一种区别鸭和鹅三种常见致病菌的引物及方法
【专利摘要】本发明属于生物技术领域，具体涉及一种用于区别鸭和鹅三种常见致病菌的引物及方法根据鸭疫里默氏菌外膜蛋白A基因、禽源多杀性巴氏杆菌KMT1基因、大肠杆菌glyceraldehyde?3?phosphate dehydrogenase A基因的保守序列设计三对特异性引物，分别标记于猪线粒体基因片段的两端形成三种不同的捕获探针，将捕获探针与待检测菌的基因组杂交、补平缺口、环化后，采用1对引物反向扩增捕获探针，鸭疫里默氏菌、禽源多杀性巴氏杆菌和大肠杆菌的扩增大小分别为504 bp、422 bp和328 bp。目前尚未见仅用一对引物就能区别鸭疫里默氏菌、禽源多杀性巴氏杆菌和大肠杆菌的PCR方法。
【专利说明】
一种区别鸭和鹅三种常见致病菌的引物及方法
技术领域
[0001] 本发明属于生物技术领域，具体涉及一种用于区别鸭和鹅三种常见致病菌的引物 及方法，具体为一种区别鸭和鹅的鸭疫里默氏菌病、禽霍乱和大肠杆菌病的引物及方法。
【背景技术】
[0002] 鸭疫里默氏菌感染常引起雏鸭和雏鹅大批发病和死亡，降低饲料转化率，增加胴 体淘汰率，增加治疗费用，病变主要表现为纤维素性心包炎、肝周炎、气囊炎和脑膜炎。禽霍 乱是由禽源多杀性巴氏杆菌引起的危害鸭和鹅的一种慢性或急性接触性、败血性传染病， 病变的主要特征为心冠脂肪出血、肝脏坏死和肠道粘膜出血。大肠杆菌病是由致病性大肠 杆菌引起鸭和鹅全身或局部感染的一种细菌性传染病，临床上最常见的病型是败血症，病 变主要表现为心包炎、腹膜炎和气囊炎。三种细菌病的病变特征有很大的相似之处，临床上 容易混淆。由于三种细菌的耐药特点差异较大，一旦误诊，导致用药不当，会造成严重的经 济损失。实际生产中迫切需要建立一种快速区别三种细菌的方法以指导疾病的诊断和药物 的选择从而减少经济损失。目前已有检测鸭疫里默氏菌的PCR方法、检测禽源多杀性巴氏杆 菌的PCR方法、检测大肠杆菌的PCR方法、检测鸭疫里默氏菌和大肠杆菌的双重PCR方法，但 目前尚未见仅用一对引物就能区别鸭疫里默氏菌、禽源多杀性巴氏杆菌和大肠杆菌的PCR 方法。
【发明内容】
[0003] 本发明的目的在于提供一种用于区别鸭和鹅三种常见致病菌的引物及方法。
[0004] 为实现上述目的，本发明采用如下技术方案： 用于区别三种细菌的引物，所述的引物包括如下： 鸭疫里默氏菌捕获探针的引物：
禽源多杀性巴氏杆菌捕获探针的引物：
大肠杆菌捕获探针的引物：
能同时检测鸭和鹅三种致病菌的检测引物：
[0005] 具体方法为： 1)捕获探针的制备:提取猪精肉的DNA，配成100 ng/yL的浓度做为模板，分别与鸭疫里 默氏菌捕获探针的引物(RTZF/ RTZR)、禽源多杀性巴氏杆菌捕获探针的引物(FTZF/ FTZR) 和大肠杆菌捕获探针的引物（TZTF/ TZTR)配制PCR反应体系，总量为50 yL:25 yL Dream Green PCR Master Mix(2X)、浓度为10 μΜ的上游引物1 yL、浓度为10 μΜ的下游引物 1 yL、l yL模板、22 yL ddH20;PCR反应条件为:94°C预变性5 min;94°C变性30 s，52°C退火 40 s，72 °C延伸30 s，共30个循环，最后72 °C延伸10 min;分别凝胶回收PCR产物，制成不 同细菌的捕获探针； 2) 检测引物的设计:设计检测引物，鸭疫里默氏菌应扩增出540 bp的特异性片段，禽源 多杀性巴氏杆菌应扩增出422 bp的特异性片段，大肠杆菌应扩增出328 bp的特异性片段， 序列如下： TZTF:CGTCAAAGGCCCTAACACAGT， TZTR：GGTGATACGCATGTTGACTGG； 3) 鸭疫里默氏菌、禽源多杀性巴氏杆菌和大肠杆菌的PCR检测:配制PCR反应体系，总量 为30以1^:3以1^连接酶131^€6广3以1^了39酶131^€6广1以1^连接酶、1以1^了39酶、浓度为1〇111]\1 dNTP2 yL、浓度为10 μΜ的检测上游引物即TZTF 1 yL、浓度为10 μΜ的检测下游引物即TZTR 1 yL、浓度为1 pg/yL的鸭疫里默氏菌捕获探针2 yL、浓度为1 pg/yL的禽源多杀性巴氏杆 菌捕获探针2此、浓度为1 pg/yL的大肠杆菌捕获探针2 yL、含100 ng DNA的模板、补足 ddH20至30 yL。反应程序为94°C预变性5 min;94°C变性50 s，50°C退火10 min，6个循环， 然后94°C变性30 s，50°C退火30 s，72 °C延伸30 s，30个循环，最后72 °C延伸10 min。
[0006] 本发明的优点在于： 与检测鸭疫里默氏菌的PCR方法、检测多杀性巴氏杆菌的PCR方法、检测大肠杆菌的PCR 方法相比，本方法能在一个PCR反应体系和一次PCR反应中同时检测三种细菌，减轻工作量 并节省时间，达到快速的目的。与检测鸭疫里默氏菌和大肠杆菌的双重PCR方法相比，特异 性更好，准确度更高，因为双重PCR方法设计时比普通PCR难度更高，必须考虑引物和引物之 间、引物本身、产物和产物之间不能有错配，相对而言，双重PCR方法的特异性较差，假阳性 或假阴性的概率较大。三重PCR方法对引物设计的要求、PCR反应体系的优化等提出更高的 要求，所以目前没有这三种细菌的三重PCR检测方法。
【附图说明】
[0007] 图1鸭疫里默氏菌的PCR检测，其中1、DNA分子量标准DL2000;2、鸭疫里默氏菌;3、 ddH20〇
[0008] 图2禽源多杀性巴氏杆菌的PCR检测，其中1、DNA分子量标准DL2000;2、禽源多杀 性巴氏杆菌;3、ddH2〇。
[0009] 图3大肠杆菌的PCR检测，其中1、DNA分子量标准DL2000;2、大肠杆菌;3、ddH20。 [00 10]图4鸭疫里默氏菌和大肠杆菌的PCR检测，其中1、DNA分子量标准DL2000;2、鸭疫 里默氏菌、禽源多杀性巴氏杆菌和大肠杆菌;3、鸭疫里默氏菌;4、禽源多杀性巴氏杆菌;5、 大肠杆菌;6、ddH2〇。
【具体实施方式】 [0011] 实施例1 1捕获探针的制备将猪精肉剪碎，加适量水研磨，按试剂盒的方法提取基因组DNA，用 NanoDrop 2000超微量分光光度计测定核酸浓度，配成100 ng/yL的浓度。用鸭疫里默氏菌 捕获探针的引物、禽源多杀性巴氏杆菌捕获探针的引物和大肠杆菌捕获探针的引物(见表 1)分别配制PCR反应体系，总量为50 yL:25 yL Dream fag Green PCR Master Mix(2X)、l yL上游引物（10 μΜ)、1 yL下游引物（10 μΜ)、1 yL模板、22 yL ddmPCR反应条件为:94°C 预变性5 min;94°C变性30 s，52°C退火40 s，72 °C延伸30 s，共30个循环，最后72 °C延伸 10 min。分别凝胶回收PCR产物，用NanoDrop 2000超微量分光光度计测定核酸浓度，配成1 pg/yL的浓度，冰冻保存备用。
[0012]表1制作探针的引物
2检测引物的设计设计检测引物，鸭疫里默氏菌应扩增出540 bp的特异性片段，禽源 多杀性巴氏杆菌应扩增出422 bp的特异性片段，大肠杆菌应扩增出328 bp的特异性片段， 序列如下： TZTF：CGTCAAAGGCCCTAACACAGT TZTR：GGTGATACGCATGTTGACTGG 3鸭疫里默氏菌的PCR检测挑取鸭疫里默氏菌菌落10个左右，按试剂盒的方法提取基 因组DNA，用NanoDrop 2000超微量分光光度计测定核酸浓度，配成100 ng/yL的浓度。配制 ?〇?反应体系，总量为30以1^:3以1^连接酶131^€6匕3以1^了39酶131^€6匕1以1^连接酶、141^ Taq 酶、2 yL dNTP(10 mM)、l yL检测上游引物（10 μΜ)、1 yL检测下游引物（10 μΜ)、2 yL 鸭疫里默氏菌捕获探针（1 pg/yL)、15 yL ddH20、模板用1 yL鸭疫里默氏菌核酸（100 ng/ yL)或1 yL ddH20为空白对照。反应程序为94°C预变性5 min;94°C变性50 s，50°C退火10 min，6个循环，然后94°C变性30 s，50°C退火30 s，72 °C延伸30 s，30个循环，最后72 °C延 伸10 min。凝胶检测，空白对照无 PCR产物，鸭疫里默氏菌核酸可扩增出特异性PCR产物，片 段大小约为540 bp，见图1。
[0013] 4禽源多杀性巴氏杆菌的PCR检测挑取禽源多杀性巴氏杆菌菌落10个左右，按试 剂盒的方法提取基因组DNA，用NanoDrop 2000超微量分光光度计测定核酸浓度，配成100 ng/yL的浓度。配制PCR反应体系，总量为30 yL:3 yL连接酶buffer、3 yL Taq酶buffer、l yL连接酶、1 yL Taq酶、2 yL dNTP(10 mM)、l yL检测上游引物（10 μΜ)、1 yL检测下游引 物（10 μΜ)、2 yL禽源多杀性巴氏杆菌捕获探针（1 pgAxL)、15 yL ddH20、模板用1 yL禽源 多杀性巴氏杆菌核酸（100 ng/yL)或1 yL ddH20为空白对照。反应程序为94°C预变性5 min;94°C变性50 s，50°C退火 10 min，6个循环，然后94°C变性30 s，50°C退火30 s，72 °C 延伸30 s，30个循环，最后72 °C延伸10 min。凝胶检测，空白对照无 PCR产物，禽源多杀性巴 氏杆菌核酸可扩增出特异性PCR产物，片段大小约为422 bp，见图2。
[0014] 5大肠杆菌的PCR检测挑取大肠杆菌菌落10个左右，按试剂盒的方法提取基因组 DNA，用NanoDrop 2000超微量分光光度计测定核酸浓度，配成100 ng/yL的浓度。配制PCR反 应体系，总量为30以1^:3以1^连接酶131^€6广3以1^了39酶131^€6广1以1^连接酶、1以1^了39酶、 2 yL dNTP(10 mM)、l yL检测上游引物（10 μΜ)、1 yL检测下游引物（10 μΜ)、2 yL大肠杆菌 捕获探针（1 pg/VL)、15 yL ddH20、模板用1 yL大肠杆菌核酸（100 ng/VL)或1 yL ddH20为 空白对照。反应程序为94°C预变性5 min;94°C变性50 s，50°C退火10 min，6个循环，然后 94°C变性30 s，50°C退火30 s，72 °C延伸30 s，30个循环，最后72 °C延伸10 min。凝胶检 测，空白对照无 PCR产物，大肠杆菌核酸可扩增出特异性PCR产物，片段大小约为328 bp，见 图3。
[0015] 6鸭疫里默氏菌、禽源多杀性巴氏杆菌和大肠杆菌的PCR检测配制PCR反应体系， dNTP(10 mM)、l yL检测上游引物（10 μΜ)、1 yL检测下游引物（10 μΜ)、2 yL鸭疫里默氏菌 捕获探针（1 pg/yL)、2 yL禽源多杀性巴氏杆菌捕获探针（1 pgAxL)、2 yL大肠杆菌捕获探 针（1 pg/yL)、9 yL ddH20、模板用1 yL鸭疫里默氏菌核酸（100 ng/yL)、l yL禽源多杀性巴 氏杆菌核酸（100 ng/VL)和1 yL大肠杆菌核酸（100 ng/VL)或1 yL鸭疫里默氏菌核酸（100 ng/VL)和2 yL ddH20或1 yL禽源多杀性巴氏杆菌核酸（100 ng/VL)和2 yL ddH20或1 yL大 肠杆菌核酸（100 ng/VL)和2 yL ddH20或3 yL ddH20为空白对照。反应程序为94°C预变性5 min;94°C变性50 s，50°C退火 10 min，6个循环，然后94°C变性30 s，50°C退火30 s，72 °C 延伸30 s，30个循环，最后72 °C延伸10 min。凝胶检测，空白对照无 PCR产物，三种核酸可扩 增出三个片段，大小约为540 bp、422 bp和328 bp，一种核酸只能扩增出相应大小的片段， 见图4。
[0016]以上所述仅为本发明的较佳实施例，凡依本发明申请专利范围所做的均等变化与 修饰，皆应属本发明的涵盖范围。
【主权项】
1. 一种区别鸭和鹅三种常见致病菌的引物，其特征在于:所述的引物包括如下： 鸭疫里默氏菌捕获探针的引物： RTZF：ATGGACTTAAGGTTCCAACGCATTAACTGCTAGTCCCCAT, RTZR：CATATCAGCACAGAGTTTATCTGCCGGATCATGAGTTCC； 禽源多杀性巴氏杆菌捕获探针的引物： FTZF：AGATGATTCGATGGGCGAAGCATTAACTGCTAGTCCCCAT, FTZR：GTATTTCGAGTGTACCGAGTGCCGGATCATGAGTTCC； 大肠杆菌捕获探针的引物： ETZF：GTGAGTGCCGGCAAAGCTGGCATTAACTGCTAGTCCCCAT, ETZR：TTACGCTGGCTATGCCGGTTGCCGGATCATGAGTTCC； 能同时检测鸭和鹅三种致病菌的检测引物： TZTF:CGTCAAAGGCCCTAACACAGT， TZTR:GGTGATACGCATGTTGACTGG。2. 如权利要求1所述的引物用于区别鸭和鹅三种常见致病菌的方法，其特征在于:所述 方法包括如下步骤： 1) 三种细菌捕获探针的制备:提取猪精肉的DNA，配成100 ng/yL的浓度作模板，与权利 要求1所述的鸭疫里默氏菌捕获探针的引物、禽源多杀性巴氏杆菌捕获探针的引物和大肠 杆菌捕获探针的引物分别配制PCR反应体系，总量为50 yL: 25 yL Dream Green PCR Master Mix(2X)、浓度为10 μΜ的上游引物I yL、浓度为10 μΜ的下游引物I yL、l yL模板、 22 yL ddH20;PCR反应条件为：94°C预变性5 min;94°C变性30 s，52°C退火40 s，72°C延伸 30 s，共30个循环，最后72°C延伸10 min;分别凝胶回收PCR产物，获得三种细菌的捕获探 针； 2) 检测引物的设计:设计检测引物，鸭疫里默氏菌应扩增出540 bp的特异性片段，禽源 多杀性巴氏杆菌应扩增出422 bp的特异性片段，大肠杆菌应扩增出328 bp的特异性片段， 序列如下： TZTF:CGTCAAAGGCCCTAACACAGT， TZTR：GGTGATACGCATGTTGACTGG； 3) 鸭疫里默氏菌、禽源多杀性巴氏杆菌和大肠杆菌的PCR检测:配制PCR反应体系，总量 为30以1^:3以1^连接酶131^€6广3以1^了39酶131^€6广1以1^连接酶、1以1^了39酶、浓度为1〇111]\1 dNTP2 yL、浓度为10 μΜ的检测上游引物即TZTF I yL、浓度为10 μΜ的检测下游引物即TZTR I yL、浓度为I pg/yL的鸭疫里默氏菌捕获探针2 yL、浓度为I pg/yL的禽源多杀性巴氏杆 菌捕获探针2此、浓度为I pgAiL的大肠杆菌捕获探针2 yL、含100 ng DNA的模板、补足 ddH20至30 yL;反应程序为94°C预变性5 min;94°C变性50 s，50°C退火10 min，6个循环， 然后94°C变性30 s，50°C退火30 s，72 °C延伸30 s，30个循环，最后72 °C延伸10 min。3. 如权利要求1所述的引物在制备检测鸭疫里默氏菌、禽源多杀性巴氏杆菌和大肠杆 菌的试剂盒中的应用。
【文档编号】C12Q1/10GK105886654SQ201610465971
【公开日】2016年8月24日
【申请日】2016年6月24日
【发明人】程龙飞, 傅光华, 林群群, 林建生, 傅秋玲, 刘荣昌, 万春和, 施少华, 陈红梅, 黄瑜
【申请人】福建省农业科学院畜牧兽医研究所