土壤中植物病原菌含量的检测方法
【技术领域】
[0001 ] 本发明涉及生物技术领域中土壤中植物病原菌含量的检测方法。
【背景技术】
[0002] 土传病害对植物危害严重。其病原微生物存在于土壤中，环境稳定、病原抗逆能 力强，难以进行化学防治。如：十字花科根肿病（Clubroot)是由专性寄生的芸薹根肿菌 (Plasmodiophorabrassicae Woronin.)引起的世界性土传病害。该病为害十字花科白菜、 油菜、甘蓝、薹菜等多种栽培品种，致使根部肿大，生长不良，萎蔫、矮化，产量和质量受损， 严重威胁十字花科作物的生产。植物土传病害发生的主要决定因子是播种前土壤中病原菌 的含量，对土壤中植物病原菌的定量检测是采取合理防治措施的基础。
[0003] 土壤中植物病原菌的检测有多种方法，如：种植感病植株、荧光显微镜检测、血清 学检测、常规PCR检测和荧光定量PCR检测等。我国不同地区的土壤类别、有机质含量和pH 值差异很大。同时，土壤中富含酚类、酯类、腐植酸、重金属离子等，影响DNA的提取和后续 的PCR反应。目前，土壤样品DNA的制备多采用试剂盒方法，土壤样品的处理量为0. 25g-lg， 其生物学代表意义差，不适合大量土壤样品检测。
【发明内容】
[0004] 本发明所要解决的技术问题是如何检测土壤中植物病原菌的含量。
[0005] 为解决上述技术问题，本发明首先提供了土壤中植物病原菌含量的检测方法。
[0006] 本发明所提供的土壤中植物病原菌含量的检测方法，包括如下S1)和S2):
[0007] S1)、用提取土壤微生物DNA的方法提取待测土壤微生物DNA，得到待测土壤微生 物DNA ;
[0008] S2)、以所述待测土壤微生物DNA为模板，用鉴定植物病原菌的成套试剂进行荧光 定量PCR，通过PCR产物的荧光强度确定所述待测土壤中所述植物病原菌的含量；所述鉴定 植物病原菌的成套试剂由鉴定所述植物病原菌的PCR引物对和探针组成；所述PCR引物对 由序列表中SEQ ID No. 1所示的单链DNA和SEQ ID No. 2所示的单链DNA组成；所述探针 的核苷酸序列如序列表中SEQ ID No. 3所示；
[0009] S1)所述提取土壤微生物DNA的方法包括如下S21)和S22)的步骤：
[0010] S21)向所述土壤中加入提取缓冲液得到细胞悬液；
[0011] S22)向所述细胞悬液中加入SDS得到细胞裂解液，所述细胞裂解液中的SDS的质 量百分比浓度为4%，裂解细胞，得到裂解液；除去所述裂解液中的杂质得到所述待测土壤 微生物DNA ;
[0012] 所述提取缓冲液由溶剂和溶质组成；所述溶剂为磷酸缓冲液，所述溶质及其浓度 为1M Tris-HC1、0.1M EDTA、1.5M NaCl、2% (质量百分比浓度）CTAB、2% (质量百分比浓 度）PVP(聚乙烯吡咯烷酮）；所述磷酸缓冲液为由溶质和溶剂组成的缓冲液，所述溶剂为 水，所述溶质为NaH 2POJP Na 2HP04，所述似112?04在所述磷酸缓冲液中的浓度为6. 8mM，所述 似2即04在所述磷酸缓冲液中的浓度为93. 2mM (即所述磷酸缓冲液中H2P04_和HP042_的浓度 之和为lOOmM)，所述磷酸缓冲液的pH为8. 0。
[0013] 上述土壤中植物病原菌含量的检测方法中，所述裂解细胞的时间可为2小时，所 述裂解细胞的温度可为65°C。
[0014] 上述土壤中植物病原菌含量的检测方法中，所述探针可标记有报告基团和荧光 淬灭基团。所述报告基团具体可为FAM或R0X ;所述荧光淬灭基团具体可为TAMARA或 Eclipse。
[0015] 在本发明的一个实施例中，所述探针的5'端标记有FAM，所述探针的3'端标记有 TAMARA〇
[0016] 上述土壤中植物病原菌含量的检测方法中，S21)可包括下述S21a)和S21b):
[0017] S21a)向所述土壤中加入所述提取缓冲液得到土壤悬液；
[0018] S21b)破碎所述土壤悬液中的土壤颗粒得到所述细胞悬液。
[0019] 上述土壤中植物病原菌含量的检测方法中，所述细胞悬液中土壤颗粒的直径在50 微米以下。
[0020] 上述土壤中植物病原菌含量的检测方法中，所述破碎所述土壤悬液中的土壤颗粒 可用德国Retsch生产的PlanetaryBall Mill PM 400仪器处理所述土壤悬液。所述处理 的时间可为5-20分钟，具体可为10分钟。
[0021] 上述土壤中植物病原菌含量的检测方法中，所述除去所述裂解液中的杂质得到所 述待测土壤微生物DNA包括S22a)和S22b):
[0022] S22a)向所述裂解液中加入PEG溶液除去所述裂解液中的杂质得到DNA溶液；
[0023] S22b)用PVPP (交联聚乙烯吡咯烷酮）除去所述DNA溶液中的杂质得到所述待测 土壤微生物DNA ;
[0024] 上述土壤中植物病原菌含量的检测方法中，所述PEG溶液由水、NaCl和PEG组成； 所述PEG溶液中所述PEG的质量百分浓度为20% -50 %，所述NaCl的浓度为1. 6M。所述 PEG具体可为PEG8000。所述20 % -50 %具体可为30 %。
[0025] 上述土壤中植物病原菌含量的检测方法中，所述S22a)包括A1)和A2):
[0026] A1)将所述裂解液进行离心，使DNA进入上清液中，收集上清液，将该上清液称为 上清液al，向所述上清液al中加入氯仿，得到含有DNA的提取液，将该提取液称为提取液 bl ；
[0027] A2)将所述提取液bl进行离心，使DNA进入上清液中，收集上清液，将该上清液称 为上清液a2,向所述上清液a2中加入所述PEG溶液，得到含有DNA的提取液，将该提取液称 为提取液b2,除去所述提取液b2中的杂质，得到所述DNA溶液；
[0028] 上述土壤中植物病原菌含量的检测方法中，所述PEG溶液的体积可为所述上清液 a2体积的1/2。
[0029] 上述土壤中植物病原菌含量的检测方法中，所述上清液a2和所述PEG溶液的反应 温度可为4°C ;所述上清液a2和所述PEG溶液的反应时间可为1小时。
[0030] 上述土壤中植物病原菌含量的检测方法中，所述除去所述提取液b2中的杂质可 包括如下步骤：将所述提取液b2进行离心，使DNA进入沉淀中，收集沉淀，将该沉淀称为沉 淀cl，向所述沉淀cl中加入体积百分比浓度为75%的乙醇水溶液，得到含有DNA的提取 液，将该提取液称为提取液b3,除去所述提取液b3中的杂质，得到所述DNA溶液。
[0031] 上述土壤中植物病原菌含量的检测方法中，所述除去所述提取液b3中的杂质可 包括如下步骤：将所述提取液b3进行离心，使DNA进入沉淀中，收集沉淀，将该沉淀称为沉 淀c2,向所述沉淀c2中加入TE buffer，得到所述DNA溶液；
[0032] 所述TE buffer由水和溶质组成，所述TE buffer的pH为8. 0,所述溶质及其浓度 为 10mM Tris-HCl、lmM EDTA。
[0033] 上述土壤中植物病原菌含量的检测方法中，所述向所述沉淀c2中加入TE buffer 的温度可为50-60°C。所述50-60°C具体可为55°C。
[0034] 上述土壤中植物病原菌含量的检测方法中，所述S22b)包括如下步骤：将所述DNA 溶液加入PVPP纯化柱中进行离心，收集流出液，得到含有DNA的提取液，将该提取液称为提 取液b4,除去提取液b4中的杂质，得到所述待测土壤微生物DNA ;
[0035] 所述PVPP纯化柱的制备方法如下：先在纯化柱底部加入一层滤纸，然后向所述纯 化柱中加入混合物A，离心，得到所述PVPP纯化柱；所述混合物A的pH为7. 0,所述混合物 A为向磷酸缓冲液甲中加入PVPP得到的混合物，所述混合物A中所述PVPP的质量百分比 浓度为20% ;所述磷酸缓冲液甲为由溶质和溶剂组成的缓冲液，所述溶剂为水，所述溶质为 NaH2P0jP Na 2HP04，所述NaH2P04在所述磷酸缓冲液甲中的浓度为57. 7mM，所述Na 2HP04在所 述磷酸缓冲液甲中的浓度为42. 3mM (即所述磷酸缓冲液甲中H2P(V和HP0广的浓度之和为 100mM)，所述磷酸缓冲液甲的pH为7. 0。所述离心可在455Xg下进行，所述离心的时间可 为1分钟。
[0036] 上述土壤中植物病原菌含量的检测方法中，所述将所述DNA溶液加入PVPP纯化 柱中进行离心可为将所述DNA溶液加入PVPP纯化柱中于2200X g下离心10-20min (如 15min)〇
[0037] 上述土壤中植物病原菌含量的检测方法中，所述除去提取液b4中的杂质包括如 下步骤：向所述提取液b4中加入Tris饱和酚，得到含有DNA的提取液，将该提取液称为提 取液b5,除去所述提取液b5中的杂质，得到所述待测土壤微生物DNA。
[0038] 所述Tris饱和酚可为北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司产品，货号为NEP038。
[0039] 上述土壤中植物病原菌含量的检测方法中，所述Tris饱和酚和所述提取液b4的 体积相等。
[0040] 上述土壤中植物病原菌含量的检测方法中，所述除去所述提取液b5中的杂质包 括如下步骤：将所述提取液b5进行离心，使DNA进入上清液中，收集上清液，将该上清液称 为上清液a3,向所述上清液a3中加入溶液A，得到含有DNA的提取液，将该提取液称为提取 液b6,除去所述提取液b6中的杂质，得到所述待测土壤微生物DNA ;
[0041 ] 所述溶液A由氯仿和异戊醇组成，所述溶液A中氯仿和异戊醇的体积比为24 :1。
[0042] 上述土壤中植物病原菌含量的检测方法中，所述溶液A和所述上清液a3的体积相 等。
[0043] 上述土壤中植物病原菌含量的检测方法中，所述除去所述提取液b6中的杂质包 括如下步骤：将所述提取液b6进行离心，使DNA进入上清液中，收集上清液，将该上清液称 为上清液a4,向所述上清液a4中加入醋酸钠水溶液和异丙醇，得到含有DNA的提取液，将该 提取液称为提取液b7,除去所述提取液b7中的杂质，得到所述待测土壤微生物DNA ;
[0044] 所述醋酸钠水溶液中醋酸钠的浓度为3M，pH值为5.2。
[0045] 上述土壤中植物病原菌含量的检测方法中，所述醋酸钠水溶液的体积可为所述上 清液a4的体积的1/10;所述异丙醇的体积可为所述上清液a4的体积的7/10。
[0046] 上述土壤中植物病原菌含量的检测方法中，所述植物病原菌可为十字花科根肿病 菌。
[0047] 本发明所要解决的另一个技术问题是如何提取土壤微生物的DNA。
[0048] 为解决上述技术问题，本发明提供了提取土壤微生物DNA的方法。
[0049] 本发明所提供的提取土壤微生物DNA的方法，为上述土壤中植物病原菌含量的检 测方法中所述提取土壤微生物DNA的方法。
[0050] 本发明所