM Sequencing 0T2kit、Ion 318chip等部分。上机反应获得的数据结果通过序列筛选、拼接 和比对等方法以及生物信息学分析，最终获得测试样本的SNP位点信息。
[0025] 上机测序反应过程包括PGM测序反应过程，其原理是利用半导体技术来检测合成 过程中核苷酸掺入时释放的质子，以此测定DNA的碱基序列。
[0026] 模板文库构建过程包括末端补平修复、末端连接测序接头、模板扩增和纯化，所述 反应体系中包含〇. 2-1U末端补平酶、0. 2-1U连接酶、0. 2-1U扩增Taq酶、10_50mM测序接头 A和Pl、10-20mM测序接头A和P1通用引物、l-10XBuffer和0? 2-1. 8XAmpure纯化磁珠 等试剂。
[0027] 所述检测结果数据处理、生物信息学分析得出检测基因的特定SNP位点情况。
[0028] 测试数据处理分析包括测序数据的转换、拼接、质控和突变位点分析等过程，通过 数据的处理最终获得检测样本SNP位点的信息。
[0029] 本发明具备检测通量高、灵敏度高、特异性高的特性，灵敏度可以达到0.01%，样 本的DNA浓度可以低至0. 1-lng/ y 1。
[0030] SEQ NO :1~SEQ NO :448的引物序列如表1所示。
[0031] 表1 BRCA基因易感SNP位点检测引物序列
【主权项】
1.BRCA基因易感SNP位点检测组合物，其特征在于，所述BRCA基因易感SNP位点检测 组合物包括SEQNO:1~SEQNO:448的引物； 所述SEQNO:1~SEQNO:448引物的序列如下：
o
2. 根据权利要求1所述的BRCA基因易感SNP位点检测组合物，其特征在于，所述BRCA 基因易感SNP位点检测组合物包括：MasterMixllia、包含所述SEQN0:l~SEQN0:448 引物的引物panel5. 1、待测DNA样品4. 1。
3. 根据权利要求2所述的BRCA基因易感SNP位点检测组合物，其特征在于，所述BRCA 基因易感SNP位点检测组合物的PCR反应条件包括：首先92~97°C预变性3~10分钟； 然后聚合酶链式反应扩增阶段：92~97°C变性10~20s，50~65°C退火10~30s，70~ 75°C延伸10~20s，并进行10~15个循环。
【专利摘要】本发明公开了BRCA基因易感SNP位点检测组合物，所述BRCA基因易感SNP位点检测组合物包括SEQ NO：1～SEQ NO：448的引物。本发明能够一次检测BRCA基因两千多个易感SNP位点，对乳腺癌及卵巢癌相关易感SNP位点具有检测通量高、特异性强、不易污染、安全性高等优点，检测结果具有较好的准确性和重复性，对结乳腺癌和卵巢癌易感人群，尤其是具有这两种癌症家族遗传史的人群有一定的辅助诊断和提示作用。
【IPC分类】C12Q1-68, C12N15-11
【公开号】CN104694663
【申请号】CN201510172522
【发明人】张利清, 官民晓, 刘蕊芳, 焦淑静, 王弢, 何素莉
【申请人】玉峰惠仁生物医药科技（北京）有限公司
【公开日】2015年6月10日
【申请日】2015年4月13日