一种检测胎儿染色体数目变异的方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及染色体检测领域，尤其涉及无创检测胎儿染色体数目变异的方法。
【背景技术】
[0002] 染色体非整倍体疾病是先天性染色体数目异常引起的疾病，是引起新生儿出生缺 陷的主要疾病之一。染色体发生数目异常，将会导致许多基因的增加或缺失，破环基因的 平衡，妨碍人体相关器官的分化发育，临床表现为器官畸形、智力低下和生长发育迟缓等症 状。染色体非整倍体疾病分为常染色体非整倍体疾病和性染色非整倍体疾病。21-三体（唐 氏综合征）、18-三体（爱德华氏综合征）和13-三体（帕陶氏综合征）是三种最常见的常 染色体非整倍体疾病，在新生儿中发病率分别为1/800、1/8000和1/6000。染色体非整倍疾 病发生率与母亲怀孕年龄有相关性，如唐氏综合征的发生率随孕妇年龄变化，20岁孕妇的 胎儿发病率为〇. 07%，40岁孕妇的胎儿发病率为1 %。目前，对胎儿染色体疾病尚无有效治 疗方法，对于该病的控制目前最可行的措施是采取有效的方法进行出生前筛查与诊断来避 免患儿的出生。
[0003] 目前，唐氏筛查是医院最常用的21三体筛查方法，是通过间接检测母体血清的生 化标记物评估胎儿染色数目变异的风险，具有很高的假阳性率和漏检率。绒毛膜穿刺、羊膜 腔穿刺及经脐静脉穿刺技术是诊断胎儿染色体非整倍体疾病的金标准，但是该类方法需要 通过有创的方式获得胎儿细胞检测染色体核型，具有0. 5-1%的胎儿流产率和宫内感染率。
[0004] 1997年Lo等发现在孕妇血浆中存在游离的胎儿DNA，这为无创产前诊断技术的诞 生提供了前提。孕妇外周血胎儿游离DNA具有其独特的特点：1)在于孕妇外周血中的胎儿 DNA以小片段的形式存在，其长度较母源性分子短，绝大部分小于300bp，易于分离富集；2) 孕妇血中胎儿游离DNA在妊娠4周左右即可出现在母血中，且半衰期短，在分娩后数小时内 可从母体血中消失，不会导致先前妊娠对后续妊娠检测结果的干扰和误判；3)母血中胎儿 游离的DNA占母体血中总DNA的10-20%左右，随着孕周的增长其数量也不断地增加。胎儿 游离的DNA上述特点使其成为无创产前诊断的最佳材料。
[0005] 高通量测序技术的飞速发展为无创产前诊断技术奠定了坚实的基础。基于高通量 测序的无创DNA产前诊断技术，具有准确度高、通量高和成本低等优点。目前，illumina公 司和life technologies公司的高通量测序平台已应用于无创DNA产前诊断。这两大平 台最大的区别是测序原理不同，illumina公司测序原理是通过读取荧光信号来识别不同碱 基；而Life technologies公司的半导体测序平台是根据DNA合成时释放的电流信号识别 不同碱基。在上述高通量检测的整个流程中，高通量测序文库的制备是非常关键的一步，文 库质量的好坏将直接影响测序数据的质量，并最终影响到检测结果的准确性。illumina公 司和life technologies公司的高通量测序文库的制备都需要经过DNA片段化、末端修复、 PCR扩增完成文库的制备。人类的基因组GC含量不均一，具有复杂二级结构等因素将会影 响PCR扩增效率，使得PCR扩增会出现偏好，影响检测结构的准确性。
【发明内容】
[0006] 本发明的目的就是为了克服上述现有技术存在的问题，提供一种检测准确率高、 成本低的试剂盒及其制备方法，用于Ion Proton测序仪检测胎儿染色体数目变异。
[0007] 为了实现本发明的目的，本发明一方面提供一种用于检测胎儿染色体数目变异的 试剂盒，其特征在于，包括：对采集的外周血中的DNA进行末端补平及添加A碱基的修饰处 理的试剂I，用于使所述DNA末端补平且具有粘性；用于连接进行了修饰处理的DNA两端的 磷酸化测序接头；将进行了修饰处理的DNA两端与所述磷酸化测序接头连接在一起以便得 到连接产物的试剂II ;对所述连接产物不需要利用引物进行扩增处理，而直接进行纯化处 理得到测序文库的装置。
[0008] 其中，所述磷酸化测序接头是其下游5'端缺少A碱基并经过磷酸化修饰的。
[0009] 其中，所述磷酸化测序接头包括通用接头和Barcode接头。
[0010] 其中，所述通用接头的正反向序列为：
[0011] 5'-CCACTACGCCTCCGCTTTCCTCTCTATGGGCAGTCGGTGAT - 3'
[0012] 3,-T*T*GGTGATGCGGAGGCGAAAGGAGAGATACCCGTCAGCCACTp - 5,〇
[0013] 其中，所述Barcode接头的正反向序列可以是：
[0014] 5'-CCATCTCATCCCTGCGTGTCTCCGACTCAGCTAAGGTAACGAT-3'
[0015] 3,-T*T*GGTAGAGTAGGGACGCACAGAGGCTGAGTCGATTCCATTGCTp-5，；
[0016] 也可以是：
[0017] 5' -CCATCTCATCCCTGCGTGTCTCCGACTCAGTAAGGAGAACGAT - 3'
[0018] 3,-T*T*GGTAGAGTAGGGACGCACAGAGGCTGAGTCATTCCTCTTGCTp-5，；
[0019] 还可以是将life technologies公司的Barcode接头通过上述方法制得的其它磷 酸化的Barcode接头。
[0020] 其中，所述对采集的外周血中的DNA进行末端补平及添加A碱基的修饰处理的试 剂I包括：用于末端补平及添加A碱基的酶；用于实现并促进末端补平及添加A碱基的修 饰反应的缓冲液I;其中，所述用于末端补平及添加A碱基的酶包括T4 DNA Polymerase、 Taq和T4 Polynucleotide Kinase;其中，所述缓冲液I的pH值为8.0,溶剂为水，溶质为： 100mMTris-HCl、500mM KCl、100mM MgC12、10mM DDT 和 2.5mM dNTPs。
[0021] 其中，所述将进行了修饰处理的DNA两端与所述磷酸化测序接头连接在一起以便 得到连接产物的试剂II包括：用于将所述进行了修饰处理的DNA与所述磷酸化接头连接在 一起的酶；用于实现并促进所述连接的缓冲液II ;其中，所述用于将所述进行了修饰处理 的DNA与所述磷酸化接头连接在一起的酶是T4 DNA Ligase;其中，所述用于实现并促进所 述连接的缓冲液的口!1值为7.3，溶剂为水，溶质为：18〇11111^8-10、3〇11111%(：12、3111101'1'、 3mM ATP和1. 3M甜菜碱。
[0022] 其中，所述直接进行纯化处理得到测序文库的装置选自磁珠纯化、纯化柱纯化或 2 %的琼脂糖凝胶电泳纯化装置中的一种，优选为磁珠纯化，包括：用于盛装DNA溶液并进 行纯化处理的EP管；向所述EP管中添加的使DNA发生吸附反应的XP