专利名称：唐氏综合征基因诊断新技术及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种疾病的基因诊断方法及其应用，特别是涉及一种为唐氏综合征作基因诊断的新技术及其应用。
背景技术：
人类染色体数目异常导致先天性疾病，最常见的是唐氏综合征(Down’sSyndrom，D.S.)发病率约1/800，由21号染色体多出1条引起，又称21-三体综合征。患儿智力发育迟缓，低下，有特殊面容等。此外，还有18-三体，13-三体至今无有效治疗方法。孕妇，尤其是高龄孕妇最好进行孕期筛查，筛出的高危孕妇在孕中期取羊水，进行羊水细胞培养及染色体检查，做出诊断。但染色体核型分析技术费时费力，出结果慢，对操作者技术水平要求高[1]。FISH技术(Fluoresent In Situ Hybridization)费用昂贵，操作技术要求高，存在一定的漏检率等。相比之下，分子生物学技术简便快速。基于STR-PCR的进行D.S.分子诊断的技术[1]，因要对PCR产物进行凝胶电泳分析或杂交处理，故同样存在着手工操作多，费时费力，不易质控，易造成污染等缺点。因此亟待建立一种既准确可靠，又自动化程度高，易质控，省时省力，出结果快的技术方法。Genevieve等于2003年发表了用D.C.分析结合STR原理进行等位基因定量的方法检测D.S.的一篇文章[2]，不但用到探针，且实验设计相当繁杂，工作量大，准确率还有限。Zimmermann及国内郑明明等运用基于TaqMan的F-Q-PCR技术进行D.S.的产前诊断[3，4]。尚未见到用SYBR-Q-PCR结合D.C.分析技术进行D.S.分子诊断的报道。本项专利即是利用SYBR-Q-PCR结合D.C分析技术，建立对21号染色体上目标基因进行相对定量的方法，从而对D.S做出快速诊断。
参考文献1.陈振斌，雷箴，闫梅等，用短串联重复序列诊断唐氏综合征.中华医学遗传学杂志.2004，21(2)190-1922.Genevieve PK，Lyon E.Rapia detection of Aneuploidy(Trisomy 21)by Allelequantification combined with melting curve analysis of single-nucleotidepolymorphism loci，Clin.Chemistry，2003，49(1)1087-943.Zimmermann B，Holzgreve W，Wenzel F et al.Navel real-time quantitative PCR testfor trisomy 21，Clin.Chem.2002，48362-363
4.郑明明，胡娅莉，许争峰等，实时荧光定量聚合酶链反应技术在产前诊断唐氏综合征中的应用，中华妇产科杂志，2004，39(10)678-681发明内容本发明的目的，在于提供一种利用荧光染料进行的实时PCR结合融解曲线分析(D.C.)，通过对参照基因与21号染色体上目标基因的相对定量分析确定待检21号染色体数目是否异常的唐氏综合征基因诊断新技术及其应用。
本发明的技术方案如下。
一种能对唐氏综合征做出基因诊断和产前诊断的新技术，它利用荧光染料进行的实时PCR结合融解曲线分析(D.C.)，通过对参照基因与21号染色体上目标基因的相对定量分析，确定待检21号染色体数目是否异常。
建立运用SYBY-Q-PCR和D.C分析对21号染色体上与D.S密切有关的目标基因的定量分析方法和指标，依此定出该目标基因是2份拷贝还是3份拷贝。从而对是否21-三体综合征(D.S)做出分子诊断，具体内容包括选定21号染色体上与D.S密切相关的1个目标基因，优化设计合成扩增其基因片段的引物；选定不在21号染色体上某合适的基因白蛋白基因作为参照基因，优化设计合成扩增其基因片段的引物.以上2对引物分别在不同的反应管中进行，通过比较二个SYBR-Q-PCR的ΔCT值及D.C分析，进行目标基因拷贝数的相对定量，做出是否D.S的诊断。并进行这一相对定量方法的平行性试验，变化系数之测定。
以上2对引物合在一管中进行一个2重SYBR-Q-PCR，通过ΔCT值及D.C分析进行目标基因拷贝数的相对定量，做出是否D.S的诊断；PCR热循环数对二重SYBR-Q-PCR/D.C.分析相对定量法的影响很大；并进行模板DNA量对二重SYBR-Q-PCR/D.C.分析相对定量法的影响；平行性试验，变化系数测定。
针对D.S的相对定量检测方法的建立(ΔCT-两管法)用测定参照基因的SYBY-Q-PCR-1反应管，以系列倍比稀释的正常人基因组DNA溶液作模板，进行PCR，作标准曲线(Standard，curve，S.C)。取10份已知D.S患者DNA标本，分别进行SYBY-Q-PCR1(测参照基因)及SYBY-Q-PCR2(测目的基因)，及其D.C分析，测出各标本的浓度，ΔCT＝CT目标基因-CT参照基因。以5份DNA的ΔCT值对各DNA浓度的对数值作图，计算出所得的直线斜率。该斜率＜0.1，表明该两管法相对定量是可行的，是有科学根据的。上述方法建立后，就不必每批试验都作标准曲线了。
ΔPh及ΔPa单管相对定量法的建立首先优化热循环数。以正常人DNA标本，优化2对引物的浓度和比例，以能使D.C.图谱中二个特异峰的峰高，面积都基本相同为标准。测50个正常人DNA标本，分别统计出两个特异峰的峰高，面积的平均值，SD(ΔPh±SD)n，(ΔPa±SD)n，Ph特异峰的峰高，Pa特异峰的面积，nnormal，正常人。测定5份D.S.患者DNA，分别统计出Ph21±SD，Pa21±SD；Ph Alou±SD，Pa Alou±SD。(ΔPh±SD)21，(ΔPa±SD)21，2121-三体者。预期(ΔPh±SD)21显著大于(ΔPh±SD)N；差异有统计学意义，(ΔPa±SD)21显著大于(ΔPa±SD)N差异有统计学意义。
ΔCT-单管法参见ΔCT-两管法，只不过是进行含2对引物的1管SYBY-Q-PCR.
ΔPh及ΔPa两管相对定量法的建立参见ΔPh及ΔPa单管相对定量法的建立，只不过是进行2管SYBY-Q-PCR.
图1——曲线A用SYBY-Q-PCR扩增正常人DNA 21号染色体上目标基因与Albumin基因片段的荧光曲线；图2——曲线B已知21三体患者(D.S.)DNA的荧光曲线；图3——曲线CD.C分析曲线；图4——曲线DD.C曲线。
具体实施例方式
实施例1双管相对定量法检测21号染色体数目1、Albumin gene作参照基因，引物序列，Alb15′-GCT GTC ATC TCT TGT GGGCTG T-3′；Alb25′-ACT CAT GGG AGC TGC TGG TTC-3′；2、选21号染色体上DSCR3 gene作为目标基因，引物序列，21#-15′-GTGGAG GGA AGT CAT GCA TTT-3；21#-25′-AAC ATT GAC TGT GGC TCTTGC-3。′
3、SYBY-Q-PCR反应混合物含2.5μl 10×SYBY PCR Buffer；1.5mMMgCl2；200mMdNTPs；300nM each of primer Alb1，Alb2或21#-1，21#-2；0.6U TaqDNA polymerase，50ng of DNA。总体积50μl/PCR.
4、热循环在GeneAmp 5700型或ABI 7000型等定量PCR仪上进行。95℃，10min→(95℃，15s---60℃，1min)，20～30个循环，之后进行一个60℃-95℃融解曲线分析。
5、结果用该项发明专利技术检测正常人DNA得到的荧光扩增曲线和D.C，见附图A，C；检测21-三体患者DNA所得到的荧光扩增曲线和D.C，见附图B，D。
5-1由A得出ΔCT(正常)＝CTAlbu.-CT21#＝-0.5由B得出ΔCT(D.S) ＝CTAlbu.-CT21#＝2.9可见ΔCT(D.S)显著＞ΔCT(正常)由20个正常人DNA得出ΔCT(正常)平均值±SD由10个D.S DNA得出ΔCT(D.S)平均值±SDΔCT(D.S)平均值±SD显著＞ΔCT(正常)平均值±SD，两组有显著性差异。
由此得出判断未知标本是否D.S的相对定量方法的标准。
5-2由图C，D中的峰高进行比较后得出ΔPh(D.S.)平均值±SD显著＞ΔP.h.(正常)平均值±SD，两组有显著性差异。
由此得出判断未知标本是否D.S的第二种校对定量方法及标准。
5-3类似的图C，D中，以峰的积分面积进行比较后得出ΔP.a(D.S)平均值±SD显著＞ΔP.a(正常)平均值±SD，两组有显著性差异。
由此得出判断未知标本是否D.S的第三种校对定量方法。
权利要求
1.一种唐氏综合征基因诊断新技术，其特征在于是利用荧光染料SYBRGreen1进行实时荧光PCR及融解曲线分析，通过对21号染色体上目标基因与参照基因的相对定量分析，诊断21号染色体是否三体。
2.根据权利要求1所述的唐氏综合征基因诊断新技术，其特征在于检测目标基因和参照基因的PCR可合在一管中进行，也可以分别进行；基因相对定量分析可以依据ΔCT＝CT目标基因-CT参照基因做出，也可以依据融解曲线中特定的Tm值时的峰的定量比较做出；ΔCT±SD大于ΔCT正常人±SD约1.5倍者即为21-三体综合征。
3.根据权利要求1所述的唐氏综合征基因诊断新技术及其应用，其特征在于既可用于患者基因的诊断，也可用于高危孕妇羊水细胞或孕妇外周血中胎儿有核红细胞的基因诊断。
全文摘要
本发明公开了一种能对唐氏综合征做出基因诊断和产前诊断的新技术。它利用荧光染料进行的实时PCR结合融解曲线分析(D.C.)，通过对参照基因与21号染色体上目标基因的相对定量分析，确定待检21号染色体数目是否异常。该技术可以用于患者的基因诊断和21－三体即唐氏综合征高危孕妇羊水细胞或其外周血中胎儿有核红细胞的快速基因诊断。其优点检测特异性高，准确可靠，自动化程度高，灵敏度高，无PCR产物后处理操作，省时省力。闭管操作，避免扩增产物的污染。无需荧光标记探针，成本低廉。高通量，能满足大量样本的快速筛查或检测。
文档编号C12Q1/68GK1683566SQ200510055338
公开日2005年10月19日 申请日期2005年3月17日 优先权日2005年3月17日
发明者刘敬忠 申请人:刘敬忠