一种结合短双歧杆菌的适配体、筛选方法及应用
【专利摘要】本发明提供一种结合短双歧杆菌的适配体、筛选方法及应用，其包含与序列5’?AGCAGCACAGAGGTCAGATG?N40?CCTATGCGTGCTACCGTGAA?3’具有至少与短双歧杆菌的结合率在65％以上的核苷酸序列；其中，N代表碱基A，T，C，G中任一个，N40代表随机片段长度为40个碱基。本发明针对短双歧杆菌的高质量适配体，与短双歧杆菌的结合力较高且特异性良好，可广泛应用于有关短双歧杆菌相关的生物技术的各个领域。
【专利说明】
一种结合短双歧杆菌的适配体、筛选方法及应用
技术领域
[0001] 本发明属于生物技术领域，具体涉及针对短双歧杆菌的适配体、筛选方法以及利 用该适配体的方法。
【背景技术】
[0002] -直以来，作为益生菌的双歧杆菌及其微生态制剂以其特有的性质越来越受到学 术界的重视和商家的关注。双歧杆菌不仅能抑制肠道致病菌的生长，从而调节和改善肠道 菌群，双歧杆菌还能改善乳糖不耐症、预防肠道感染、降低血清胆固醇、促进免疫和发挥抗 氧化等作用。含双歧杆菌的酸奶已在欧洲和日本盛行多年，而且销量仍在增长。我国也开发 研制了多种双歧杆菌制品，如含双歧杆菌的酸奶、奶粉、饮料等制品，销量也较好。
[0003] 短双歧杆菌是母乳喂养婴儿肠道中的优势菌，对婴儿健康起到至关重要的作用。 正是基于短双歧杆菌与婴儿健康息息相关，短双歧杆菌经常被作为益生菌添加到微生态制 剂中。但到目前为止，短双歧杆菌在国际上还没有标准的检测方法，这对短双歧杆菌制品的 质量管理十分不利。因此，为满足市场需求，短双歧杆菌的快速检测方法势在必行。目前针 对短双歧杆菌的检测主要是利用传统培养方法和分子生物学方法。传统检测方法需要对短 双歧杆菌进行培养，这种方法耗费时间长，而且培养条件对短双歧杆菌形态有不同程度的 影响，从而导致不可靠的检测结果，也不能满足快速检测的需要。以PCR技术为基础的分子 生物学技术在一定程度上提高了检测灵敏度同时也节省了检测时间，但这种检测技术需要 复杂设备且对检测人员技术要求高，因此也很难满足快速检测的需要。
[0004] 核酸适配体是经体外筛选技术筛选出的能特异结合金属离子、多肽、蛋白质乃至 整个细胞的寡聚核苷酸（SSDNA或RNA)片段，其特异性如同抗体一样，对可结合的配体有特 异的识别能力和高度的亲和力。核酸适配体的体外筛选技术被称为指数富集的配体系统进 化（Systematic Evolution of Ligand by Exponential enrichment，SELEX)技术。SELEX 技术模拟自然进化过程，利用大容量的随机寡核苷酸库与靶分子相互作用，对随机寡核苷 酸文库施加选择压力，从中筛选出与靶标特异结合片段，并结合PCR体外扩增技术，从而实 现指数富集，如此循环数轮，最终得到与靶标高亲和力和高特异性结合的寡核苷酸配体。
【发明内容】
[0005] 本部分的目的在于概述本发明的实施例的一些方面以及简要介绍一些较佳实施 例。在本部分以及本申请的说明书摘要和发明名称中可能会做些简化或省略以避免使本部 分、说明书摘要和发明名称的目的模糊，而这种简化或省略不能用于限制本发明的范围。
[0006] 鉴于上述和/或现有针对短双歧杆菌的适配体及用途中存在的问题，提出了本发 明。
[0007] 因此，本发明其中一个目的是，通过改良的Whole-Bacterium SELEX技术，以短双 歧杆菌为靶标，筛选出能与短双歧杆菌特异性结合的核酸适配体序列，以该适配体为新型 识别元件，开发短双歧杆菌的新型快速检测方法。
[0008] 为解决上述技术问题，根据本发明的一个方面，本发明提供了如下技术方案:一种 结合短双歧杆菌的适配体，其特征在于：包含与序列5 ' -AGCAGCACAGAGGTCAGATG-N40- CCTATGCGTGCTACCGTGAA-3'具有至少与短双歧杆菌的结合率在65%以上的核苷酸序列；其 中，
[0009] N代表碱基A，T，C，G中任一个，N40代表随机片段长度为40个碱基。
[0010] 作为本发明所述结合短双歧杆菌的适配体的一种优选方案，其中：其具有以下核 苷酸序列：
[0011] S'-AGCAGCACAGAGGTCAGATGCCGGGCAGCGGTCAATGCCGCAC CTTCCATATGATCGGGGCCTATGCGTGCTACCGTGAA-3 '；
[0012] S'-AGCAGCACAGAGGTCAGATGGGCCCCCTGCCTGCCAAAAAGGT GTTGCCAGGTTGGCGGCCCTATGCGTGCTACCGTGAA-3 '；
[0013] 5'-AGCAGCACAGAGGTCAGATGCTCCCAGGCCGTTGGGGCGTTGC CTGCGTGCACCCGGGGCCCTATGCGTGCTACCGTGAA-3 '。
[0014] 作为本发明所述结合短双歧杆菌的适配体的一种优选方案，其中：所述适配体其 中至少一个核苷酸被修饰。
[0015] 作为本发明所述结合短双歧杆菌的适配体的一种优选方案，其中：所述适配体被 荧光FAM修饰。
[0016] 作为本发明所述结合短双歧杆菌的适配体的一种优选方案，其中：所述适配体被 荧光基团、同位素、电化学标记物、酶标记物，以及用于形成组合物的亲和配基、巯基所修 饰。
[0017] 本发明其中另一个目的是提供一种结合短双歧杆菌的适配体的筛选方法。
[0018] 为解决上述技术问题，根据本发明的另一个方面，本发明提供了如下技术方案:一 种筛选结合短双歧杆菌的适配体的方法，包括初始随机单链DNA文库构建及引物合成文库 序列，其还包括，PCR扩增和非变性聚丙烯酰氨凝胶电泳;ssDNA的纯化和变性聚丙烯酰氨凝 胶电泳;反筛，利用长双歧杆菌、两歧双歧杆菌、婴儿双歧杆菌、动物双歧杆菌和青春双歧杆 菌组成的混合物作为反筛的靶标，将所述混合物与纯化后ssDNA文库进行室温孵育，离心取 上清作为模板进行PCR，最终得到结合短双歧杆菌的适配体。
[0019] 作为本发明所述筛选结合短双歧杆菌的适配体的方法的一种优选方案，其中：所 述PCR扩增，其反应系统中加入有机溶剂二甲亚楓，且二甲亚楓占反应体系体积百分比5% ~7%〇
[0020] 作为本发明所述筛选结合短双歧杆菌的适配体的方法的一种优选方案，其中：所 述PCR扩增，其退火温度为69 °C。
[0021] 本发明再一个目的是提供一种结合短双歧杆菌的适配体在短双歧杆菌纯化、短双 歧杆菌的固相载体的制备，以及短双歧杆菌的快速检测方面的应用。
[0022]本发明所具有的有益效果：
[0023] 1、与抗体相比，核酸适配体更为稳定，制备方法简单、制备周期短、成本低廉，可直 接体外合成和任意修饰，操作更加方便。
[0024] 2、该组序列是从保守序列显著、二级结构稳定且与目标菌体具有不同亲和力的适 配体序列中选取出的亲和力和特异性均表现优良的核酸适配体序列，适配体性质稳定，与 双歧杆菌的亲和力和特异性十分优秀。
[0025] 3、填补了短双歧杆菌快速检测领域的技术空白，推动了行业对短双歧杆菌制品的 质量管理的发展。
【附图说明】
[0026] 为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例描述中所需要使用 的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本 领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动性的前提下，还可以根据这些附图获得其它 的附图。其中：
[0027]图1是CCFM623-2核酸适配体的二级结构图；
[0028]图2是CCFM623-10核酸适配体的二级结构图；
[0029]图3是CCFM623-16核酸适配体的二级结构图；
[0030]图4是CCFM623-2核酸适配体的饱和结合曲线图；
[0031]图5是CCFM623-10核酸适配体的饱和结合曲线图；
[0032]图6是CCFM623-16核酸适配体的饱和结合曲线图；
[0033] 图7是CCFM623-2、CCFM623-10和CCFM623-16核酸适配体的结合特异性试验结果；
[0034] 图8是不同有机溶剂剂在PCR反应体系中的表现示意图。
【具体实施方式】
[0035] 为使本发明的上述目的、特征和优点能够更加明显易懂，下面结合说明书附图对 本发明的【具体实施方式】做详细的说明。
[0036] 在下面的描述中阐述了很多具体细节以便于充分理解本发明，但是本发明还可以 采用其他不同于在此描述的其它方式来实施，本领域技术人员可以在不违背本发明内涵的 情况下做类似推广，因此本发明不受下面公开的具体实施例的限制。
[0037]其次，此处所称的"一个实施例"或"实施例"是指可包含于本发明至少一个实现方 式中的特定特征、结构或特性。在本说明书中不同地方出现的"在一个实施例中"并非均指 同一个实施例，也不是单独的或选择性的与其他实施例互相排斥的实施例。
[0038] 实施例1:
[0039] (1)体外化学合成初始随机单链DNA(ssDNA)文库及引物文库序列如下：
[0040] 5'-AGCAGCACAGAGGTCAGATG-N40-CCTATGCGTGCTACCGTGAA-3'（Integrated DNA Technologies，IDT)，构建了长度为80nt的随机ssDNA文库，两端为固定引物序列，中间为 40nt的随机序列，库容量在1014以上。
[0041 ]上游引物：5 ' -AGCAGCACAGAGGTCAGATG-3 '
[0042] 下游引物：5 ' -TTCACGGTAGCACGCATAGG-3 '
[0043] 5 ' 磷酸化下游引物:5 ' -P-TTCACGGTAGCACGCATAGG-3 '
[0044] 将随机ssDNA文库和引物均用TE缓冲液配制成IOOuMIC存液于-20°C贮存备用。
[0045] (2)SELEX 筛选
[0046] 将培养至对数期的短双歧杆菌用结合缓冲液（50mmol/L Tris-HCl(pH 7.4)， 5mmol/L KC1, lOOmmol/L NaCl, lmmol/L MgCl2)清洗两遍以去除培养基。首轮将2nmol随机 单链文库热变性10分钟，随后立即冰浴10分钟，然后加入含短双歧杆菌的600ul结合缓冲液 中，室温孵育45min。洗涤两次将未与靶标结合以及结合不牢的ssDNA洗脱，随后将与靶标结 合的ssDNA热解离洗脱，将洗脱液作为模板进行PCLPCR产物通过8 %非变性聚丙烯酰胺凝 胶电泳(PAGE)验证，出现唯一的80nt目标条带扩增产物，然后将该扩增产物用于单链制备。 采用Lambda核酸外切酶消化法将待切产物进行酶切反应，灭酶后将酶切产物经尿素变性 PAGE电泳验证，用稀释后的80nt核酸单链文库作为对照，出现唯一的且与对照条带一致酶 切产物即可进行纯化。采用饱和酚-乙醇提纯法对制备的核酸单链文库纯化，复溶后经 Nan〇Dr〇p2000超微量分光光度计测定ssDNA浓度，定量200pmol投入下一轮筛选。分别在第 九和十一轮进行反筛(长双歧杆菌等同属双歧杆菌作为反筛靶标）。将第十二轮筛选得到的 核酸适配体PCR产物送至上海生物工程技术有限公司进行克隆测序，获得33条核酸单链序 列。采用DNAMAN软件对核酸单链序列进行一级结构同源性分析，依据序列之间的同源性将 该33条序列分为六个家族。然后用RNA Structure.2软件对核酸适配体序列的二级结构的 稳定性进行分析。结合以上两种软件的分析结果，从中挑选出能级较低、结构稳定的序列， 由美国IDT公司合成5'-FAM荧光标记的核酸适配体序列，用流式细胞分析仪作进一步的亲 和力和特异性分析。
[0047] 实施例2:
[0048]单链核苷酸碱基之间存在的相互作用可使其形成一定的空间结构，这些结构易于 与各种靶分子实现构象结合。基于这种构象识别特性，采用一个足够大容量(1〇14以上)的核 酸文库能够包容尽可能多的立体结构，因此有可能从中筛选得到针对任何种类靶标的高亲 和力和高特异性的适配体。
[0049] 根据上述原理，本实施例中发明人提出了一组通过改良的whole-Bacterium SELEX技术筛选得到与短双歧杆菌特异结合的核酸适配体序列。下面结合说明书附图和具 体实施方式对本发明作进一步说明。
[0050]短双歧杆菌特异结合的核酸适配体筛选方法大致如下：
[00511 (1)初始随机单链DNA( ssDNA)文库构建及引物合成文库序列如下：5'_ AGCAGCACAGAGGTCAGATG-N40-CCTATGCGTGCTACCGTGAA-3'（Integrated DNA Technologies， IDT)，构建了长度为80nt的随机ssDNA文库，两端为固定引物序列，中间为40nt的随机序列， 库容量在1014以上。
[0052] 上游引物：5 ' -AGCAGCACAGAGGTCAGATG-3 '
[0053] 下游引物：5 ' -TTCACGGTAGCACGCATAGG-3 '
[0054] 5 ' 磷酸化下游引物:5 ' -P-TTCACGGTAGCACGCATAGG-3 '
[0055] 将随机ssDNA文库和引物均用TE缓冲液配制成IOOuMIC存液于-20°C贮存备用。
[0056] (2)whole_Bacterium SELEX筛选
[0057] 将培养至对数期的短双歧杆菌用结合缓冲液（50mmol/L Tris-HCl(pH 7.4)， 5mmol/L KC1, lOOmmol/L NaCl, lmmol/L MgCl2)清洗两遍以去除培养基。首轮将2nmol随机 单链文库热变性10分钟，随后立即冰浴10分钟，然后加入含短双歧杆菌的600ul结合缓冲液 中，室温孵育45min。洗涤两次将未与靶标结合以及结合不牢的ssDNA洗脱，随后将与靶标结 合的ssDNA热解离洗脱，将洗脱液作为模板进行PCLPCR产物通过8 %非变性聚丙烯酰胺凝 胶电泳(PAGE)验证，出现唯一的80nt目标条带扩增产物，然后将该扩增产物用于单链制备。 采用Lambda核酸外切酶消化法将待切产物进行酶切反应，灭酶后将酶切产物经尿素变性 PAGE电泳验证，用稀释后的80nt核酸单链文库作为对照，出现唯一的且与对照条带一致酶 切产物即可进行纯化。采用饱和酚-乙醇提纯法对制备的核酸单链文库纯化，复溶后经 Nan〇Dr〇p2000超微量分光光度计测定ssDNA浓度，定量200pmol投入下一轮筛选。将第十二 轮筛选得到的核酸适配体PCR产物送至上海生物工程技术有限公司进行克隆测序，获得33 条核酸单链序列。采用DNAMAN软件对核酸单链序列进行一级结构同源性分析，依据序列之 间的同源性将该33条序列分为六个家族。然后用RNA Structure.2软件对核酸适配体序列 的二级结构（如说明书附图1~图3所示）的稳定性进行分析。结合以上两种软件的分析结 果，从中挑选出能级较低、结构稳定的序列，由美国IDT公司合成5'-FAM荧光标记的核酸适 配体序列，用流式细胞分析仪作进一步的亲和力和特异性分析。
[0058] (3)whole_Bacterium SELEX筛选方法的优化 [0059] 1)PCR扩增和非变性聚丙烯酰氨凝胶电泳
[0060] 为了增加 PCR扩增产物的特异性，我们在PCR反应体系中加入了有机溶剂二甲亚楓 (DMS0)。25此的PCR反应体系如下： 丁叫酶 0.3μ1\ Buffer 2.5'uL (1NTP 2μ1. DMSO 1.25αΙ.
[0061] 模板 5gL 上游引物（2(^mol/L) 〇.5μL. 5'磷酸化下游引物 （20μL?〇1/? 0.5μΤ. 加入无菌水，补充体系至25,u:U
[0062] PCR扩增产物通过区分度更好的8%非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)进行检测， 结果出现唯一的80nt目标条带扩增产物。在此，参见图8,纵轴为特异性条带与非特异性条 带比率，从图上我们能看出，当在PCR反应体系中加入DMS0时可以明显增加 PCR反应的特异 性。
[0063] 在PCR反应程序:预变性、变性、退火和延伸4个主要步骤中，一般情况下预变性、变 性、延伸的温度很少改变，改变的往往是退火温度，退火温度过高或过低对PCR结果都能产 生较大的影响，退火温度太高，特异性强，会导致目的条带的丢失，退火温度太低，特异性 差，会导致杂带的增多，所以对于PCR的扩增，找到最适退火温度是PCR成功的关键。该PCR反 应中若模板DNA是混合物且模板的的G、C含量高，往往需要更高的退火温度，而当退火温度 过高时，又会对PCR结果产生负作用，DMS0是一种含硫有机化合物，常温下为无色无臭的透 明液体。在PCR反应体系中加入DMS0有利于减少DNA的二级结构，使G、C含量高的模板易于完 全变性，从而间接降低PCR反应所需的退火温度，进而使得PCR扩增产物特异性更高。在本实 施方式中，优选退火温度为69 °C。
[0064] 2) ssDNA的纯化和变性聚丙稀酰氨凝胶电泳
[0065] Lambda核酸外切酶消化后的ssDNA通过苯酸、氯仿、异戊醇(苯酸:氯仿:异戊醇= 25: 24:1)混合液抽提，12000rpm，离心5min，吸取上层水相，并加入1/10倍体积的3mol/L的 醋酸钠 （pH 5.2)，2.5倍体积的冰乙醇混匀，置于-20 °C的冰箱2h，4°C、12000rpm，离心 15min，弃上清，用4°C预冷的75%乙醇洗涤后，4°C、12000rpm，离心15min。沉淀部分室温干 燥，用30yL的结合缓冲液重溶，用Nan〇Dr〇p2000超微量分光光度计测定ssDNA浓度。
[0066] PCR扩增产物通过区分度更好的8%变性(7M尿素)聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)进 行检测，用稀释ssDNA文库作为标记检测纯化产物。
[0067] 3)反筛
[0068] 为了得到特异性更好的适配体，我们分别在第九和十一轮进行反筛，具体做法如 下:利用长双歧杆菌、两歧双歧杆菌、婴儿双歧杆菌、动物双歧杆菌和青春双歧杆菌组成的 混合物作为反筛的靶标，将该混合物与纯化后ssDNA文库进行室温孵育45min，离心取上清 作为模板进行PCR。
[0069] (4)短双歧杆菌核酸适配体的亲和力分析
[0070]将合成的三条FAM荧光标记的短双歧杆菌适配体均用结合缓冲液稀释成lOOuM贮 存液于-20°C贮存备用。将这三条适配体序列lOOpmol分别与双歧杆菌（108cfu/mL)室温下 孵育45min，并用结合缓冲液冲洗离心，去除未与菌体结合的寡核苷酸适配体，用结合缓冲 液重悬，然后通过流式细胞分析仪检测结合上FAM标记适配体的菌体阳性结合率。每个数据 做三个平行样，整个过程注意避光操作。所测得阳性结合率如下表所示。
[0071]
根据上述亲和力分析结果可知，这三条适配体序列与短双歧杆菌的结合率均在 65%以上，进一步将该组适配体分别用结合缓冲液稀释为不同浓度梯度(0，10,25,50,75， 100，150nM)，分别与108cfu短双歧杆菌室温孵育45min，用结合缓冲液冲洗离心后，将菌体 重悬于结合缓冲液中，用流式细胞分析仪检测结合上FAM标记适配体的菌体阳性率。除了被 荧光基团、同位素、电化学标记物、酶标记物所修饰外，还可以被用于形成组合物的亲和配 基、疏基所修饰。每个数据做三个平行样，整个过程注意避光操作。利用GraphPad Prism 5.0软件计算各寡核苷酸适配体的解离常数Kd值，绘制短双歧杆菌各个适配体饱和结合曲 线(如说明书附图4~图6所示）。
[0073] (5)短双歧杆菌核酸适配体的特异性分析
[0074]根据上述亲和力分析结果，进一步将这三条适配体进行特异性分析。分别将该组 序列与其它菌(长双歧杆菌、青春双歧杆菌、动物双歧杆菌、两歧双歧杆菌、植物乳杆菌)室 温下孵育45min，然后用结合缓冲液冲洗离心，去除未与菌体结合的寡核苷酸适配体，用结 合缓冲液重悬，然后通过流式细胞分析仪检测结合上FAM标记适配体的菌体阳性结合率。每 个数据做三个平行样，整个过程注意避光操作。将测定结果进行比较分析，如说明书附图7 所示。
[0075] 由此可见，短双歧杆菌与适配体CCFM623-2、CCFM623-10和CCFM623-16的结合力均 较高且特异性良好。故上述适配体可以适用用于短双歧杆菌的纯化、短双歧杆菌的固相载 体的制备，以及应用于短双歧杆菌的快速检测。该组核酸适配体为分析检测微生态制剂中 短双歧杆菌提供了特异高效的识别配体，该组适配体将会在工业生产中短双歧杆菌快速检 测方面发挥广泛应用前景。
[0076]应说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照较佳 实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术 方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的精神和范围，其均应涵盖在本发 明的权利要求范围当中。
【主权项】
1. 一种结合短双歧杆菌的适配体，其特征在于:包含与序列 5 ' -AGCAGCACAGAGGTCAGATG-N40-CCTATGCGTGCTACCGTGAA-3 ' 具有至少与短双歧杆菌的 结合率在65%以上的核苷酸序列;其中， N代表碱基A，T，C，G中任一个，N40代表随机片段长度为40个碱基。2. 根据权利要求1所述的适配体，其特征在于:其具有以下核苷酸序列： 5 '-AGCAGCACAGAGGTCAGATGCCGGGCAGCGGTCAATGCCGCACC TTCCATATGATCGGGGCCTATGCGT GCTACCGTGAA-3,； 5 '-AGCAGCACAGAGGTCAGATGGGCCCCCTGCCTGCCAAAAAGGTG TTGCCAGGTTGGCGGCCCTATGCGT GCTACCGTGAA-3,； 5 '-AGCAGCACAGAGGTCAGATGCTCCCAGGCCGTTGGGGCGTTGCC TGCGTGCACCCGGGGCCCTATGCGT GCTACCGTGAA-3,。3. 根据权利要求1或2所述的适配体，其特征在于:所述适配体其中至少一个核苷酸被 修饰。4. 根据权利要求3所述的适配体，其特征在于:所述适配体被荧光FAM修饰。5. 根据权利要求3所述的适配体，其特征在于:所述适配体被荧光基团、同位素、电化学 标记物、酶标记物，以及用于形成组合物的亲和配基、巯基所修饰。6. -种筛选如权利要求1、2、4或5任一所述的结合短双歧杆菌的适配体的方法，包括初 始随机单链DNA文库构建及引物合成文库序列，其特征在于:还包括， PCR扩增和非变性聚丙烯酰氨凝胶电泳； ssDNA的纯化和变性聚丙烯酰氨凝胶电泳； 反筛，利用长双歧杆菌、两歧双歧杆菌、婴儿双歧杆菌、动物双歧杆菌和青春双歧杆菌 组成的混合物作为反筛的靶标，将所述混合物与纯化后ssDNA文库进行室温孵育，离心取上 清作为模板进行PCR，最终得到结合短双歧杆菌的适配体。7. 根据权利要求6所述的适配体，其特征在于:所述PCR扩增，其反应系统中加入有机溶 剂二甲亚楓，且二甲亚楓占反应体系体积百分比5%~7%。8. 根据权利要求6所述的适配体，其特征在于:所述PCR扩增，其退火温度为69 °C。9. 一种结合短双歧杆菌的适配体在短双歧杆菌纯化、短双歧杆菌的固相载体的制备， 以及短双歧杆菌的快速检测方面的应用。
【文档编号】C12N15/10GK105838719SQ201610229311
【公开日】2016年8月10日
【申请日】2016年4月13日
【发明人】陈卫, 张灏, 胡陆军, 赵建新, 田丰伟, 王刚, 张秋香, 范大明, 翟齐啸, 赵国忠
【申请人】江南大学