专利名称：：一种检测导致自然流产的染色体数目异常的试剂盒的制作方法
技术领域：
：本发明涉及生物化学领域，具体涉及包括核酸的检测试剂。
背景技术：
：自然流产是妇产科的一种常见病，其发生率约占临床妊娠的1020%,据文献报道，直接针对流产绒毛进行细胞遗传学观察(核型分析)，在〈15孕周的自然流产中，染色体异常的发生率超过50%(5070%)。在自然流产胚胎中，非整倍体主要表现为三体型及性染色体的单体型(常染色体单体型因具有高度的致死性而极其罕见)，异常染色体核型多为16三体、21三体、18三体、13三体、15三体以及X单体型。目前国际上己报道的用于自然流产胚胎遗传学检测的方法包括核型分析(G显带法)、FISH(fluorescencein-situhybridization,荧光原位杂交)、CGH(comparativegenomichybridization,比较基因组杂交)、MLPA(nmlUplexligation-d印endentprobeamplification,多重酶联依赖性探针扩增)、互补腿(complementaryDNAs,cDNA)微阵列、QF-PCR(quantitativefluorescent—polymerasechainreaction,定量焚光RCR)六禾中。核型分析属于传统的细胞遗传学方法，优点是直观、全面，可对每一号染色体的数目异常或大的结构异常(〉5Mb)作出判断，是目前国际上通用的实验室检测方法。但该方法若用于检查自然流产胚胎(绒毛)，最大的缺陷是无法区分母源性的污染，而且因为需要进行细胞培养而对标本要求高，失败率高(按AmericanCollegeofMedicalGenetics的标准为10~40%)。同时，由于绒毛细胞培养不仅耗时(需23周)而且染色体形态较差，因而其结果的观察和判断比较依赖于技术人员的专业水准和责任心。鉴于上述缺陷，目前国内外最为常规的检査项目并不是直接进行流产胚胎的染色体检査，而是进行夫妇双方外周血染色体的核型分析(G显带法)。根据统计，外周血染色体核型分析只能为2.狄5.0%的自然流产患者找到病因，其低检出率的原闲在于该检査一般只对染色体结构畸变的自然流产具有临床意义，因为大多数由染色体结构崎变造成的自然流产，其畸变染色体是来源于携带染色体平衡易位的双亲之一；而对于占绝大多数的以非整倍体为主的染色体数目异常的自然流产而言，其诊断意义甚微，因为产生这种流产胚胎的双亲的外周血染色体一般均为正常。FISH技术出现于20世纪80年代，其原理是利用炎光标记的探针(单链DNA分子)与染色体上互补的靶序列进行杂交，经荧光显微镜在杂交位点观察所要检测的染色体区段。FISH可用于染色体数目异常与结构异常的检测，对染色体异常的检出率约为核型分析的83%，比较快捷(需23天)，但其同样无法区分母源性的污染，而且价格高昂(单一探针的价格就高达1000元左右)，限制了其广泛运用。CGH始于20世纪90年代，是一种在FISH技术的基础上发展起来的分子细胞遗传学方法。待测样本经过一次染色体原位杂交即可在全部染色体或特定的染色体区域对不同基因组间DNA序列的拷贝数进行检测。CGH所需实验时间约为l周，该检测方法需要特殊的分析软件并且价格尤其昂贵，难以在临床上开展。另外，CGH不仅无法区分母源性的污染，而且无法检出整倍体及低比例的嵌合体，只适于非整倍体及不平衡易位的检测。由于在自然流产中多倍体及嵌合体较为常见，因此CGH只能作为核型分析的辅助实验，即CGH结果正常的样本仍需进行核型分析。MLPA是一种最近几年新发展起来的基因分子杂交和PCR合为一体的基因剂量测定技术，其优点是不仅能检测缺失,也能检测基因拷贝数，可用于定性和半定量检测。其缺点是费用高昂，要求合成特异的探针，而且不易区分母源性污染。cDNA微阵列则是通过PCR扩增c咖A文库中的已知基因片断，与不同荧光标记的对照样品m咖A逆转录的cDNA片段同时杂交，对比不同标记杂交信号的变化来检测基因表达水平的变化。其优点是能高分辨地检测染色体区段或基因的缺失或重复并可同时检测许多目标序列，但缺点是需要已知的DNA片段和昂贵的设备，目前尚不适用于临床。QF-PCR是在PCR反应系统中加入一个可与DNA模板发生特异性杂交的荧光标记探针。当探针保持完整时，3'端的淬灭基团抑制5'端的发射基团的荧光发射。在PCR退火过程中，淬灭基团解除而检测到发射基团发出的荧光，而且释放的荧光基团数和PCR产物量呈一一对应关系。从理论上说，通过QF-PCR比较流产夫妇及胚胎的STR(shorttandemr印eat,短串联重复)的异同可用于区分母源性的污染，并诊断非整倍体、二倍体、嵌合体及单亲二体。这是由于在人类基因组中，STR总数大约有510万个而且分布广泛，在不同个体或不同染色体中串联的重复序列拷贝数相差悬殊，导致其形成高度的遗传多态性。除了部分同卵双生子，个体之间的STO都是互不相同的。由于高度的多态性并且能够稳定地遗传，STR成为一类有用的DNA遗传标志。DanDiego-Alvarez等选择了13,15,16,18,21,22和X染色体上的2—4个STR迸行QF-PCR扩增，然后用ABI3100遗传分析仪对扩增产物进行分析，从而获得诊断结果，该方法的诊断率为94%ApplicationofquantitativefluorescentPCRwithshorttandemrepeatmarkerstothestudyofaneuploidiesinspontaneousmiscarriages.HumReprod.2005May;20(5):1235-43。GangZou等选择了13、14、15、16、18、21、22和X染色体上共19个STR位点进行QF-PCR扩增，然后用MegaBACE1000对扩增产物进行分析，从而获得诊断结果，该方法的诊断率为98.3。/。(Quantitativefluorescentpolymerasechainreactiontodetectchromosomalanomaliesinspontaneousabortion.IntJGynaecolObstet.2008Sep22.)。上述QF-PCR方法均能对染色体非整倍体、三倍体、单亲二倍体进行诊断，并鉴别母源性污染，但是该方法受探针限制较大，荧光探针的好坏直接影响结果，比普通PCR受影响因素多，直接影响了该方法的准确率；另外，该方法需要用到的荧光探针比较昂贵，直接限制了该方法在临床上的应用，而且其结果需要特殊分析软件对荧光信号进行处理后才能判读，不适合大范围推广。
发明内容本发明要解决的技术问题是提供一种成本低、检测范围广并能区分母源性污染的检测6然流产常见染色体数目异常的试剂盒。本发明解决上述问题的技术方案是一种检测导致自然流产的染色体数目异常的试剂盒，该试剂盒是一种多重PCR试剂盒，其特征在于包括以下第17组用于检测不同STR位点的多重PCR引物，所述的17组引物如下所示第l组STR位点引物序列D2S1242CCAGCAGGATTTCTTTCTGAACA(SEQNO.1)和TGCCCTCCAGCTTTAGTGACATA(SKJNO.2)D21S11AGTCAATTCCCCAAGTGAATTGC(SEQNO.3)和TTCTCCAGAGACAGACTAATAGGAGGTA(SEQNO.4)D21S1270GAGATGGCCTGTGTCTATCCCAC(SEQNO.5)和GCCAATCCTTCGTGATAMTCACTC(SEQNO.6)D21S1411CGGATAGAAAAATAGGATGGATMA(SEQNO.7)和CAGCCTTCTAAATATTCATCCTGTTT(SEQNO.8)第2组STK位点引物序列"~D13S317GGACTCTGACCCATCTAACGCCTATC(SEQNO.9)和CCATAGGCAGCCCAMAAGACAGA(SEQNO.10)D18S535TGACAMAGCCACACCCATAACT和(SEQNO.11)ATGGTAGCCTGGCAGGCTAAGAG(SEQNO.12)D13S258CACGGAGTCATTCTTAAAATAGACAGA(SEQNO.13)和AAGACAGAGAGAGGGAATAAACCA(SEQNO.14)D18S382ATCCATCCATCCTTCCACAGATACAT(SEQNO.15)和CACCATGCCCAGGCTTTTTC(SEQNO.16)第3组STR位点引物序列D22S417ACGGCMGACCCTGTTTTGAGA(SEQNO.17)和TCCAACMGCCAGCTTTTTACC(SEQNO.18)D15S189TGCAGCGAGACTCTGCCMAAAAG(SEQNO.19)和AGGATCCCCATCTTTCCCCTTTC(SEQNO.20)D16S746CCAAAGCTTATCGGTGAGGGTCT(SEQNO.21)和CCTGGGTGACAAGAATGAAACCAGAA(SEQNO.22)D16S675GCGATATTGGCTGAGGCACATTCT(SEQNO.23)和GCCTTCCTGCCTTCCTTCCTGAC(SEQNO.24)D15S523TGCCAGCACTTGGTGMCACTATG(SEQNO.25)和GGCCAGCATCTGGGTMCATAGG(SEQNO.26)第4组STK位点引物序列^D20S438TGAGACTTGATGGGAGTATCCAGAGAG(SEQNO.27)和TGCACCACTGTACTCCAGCATGAATTA(SEQNO.28)DXS8377GCCCCAGCCTACATCTACCAC(SEQNO.29)和TGCTCCTTCGTTCCCTGTCTTCT(SEQNO.30)D2S1244GGATTACAGGCATGAGCCACTACAG(SEQNO.31)和TTCCMGAGGTGGGGMAAAAAG(SEQNO.32)第5组STR位点引物序列DXS6804TTTCCCAGATATTTTGACCACCATA(SEQNO.33)和CCCGTGGCATGTGGTTGCTATA(SEQNO.34)DXS6809TTGCTTTAGGCTGATGTGAGGAAGA(SEQNO.35)和AGCTCAGGAATACTGAGGGCATGAC(SEQNO.36)DYS389GATAGATTGATAGAGGGAGGGATA(SEQNO.37)和TCTACCTMTCTGTCAATGATTTTCTGT(SEQNO.38)第6组STR位点引物序列D15S195GGGATCACGAGAGAAGCAAAATTAA(SEQNO.39)和TCACATGGGCTAATTCCCGTA(SEQNO.40)D2IS1414TCCCCAAGTGAATTGCCTTCTATCTAT(SEQNO.41)和TCTCCAGAGACAGACTAATAGGAGGTAG(SEQNO.42)D20S431TCCAGCCTGAGTGACAGAGTGATACCA(SEQNO.43)和GGGGATATTTGGGACTCCTTGACAG(SEQNO.44)D2S1239ACCAGGTGGCCTGCATCATGCT(SEQNO.45)和GGCGACAGAGCAAGACTCCATCA(SEQNO.46)_第7组STR位点引物序列D22S343AAGGCCGAGTGGGAGTATTT(SEQNO.47)和TCTCCCCCACTTGCTGAA(SEQNO.48)D22S689ATCTAGGACATCTCAGGAGCTATCTAA(SEQNO.49)和CMAGTGAGACCCCATCTCAATC(SEQNO.50)D15S184CAGCCTTGTTGCTCACGCAAAGC(SEQNO.51)和CCTGGGTGACAGAGTGAGACTGTCAA(SEQNO.52)本发明试剂盒的7组引物中的每一组引物分别对自然流产胚胎及其父亲和母亲的STR进行多重PCR扩增，然后在非变性温度条件下用变性高效液相色谱(DHPLC)对PCR产物进行分析，所得的DHPLC图谱可反映每个STR位点的扩增情况，由此判断自然流产是否为染色体数目异常造成；其中各组引物的多重PCR扩增分别条件为第1组引物的扩增条件94。C3min,94。C30s，60。C50s,72'C30s，72'C3min，4'C保存，一共25个循环；第2组引物的扩增条件94。C3min,94'C30s，60。C50s,72'C30s，72。C3min,4'C保存,一共25个循环；第3组引物的扩增条件94'C3min，94。C30s,62。C50s，72'C30s,72'C3min，4'C保存，一共25个循环；第4组引物的扩增条件94。C3min，94。C30s，64'C50s，72。C30s,72'C3min,4'C保存,一共25个循环；第5组引物的扩增条件94。C3min,94。C30s,64。C50s,72。C30s,72。C3min，4'C保存，一共25个循环；第6组引物的扩增条件94'C3min，94。C30s，62。C50s,72。C30s'72。C3min，4t:保存，一共25个循环；第7组引物的扩增条件94。C3min,94。C30s,64。C50s,72'C30s,72。C3min，4'C保存，一共25个循环。所得PCR产物的DHPLC图谱的分析方法如下首先，根据图谱上峰的迁移时间确定其所属由于本发明试剂盒中每一对引物对应一个STR位点，所得扩增片段大小都不一样(如表l所示)，每对引物的PCR产物在进行DHPLC检测时的迁移速度都不一样，且片段大小和迁移速度成正相关，在DHPLC图谱中表现为小片段的峰出现较快，大片段的峰出现较慢，因此可从PCR产物的迁移时间对其进行定性分析，即确定DHPLC图谱中每一个峰所对应的STR位点。表l引物组别STR位点PCR产物大小(bp)PCR产物序列D2S1242171SEQNO.53第l组D21S11202SEQNO.54D21S1270274SEQNO.55D21S1411314SEQNO.56第2组D13S317136SEQNO.57D18S535183SEQNO,58D13S258211SEQNO.59<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>接着，通过分析每个位点的扩增产物判断流产是否由染色体异常造成。自然流产胚胎每个STR位点的PCR产物经DHPLC检测后在DHPLC图谱有可能表现为以下几种情况(1)若胚胎某一STR位点的扩增产物表现为峰高或面积比为接近1:1的双峰，说明该STR位点为杂合子，如果双峰的位置分别与父母双方的重合，则所在的染色体为正常；如果双峰的峰型和位置仅与双亲中的一方吻合，但其他染色体STR位点的杂合峰的位置分别与双亲重合，则可判断为单亲二倍体；(2)若胚胎某一STR位点的扩增产物表现为峰高或面积比为接近1:1:1的三峰或2:1的双峰，说明该STR位点为杂合子，所在的染色体为三体；胚胎的2:1杂合双峰或1:1:1杂合三峰中必然有一部分与父亲的位置重合，另一部分与母亲的重合，若胚胎的2:1杂合双峰中的二倍峰或杂合三峰中的两个峰的位置与母亲(或父亲)重合，则该异常染色体为母源性(或父源性)；(3)若胚胎所有染色体上STR位点的扩增产物均表现为1:1:1或者比例约为2:1的杂合峰时，则该胚胎标本为三倍体；(4)若胚胎所有的染色体上的STR位点的峰型以及出锋位置完全和母亲的重合且为女性，则所检测的"绒毛标本"不属于胚胎及其附属物，而为母体组织，即母源性污染(5)若胚胎某一STR位点为单峰说明该STR位点为纯合子，无法判断所在染色体是否正常。本发明根据STR在不同个体或不同染色体中串联的重复序列拷贝数不同而形成高度的遗传多态性这一特性，设计了一系列针对2号、13号、15号、16号、18号、20号、21号、22号、X和Y染色体中STR位点的引物，通过分析其扩增产物可以判读出非整倍体，三倍体，单亲二倍体以及区分母源性污染(但本发明试剂盒不能检测出四倍体以及平衡易位)，并可通过家系分析帮助患者査明染色体异常的来源。但是，当所检测的STR位点为纯合峰时，本发明试剂盒无法判断其所在染色体数目是否正常，为此，本发明试剂盒针对每个染色体都设计了多对引物，用以扩增同一染色体上不同的STR位点，同一染色体上的多个位点都为纯合子的概率很低，这样大大提高了本发明试剂盒的准确率。尽管同一染色体上的多个位点都为纯合子的概率很低，但仍有这样的可能，为了进一步确保本发明试剂盒的准确率，本发明试剂盒还可以含有以下第89组引物中的一组或两组-第8组ST晚点引物序列W8S1002TACCCCAGGGCAAGACAGAC(SEQNO.79)和ACCACAGGCCTCCTTTCTCTTC(SEQN0.80)D16S475CACTGCAGCAGGGGTTGACAGAG(SEQNO.81)和GGCCAGAAACTACTGGCAGGAAC(SEQNO.82)D13S634GGCAGATTCMTAGGATMATAGACAGA(SEQNO.83)和GCCAATTCCCCTATTTAGTCATCT(SEQNO.84)第9组STR位点引物序列D16S526GGAGGTGCCTTTATGGACCGTAGGT(SEQNO-85)和GCAGCGTGGGCAACAAGGAG(SEQNO.86)D13S631GGGCAACAAGAGCAAAACTCTG(SEQNO.87)和GGCCTCACCATGATTGGATCAC(SEQNO.88〉D18S386AGGAAGGAGMAGAGAGAGCGAGAG(SEQNO,89)和GGTAGAATCTACGCACCCTCTGATTT(SEQNO.90)使用本发明试剂盒中第17組引物检测自然流产胚胎，如果测出某一染色体上的几个STR位点均为纯合子，可从第89组中挑选一组或多组有检测该染色体STI位点的引物再作检测，除各组引物的扩增条件不同外，其检测步骤和判读方法均与第17组引物相同；第89组引物的扩增条件如下第8组引物的扩增条件94。C3min,94'C30s,62°C50s,72°C30s,72°C3min,4'C保存，一共25个循环;第9组引物的扩增条件94。C3rain,94'C30s，67。C50s,72t;30s，72'C3min,4'C保存，共25个循环；第89组引物的扩增产物及其大小如表2所示表2<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>本发明试剂盒中的引物均可按照常规的寡核苷酸合成方法制备。本发明试剂盒可以为临床提供10种(2号、13号、15号、16号、18号、20号、21号、22号、X和Y染色体)染色体的数目异常的分子检测和来源判断，检测范围覆盖了自然流产以及产前诊断中常见的异常染色体类型，诊断率可达83-98%。本试剂盒所对应的核心技术--DHPLC技术对检测样本的要求低(仅需100l50mg，且可以是陈旧性的胚胎样本)，灵敏度高，并依靠自动化操作的分析仪完成，可进行完备的质控，能极大地避免人工操作所带来的人为出入。通过家系分析还可以有效鉴别母源性污染减少因母源性污染所造成的误诊。同时，本发明试剂盒的检测成本仅为8元/检测位点，远远低于现有的分析技术。另外，该技术还具有高通量的特点，每天可完成80个次的检测。本发明试剂盒可用于査找自然流产的病因，为患者提供有针对性的生育指导；还可用于辅助核型分析，提高产前诊断的准确率。图1为例1的流产绒毛核型分析结果。图2为例1的第1组引物PCR产物的DHPLC谱图。图3为例2的流产绒毛核型分析结果。图4为例2的第1组引物PCR产物的DHPLC谱图。图5为例2的第2组引物PCR产物的DHPLC谱图。图6为例2的第3组引物PCR产物的DHPLC谱图。图7是例2的第4组引物PCR产物的DHPLC谱图。图8是例2的第5组引物PCR产物的DHPLC谱图。图9是例2的第6组引物PCR产物的DHPLC谱图图10为例2的第7组引物PCR产物的DHPLC谱图。图U为例2的第8组引物PCR产物的DHPLC谱图。图2为例2的第9组引物PCR产物的DHPLC谱图。具体实施例方式为了更好地理解本发明试剂盒的使用方法和技术效果，下面将通过具体的病例分析和临床统计来对本发明做进一步阐述。例l2号染色体数目异常病例1、实验材料-(1)此例标本来自于孕妇孕IO周时B超提示胚胎停止发育(无心管搏动、不能见到胎芽等)后行清宫术时所收集的绒毛标本，同时采集流产夫妇双方静脉血。(2)本发明试剂盒，其组成如下引物本发明所述第l-7组引物，由上海英俊生物技术有限公司合成。酶选用的是北京鼎国生物技术公司的Taq酶。试剂北京鼎国生物技术公司的10Xbuffer(20mMTris-HCl，10mM(NH4)2S04，2raMMgCl2，0,1%TritonX-100禾nlOmMKCl，pH8,8);TAKARA公司dNTP(各2.5mM)。2、实验方法(1)核型分析无菌取出绒毛组织15~20mg，经过粗剪，细剪，消化后加入培养基接种到培养瓶内，37°C,5°/。C02温箱内培养5-10天。提取细胞中的染色体，并经低渗、预固定、两次固定后制作成玻片，待烤干后进行常规的G显带。(2)本发明试剂盒分析a.采用本发明试剂盒第l-7组引物对父亲、母亲和胎儿DNA样本分别进行多重PCR反应，每组引物相应的反应体系如表3所示。第1组PCR反应第2组引物(10pmol/ul):d2sl242:lul，d21sll:3ul，d21sl270:lul,d21sl411:6ul，其余试剂见表3，总反应体积40ul。第2组PCR反应第2组引物(10pmol/ul):dl3s317:3ul，dl8s535:0.75ul，dl3s258:lul，dl8s382:3ul:其余试剂见表3,总反应体积35ul。第3组PCR反应第3组引物(10pmol/ul):d22S417:0.75ul，dl5sl89:0.5ul，dl6s746:3u1,dl6s675:2ul，dl5s523:3ul:其余试剂见表3，总反应体积40ul。第4组PCR反应第4组引物(10pmol/ul):d20s438:lul，dxs8377:lul，d2sl244:6ul;其余试剂见表3，总反应体积40ul。第4组PCR反应第4组引物(10pmol/ul):d20s438:lul'dxs8377:lul，d2sl244:6ul;其余试剂见表3，总反应体积40ul。第5组PCR反应第5组引物(10pmol/ul):dxs6804:3ul，dxs6809:0.7ul，dys389:4ul;其余试剂见表3，总反应体积35ul。第6组PCR反应第6组引物(10pmol/ul):dl5sl95:3ul，d21sl414:lul，d20s431:0.75ul，d2sl239:2.5ul;其余试剂见表3，总反应体积35ul。第7组PCR反应第7组引物(10pmol/ul):d22s343:4ul，d22689:0.75ul,dl5sl84:0.75ul;其余试剂见表3，总反应体积30ul。表3<table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table>b.将所得PCR产物进行DHPLC分析用DHPLC分析仪(WAVEDNAfragmentanalysissystem,Transgenomic公司)在非变性条件下对七组STR-PCR扩增产物进行分析。依据N0N-DHPLC在柱温5(TC以下DNA双链保持完整状态的特性，本试验柱温选择在50'C，进样量为8ul，洗脱液浓度梯度由WAVEMaker软件自动计算出。由于长片段DNA的P03—与TEAA分子的NH^结合紧密，故其洗脱时间延长，因此，根据洗脱峰的位置先后及高度差异通过DNA色谱柱(DNASep，Transgenomic公司)将不同长度和拷贝数的STR区分。洗脱液包括缓冲液A(0.1MTEAA)和缓冲液B(0.1MTEAA，25%乙腈)。3、结果分析(1)核型分析结果如图l所示，可见2号染色体数目异常，为三体。(2)本发明试剂盒分析-第组引物的PCR产物的DHPLC分析如图2所示，该图显示胚胎位于2号染色体的一个位点(d2s1242)两峰之间的比值是1.75:1,考虑为2三体("2三体"表示2号染色体为3条，正常人为两条)，核型表达47,XX，+2。从整个家系分析，胚胎的异常峰与父亲重合，即可判断胎儿多出的2号染色体来自于父亲，即父源性的2三体。与此同时，胚胎21号染色体的三个STR位点D21S11、D21S1270和D21S1411均未见异常，即其21号染色体为数目和来源均正常的一对同源染色体。例216号染色体数目异常病例1、实验材料此例标本来自于孕妇孕7周时B超提示胚胎停止发育(无心管搏动、不能见到胎芽等)后行清宫术时所收集的绒毛标本，同时采集流产夫妇双方静脉血。2、实验方法(1)核型分析无菌取出绒毛组织1520mg,经过粗剪，细剪，消化后加入培养基接种到培养瓶内，37'C,5%C02温箱内培养5-10天。提取细胞中的染色体，并经低渗、预固定、两次固定后制作成玻片，待烤干后进行常规的G显带。(2)本发明试剂盒分析-a.采用本发明试剂盒第l-9组引物对父亲、母亲和胎儿样本分别进行多重PCR反应第1组PCR反应第2组引物(10pmol/ul):d2sl242:lul，d21sll:3ul，d21sl270:lul，d21sl411:6ul，其余试剂见表3，总反应体积40ul。第2组PCR反应第2组引物(10pmol/ul):dl3s317:3ul，dl8s535:0.75ul,dl3s258:lul，dl8s382:3ul;其余试剂见表3，总反应体积35ul。第3组PCR反应第3组引物(10pmol/ul):d22S417:0.75ul，dl5sl89:0.5ul，dl6s746:3ul，dl6s675:2ul，dl5s523:3ul;其余试剂见表3，总反应体积40ul。第4组PCR反应第4组引物(10pmol/ul):d20s438:lul，dxs8377:lul，d2sl244:6ul;其余试剂见表3，总反应体积40ul。第4组PCR反应第4组引物(10pmol/ul):d20s438:lul，dxs8377:lul，d2sl244:6ul;其余试剂见表3，总反应体积衡l。第5组PCR反应第5组引物(10pmol/ul):dxs6804:3ul，dxs6809:0.7ul，dys389:4ul;其余试剂见表3,总反应体积35ul。第6组PCR反应第6组引物(10praol/ul):dl5sl95:3ul，d21sl414:lul,d20s431:0.75ul,d2sl239:2.5ul:其余试剂见表3,总反应体积35ul。第7组PCR反应第7组引物(10pmol/ul):d22s343:4u1,d22689:0.75ul，dl5sl84:0.75ul;其余试剂见表3，总反应体积30ul。第8组引物(10pmol/ul):dl8sl002:0.75ul，dl3s634:2ul，dl6s475:lul;其余试剂见表3,总反应体积30ul。第9组引物(10pmol/ul):dl6s526:0.75ul，dl3s631:1.5ul，dl8s386:4ul;其余试剂见表3，总反应体积35ul。b.将所得PCR产物进行DHPLC分析条件同例l:柱温选择在50'C，进样量为8ul，洗脱液浓度梯度由WAVEMaker软件自动计算出。即直接按照仪器所设置的多重条件即可。3、结果分析(1)核型分析-结果如图3所示，可见16号染色体数目异常，为三体。(2)本发明试剂盒分析-结果如图412所示。图4为第1組引物的PCR结果，图中前3个位点的扩增结果均为1:1的双峰，说明第2号染色体和第21号染色体数目正常。图5为第2组引物的PCR结果，图中第、2、4个位点均为l:l的双峰，说明第13号染色体和第18号染色体数g正常。图6为第3组引物的PCR结果，图中显示第3个位点的扩增结果为i:i:i的三峰，说明第16号染色体数目异常，为三体，且多出来的峰与母亲的重合，说明异常来源于母亲；第四个位点两个峰的比值接近于2:1再次证明了流产胚胎16号染色体为三体。图7是第4组引物的PCR结果，从第一个位点的扩增情况可判读出第20号染色体数目正常，其余两个位点的结果均为单峰，即第2号染色体和X染色体需要结合其他位点进行分析。图8是第5组引物的PCR结果，图中X染色体的扩增结果为1:1的双峰，说明X染色体数目正常，并可判断该流产胎'儿为女性。图9是第6组引物的PCR结果，图中前两个位点的扩增结果为1:1的双峰，说明第15号染色体和第21号染色体数目正常，后两个位点的扩增结果为单峰，无法判读。图10为第7组引物的PCR结果，图中前两个位点的扩增结果为1:)的双峰，说明第22号染色体数目正常。图11是第8组引物的PCR结果，第二个位点双峰峰高的比值近似于2:1，进一步验证第16号染色体数目异常，且为母源性的三体。图12为第9组引物的PCR结果，第l个位点为三个比值接近于1:1:1的三峰印证了16三体的结果，第2和第3个位点均为纯合峰，故无法判读。综合上述19组结果，该胚胎为16三体的女性胚胎，多余的16号染色体为母源性。例3本发明试剂盒的诊断率统计1、实验材料绒毛孕6-12周，B超发现胚胎停育(无心管搏动、不能见到胎芽等)后行清宫术时所收集的绒毛标本。外周血流产夫妇外周血。2、实验方法(1)本发明所选STR位点的理论杂合度的获得通过www.gdb.org数据库査找STR位点的理论杂合度。(2)本发明所选STR的实际杂合比例的统计STR实际杂合比例是通过40个流产家系(流产绒毛DNA和流产夫妇外周血DNA)共120个DNA样本经9组PCR后统计每个位点的杂合峰个数计算所的。实际杂合比例STR位点为杂合峰的个数/总样本个数。3、结果分析结果如表4所述，本发明所选引物与STR都有较高的杂合度，说明可以通过STR的杂合峰比值来分析样本待测染色体的数目。表4<table>tableseeoriginaldocumentpage14</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage15</column></row><table>注表中每个STR位点实际杂合比例是经过40对流产夫妇家系共120个DNA样本进行9组PCR/DHPLC分析后，计算出的杂合峰比例。实际的杂合比例和从GDB数据库中査到的杂合度有差异是因为不同种族与人群所造成。以13号染色体上的STR杂合比例进行说明单一D13S317位点在120个样本中杂合峰占66.4。/。，即杂合比例是0.664;同理D13S258在120个样本中杂合峰比例是58.2。/o;但是在l7组中，D13S317结合D13S258后，它们总的杂合度提高到了90.9%(注总杂合度提高的原因在丁-如果D13S317这个位点上为纯合峰，但是在D13S258这个位点上可能就是一个杂合峰，因此两个位点结合起来后实际杂合比例提高，即诊断率提高到了90.9%);同理将19组13号染色体上的四个位点进行联合检测，在120个样本中能诊断的杂合峰比例即可达到％%。同理可得出其他染色体上的STR的实际杂合比例和总的杂合比例。本发明人还利用该试剂盒对100例正常人群和40个流产家系进行了检测，并将所得结果与同步进行的核型分析结果进行了比对，两者的一致率达到100%。SEQUENCELISTING<"0>南方医科大学<120>—种检测导致自然流产的染色体数目异常的试剂盒<160>96<170>PatentInversion3.3<210><211><212><213>123■人工序列<400>1ccagcaggatttctttctgaaca23<210>2<211>23<212>DNA<213>人工序列<400>2tgccctcc3gctU3gtg3c3t323<210>3<211>23<212>■<213>人工序列<400>3agtcsattcccca3gtg33ttgc23<210>4<211>28<212>隠<213>人工序列<400>4ttctccagagac3g3ct33taggaggta28<210>5<211>23<212>■<213>人工序列<400>5gagatggcctgtgtctatcccac23<210>6<211>25<212>■<213>人工序列<400>6gccaatccttcgtgataaatcactc25<210>7<211>25<212>DNA<213>人工序列<400>7cgg3tsg33333t3gg3tgg3t33325<210>8<211>26<212>■<213>人工序列<400>8cagccttctaaatattcatcctgttt26<210>9<211>26<212>隠<213>人工序列<400>9ggactctgaccc3tct3acgcct3tc26<210>10<211>24<212>DNA<213>人工序列<400>10ccataggcagcccaaaaagaC3ga24<210>11<211>23<212>謹<213>人工序列<400>11tg3C3333gCC3C3CCC3t33Ct23<210>12<211>23<212>隱<213>人工序列<400>12atggtsgcctggc3ggct3agsg23<210>13<211>27<212>隠<213>人工序列<400>13cacggagtcattctta3aat3gacag327<210>14<211>24<212>謹<213>人工序列<400>14aagacagagagagggaataaacca24<210>15<211>26<212>DNA<213>人工序列<400>15atccatccatccttccaca'gatac3t26<210>16<2">20<212>隠<213>人工序列<400>16caccatgcccaggctttttc20<210>17<211>22<212>DNA<213>人工序列<400>17acggcaagaccctgttttgaga22<210>18<211>22<212>隠<213>人工序列<400>18tccaacaagccagctttttacc22<210>19<211>24<212>DNA<213>人工序列<400>19tgcagcgsgactctgccaaa333g24<210>20<211>23<212>隠<table>tableseeoriginaldocumentpage20</column></row><table><400>25tgccagcacttggtg33cact3tg24<210>26<211>23<212>■<213>人工序列<400>26ggccagcatctgggt33C3t3gg23<210>27<211>27<212>瞧<213>人工序列<400>27tg3gacttgatgggsgtatcC3gagsg27<210>28<211>27<212>隠<213>人工序列<400>28tgcsccactgt3Ctccagc3tgaatta27<210>29<211>21<212>暖<213>人工序列<400>29gccccagcctacatctsccac21<210>30<211>23<212>DNA<213>人工序列<400>30tgctccttcgttccctgtcttct23<210>31<211>25<212>DNA<213>人工序列<400>31gg3tt3C3ggC3tgsgcc3ct3C3g25<210>32<211>23<212>■<213>人工序列<400>32ttccaagaggtggggaaaaaaag23<210>33<211>25<212>■<213>人工序列<400>33tttcccagatattttgaccscc3ta25<210>34<211>22<212>■<213>人工序列<400>34cccgtggcatgtggttgctata22<210>35<211>25<212>隱<213>人工序列<400>35ttgctttsgg'ctgatgtgaggaaga25<210>36<211>25<212>DNA<213>人工序列<400>36agctcaggaatactgsgggcatgac25<210>37<211>24<212>DNA<213>人工序列<400>37gatagattgatagagggagggata24<210>38<211>28<212>■<213>人工序列<400>38tctacctaatctgtcaatgattttctgt28<210>39<211>25<212>DNA<213>人工序列<400>39ggg3tc3cg3g3g33gc3333tt3325<210>40<211>21<212>DNA<213>人工序列<400>40tcacatgggctaattcccgta21<210>41<211>27<212>DNA<213>人工序列<400>41tccccaagtg3attgccttctatct3t27<210>42<211>28<212>隠<213>人工序列<400>42tctccagagacagactaataggaggtag28<210>43<211>27<212>DNA<213>人工序列<400>43tcc3gcctg3gtg3c3g3gtg3tacca27<210>44<211>25<212>DNA<213>人工序列<400>44ggggstatttgggactccttg3c3g25<210>45<211>22<212>■<213>人工序列<400>45accaggtggcctgcatcatgct22<210>46<211>23<212>隠<213>人工序列<400>46ggcgacagagC33gactccatC323<210>47<211>20<212>DNA<213>人工序列<400>47aaggccgagtgggagtattt<210>48<211>18<212>DNA<213>人工序列<400>48tctcccccscttgctg33<210>49<211>27<212>隠<213>人工序列<400>493tct3gg3C3tctcaggsgct3tct33<210>50<211>23<212>隠<213>人工序列<400>50C33agtgagaccccatctc33tc<210>51<211>23<212>隱<213>人工序列<400>51cagccttgttgctcacgcaaagc23<210>52<211>26<212>DNA<213>人工序列<400>52cctgggtgsc柳gtg柳ctgtcsa26<210>53<211>171<212>隨<213>入<400>53ccagcaggatttctttctgaacagaatatagagggtgggaactttttctttttctttctt60tctUccUctUctttcUtctttcmctttctttctttctttctttctttctttcat120ttatttattttttgagacagggtctcactatgtcactaaagctggagggca171<210>54<211>202<212>DNA<213>人<400>54agtcaattccccaagtgaattgccttctatctatctatctatctgtctgtctgtctgtct60gtctgtctatctatctatatctatctatctatcatctatctatccatatctatctatcta120tctatctatctatctatctatctatctatctatcgtctatctatccagtctatctacctc■ctattagtctgtctctggag33202<210>55<211>274<212>DNA<213>人<400>55gagatggcctgtgtctatcccactgtattattcagggctacatagagaaacagaaccaat6033a3tag3tagstsgatgatagatg3t3g3tgat3gat3g3tagatagatagatagstsg120atagatagatagacagactatatataatatatatttatctcactgtatatatgtgtgtgt180atatatatgcatgtgtgtgtgtgtgtgtgtgtgtgtgtgtgtgtgtgtgtatgaagagag240agagagagtgagtgatttatcacgaaggattggc274<210>56<211>314<212>DNA<213>人<400>56cggat3gaa333tsgg3tgg3t3a3t3ga33t3gstgg3t.gggtggstgg3tgg3tgg3t3tac3t3gatg33tggstgg3tsg3tagt3aggtaggtaggt3gt3gat3gatsgatags3acaggatagatagat3g3t柳tagat3gt3ttt3ga3ggctgC3t3ggtagat3cat33at3tgatgaatgc60gg3tggatgg3tgg3tgg3tggstg33tgg120t3t333tggstgg3tggat3gat3cac3gt■tagatagatagatagatagatagatagata2403t3g3t3g3t3g3t3gst333C3ggstg33300314<210>57<211>136<212>DNA<213>人<400>57ggactctgacccatctaacgcctatctgtatttacaaatacattatctatctatctatct60atctatctatctatctatctatctatcaatcaatcatctatctatctttctgtctgtctt120tttgggctgcctatgg136<210>58<211>183<212>DNA<213>人<400>58tgacaaaagccacacccataacttttttcctctagatagacagatagatgatagatagat60sgatagstagatagstagat3g3t3gat3g3tagatagatat3g3ttctctttctctgca120ttct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及产前诊断中常见的异常染色体类型，具有灵敏度和准确度高、检测成本低等优点。文档编号C12Q1/68GK101407843SQ20081021922公开日2009年4月15日申请日期2008年11月19日优先权日2008年11月19日发明者嵘曾,丽熊申请人:南方医科大学