专利名称：一套检测常见肠道致病菌的寡核苷酸探针及其用途的制作方法
技术领域：
本发明属于微生物检测技术、尤其是肠道致病菌的核酸检测技术范畴。本发明涉及一套能够检测李氏菌属、副溶血性弧菌、弯曲菌属、小肠结肠炎耶尔森氏菌、耶尔森氏菌属、金黄色葡萄球菌、肉毒梭菌、蜡样芽孢菌属、沙门氏菌、伤寒沙门氏菌、志贺氏菌、痢疾杆菌、产气荚膜梭菌、变形杆菌、布鲁氏菌、肠出血性大肠杆菌O157:H7和霍乱弧菌的寡核苷酸探针，该套探针的序列及用途。
背景技术：
肠道致病菌是临床上引起以腹泻、呕吐为症状传染病的主要病原体。常见的致病菌有李氏菌属、副溶血性弧菌、弯曲菌属、小肠结肠炎耶尔森氏菌、耶尔森氏菌属、金黄色葡萄球菌、肉毒梭菌、蜡样芽孢菌属、沙门氏菌、伤寒沙门氏菌、志贺氏菌、痢疾杆菌、产气荚膜梭菌、变形杆菌、布鲁氏菌、肠出血性大肠杆菌O157:H7和霍乱弧菌等十七个种属，其中蜡样芽孢杆菌、炭疽杆菌等作为一类细菌进行检出；李氏菌属主要以单增李氏菌最为常见；耶尔森氏菌属主要以鼠疫耶尔森氏菌和小肠结肠炎耶尔森氏菌为主；弯曲菌属中最为常见的是空肠弯曲菌和结肠弯曲菌。这些细菌可通过食物和饮水等途径导致大规模暴发，严重威胁人类的饮食安全和正常生活，并且给社会带来了沉重的经济负担。据世界卫生组织(WHO)不完全统计报告，2000年全球有210万人死于腹泻，大部分归因于食物和饮用水中致病菌的污染；而且尤其是近几年肠道疾病的实际发病率要比报告的病例数多300-500倍，全世界的患病者以达数亿，并且每年的统计数值都居高不下。美国每年约有7600万例肠道致病菌导致的疾病，其中有32500人住院治疗，5000人死亡；细菌污染造成的肠道疾病(食物中毒)也是我国食品安全和临床诊断中最突出的问题。据国家卫生部统计，2000年共收到重大食物报告达150起，中毒6237人死亡135人；2001共发生重大食物中毒事件185起，15715人中毒，146人死亡。这些由于多种致病菌导致的肠道疾病影响的国家范围之广、危急健康人群之多都是其他原因引起疾病所不及的。
16S rRNA和23S rRNA在细菌的分类鉴定学上具有重要的生物学意义，在生物进化过程中比其他基因演变得慢，真细菌的16S rRNA和23S rRNA保守性强，被称之为“细菌进化的活化石”。但是这种保守性也是相对的，也就是说在16S rRNA和23S rRNA序列上存在着每种细菌特异性的片段。通过对各种细菌的16S rDNA和23S rDNA序列进行比对的结果发现其上的序列可变区和恒定区是交错排布的。因此本专利中分别在16S rDNA和23S rDNA序列上选取的一对引物作为通用引物，在其间选取特异性序列作为探针，对上述十七个种属的细菌进行鉴别。
细菌性痢疾是由痢疾杆菌导致的一种疾病。在临床上病历较多，且传染性强。ipaH是大质粒上编码侵袭质粒抗原H的一段基因，其特异性的存在于痢疾杆菌中，包括志贺氏菌属的四种致病菌和侵袭性大肠杆菌，因此针对ipaH设计引物和探针，可以对细菌性痢疾进行鉴别。
沙门氏菌是一种在临床上常见的肠道致病菌，根据临床症状和生化特征分为伤寒沙门氏菌和肠炎沙门氏菌等。其中伤寒沙门氏菌是该菌属中最具有代表性的，它可以导致伤寒热，在临床上症状不是很明显，这就给诊断带来一定的麻烦；而且它还是生物反恐任务中的重要项目。VipR是位于伤寒沙门氏菌染色体ViaB区域中的一种编码调控Vi抗原表达的基因，与其他肠道致病菌中的序列进行对比，具有很高的特异性。因此选取该基因作为检测的目的片段，设计引物和探针，在经过16S rDNA序列上的探针鉴定为沙门氏菌的前提下，进一步对伤寒沙门氏菌进行甄别。
长期以来，对于肠道致病菌的实验室金标准鉴定手段还停留在培养、血清和生化方面等传统的细菌学检测水平，步骤繁琐且需要数天才能得到结果，在一定的程度上限制了对肠道致病菌的快速鉴定，也给临床治疗带来诸多不便。免疫学方法的应用缩短了实验操作的时间，但是该方法也存在其实验样品的特殊性以及结果的假阳性率偏高等问题。近年来，PCR和核酸杂交技术的应用以其操作简单、快速和结果直观等特点极大地促进了细菌检测技术的发展。对于将多数量的肠道致病菌同时进行鉴定的要求，目前常用的方法都无法达到。因此DNA芯片技术以其特有的优势被应用到了肠道致病菌的检测鉴定中。
DNA芯片(DNA microarrays)是近年来发展成熟的一种高通量基因检测技术，是分子生物学发展史上的又一重大技术突破，其特点是实验操作和数据处理的集成化、微型化、自动化。DNA芯片的一个主要用途是多基因平行检测，是一种发展前景广阔的多基因大规模检测新技术。DNA芯片技术检测的关键之处在于设计、筛选一系列高特异性、高灵敏度、高稳定性的匹配探针，固定于玻璃片等固相载体上，利用样品与探针的杂交反应，经扫描、分析后即可得出正确的结果。就本实验而言，通过一次实验操作就可确定样品中肠道致病菌的种类，极大地提高了检测效率，为临床诊断及食品鉴定提供了简便、快捷的技术手段。
发明内容
本发明提供了一套用于检测常见肠道致病菌的寡核苷酸探针，包含以下各组探针的全部或为部分探针的组合，各部分的探针长度在25-50碱基之间。
a.金黄色葡萄球菌的16S rDNA基因检测探针b.李斯特氏菌属的16S rDNA基因检测探针c.肠出血性大肠杆菌O157:H7的23S rDNA基因检测探针
d.霍乱弧菌的16S rDNA基因检测探针e.耶尔森氏菌属的16S rDNA基因检测探针f.小肠结肠炎耶尔森氏菌的16S rDNA基因检测探针g.沙门氏菌属的16S rDNA基因检测探针h.伤寒沙门氏菌的对Vi抗原表达基因ViaB起到正调控作用的基因VipR检测探针i.志贺氏菌属的16S rDNA基因检测探针j.痢疾杆菌的大质粒上编码侵袭质粒抗原H基因ipaH检测探针k.副溶血性弧菌的16S rDNA基因检测探针l.副溶血性弧菌的23S rDNA基因检测探针m.志贺氏菌属、沙门氏菌属和大肠杆菌共有的16S rDNA基因检测探针n.产气荚膜梭菌的16S rDNA基因检测探针o.弯曲菌属的16S rDNA基因检测探针p.变形杆菌的16S rDNA基因检测探针q.蜡样芽孢菌属的16S rDNA基因检测探针r.肉毒梭菌的16S rDNA基因检测探针s.真细菌通用的16S rDNA基因检测探针t.布鲁氏菌的16S rDNA基因检测探针本发明还提供了各部分探针的核苷酸序列，详见表1-1。还提供了一套可以同时检测常见肠道致病菌的寡核苷酸探针，包含上述a～t二十个部分。
本发明通过优选，进一步提供了一套特异性好，灵敏度高的探针，其中a探针为SA5，b探针为LI2和LI3，c探针为O157:H7-1和O157:H7-2，d探针为VC1，e探针为YE1，f探针为ye-2e，g探针为SHI1，h探针为V2和V3，i探针为SAL1，j探针为I-1和I-2，k探针为VP1，1探针为VP23，m探针为SS5，n探针为CP-new-1，o探针为Cam-5，p探针为PR-2，q探针为B-6，r探针为CB-1，s探针为common-2-1和common-3-1，t探针为Bru-2。
此外，本发明还提供了上述寡核苷酸探针的用途，利用一套探针可通过核酸杂交反应对样品中的常见肠道致病菌进行检测，尤其适用于基于基因芯片技术的检测。利用探针还可以在鉴定出沙门氏菌和志贺氏菌的同时，进一步确定出是否为伤寒沙门氏菌和痢疾杆菌。
具体的说，本发明内容是这样实现的根据选取的近三十种肠道致病菌及其相关近源种属的16S rDNA、23S rDNA的全序列(每种菌至少要三种不同的Genebank序列号，以免所选区域个别碱基出现差别)，使用clustalx1.8.msw Alignment程序将从Genebank的核酸数据库中检索到的近三十种细菌的16S rDNA、23S rDNA基因序列进行比对，得到碱基对齐图和聚类分析的结果。根据碱基对齐图可以划分出16S rDNA、23S rDNA基因中的保守区和差异较大的变化区，然后再使用primer5.0软件在保守区寻找通用引物，在变化区寻找特异性的探针，使得各个探针的Tm值及两对引物间的Tm值基本相同。然后分别在痢疾杆菌(包括志贺氏菌属内的四种致病菌和侵袭性大肠杆菌)的大质粒上编码侵袭质粒抗原H基因(ipaH)上和伤寒沙门氏菌的对Vi抗原表达基因ViaB起到正调控作用的基因(VipR)上设计引物和探针，共设计91条寡核苷酸探针，探针长度在25-50碱基之间。寡核苷酸探针序列与上述基因特定区域DNA正链的碱基序列一致(探针序列见表1-1)。
利用上述的一套探针，可以通过杂交反应对样品中的相应病原菌进行检测，尤其适用于基于DNA芯片原理的检测，具有较高的灵敏度和特异性。在进行基于DNA芯片原理的检测时，需要把探针全部或其中一部分用适当的方法固定于固向载体上(如玻璃片、硅基片、聚丙烯膜、硝酸纤维素膜、尼龙膜等)，成为M×N排布的探针阵列，即为DNA芯片。然后利用优化的相应的PCR引物扩增待检样品中的致病菌，选择引物的要求是能够扩增出所有细菌的包含探针所在区域的片段。在扩增的同时引入荧光标记、生物素标记或其他合适的标记物。扩增产物作为探针检测的靶分子，在一定条件下与芯片共保温30分钟至数小时，利用荧光扫描仪或其他相应的检测设备即可以检测到杂交信号。根据探针出现信号的位置可以判定出样品中致病菌的种类。
除了基于DNA芯片原理的检测外，这套探针也可以用于基于反相斑点杂交的检测首先将探针固定于合适的载体上，提取待检细菌核酸，并对细菌的核酸进行标记，然后，将标记好的核酸与载体上的探针进行杂交反应，最后，提供合适的仪器设备进行检测。
本发明提供的探针能够快速、准确、高效地检测出样品中的致病菌的种类。如果制备成相应的试剂盒，可以广泛用于临床细菌感染性疾病的诊断、抗菌素筛选、环境监测与评价、卫生监督与食品检疫、细菌学分类、流行病学调查等方面。
图1为致病菌16S rDNA引物PCR产物电泳检测结果。1DL2000 Marker，2单增李氏菌，3空肠弯曲菌，4小肠结肠炎耶尔森氏菌，5霍乱弧菌，副溶血性弧菌，7变形杆菌，8金黄色葡萄球菌，9腊样芽孢杆菌，10产气荚膜梭菌，11志贺氏菌，12沙门氏菌。
图2为致病菌23S rDNA引物PCR产物电泳检测结果。1100bp DNA Ladder Marker，2单增李氏菌，3空肠弯曲菌，4小肠结肠炎耶尔森氏菌，5霍乱弧菌，6副溶血性弧菌，7变形杆菌，8金黄色葡萄球菌，9腊样芽孢杆菌，10产气荚膜梭菌，11志贺氏菌，12沙门氏菌。
图3为16S rDNA、ipaH和23S rDNA、vipR二重PCR结果。1伤寒沙门氏菌23S rDNA引物扩增结果，2伤寒沙门氏菌vipR引物扩增结果，3伤寒沙门氏菌23S rDNA和vipR引物二重PCR扩增结果，4DL2000 Marker，5-9痢疾杆菌(志贺氏菌属四种细菌和侵袭性大肠杆菌)16S rDNA、ipaH二重PCR扩增结果，10痢疾杆菌ipaH引物扩增结果，11痢疾杆菌16S rDNA引物扩增结果。
图4为十七种肠道致病菌检测基因芯片探针排列位置。
图5为基因芯片分别与十七种肠道致病菌及其他阴性细菌的荧光标记PCR产物杂交结果。其中伤寒沙门氏菌和痢疾杆菌杂交图均系二重PCR扩增产物杂交结果。
具体实施例方式为了进一步说明一套用于同时检测上述十七个种属常见肠道致病菌寡核苷酸探针的实施方式和用途，参照以下实施例进行说明。实施例是为了解释而不是以任何方式限制本发明的范围，本领域技术人员在权利要求的范围内所做出的某些改变和调整也应认为属于本发明的范围。
实施例1.检测十七个种属肠道致病菌的寡核苷酸探针的筛选和优化1.检测十七个种属肠道致病菌的寡核苷酸探针的设计探针分别设计在细菌16S rRNA和23S rRNA以及痢疾杆菌中大质粒上编码侵袭质粒抗原H(ipaH)和伤寒沙门氏菌调控Vi抗原表达等基因序列上，具有较高的灵敏度和特异性，寡核苷酸探针序列与上述基因特定区域DNA正链的碱基序列一致(探针序列见表1-1)。探针长度在25-50碱基之间。探针合成时在其3’端氨基修饰，用于探针与载玻片表面的活性醛基发生反应并固定到载体表面。
表1-1检测常见肠道致病菌的寡核苷酸探针备选序列探针 探针序列 探针长名称 (5’-3’) 度(BP)SA1aac gga cga gga gct tgc ttc tct gat gtt agc33SA2caa aag tga aag acg gtc ttg ctg tca ctt ata ga 35SA3aaa ctc tgt tat tag gga aga aca tat gtg taa gta36SA4gtg cac atc ttg acg gta cct aat cag aaa gcc acg36
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表1-2用于扩增含有探针序列靶基因片段的引物序列基因引物序列(5’---3’) 产物长度 备注名称 (bp)16S rDNAcgc tgg cgg cag gcc taa cac atg c500 正向引物cgc ggc tgc tgg cac gga gtt agc c反向引物23S rDNAtta aat gat ggc tgc ttc taa gcc 500 正向引物acc gat agt gaa cca gta ccg tga g反向引物ipaHgtt cct tga ccg cct ttc cga tac 330 正向引物gag agt tct gac ttt atc ccg 反向引物VipRggt ttc atc att tct ggc ctc cg 337 正向引物ctc tgc tcc gtc aag atc ttt tca cc 反向引物3.寡核苷酸基因芯片的制备和探针的筛选优化将备选寡核苷酸探针纯化、定量后，用基因芯片点样仪点到醛基活化的载玻片上，制成探针微阵列。用荧光标记的PCR扩增产物与基因芯片杂交，得到各探针的杂交图。针对不同病原菌的基因片段，根据芯片杂交结果选择各自特异性好，灵敏度高的探针。筛选得到的探针序列见表1-3。
表1-3检测常见肠道致病菌的寡核苷酸探针优化序列探针探针序列 探针长度名称 (BP)SA5 aca tat gtg taa gta act gtg cac atc ttg acg gta 36LI2 tgt tgt tag aga aga aca agg ata aga gta act gct 36LI3 tag aga aga aca agg ata aga gta act gct tgt ccc 36VC1 cag cac aga gga act tgt tcc ttg ggt ggc gag 33YE1 gcg gca gcg gga agt agt tta cta ctt tgc cgg 33ye-2ecat aaa ggt taa taa cct ttg tga ttg acg t 31SHI1 ggg agt aaa gtt aat acc ttt gct cat tga 30V-2 ctt caa taa tgc cag cag ctc caa ccc cga aat aga ta38
V-3aca ggc tgt agc gat tta ggt tca caa aca aat aat tt 38SAL1 ggt gtt gtg gtt aat aac cgc agc aat tga 30I-1gaa ggc ctt ttc gat aat gat acc ggc gct ctg ctc tcc c 40I-2gga ccg tgt cgc gct cac atg gaa caa tct ccg gaa aac cct 42VP1aaa cga gtt atc tga acc ttc ggg gaa cga taa cgg 36VP23 ggt acg cag tca cag gac aaa gcc 24H7-1 gca gtc acc cca taa aag agg ct 23H7-2 tca ccc cat aaa aga ggc tcc cac tgc 27SS5ggt ttc agg ttc ttt ttc act ccc ctc gcc g 31CP-new-1 atg gca tca tca ttc aac caa agg agc aat ccg cta tga gat gga 48cccCam-5 ctc ctt ttc tta ggg aag aat tct gac ggt acc taa gga at 41pr-2 cga gcg gta aca gga gaa agc ttg ctt tct tgc tga 36CB-1 tat aag aga atc gca tga ttt tct tat cca aag att tat 39com21 act gag aca cgg tcc aga ctc cta cgg gag gca gca gta ggg aat 49attgcom31 cac act gga act gag aca cgg tcg aga ctc cta cgg ga 38Bru-2 cgt acc att tgc tac gga ata act cag gga aac ttg tg 38B-6tgc tag ttg aat aag ctg gca cct tga cg 29实施例2.寡核苷酸探针的特异性和灵敏度评价1.基因芯片制备 将寡核苷酸探针用点样液(6×SSC，0.1％SDS)稀释至终浓度50μmol/L，取5ul转移至384孔板。用Cartesian芯片制备仪将探针点到醛基片上(探针排列见附图4，芯片分别与十七个种属肠道致病菌的荧光标记PCR产物杂交结果见附图5)。在该探针微阵列中，以荧光引物的反向互补序列作为阳性对照，以无关随机序列作为阴性探针对照，以不含探针的空白点样液做为阴性对照。探针序列见表2-1。
表2-1常见肠道致病菌的检测基因芯片探针序列探针名称 探针序列探针长度(BP)SA5aca tat gtg taa gta act gtg cac atc ttg acg gta36LI2tgt tgt tag aga aga aca agg ata aga gta act gct36
LI3 tag aga aga aca agg ata aga gta act gct tgt ccc 36VC1 cag cac aga gga act tgt tcc ttg ggt ggc gag 33YE1 gcg gca gcg gga agt agt tta cta ctt tgc cgg 33ye-2e cat aaa ggt taa taa cct ttg tga ttg acg t 31SHI1 ggg agt aaa gtt aat acc ttt gct cat tga 30V-2 ctt caa taa tgc cag cag ctc caa ccc cga aat aga ta 38V-3 aca ggc tgt agc gat tta ggt tca caa aca aat aat tt 38SAL1 ggt gtt gtg gtt aat aac cgc agc aat tga 30I-1 gaa ggc ctt ttc gat aat gat acc ggc gct ctg ctc tcc c 40I-2 gga ccg tgt cgc gct cac atg gaa caa tct ccg gaa aac cct 42VP1 aaa cga gtt atc tga acc ttc ggg gaa cga taa cgg 36VP23 ggt acg cag tca cag gac aaa gcc 24H7-1 gca gtc acc cca taa aag agg ct 23H7-2 tca ccc cat aaa aga ggc tcc cac tgc 27SS5 ggt ttc agg ttc ttt ttc act ccc ctc gcc g 31CP-ncw-1 atg gca tca tca ttc aac caa agg agc aat ccg cta tga gat 48gga cccCam-5 ctc ctt ttc tta ggg aag aat tct gac ggt acc taa gga at 41pr-2 cga gcg gta aca gga gaa agc ttg ctt tct tgc tga 36CB-1 tat aag aga atc gca tga ttt tct tat cca aag att tat 39com21 act gag aca cgg tcc aga ctc cta cgg gag gca gca gta ggg 49aat attgcom31 cac act gga act gag aca cgg tcg aga ctc cta cgg ga 38Bru-2 cgt acc att tgc tac gga ata act cag gga aac ttg tg 38B-6 tgc tag ttg aat aag ctg gca cct tga cg 29阴性探针对照 ccg ctg tat cac aag ggc tgg tac c 25阵列探针对照 荧光引物反向互补序列253.肠道致病菌寡核苷酸芯片特异性检测在优化好的两套二重PCR扩增和杂交反应条件下，检测了146株不同血清型的标准肠道致病菌。其中所包括的常见肠道致病菌大肠杆菌O157H7W933、882364；侵袭性大肠杆菌48017、大肠杆菌、霍乱弧菌O139、O1型、金黄色葡萄球菌6538、沙门氏菌、耶尔森氏菌、蜡样芽胞杆菌、志贺氏菌、李斯特氏菌、假单胞菌、变性杆菌、布鲁氏菌、弯曲杆菌、产气荚膜梭菌、副溶血性弧菌、枸橼酸杆菌、爱德华氏菌、创伤弧菌、克雷伯氏菌、沙雷氏菌等共146株。以细菌DNA为模板进行两套二重PCR扩增，产物与芯片杂交。其中除阳性对照探针common21和common31在全部细菌的杂交结果中出现信号外，其他出现信号的探针均与其杂交的细菌对应，而一些阴性细菌的杂交则无任何信号产生(见表2-2)。这说明所选取的用于鉴别上述十七种肠道致病菌的探针是特异的，也说明本实验建立在两套二重PCR基础上，同时定性检测十七个种属肠道致病菌的基因芯片是可靠的。
以上实施例的技术要点如下1.寡核苷酸合成寡核苷酸(引物或探针)采用标准亚磷酰胺化学方法在自动合成仪(ABI8909)上合成。所有荧光引物在合成中用Cy3亚磷酰化试剂在5’端进行标记。所有寡核苷酸探针在3′端进行氨基修饰，氨基与探针序列之间以间隔臂(聚乙二醇磷酰化试剂)相连。合成完毕用浓氨水55℃作用15小时脱保护/切割，OPC柱纯化。紫外定量，冻存备用。
2.多重PCR扩增20ul常规PCR反应体系中，正、反向引物浓度均0.5μM，dNTP为100μM，1U Taq DNA聚合酶，1×PCR反应缓冲液，50-100ng模板DNA；扩增条件为预变性(94℃，5min)；35个循环变性(94℃，30sec)，退火(56℃，30sec)延伸(72℃，30sec)；延伸(72℃，5min)；4℃，∞。
多重不对称PCR反应中，四对引物之间浓度的改变对目的基因的扩增效率有明显的影响，每个基因的正向与反向荧光引物的比例和杂交信号的强弱密切相关。经过多次实验优化，使一个反应管中四个产物均能达到相近而且较好的扩增效率和杂交信号。优化的结果为两套二重PCR反应中16S rDNA、ipaH和23S rDNA、vipR基因的正向引物浓度分别为0.25μM、0.25μM，反向荧光标记引物浓度分别为0.75μM、0.75μM。20ul反应体系中，dNTP为200μM，MgCl2为3mmol，2U TaqDNA聚合酶，1×PCR反应缓冲液；扩增条件为预变性(94℃，5min)；40个循环变性(94℃，30sec)，退火(56℃，30sec)延伸(72℃，30sec/)；延伸(72℃，5min/)。
3.常见肠道致病菌寡核苷酸芯片制备 寡核苷酸探针用点样液(6×SSC，0.1％SDS)稀释至终浓度50μmol/L，取5ul转移至384孔板。用Cartesian芯片制备仪将探针点到醛基片(Telechem)上，点样仪内保持温度为23℃，相对湿度大于85％。寡核苷酸芯片制备完毕后，置于载玻片盒内室温放置备用。点样后的芯片在使用前至少在室温放置24h。
4.常见肠道致病菌寡核苷酸芯片杂交与检测4.1寡核苷酸基因芯片预处理 寡核苷酸芯片用0.2％SDS清洗2次，接着以水清洗2次，晾干后用于杂交。
4.2杂交和杂交后处理 荧光标记的PCR产物变性(98℃、5min，冰浴、5min)后与杂交液(5×SSC，5％甲酰胺，0.1％SDS)混匀，取12μ1转移至芯片反应区，芯片置于杂交盒内，连同杂交盒浸入50℃水浴中反应60分钟，杂交后的芯片依次在洗液A(1×SSC，0.2％SDS)，洗液B(0.2×SSC)和洗液C(0.1×SSC)中于室温各洗涤1min。置室温晾干。
4.3扫描和结果判定 芯片用芯片扫描仪GenePix 4000B进行扫描，用GenePix Pro 4.0软件分析结果。
表2-2应用基因芯片检测146株肠道菌结果
序列表<110>中国人民解放军军事医学科学院放射医学研究所<120>一套用于检测常见肠道致病菌的寡核苷酸探针及其用途<160>91<210>1<211>33<212>DNA<213>人工序列<400>1aac gga cga gga gct tgc ttc tct gat gtt agc 33<210>2<211>35<212>DNA<213>人工序列<400>2caa aag tga aag acg gtc ttg ctg tca ctt ata ga 35<210>3<211>36<212>DNA<213>人工序列<400>3aaa ctc tgt tat tag gga aga aca tat gtg taa gta 36<210>4<211>36<212>DNA<213>人工序列<400>4gtg cac atc ttg acg gta cct aat cag aaa gcc acg 36<210>5<211>36<212>DNA<213>人工序列<400>5aca tat gtg taa gta act gtg cac atc ttg acg gta 36<210>6<211>36<212>DNA<213>人工序列<400>6tga cta ctt gta agc aca cgg ttt cag gtt cta ttt 36
<210>7<211>33<212>DNA<213>人工序列<400>7aat att ttg aac cgc atg gtt caa aag tga aag 33<210>8<211>18<212>DNA<213>人工序列<400>8tac gac caa ata cta aac 18<210>9<211>20<212>DNA<213>人工序列<400>9caa taa tca tca ctt gag gc 20<210>10<211>33<212>DNA<213>人工序列<400>10aac gga gga aga gct tgc tct tcc aaa gtt agt 33<210>11<211>36<212>DNA<213>人工序列<400>11tgt tgt tag aga aga aca agg ata aga gta act gct 36<210>12<211>36<212>DNA<213>人工序列<400>12tag aga aga aca agg ata aga gta act gct tgt ccc 36<210>13<211>22<212>DNA<213>人工序列<400>13
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<212>DNA<213>人工序列<400>20ggg agt aaa gtt aat acc ttt gct cat tga 30<210>21<211>24<212>DNA<213>人工序列<400>21ctg gcc tcc gaa tga tat cta ttt 24<210>22<211>38<212>DNA<213>人工序列<400>22tat cta ttt cgg ggt tgg agc tgc tgg cat tat tga ag 38<210>23<211>38<212>DNA<213>人工序列<400>23aca ggc tgt agc gat tta ggt tca caa aca aat aat tt 38<210>24<211>25<212>DNA<213>人工序列<400>24cgt tat cat ttc aag ttc gcg act a 25<210>25<211>33<212>DNA<213>人工序列<400>25cgg caa cat cag tcc agg ata tta tca gaa atg 33<210>26<211>30<212>DNA<213>人工序列<400>26ggt gtt gtg gtt aat aac cgc agc aat tga 30
<210>27<211>40<212>DNA<213>人工序列<400>27gaa ggc ctt ttc gat aat gat acc ggc gct ctg ctc tcc c 40<210>28<211>42<212>DNA<213>人工序列<400>28gga ccg tgt cgc gct cac atg gaa caa tct ccg gaa aac cct 42<210>29<211>28<212>DNA<213>人工序列<400>29agt ctt tcg ctg ttg ctg ctg atg cca c 28<210>30<211>35<212>DNA<213>人工序列<400>30cct ctg cgg agc ttc gac agc agt ctt tcg ctg tt 35<210>31<211>35<212>DNA<213>人工序列<400>31ata ccg tct ctg cac gca ata cct ccg gat tcc gt 35<210>32<211>32<212>DNA<213>人工序列<400>32tcc gga ttc cgt gaa cag gtc gct gca tgg ct 32<210>33<211>23<212>DNA
<213>人工序列<400>33gca gtc acc cca taa aag agg ct 23<210>34<211>27<212>DNA<213>人工序列<400>34tca ccc cat aaa aga ggc tcc cac tgc 27<210>35<211>26<212>DNA<213>人工序列<400>35act cct gct taa cac aag ttg agt ag 26<210>36<211>24<212>DNA<213>人工序列<400>36tcg gtg tag gat gag act ata tag 24<210>37<211>40<212>DNA<213>人工序列<400>37act cct gct taa cac aag ttg agt agg gaa agt ttt tcg g 40<210>38<211>27<212>DNA<213>人工序列<400>38ggt ata gtt aat ctg ccc tac aca aga 27<210>39<211>41<212>DNA<213>人工序列<400>39ctc ctt ttc tta ggg aag aat tct gac ggt acc taa gga at 41
<210>40<211>32<212>DNA<213>人工序列<400>40act cct gct taa cac aag ttg agt agg gaa ag 32<210>41<211>36<212>DNA<213>人工序列<400>41gat ttg cct gta taa cct cct acg acc tta gac tag 36<210>42<211>29<212>DNA<213>人工序列<400>42cgg agt aaa tcc taa tac aaa gct aac ca 29<210>43<211>31<212>DNA<213>人工序列<400>43ttc tat cca tcc gaa gac ttc aaa aag cct t 31<210>44<211>40<212>DNA<213>人工序列<400>44act cct gct taa cac aag ttg agt agg gaa agt ttt tcg g 40<210>45<211>33<212>DNA<213>人工序列<400>45cat ttt gaa ccg cat ggt tcg aaa ttg aaa ggc 33<210>46<211>30<212>DNA<213>人工序列
<400>46gga taa cat ttt gaa ccg cat ggt tcg aaa 30<210>47<211>28<212>DNA<213>人工序列<400>47ggc tgt cac tta tgg atg gac ccg cgt c 28<210>48<211>24<212>DNA<213>人工序列<400>48tgc tag ttg aat aag ctg gca cct 24<210>49<211>34<212>DNA<213>人工序列<400>49ggc ttc ggc tgt cac tta tgg atg gac ccg cgt c 34<210>50<211>29<212>DNA<213>人工序列<400>50tgc tag ttg aat aag ctg gca cct tga cg 29<210>51<211>24<212>DNA<213>人工序列<400>51tgc gta gcc gac ctg aga ggg tgt 24<210>52<211>16<212>DNA<213>人工序列<400>52cga gct caa agt atg t 16<210>53
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权利要求
1.一套用于检测常见肠道致病菌的寡核苷酸探针，其特征在于包含以下各组探针的全部或部分探针的组合，各部分的探针长度在25-50碱基之间。a.金黄色葡萄球菌的16S rDNA基因检测探针b.李斯特氏菌属的16S rDNA基因检测探针c.肠出血性大肠杆菌O157H7的23S rDNA基因检测探针d.霍乱弧菌的16S rDNA基因检测探针e.耶尔森氏菌属的16S rDNA基因检测探针f.小肠结肠炎耶尔森氏菌的16S rDNA基因检测探针g.沙门氏菌属的16S rDNA基因检测探针h.伤寒沙门氏菌的对Vi抗原表达基因ViaB起到正调控作用的基因VipR检测探针i.志贺氏菌属的16S rDNA基因检测探针j.痢疾杆菌的大质粒上编码侵袭质粒抗原H基因ipaH检测探针k.副溶血性弧菌的16S rDNA基因检测探针l.副溶血性弧菌的23S rDNA基因检测探针m.志贺氏菌属、沙门氏菌属和大肠杆菌共有的16S rDNA基因检测探针n.产气荚膜梭菌的16S rDNA基因检测探针o.弯曲菌属的16S rDNA基因检测探针p.变形杆菌的16S rDNA基因检测探针q.蜡样芽孢菌属的16S rDNA基因检测探针r.肉毒梭菌的16S rDNA基因检测探针s.真细菌通用的16S rDNA基因检测探针t.布鲁氏菌的16S rDNA基因检测探针。
2.如权利要求1所述的一套寡核苷酸探针，其中a探针选自下列寡核苷酸序列中的1条或数条SA1aac gga cga gga gct tgc ttc tct gat gtt agcSA2caa aag tga aag acg gtc ttg ctg tca ctt ata gaSA3aaa ctc tgt tat tag gga aga aca tat gtg taa gtaSA4gtg cac atc ttg acg gta cct aat cag aaa gcc acgSA5aca tat gtg taa gta act gtg cac atc ttg acg gtaSA-6 tga cta ctt gta agc aca cgg ttt cag gtt cta tttSA-7 aat att ttg aac cgc atg gtt caa aag tga aagSA-8tac gac caa ata cta aacSA-9caa taa tca tca ctt gag gcb探针选自下列寡核苷酸序列中的1条或数条LI1 aac gga gga aga gct tgc tct tcc aaa gtt agtLI2 tgt tgt tag aga aga aca agg ata aga gta act gctLI3 tag aga aga aca agg ata aga gta act gct tgt cccLis-23 gtg gca tgc gcc aca ctt tat cc探针选自下列寡核苷酸序列中的1条或数条H7-1gca gtc acc cca taa aag agg ctH7-2tca ccc cat aaa aga ggc tcc cac tgcd探针选自下列寡核苷酸序列中的1条或数条VC1 cag cac aga gga act tgt tcc ttg ggt ggc gage探针选自下列寡核苷酸序列中的1条或数条YE1 gcg gca gcg gga agt agt tta cta ctt tgc cggye-3agg ggt tga gtt taa tac gct caa tca ttgf探针选自下列寡核苷酸序列中的1条或数条ye-2e cat aaa ggt taa taa cct ttg tga ttg acg tg探针选自下列寡核苷酸序列中的1条或数条SHI1ggg agt aaa gtt aat acc ttt gct cat tgah探针选自下列寡核苷酸序列中的1条或数条V-1 aaa tag ata tca ttc gga ggc cagV-2 ctt caa taa tgc cag cag ctc caa ccc cga aat aga taV-3 aca ggc tgt agc gat tta ggt tca caa aca aat aat ttV-4 tag tcg cga act tga aat gat aac gV-5 cat ttc tga taa tat cct gga ctg atg ttg ccgi探针选自下列寡核苷酸序列中的1条或数条SAL1ggt gtt gtg gtt aat aac cgc agc aat tgaj探针选自下列寡核苷酸序列中的1条或数条I-1 gaa ggc ctt ttc gat aat gat acc ggc gct ctg ctc tcc cI-2 gga ccg tgt cgc gct cac atg gaa caa tct ccg gaa aac cctI-3 agt ctt tcg ctg ttg ctg ctg atg cca cI-4 cct ctg cgg agc ttc gac agc agt ctt tcg ctg ttI-5 ata ccg tct ctg cac gca ata cct ccg gat tcc gtI-6 tcc gga ttc cgt gaa cag gtc gct gca tgg ctk探针选自下列寡核苷酸序列中的1条或数条VP1 aaa cga gtt atc tga acc ttc ggg gaa cga taa cgg1探针选自下列寡核苷酸序列中的1条或数条VP23 ggt acg cag tca cag gac aaa gccm探针选自下列寡核苷酸序列中的1条或数条SS3 tgt ctg gga aac tgc ctg atg gag gSS4 cgt cgc aag acc aaa gag ggg gac ctt cgg gSS5 ggt ttc agg ttc ttt ttc act ccc ctc gcc gSS6 aac ctg ccc atg gct aga tca ccg ggt ttc ggg tct ata ccc tSS7 aat ttt tca aca tta gtc ggt tcg gtc ctc cag tta gtgSS8 cct ctt gcc atc gga tgt gcc cag atgn探针选自下列寡核苷酸序列中的1条或数条CP-1 cga gct caa agt atg tCP-2 gcc gag ctc aaa gta tgtCP-3 gcc gag ctc aaa gta tgt ggc attCP-4 act act cat act cga cgc tag cCP-5 gtg ata agg ttc ggt aag cgc tat gccCP-6 ggc ata gcg ctt acc gaa cct tat caccp-16aag atg gca tca tca ttc aac caa agg agc aat cCP-16-1 aag atg gca tca tca ttc aac caa agg agc aat cgc tat gCP1 gaa aga tgg cat cat cat tca acc aaa gga gca atcCP-new-1 atg gca tca tca ttc aac caa agg agc aat ccg cta tga gat gga cccCP-new-2 atg gca tca tca ttc aac caa agg agc aat ccg cta tga gat ggao探针选自下列寡核苷酸序列中的1条或数条Cam-1act cct gct taa cac aag ttg agt agCam-2tcg gtg tag gat gag act ata tagCam-3act cct gct taa cac aag ttg agt agg gaa agt ttt tcg gCam-4ggt ata gtt aat ctg ccc tac aca agaCam-5ctc ctt ttc tta ggg aag aat tct gac ggt acc taa gga atCam-6act cct gct taa cac aag ttg agt agg gaa agCam-7gat ttg cct gta taa cct cct acg acc tta gac tagCam-8cgg agt aaa tcc taa tac aaa gct aac caCam-9ttc tat cca tcc gaa gac ttc aaa aag cct tCam-3-1 act cct gct taa cac aag ttg agt agg gaa agt ttt tcg gCam-1act cct gct taa cac aag ttg agt agp探针选自下列寡核苷酸序列中的1条或数条PR1 taa cag gag aaa gct tgc ttt ctt gct gacPR-2 cgt cga gtt cac aat aac agc atc ttc agapr-2 cga gcg gta aca gga gaa agc ttg ctt tct tgc tgapr-3 cga gcg gta aca gga gaa agc ttg ctt tpr-4 gta aca gga gaa agc ttg ctt tct tgc tga cga gcpr-5 gtc tac gga cca aag cag ggg ctc ttc gga cct tgcpr-6 gtg ata aag tta ata cct tta tca att gpr-7 att gcg taa cag aga gaa agc ttg ctt tct tgc tgapr-8 att gcg taa cag aga gaa agc ttg ctt tpr-9 taa cag aga gaa agc ttg ctt tct tgc tga ctg agcpr-10gtg ata aag tta ata cct ttg tca att gq探针选自下列寡核苷酸序列中的1条或数条B-1 cat ttt gaa ccg cat ggt tcg aaa ttg aaa ggcB-2 gga taa cat ttt gaa ccg cat ggt tcg aaaB-3 ggc tgt cac tta tgg atg gac ccg cgt cB-4 tgc tag ttg aat aag ctg gca cctB-5 ggc ttc ggc tgt cac tta tgg atg gac ccg cgt cB-6 tgc tag ttg aat aag ctg gca cct tga cgB-41 tgc gta gcc gac ctg aga ggg tgtr探针选自下列寡核苷酸序列中的1条或数条CB-1 tat aag aga atc gca tga ttt tct tat cca aag att tatCB-2 atg aag ctt cct tcg gga agt gga tta gcg gcCB-3 ggg ata gcc ttc cga aag gaa gat taa tacs探针选自下列寡核苷酸序列中的1条或数条common-1 cca gac tcc tac ggg agg cag cag tcommon-2 ctc cta cgg gag gca gca gta ggg aatcommon-3 cac act gga act gag aca cgg tccommon-2-1 act gag aca cgg tcc aga ctc cta cgg gag gca gca gta ggg aat attgcommon-3-1 cac act gga act gag aca cgg tcg aga ctc cta cgg gat探针选自下列寡核苷酸序列中的1条或数条Bru-1 gtg ccc ttc ggg gga aag att tat cgg caa atg atc ggc ccg cgt tBru-2 cgt acc att tgc tac gga ata act cag gga aac ttg tg 。
3.如权利要求1所述的一套寡核苷酸探针，其特征在于同时包含a～t二十组探针。
4.如权利要求3所述的一套寡核苷酸探针，其中a探针为SA5，b探针为LI2和LI3，c探针为O157H7-1和O157H7-2，d探针为VC1，e探针为YE1，f探针为ye-2e，g探针为SHI1，h探针为V2和V3，i探针为SAL1，j探针为I-1和I-2，k探针为VP1，l探针为VP23，m探针为SS5，n探针为CP-new-1，o探针为Cam-5，p探针为PR-2，q探针为B-6，r探针为CB-1，s探针为common-2-1和common-3-1，t探针为Bru-2。
5.权利要求1～4所述的任一寡核苷酸探针的用途，其特征在于利用探针可对样品中的常见肠道致病菌的相应基因进行检测，尤其适用于基于基因芯片技术的检测。
6.权利要求5所述的寡核苷酸探针的用途，其特征在于利用探针可以检测出十七种常见肠道致病菌以及对痢疾杆菌和伤寒沙门氏菌进行区分。
7.权利要求5所述的寡核苷酸探针的用途，其特征在于该检测可用于临床疾病诊断、抗菌素筛选、环境监测与评价、卫生监督与进出口食品检疫、细菌学分类与流行病学调查、生物战剂检测等。
全文摘要
一套用于检测常见肠道致病菌的寡核苷酸探针及其用途，属于微生物检测领域(生物工程类检测产品)。探针分别设计在细菌16S rRNA和23S rRNA以及痢疾杆菌中大质粒上编码侵袭质粒抗原H(ipaH)和伤寒沙门氏菌调控Vi抗原表达(VipR)等基因序列上，探针长度在25－50碱基之间，具有较高的灵敏度和特异性。适用于基于核酸杂交原理的检测技术，尤其适用于基因芯片原理的检测。在一定的使用条件下，能够检测出实验样品中的李氏菌属、副溶血性弧菌、弯曲菌属、小肠结肠炎耶尔森氏菌、耶尔森氏菌属、金黄色葡萄球菌、肉毒梭菌、蜡样芽孢菌属、沙门氏菌、伤寒沙门氏菌、志贺氏菌、痢疾杆菌、产气荚膜梭菌、变形杆菌、布鲁氏菌、肠出血性大肠杆菌O157H7和霍乱弧菌。可用于多种方面，如疾病诊断、环境检测、食物中毒检测、进出口食品检疫、细菌学分类、流行病学调查、生物战剂检测等。
文档编号C12Q1/68GK1683565SQ20051005520
公开日2005年10月19日 申请日期2005年3月15日 优先权日2005年3月15日
发明者王升启, 金大智, 文思远, 陈苏红 申请人:中国人民解放军军事医学科学院放射医学研究所