专利名称：食品和动物产品常见致病菌的maldi-tof-ms数据库的构建方法
技术领域：
本发明涉及一种食品和动物产品常见致病菌的MALDI-T0F-MS数据库的构建方法。
背景技术：
基于细菌表面蛋白分子量检测的基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱 (Matrix-assisted laser desorption ionization-time of flight mass spectrometry, MALDI-T0F MS)技术是一种全新的微生物快速检测和鉴定技术。通过测定细菌自身独特的蛋白质组成，应用质谱技术将测得的蛋白质和多肽按分子量大小依次排列，形成独特的蛋白质组指纹图，通过特征性的模式峰进行菌株的鉴定。其基本原理为将微生物与等量的基质分别点在加样板上，溶剂挥发后形成样品和基质的共晶体，基质从激光中吸收能量使样品解吸，基质与样品之间发生电荷转移使得样品分子电离，经过飞行时间检测器，根据到达检测器的飞行时间不同而被检测，即测定离子的质荷比(M/Z)与离子的飞行时间成正比来检测离子的分子量，通过专用软件分析比较，确定出特异性的指纹图谱。MALDI-T0F MS不是基于微生物的生理生化指标和基因，而是根据各种微生物的蛋白质组表达谱的比较来进行的。每种微生物都有其区别于其它种类的独特的蛋白质组成，因而拥有独特的蛋白质指纹图谱，这是由物种的遗传特性所决定的，受外界环境条件等影响较小。因此，相对于其它常用的微生物检验技术，蛋白质组指纹图谱更为准确和直接。目前，国内外学者已经在多种细菌的检测和鉴定方面取得良好的效果。传统细菌鉴定方法基于形态学、革兰氏染色和生理生化特性分析，虽然结果准确、可靠，但一般需要数天时间才能完成，而且有很多细菌鉴定程序十分繁琐。近年来发展起来的PCR、荧光PCR、核酸序列分析等分子生物学检测技术在微生物鉴定方面取得了一定的应用，但由于其敏感性高，容易出现假阳性，而且对近似种的细菌鉴定还存在一些不足。因此，对一些与人类健康关系密切的病原菌还需建立更加快速、准确、实用的检测和鉴定方法。MALDI-T0F MS技术在微生物鉴定方面已经表现出高稳定性、高特异性和高敏感性，而且具有高通量、快速、价廉的特点，可以代替传统的生化和分子生物学鉴别方法。国外在应用MALDI-T0F MS技术检测和鉴定微生物方面已经取得很好的进展，德国布鲁克公司创建了多种已知微生物的标准指纹图谱数据库(MALDI BioTyper),已经在德国食品与健康国家实验室、美国农业部农业研究服务中心食品微生物学部及其他欧美政府部门和大学、医院、研究所等单位进行评估和应用，具有快速简便的工作流程和强大可靠的数据处理能力，可以对许多未知微生物进行鉴定。该数据库中的谱图绝大多数都是国外菌株的资料，目前未见霍乱弧菌等致病菌的MALDI-T0F MS图谱。由于国内该技术的研究和应用还刚刚起步，尚未见建立各种细菌菌株的质谱图数据库的报道。由于不同国家和地区的菌株存在明显的地理差异，而MALDI-T0F MS技术对未知细菌的分形鉴定必须建立在含有足够已知菌株的谱库中进行检索，才可实现最匹配且最真实可靠的菌株鉴定结果。匹配分值越高，鉴定结果越准确。因此，建立我国常见致病菌的MALDI-TOF MS数据库，用于国内食品和动物产品中致病菌的快速检测和鉴定，可以获得更加准确和可靠的结果。
发明内容
本发明的目的在于提供了一种食品和动物产品常见致病菌的MALDI-T0F-MS数据库的建立方法，建立了国内食品和动物产品中对人和动物有致病性的包括霍乱弧菌等常见病原菌的MALDI-T0F-MS数据库，可以广泛应用于各种人和动物致病菌的快速检测和鉴定。为了达到上述目的，本发明的技术方案是
一种食品和动物产品常见致病菌的MALDI-T0F-MS数据库的构建方法，包括如下步骤 1)样品的处理；2)数据的采集；3)数据分析；4)细菌数据库的建立；
所述的步骤1)中样品的处理方法为用液体培养基对各细菌进行增菌培养后做 MALDI-TOF-MS试验；MALDI-T0F-MS试验的具体步骤为取1 mL培养液于1. 5 mL的离心管，10000 rpm离心2 min,倒掉上清，加入1 mL灭菌生理盐水，充分混勻，10000 rpm离心 2 min，倒掉上清，重复洗一遍，充分去除培养基成分；然后进行细菌的固定灭活将清洗干净的细菌加入300 μ 纯净水，混勻后加入900 μ 无水乙醇，混勻，室温固定3_%iin，10000 rpm离心2 min，弃去上清；沉淀中加入50 μ 70%甲酸，混勻后再加入50 μ 乙腈，混勻， 室温放置3-4 min, 10000 rpm高速离心2 min，吸取上清点靶；先点1 μ 上清于样品靶盘上，同时点1 PL标准，待液体干后立即点1 PL基质。所述的液体培养基，当所采用的细菌为弧菌类时接种于碱性蛋白冻水的液体培养基中，其他类细菌接种于营养肉汤的液体培养基中。(购于北京陆桥技术有限公司)
所述的步骤2)中数据的采集是指利用仪器控制软件FlexControl (德国布鲁克公司生产的MALDI Biotyper高通量微生物鉴定仪自带软件)放入已点好的样品和标准的靶板， 利用仪器进行抽真空；然后对细菌的图谱进行采集用标准品数据对仪器进行校准后进行细菌样本数据的采集，每个样品孔采集1-2个叠加图，每个叠加图采集6-8个峰图，每株细菌的所有叠加图用同一菌种名保存在同一个文件目录下。所述的步骤3)中数据分析的判断标准为在BioTyper软件中，采用所述的判断标准来判断待检细菌与数据库里标准菌株质谱图的符合度，用得分表示，得分愈高，说明待测菌株的谱图同质谱库中某一标准菌株的谱图愈相近；所述的判断标准为当得分在 2. 300-3. 000之间(依据BioTyper分析软件的判断标准)标记为(+++)，用绿色表示，表明能完全判断为该种细菌，得分在2. 000 -2. 299之间，标记为(++)，用绿色表示，则表明能基本判为该种细菌，得分在1.700-1. 999之间，标记为(+ )，用黄色表示，则表明不能确定是否为该种细菌，得分在0. 000-1. 699之间，标记为(_)，用红色表示，表明能判断不是该种细菌。所述的步骤4)中细菌数据库的建立是指选择鉴定数据参数在2. 0-3. 0之间的叠加图(依据BioTyper分析软件的判断标准)去掉小于2. 0的叠加图，保证每个菌株的叠加图在20个以上；然后在BioTyper软件中(德国布鲁克公司生产的MALDI Biotyper高通量微生物鉴定仪自带软件)调入细菌的质谱数据，使其成为数据库中的标准菌株质谱图，建成数据库。本发明的有益效果是本发明采用国内分离的常见食品和动物产品的致病菌，这些菌株都应用传统生化方法或分子生物学方法进行确认，而且绝大部分经过德国布鲁克公司推出的MALDI BioTyper细菌鉴定数据库鉴定和确认，进而建立更加适合我国各种致病菌检测和鉴定的MALDI-TOF MS数据库，可以广泛应用于临床诊断、环境监测、微生物检验、动物检疫以及食品加工中的质量控制。应用MALDI-T0F-MS技术和本发明建立的常见病原菌的MALDI-T0F-MS图谱数据库，可以对食品和动物产品中包括霍乱弧菌在内的常见致病菌进行高通量、快速、准确的鉴定。
图1是本发明的沙门氏菌MALDI-TOF MS图谱； 图2是本发明的副溶血性弧菌MALDI-TOF MS图谱。
具体实施例方式实施例1
本实施例的一种食品和动物产品常见致病菌的MALDI-T0F-MS数据库的构建方法，包括如下步骤1)样品的处理；2)数据的采集；3)数据分析；4)细菌数据库的建立。所述的步骤1)中样品的处理方法为用液体培养基对各细菌进行增菌培养后做 MALDI-T0F-MS试验；所述的液体培养基，当所采用的细菌为弧菌类时接种于碱性蛋白冻水的液体培养基中，其他类细菌接种于营养肉汤的液体培养基中。均购于北京陆桥技术有限公司。MALDI-TOF-MS试验的具体步骤为取1 mL培养液于1. 5 mL的离心管，10000 rpm 离心2 min,倒掉上清，加入1 mL灭菌生理盐水，充分混勻，10000 rpm离心2 min，倒掉上清，重复洗一遍，充分去除培养基成分。然后进行细菌的固定灭活将清洗干净的细菌加入300 μ 纯净水，混勻后加入900 μ 无水乙醇，混勻，室温固定3_%iin，10000 rpm离心2 min，弃去上清(必要时，再离心一次，尽量去除乙醇)。沉淀中加入50 μ 70%甲酸，混勻后再加入50 μ 乙腈，混勻，室温放置3-4 min, 10000 rpm高速离心2 min,吸取上清点靶。 先点1 PL上清于样品靶盘上，同时点1 PL标准(校准)，待液体干后立即点1 PL基质。所述的步骤2)中数据的采集是指利用仪器控制软件FlexControl (德国布鲁克公司生产的MALDI Biotyper高通量微生物鉴定仪自带软件)放入已点好的样品和标准的靶板，按下仪器上的IN/OUT键进行抽真空。等FlexControl-microflex界面右下角的 ft·印aring由黄变绿则抽真空完毕。选择BioTyper par的采集方法对细菌的图谱进行采集。用标准品数据对仪器进行校准后进行细菌样本数据的采集。每个样品孔采集1-2个叠加图，每个叠加图采集6-8个峰图，每株细菌的所有叠加图用同一菌种名保存在同一个文件目录下。所述的步骤3)中数据分析的判断标准是待检细菌与数据库里标准菌株质谱图的符合度，用得分表示，得分愈高，说明待测菌株的谱图同质谱库中某一标准菌株的谱图(质量和峰高)愈相近。得分2. 300-3. 000之间，标记为(+++)，用绿色表示，可完全判断为该种细菌，得分在2. 000 -2. 299之间，标记为(++)，用绿色表示，则可基本判为该种细菌， 得分在1. 700-1. 999之间，标记为(+ )，用黄色表示，则不可确定是否为该种细菌，得分在 0. 000-1. 699之间，标记为(-)，用红色表示，可判断不是该种细菌。所述的步骤4)中细菌数据库的建立是指选择鉴定数据参数在2. 0-3. 0之间的叠
5加图，去掉小于2. 0的叠加图，保证每个菌株的叠加图在20个以上。在BioTyper软件中， 调入细菌的质谱数据，选择菜单命令MSP Creation/Create MSP —输入需建库的细菌名 —Project — New Node (0/0)开始数据库建立。利用本实施例的食品和动物产品常见致病菌的MALDI-T0F-MS数据库的构建方法，采用国内分离的常见食品和动物产品的致病菌，这些菌株都应用传统生化方法或分子生物学方法进行确认，而且绝大部分经过德国布鲁克公司推出的MALDI BioTyper细菌鉴定数据库鉴定和确认，进而建立更加适合我国各种致病菌检测和鉴定的MALDI-TOF MS数据库，本实施例所建立的MALDI-TOF MS数据库主要包括的细菌见表1。可以广泛应用于临床诊断、环境监测、微生物检验、动物检疫以及食品加工中的质量控制。实施例2
食品和动物产品中沙门氏菌的鉴定
本实施例的MALDI-TOF MS法检测和鉴定沙门氏菌的过程，包括如下步骤 1.增菌培养和纯化
按国内外相应的沙门氏菌增菌和纯化方法，对食品和动物样品中的沙门氏菌进行增菌培养和纯化，取单个可疑菌落转接种于营养肉汤，培养18-24 h后备用。2.菌落样品的处理取1 mL营养肉汤培养液(购于北京陆桥技术有限公司，货号 CM106,批号110212)于1. 5 mL的离心管，10000 rpm离心2 min,倒掉上清，加入1 mL灭菌生理盐水，充分混勻，10000 rpm离心2 min，倒掉上清，重复洗一遍，充分去除培养基成分。细菌的固定灭活将清洗干净的细菌加入300 PL纯净水，混勻后加入900 PL无水乙醇，混勻，室温固定3-^iin，10000 rpm离心2 min，弃去上清(必要时，再离心一次，尽量去除乙醇)。沉淀中加入50 μ 70%甲酸，混勻后再加入50 μ 乙腈，混勻，室温放置3_4 min, 10000 rpm高速离心2 min，吸取上清点靶。先点1 PL上清于样品靶盘上，同时点1 μ 标准(校准)，待液体干后立即点ι μ 基质。3. MALDI-TOF MS 图谱的采集
打开仪器控制软件FlexControl。放入已点好样品和标准的靶板，按下仪器上的IN/ OUT键进行抽真空。等FlexControl-microflex界面右下角的Pi^paring由黄变绿则抽真空完毕。选择BioTyper par的采集方法对细菌的图谱进行采集。用标准品数据对仪器进行校准后进行细菌样本数据的采集。每个样品孔采集1个叠加图，然后保存。其MALDI-T0F MS图谱见图1。4. MALDI-TOF MS 图谱的分析
应用仪器提供的用于数据分析的BioTyper软件，选择系统数据库和本实施例1所建立的食品和动物产品常见致病菌的MALDI-T0F-MS数据库，选中并调入样品数据，选择菜单命令Identification/start identification对细菌进行检测和鉴定。比对结果见表2。得分为2. 715，在所述的2. 300-3. 000之间，标记为(+++)，用绿色表示，可完全判断为沙门氏菌。实施例3
水产品中副溶血性弧菌的鉴定
本实施例的MALDI-TOF MS法检测和鉴定副溶血性弧菌的过程，包括如下步骤 1.增菌培养和纯化按国内外相应的副溶血性弧菌增菌和纯化方法，对水产品中的副溶血性弧菌进行增菌培养和纯化，取单个可疑菌落转接种于3. 5%盐的碱性蛋白胨水，(购于北京陆桥技术有限公司，货号CM401，批号100524)培养18-24 h后备用。2.菌落样品的处理
取1 mL培养液于1. 5 mL的离心管，10000 rpm离心2 min,倒掉上清，加入1 mL灭菌生理盐水，充分混勻，10000 rpm离心2 min，倒掉上清，重复洗一遍，充分去除培养基成分。细菌的固定灭活将清洗干净的细菌加入300 PL纯净水，混勻后加入900 PL无水乙醇，混勻，室温固定3-^iin，10000 rpm离心2 min，弃去上清(必要时，再离心一次，尽量去除乙醇)。沉淀中加入50 μ 70%甲酸，混勻后再加入50 μ 乙腈，混勻，室温放置3_4 min, 10000 rpm高速离心2 min，吸取上清点靶。先点1 PL上清于样品靶盘上，同时点1 μ 标准(校准)，待液体干后立即点ι μ 基质。3. MALDI-TOF MS 图谱的采集
打开仪器控制软件FlexControl。放入已点好样品和标准的靶板，按下仪器上的IN/ OUT键进行抽真空。等FlexControl-microflex界面右下角的Pi^paring由黄变绿则抽真空完毕。选择BioTyper par的采集方法对细菌的图谱进行采集。用标准品数据对仪器进行校准后进行细菌样本数据的采集。每个样品孔采集1个叠加图，然后保存。其MALDI-T0F MS图谱见图2。4. MALDI-TOF MS 图谱的分析
应用仪器提供的用于数据分析的BioTyper软件，选择系统数据库和本发明建立的食品和动物产品常见致病菌的MALDI-T0F-MS数据库，选中并调入样品数据，选择菜单命令 Identification/start identification对细菌进行检测和鉴定。比对结果见表3。得分为2. 707，在所述的2. 300-3. 000之间，标记为(+++)，用绿色表示，可完全判断为副溶血性弧菌。表1是本发明包括的主要病原菌种类。表1
序号细菌名称菌株数量序号细菌名称菌株数量1副溶血性弧菌3516阴沟肠杆菌12金黄色葡萄球菌2717格式李斯特13沙门氏菌2918英诺克李斯特14单增李斯特2219威尔李斯特15大肠杆菌1320绵羊李斯特16阪崎杆菌1621奇异变形杆菌17霍乱弧菌522表皮葡萄球菌18蜡样芽胞菌723松鼠葡萄球菌19铜绿假单胞菌424美人鱼弧菌110雷氏普罗威登斯菌225弗氏弧菌111溶藻弧菌226梅氏弧菌112巴氏舍杆菌227费氏柠檬酸菌113嗜水气单胞菌328创伤弧菌114嗜麦芽糖寡养单胞菌株229粪产碱菌115志贺氏菌330大肠杆菌01578
表2是本发明实施例中不同数据库中沙门氏菌的分析结果。
表 权利要求
1.一种食品和动物产品常见致病菌的MALDI-T0F-MS数据库的构建方法，其特征在于， 包括如下步骤1)样品的处理；2)数据的采集；3)数据分析4)细菌数据库的建立。
2.如权利要求1所示的一种食品和动物产品常见致病菌的MALDI-T0F-MS数据库的构建方法，其特征在于，所述的步骤1)中样品的处理方法为用液体培养基对各细菌进行增菌培养后做MALDI-T0F-MS试验；MALDI-T0F-MS试验的具体步骤为取1 mL培养液于 1.5 mL的离心管，10000 rpm离心2 min，倒掉上清，加入1 mL灭菌生理盐水，充分混勻， 10000 rpm离心2 min，倒掉上清，重复洗一遍，充分去除培养基成分；然后进行细菌的固定灭活将清洗干净的细菌加入300 μ 纯净水，混勻后加入900 μ 无水乙醇，混勻，室温固定3-%iin，10000 rpm离心2 min，弃去上清；沉淀中加入50 μ 70%甲酸，混勻后再加入50 μ 乙腈，混勻，室温放置3-4 min, 10000 rpm高速离心2 min,吸取上清点靶；先点1 μ 上清于样品靶盘上，同时点1 PL标准，待液体干后立即点1 PL基质。
3.如权利要求2所示的一种食品和动物产品常见致病菌的MALDI-T0F-MS数据库的构建方法，其特征在于，所述的液体培养基，当所采用的细菌为弧菌类时接种于碱性蛋白冻水的液体培养基中，其他类细菌接种于营养肉汤的液体培养基中。
4.如权利要求1所示的一种食品和动物产品常见致病菌的MALDI-T0F-MS数据库的构建方法，其特征在于，所述的步骤2)中数据的采集是指利用仪器控制软件FlexControl， 放入已点好的样品和标准的靶板，利用仪器进行抽真空；然后对细菌的图谱进行采集用标准品数据对仪器进行校准后进行细菌样本数据的采集，每个样品孔采集1-2个叠加图， 每个叠加图采集6-8个峰图，每株细菌的所有叠加图用同一菌种名保存在同一个文件目录下。
5.如权利要求1所示的一种食品和动物产品常见致病菌的MALDI-T0F-MS数据库的构建方法，其特征在于，所述的步骤3)中数据分析中的判断标准为在BioTyper软件中， 采用所述的判断标准来判断待检细菌与数据库里标准菌株质谱图的符合度，用得分表示， 得分愈高，说明待测菌株的谱图同质谱库中某一标准菌株的谱图愈相近；所述的判断标准为当得分在2. 300-3. 000之间，标记为(+++)，用绿色表示，表明能完全判断为该种细菌， 得分在2. 000 -2. 299之间，标记为(++)，用绿色表示，则表明能基本判为该种细菌，得分在1.700-1. 999之间，标记为(+ )，用黄色表示，则表明不能确定是否为该种细菌，得分在 0. 000-1. 699之间，标记为(_)，用红色表示，表明能判断不是该种细菌。
6.如权利要求1所示的一种食品和动物产品常见致病菌的MALDI-T0F-MS数据库的构建方法，其特征在于，所述的步骤4)中细菌数据库的建立是指选择鉴定数据参数在 2. 0-3. 0之间的叠加图，去掉小于2. 0的叠加图，保证每个菌株的叠加图在20个以上；然后在BioTyper软件中，调入细菌的质谱数据，使其成为数据库中的标准菌株质谱图，建成数据库。
全文摘要
本发明公开了一种食品和动物产品常见致病菌的MALDI-TOF-MS数据库的构建方法，包括如下步骤1)样品的处理；2)数据的采集；3)数据分析；4)细菌数据库的建立。本发明建立了国内食品和动物产品中对人和动物有致病性的包括霍乱弧菌等常见病原菌的MALDI-TOF-MS数据库，可以广泛应用于各种人和动物致病菌的快速检测和鉴定。
文档编号G01N27/64GK102520055SQ20111040587
公开日2012年6月27日 申请日期2011年12月8日 优先权日2011年12月8日
发明者叶妍妍, 孔繁德, 徐淑菲, 杨俊萍, 郭书林, 陈信忠, 龚艳清 申请人:厦门出入境检验检疫局检验检疫技术中心