一种从发酵液中提取和精制冠菌素的方法
【专利摘要】本发明公开了一种从发酵液中提取和精制冠菌素的方法。本发明提供了将含有冠菌素的发酵液用吸附剂吸附，得到冠菌素。本发明的实验证明了，本发明的方法采用的吸附剂稳定性好、再生容易，对冠菌素的吸附率高、吸附快、生产周期短；工艺简单，操作十分简便，条件温和，对冠菌素没有破坏作用，溶剂皆可回收利用，成本低，适用于大规模工业生产。
【专利说明】
一种从发酵液中提取和精制冠菌素的方法
技术领域
[0001]本发明属于生物化工领域，具体涉及一种从发酵液中提取和精制冠菌素的方法。
【背景技术】
[0002]冠菌素(Coronatine，以下简称C0R)是20世纪发现的一种由植物病原菌丁香假单胞菌致病变种产生的代谢产物。冠菌素具有多种调节植物生长的功能，如促进块茎的形成与膨大，抑制种子的萌发与根的生长，促进果实脱落等。但是，传统的方法从发酵液中提取冠菌素，操作繁琐，纯度低，不利于科学研究和农业生产应用，因此，提取和制备高纯度冠菌素具有非常重要的意义。
【发明内容】
[0003]本发明的目的是提供一种从含有冠菌素的发酵液提取冠菌素的方法。
[0004]本发明提供的方法，包括如下步骤:用吸附剂对含有冠菌素的发酵液进行吸附纯化，即得到冠菌素。
[0005]上述方法中，所述用吸附剂对含有冠菌素的发酵液进行吸附纯化的方法包括如下步骤:
[0006]I)将含有冠菌素的发酵液与所述吸附剂混合，收集沉淀，得到吸附冠菌素的吸附剂；
[0007]2)用所述吸附剂对应的洗脱缓冲液对所述吸附冠菌素的吸附剂进行洗脱，收集吸附洗脱液，即为冠菌素。
[0008]上述方法中，所述吸附剂为硅胶、氧化铝、活性炭、分子筛、聚合物吸附剂和生物吸附剂中的任一种或其中任意两种或三种的组合。
[0009]上述方法中，所述吸附剂对应的吸附洗脱缓冲液为乙酸乙酯、二氯甲烷、石油醚、乙酸、甲醇和乙醇中的任一种或其中任意两种或者三种的组合。
[0010]上述方法中，所述吸附剂为活性炭，其对应的吸附洗脱缓冲液为乙醇。
[0011]上述方法中，上述硅胶对应乙酸乙酯，上述分子筛对应二氯甲烷，上述活性炭对应乙醇，上述氧化铝对应甲醇。
[0012]上述方法中，上述分子筛为钠A型分子筛，上述氧化铝为中性氧化铝FCP。
[0013]上述方法中，步骤I)中，所述发酵液与所述吸附剂的加入配比为l-5g:1000L。
[0014]上述方法中，步骤2)中，所述洗脱缓冲液与所述吸附冠菌素的吸附剂的体积比为3-8:1。
[0015]上述方法中，步骤2)中，所述用吸附剂对应的洗脱缓冲液对吸附冠菌素的吸附剂进行洗脱为将所述用吸附剂对应的洗脱缓冲液浸泡所述吸附冠菌素的吸附剂2_6h，再洗脱。
[0016]上述方法中，步骤2)中，所述用吸附剂对应的洗脱缓冲液对吸附冠菌素的吸附剂进行洗脱为将所述用吸附剂对应的洗脱缓冲液浸泡所述吸附冠菌素的吸附剂3h，再洗脱。
[0017]上述方法中，所述混合的方式为10-1OOOrpm搅拌混合l-10h。
[0018]上述方法中，所述收集沉淀为在0-28°C、3000-10000g离心5-30min收集沉淀。
[0019]上述方法中，在所述吸附纯化步骤后还包括如下层析纯化的步骤:将所述吸附洗脱液经层析柱纯化，用层析洗脱缓冲液洗脱，收集层析洗脱液，得到冠菌素。
[0020]上述方法中，在所述吸附纯化步骤前还包括浓缩的步骤:将所述含有冠菌素的发酵液依次进行超滤和纳滤，收集滤液。
[0021]上述方法中，所述吸附洗脱液和所述层析柱中介质的体积比为1:30-50。
[0022]上述方法中，所述介质为硅胶。
[0023]上述方法中，所述硅胶的粒径为100-300目或200-300目。
[0024]上述方法中，所述层析洗脱缓冲液具体为如下I)或2):
[0025]I)将乙酸和乙酸乙酯-石油醚混匀，得到洗脱缓冲液，其中，乙酸在洗脱缓冲液中的体积百分含量为0.1-0.5%;乙酸乙酯-石油醚为将乙酸乙酯和石油醚按照体积比为2:1混合得到的混合液；
[0026]2)将乙酸和二氧甲烷-石油醚混匀，得到洗脱缓冲液，其中，乙酸在洗脱缓冲液中的体积百分含量为0.1-0.5%;二氧甲烷-石油醚为将二氧甲烷-和石油醚按照体积比为2:1混合得到的混合液；
[0027]上述方法中，或，所述超滤采用的膜的材质为聚醚砜树脂，其截留分子量小于5000 ο
[0028]上述方法中，或，所述纳滤采用的膜的材质为聚酰胺，其截留分子量为200-400。
[0029]上述方法中，在所述层析纯化的步骤后还包括结晶的步骤:将所述层析洗脱液进行结晶，得到冠菌素晶体。
[0030]上述方法中，所述结晶所用的溶剂为乙酸乙酯、二氯甲烷、甲醇、乙醇、丙酮和水中的一种，或者其中任意两种或者三种的组合，所述结晶所用的溶剂具体为乙酸乙酯或丙酮溶液或甲醇。
[0031]上述方法中，所述丙酮溶液为丙酮和水按照体积比为5:1混合得到的混合液。
[0032]上述方法中，所述含有冠菌素的发酵液为丁香假单胞菌发酵液。
[0033]上述方法中，或，所述丁香假单胞菌为丁香假单胞大豆致病变种(Pseudomonas.syringae pv.glycinea)MW123CGMCC N0.1276。
[0034]由上述方法制备的冠菌素也是本发明保护的范围。
[0035]上述所述冠菌素的纯度大于等于99%。
[0036]本发明的实验证明，本发明采用吸附剂分离冠菌素，稳定性好、再生容易，对冠菌素的吸附率高、吸附快、生产周期短;工艺简单，操作十分简便，条件温和，对冠菌素没有破坏作用，溶剂皆可回收利用，成本低，适用于大规模工业生产。
【附图说明】
[0037]图1为HPLC测定COR标样(A)、COR粗提样品(B)及纯化后的COR样品(C)的色谱图。
【具体实施方式】
[0038]下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
[0039]下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
[0040]下述实施例中所用的活性炭购自溧阳市东南活性炭厂，型号为DN-868。
[0041 ] 硅胶购自上海市上邦实业有限公司，型号为ZCX Π，试剂级，300-400目。
[0042]钠A型分子筛购自上海国药集团化学试剂有限公司，产品编号20027761，CAS号70955-01-0，钠A型(Φ3-5ι?πι)，球状。
[0043]中性氧化铝FCP购自上海国药集团化学试剂有限公司，产品编号20002361，CAS号1344-28-1，200-300 目。
[0044]实施例1、含有冠菌素发酵液的制备
[0045]丁香假单胞大豆致病变种(Pseudomonas.syringae pv.glycinea)CGMCCN0.1276，在本文中命名为MW123，已于2004年12月21日保存于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC %.1276(在如下专利中公开:21^200510011466.2)。
[0046]将MW123菌在GC培养基中发酵培养，得到含有冠菌素发酵液，具体操作如下:
[0047]1、种子液制备
[0048]在无菌条件下，用接种环从划线培养基挑取活化好的菌体MW123，接入液体MG培养基中，28 °C，180rpm，培养3_4天，待菌体0D6QQ> 1.2，得到种子液。
[0049]2、冠菌素发酵
[0050]将上述I得到的种子液以体积百分含量2%的接种量接种于GC培养基(GC培养基中需加入经0.22μπι滤膜过滤灭菌的Km和Sm，Km终浓度为10yg/ml，Sm终浓度为30yg/ml)，18°C，180rpm，通气量1:1(发酵液体积/空气体积.min)，灌压0.03MPa，培养10天(此时为pH降到最低值之后24h，C0R含量最高)，得到含有冠菌素的发酵液。
[0051 ] 上述GC培养基配方:
[0052]A液:甘油 18.6g，NH4Cl 1-OgjKH2PO4 4.1gjK2HPO4 3.6g,MgSO4.7H20 0.2g，KN030.3g，蒸饱水0.99L，pH 6.8，121 °C 灭菌30min。
[0053]B液:2mM FeCb 1ml，121 °C灭菌30min。
[0054]在无菌条件下，将上述A液、B液混合均匀，待液体冷却后加入经0.22μπι滤膜过滤灭菌的Km和Sm，且Km终浓度为10yg/ml，Sm终浓度为30yg/ml。
[0055]实施例2、提纯冠菌素
[0056]一、冠菌素的提取和纯化
[0057]1、发酵液的浓缩
[0058]将实施例1获得的含有冠菌素的发酵液经超滤膜(美国Koch滤膜公司，2538k328)过滤除去杂质微粒、菌体及蛋白质、核酸、色素等生)过滤除去杂质微粒、菌体及蛋白质、核酸、色素等生物大分子杂质，得到澄清的滤液;再将滤液经过纳滤膜(美国Koch滤膜公司，2538sr3d)过滤，获得冠菌素浓缩液。
[0059]上述超滤膜材质为聚醚砜树脂，孔径大小为0.0005-0.02μπι，截留分子量小于5000，操作条件为压力小于8bar，流速I.2t/h ；
[0060]上述纳滤膜材质为聚酰胺，孔径大小为0.l-10nm，截留分子量为200-400，操作条件为压力20bar，流速I.2t/h。
[0061 ] 2、吸附剂纯化
[0062]将上述I制备的冠菌素浓缩液按照硅胶质量与冠菌素浓缩液体积的比值5g: 10001加入娃胶，搅拌混勾，搅拌速度为100rpm，时间为8h ； 3000g，O °C下离心收集沉淀，得到吸附冠菌素的硅胶；
[0063]将75L吸附冠菌素的硅胶装入100L的中空玻璃柱(郑州兴华玻璃仪器厂)中，加入乙酸乙酯封住柱底浸泡3h，乙酸乙酯体积用量为硅胶体积的5倍，然后开放柱底开始自然流速洗脱，收集洗脱液，40°C，0.08MPA下旋蒸浓缩，收集浓缩液，即为吸附剂纯化后冠菌素。
[0064]3、柱层析和结晶
[0065]将上述2制备的吸附剂纯化后冠菌素流经硅胶柱纯化，吸附剂纯化后冠菌素与硅胶的体积配比为I: 30;用洗脱缓冲液洗脱，流速为lL/min，收集8个柱体积洗脱液，得到纯化后冠菌素；
[0066]上述洗脱缓冲液按照如下方法配置:将乙酸和乙酸乙酯-石油醚混匀，得到洗脱缓冲液，其中，乙酸在洗脱缓冲液中的体积百分含量为0.1%;乙酸乙酯-石油醚为将乙酸乙酯和石油醚按照体积比为2: I混合得到的混合液。
[0067]将纯化后冠菌素50g溶解在15mL乙酸乙酯中加热回流(80摄氏度)，慢慢冷却至室温析出晶体，得到冠菌素晶体。
[0068]二、冠菌素的检测
[0069]冠菌素浓度测定方法如下:
[0070](I)冠菌素标准曲线的建立
[0071]称取冠菌素标准品0.005g(购自Sigma公司，精确至0.00002g)置于50mL容量瓶中配成母液(溶剂为甲醇)，分别稀释至10011^凡、5011^凡、2511^凡、12.511^凡和6.2511^凡，用甲醇超声溶解定容摇匀，过膜备用。
[0072](2)冠菌素待测样品的配制
[0073]称取试样0.005g(精确至0.00002g)上述一制备的冠菌素晶体至50mL容量瓶中，用甲醇超声溶解定容摇匀，过膜备用。
[0074](3)冠菌素测定
[0075]按以下色谱操作条件，待仪器基线稳定后，连续进数针标准样品，至相邻两针的峰面积值相对变化在1.5%以内，按照标准溶液、试样溶液、试样溶液、标准溶液的顺序进行测定。
[0076]HPLC 条件:
[0077].流动相:甲醇+0.5%乙酸水溶液= 70+30(V+V);
[0078]?流速:1.0mL/min;
[0079]?柱温:3(TC;
[0080]?测定波长:220nm;
[0081]?进样量:5.0yL;
[0082]?保留时间:冠菌素约为4.8min;
[0083](4)冠菌素浓度计算公式
[0084]将测得的三针试样溶液中的冠菌素峰面积求平均值，带入式(I)计算得冠菌素样品含量:
[0085]y = 0.0372x-1.8614..................(I)
[0086]式中:
[0087]X—试样溶液中冠菌素峰面积的平均值；
[0088]y—试样溶液中冠菌素峰的浓度，mg/L。
[0089]收率=冠菌素晶体中冠菌素质量/发酵液中冠菌素的质量\100%
[0090]纯度=(冠菌素晶体中冠菌素质量X50mL)/0.005gXl00%
[0091]结果如图1所示。经过计算，冠菌素的收率为90%，冠菌素的纯度为99.0%。
[0092]实施例3、精制冠菌素
[0093]一、冠菌素的提取和纯化
[0094]1、发酵液的浓缩:将实施例1获得的含有冠菌素的发酵液采用实施例2的方法浓缩，得到冠菌素浓缩液。
[0095]2、吸附剂纯化
[0096]将上述I制备的冠菌素浓缩液按照钠A型分子筛质量与冠菌素浓缩液体积的比值5g: 10001加入分子筛，搅拌混勾，搅拌速度为400rpm，时间为5h; 1000g，室温下离心1min收集沉淀，得到吸附冠菌素的分子筛。
[0097]将75L吸附冠菌素的分子筛装入100L中空玻璃柱中，加入二氯甲烷封住柱底浸泡3h，二氯甲烷体积用量为分子筛体积的3倍，然后开放柱底开始洗脱，收集洗脱液，40°C，
0.09MPA下旋蒸浓缩，收集浓缩液，即为吸附剂纯化后冠菌素。
[0098]3、柱层析和结晶
[0099]将上述2制备的吸附剂纯化后冠菌素流经硅胶柱纯化，吸附剂纯化后冠菌素与硅胶的体积配比为1:40;用洗脱缓冲液洗脱，流速为lL/min，收集8个柱体积洗脱液，得到纯化后冠菌素；
[0100]上述洗脱缓冲液按照如下方法配置:将乙酸和二氯甲烷-石油醚混匀，得到洗脱缓冲液，其中，乙酸在洗脱缓冲液中的体积百分含量为0.5%； 二氯甲烷-石油醚为将二氯甲烷和石油醚按照体积比为2: I混合得到的混合液。
[0101]将纯化后冠菌素10g溶解在50mL乙酸乙酯中，室温打浆30min，抽滤得到冠菌素晶体。
[0102]二、冠菌素的检测
[0103]与实施例1的相同，结果冠菌素的收率为80%，冠菌素的纯度为99.3%。
[0104]实施例4、精制冠菌素
[0105]一、冠菌素的提取和纯化
[0106]1、发酵液的浓缩:将实施例1获得的含有冠菌素的发酵液采用实施例2的方法浓缩，得到冠菌素浓缩液。
[0107]2、吸附剂纯化
[0108]将上述I制备的冠菌素浓缩液按照活性炭质量与冠菌素浓缩液体积的比值5g:10001加入活性炭，搅拌混勾，搅拌速度为400rpm，时间为10h; 3000g，室温下离心1min收集沉淀，得到吸附冠菌素的活性炭。
[0109]将吸附冠菌素的活性炭装入100L中空玻璃柱中，加入乙醇封住柱底浸泡3h，乙醇体积用量为活性炭体积的8倍，然后开放柱底开始洗脱，收集洗脱液，50°C，0.09MPA下旋蒸浓缩，收集浓缩液，即为吸附剂纯化后冠菌素。
[0110]3、柱层析和结晶
[0111]将上述2制备的吸附剂纯化后冠菌素流经硅胶柱纯化，吸附剂纯化后冠菌素与硅胶的体积配比为I: 50;用洗脱缓冲液洗脱，流速为lL/min，收集8个柱体积洗脱液，得到纯化后冠菌素；
[0112]上述洗脱缓冲液按照如下方法配置:将乙酸和乙酸乙酯-石油醚混匀，得到洗脱缓冲液，其中，乙酸在洗脱缓冲液中的体积百分含量为0.5%;乙酸乙酯-石油醚为将乙酸乙酯和石油醚按照体积比为2: I混合得到的混合液。
[0113]将30g纯化后冠菌素在50mL丙酮水溶液(丙酮和水按体积比丙酮:水=5:1混合的溶液)中打浆lh，抽滤得到冠菌素晶体。
[0114]二、冠菌素的检测
[0115]与实施例1的相同，结果冠菌素的收率为85%，冠菌素的纯度为99.8%。
[0116]实施例5、精制冠菌素
[0117]—、冠菌素的提取和纯化
[0118]1、发酵液的浓缩:将实施例1获得的含有冠菌素的发酵液采用实施例2的方法浓缩，得到冠菌素浓缩液。
[0119]2、吸附剂纯化
[0120]将上述I制备的冠菌素浓缩液中按照中性氧化铝FCP质量与冠菌素浓缩液体积的比值Ig: 10001加入氧化招，搅拌混勾，搅拌速度为600rpm，时间为lh; 10000g，0°C下离心收集沉淀，得到吸附冠菌素的氧化铝。
[0121]将吸附冠菌素的氧化铝装入100L中空玻璃柱中，加入甲醇封住柱底浸泡4h，甲醇体积用量为氧化铝体积的8倍，然后开放柱底开始洗脱，收集洗脱液，
[0122]450C，0.09MPA下旋蒸浓缩，收集浓缩液，即为吸附剂纯化后冠菌素。
[0123]3、柱层析和结晶
[0124]将上述2制备的吸附剂纯化后冠菌素流经硅胶柱纯化，吸附剂纯化后冠菌素与硅胶的体积配比为1:40;用洗脱缓冲液洗脱，流速为lL/min，收集8个柱体积洗脱液，得到纯化后冠菌素；
[0125]上述洗脱缓冲液按照如下方法配置:将乙酸和乙酸乙酯-石油醚混匀，得到洗脱缓冲液，其中，乙酸在洗脱缓冲液中的体积百分含量为0.1%;乙酸乙酯-石油醚为将乙酸乙酯和石油醚按照体积比为2: I混合得到的混合液。
[0126]将纯化后冠菌素50g溶解在15mL甲醇中加热回流(65摄氏度)，慢慢冷却至室温析出晶体，抽滤得到冠菌素晶体。
[0127]二、冠菌素的检测
[0128]与实施例1的相同，结果冠菌素的收率为83%，冠菌素的纯度为99.5%。
[0129]现有的方法均是实施例2的一的I发酵液的浓缩，检测冠菌素浓缩液的收率为80%，冠菌素的纯度为20%。本发明是在膜浓缩的基础上提高冠菌素的纯度。
【主权项】
1.一种从含有冠菌素的发酵液提取冠菌素的方法，包括如下步骤:用吸附剂对含有冠菌素的发酵液进行吸附纯化，即得到冠菌素。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于: 所述用吸附剂对含有冠菌素的发酵液进行吸附纯化的方法包括如下步骤: 1)将含有冠菌素的发酵液与所述吸附剂混合，收集沉淀，得到吸附冠菌素的吸附剂； 2)用所述吸附剂对应的洗脱缓冲液对所述吸附冠菌素的吸附剂进行洗脱，收集吸附洗脱液，即为冠菌素。3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于:所述吸附剂为硅胶、氧化铝、活性炭、分子筛、聚合物吸附剂和生物吸附剂中的任一种或其中任意两种或三种的组合； 所述吸附剂对应的吸附洗脱缓冲液为乙酸乙酯、二氯甲烷、石油醚、乙酸、甲醇和乙醇中的任一种或其中任意两种或者三种的组合； 或，所述分子筛为钠A型分子筛，所述氧化铝为中性氧化铝FCP; 或，所述吸附剂为活性炭，其对应的吸附洗脱缓冲液为乙醇。4.根据权利要求2或3所述的方法，其特征在于: 步骤I)中，所述发酵液与所述吸附剂的加入配比为l-5g:1000L; 或，步骤2)中，所述洗脱缓冲液与所述吸附冠菌素的吸附剂的体积比为3-8:1; 或，步骤2)中，所述用吸附剂对应的洗脱缓冲液对吸附冠菌素的吸附剂进行洗脱为将所述用吸附剂对应的洗脱缓冲液浸泡所述吸附冠菌素的吸附剂2_6h，再洗脱。5.根据权利要求2-4中任一所述的方法，其特征在于: 所述混合的方式为搅拌混合1-1Oh; 所述收集沉淀为在0-28°(:、3000-1000(^离心5-301^11收集沉淀。6.根据权利要求1-5中任一所述的方法，其特征在于: 在所述吸附纯化步骤后还包括如下层析纯化的步骤:将所述吸附洗脱液经层析柱纯化，用层析洗脱缓冲液洗脱，收集层析洗脱液，得到冠菌素； 或，在所述吸附纯化步骤前还包括浓缩的步骤:将所述含有冠菌素的发酵液依次进行超滤和纳滤，收集滤液。7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于: 所述吸附洗脱液和所述层析柱中介质的体积比为1:30-50; 或，所述介质为硅胶； 或，所述硅胶的粒径为100-300目或200-300目； 或，所述层析洗脱缓冲液具体为如下I)或2): 1)将乙酸和乙酸乙酯-石油醚混匀，得到洗脱缓冲液，其中，乙酸在洗脱缓冲液中的体积百分含量为0.1-0.5%;乙酸乙酯-石油醚为将乙酸乙酯和石油醚按照体积比为2:1混合得到的混合液； 2)将乙酸和二氧甲烷-石油醚混匀，得到洗脱缓冲液，其中，乙酸在洗脱缓冲液中的体积百分含量为0.1-0.5%;二氧甲烷-石油醚为将二氧甲烷-和石油醚按照体积比为2:1混合得到的混合液； 或，所述超滤采用的膜的材质为聚醚砜树脂，其截留分子量小于5000; 或，所述纳滤采用的膜的材质为聚酰胺，其截留分子量为200-400。8.根据权利要求6或7所述的方法，其特征在于: 在所述层析纯化的步骤后还包括结晶的步骤:将所述层析洗脱液进行结晶，得到冠菌素晶体； 所述结晶所用的溶剂为乙酸乙酯、二氯甲烷、甲醇、乙醇、丙酮和水中的一种，或者其中任意两种或者三种的组合，所述结晶所用的溶剂具体为乙酸乙酯或丙酮溶液或甲醇。9.根据权利要求1-8中任一所述的方法，其特征在于: 所述含有冠菌素的发酵液为丁香假单胞菌发酵液； 或，所述丁香假单胞菌为丁香假单胞大豆致病变种(Pseudomonas.syr ingaepv.glycinea)CGMCC N0.1276。10.由权利要求1-9中任一所述方法制备的冠菌素。
【文档编号】C07C235/82GK106083640SQ201610520942
【公开日】2016年11月9日
【申请日】2016年7月5日
【发明人】段留生, 于春欣, 姜峰, 刘少金, 胡堂路, 于莎, 王春燕, 谭伟明, 李召虎
【申请人】中国农业大学