专利名称：一种伽马-羟基丁酸的测定诊断试纸及其制备方法
一种伽马-羟基丁酸的测定诊断试纸及其制备方法技术领域
本发明属于伽马-羟基丁酸的测定领域，特别涉及一种伽马-羟基丁酸的测定诊断试纸及其制备方法。
背景技术：
伽玛-羟基丁酸的药理作用GHB学名为gamma hydroxybutyrate。是一种无色、 无嗅、无味液体，亦有白色粉末、药片和胶囊等剂型。属於中枢神经抑制剂具成瘾性，曾用来当做全身麻醉剂、帮助睡眠及健身，目前GHB并没有合法医疗用途，反而与滥用药物、中毒、 过量和约会强暴有关。
其毒理作用临床显示，低剂量的GHB可产生欣快感、可减轻焦虑产生松弛作用； 高剂量时会产生镇静作用，会让人睡觉，最后昏迷或死亡。通常口服十毫克，会产生暂时性记忆丧失、三十毫克会促进睡眠，而一次使用达二十公克就会造成中毒，类似的症状包括: 恶心、呕吐、头痛、反射作用丧失，可能很快失去意识、昏迷及死亡，与酒精并用会更加剧其危险性。
其滥用性口服GHB通常被制成颗粒或粉末状，溶於液体中例如开水、酒或其他种类之饮料后食用。GHB服用后10到20分钟即发生作用，服用后会产生类似喜悦、酒醉及催情的效果，加上其药效快且短时间不易清醒及可具有产生暂时性记忆丧失的效果，常使被害人误喝饮料受侵害后，还无法回忆起被害人，因而被滥用，甚至用以犯案，最近流行於青少年与较年轻之成人中，被滥用之场所多发生於俱乐部之内。在美国GHB被列为第一级管制药品。
伽玛-羟基丁酸，俗称“液体快乐丸”、“神仙水”、“G水”，在欧美国家已是非常严重泛滥的毒品，港、澳、台的滥用对象以青少年为主，在我国系管制麻醉类药品。吸食“神仙水”可以使人通宵达旦地歌舞狂欢而不知疲惫，更有甚者两天两夜都不睡眠，精神处于极度亢奋或幻想状态。某些贩毒分子为了增大毒品“神仙水”销量，将其他新型毒品掺杂在“神仙水”之中以增强其毒性，使其对吸毒人员更具诱惑性。已经被列为一种“约会强暴丸。，，
因此，毒品“神仙水”的发展蔓延之势不可小觑，极有可能发展成为继冰毒、“摇头丸”、“K”粉之後，又一被严重滥用的新型毒品。鉴于其来势猛、危害大、隐蔽性强等特点，禁毒部门和公安部门已经引起高度重视，在公开查缉和易涉毒娱乐场所管理整治工作中要求切实加大对各类口服液、液体包装物等的检查、分辨力度，因此快速测定和检出BHB，研制检测试剂就显得非常必要。发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种伽马-羟基丁酸的测定诊断试纸及其制备方法，该试纸具有操作方便，检测快速，灵敏度好，准确性高等优点，可以定性和半定量检测常规液体。
本发明的一种伽马-羟基丁酸(Y-羟基丁酸，4-羟基丁酸)的测定诊断试纸，所述试纸包括如下试剂
(1)第一相浸液
稳定剂和/或保护剂I-IOg ；
牛血清白蛋白20-2000mg ；草酸 200_2000mg ；
NAD+(辅酶 1)0. 1-2. Og ；NADP+(辅酶 11)0. 01-1. Og ；
黄递酶200_20000iu ；4_ 羟基丁酸脱氢酶 200_10000u ；
补加缓冲液至总体积为100 150ml ；
(2)第二相浸液
氯化硝基四氮唑蓝NBT 0. 1-0. 5g ；
吩嗪二甲酯硫酸盐PMS 0. 02-0. 2g ；
补加有机溶剂至总体积为100 150ml。
所述稳定剂和/或保护剂为明胶、阿拉伯胶、聚乙二醇、聚丙烯酸-丙烯酸酯中的一种或几种。
所述缓冲液为pH = 5. 8-8. 8的40-80mmol/L Tris-丙二酸缓冲液或磷酸盐缓冲液。
所述有机溶剂为乙醇或甲醇。
本发明的一种伽马-羟基丁酸的测定诊断试纸的制备方法，包括
(1)将滤纸在第一相浸液中浸泡3-8分钟后，于20-50°C干燥，再在第二相浸液中浸泡3-8分钟后，于20-50°C再次干燥，得到测定试纸的原纸；
(2)将上述测定试纸的原纸粘贴在塑料片基上，切割成块，制得测定试剂条。
所述步骤⑵中的试剂条的规格为0. 3X0. 3 0. 8X0. 8cm2。
本发明的反应原理如下
4-羟基丁酸脱氢酶4-羟基丁酸+NAD (P)+^乙酰乙酸+NAD (P) H+H+
DiaphoraseNAD(P)H+NBT^ NAD(P)+ + formazan
NAD (P) H+PMS--- NAD (P) ++PMS · H2
PMS · H2+NBT---- PMS+formazan
其中，NAD+:辅酶I;
NADH 还原辅酶 I ；
NADP 辅酶 II ；
NADPH 还原辅酶 II;
Diaphorase 黄递酶；
NBT 硝基四氮唑蓝，氯化硝基四氮唑蓝一类显色剂；
PMS 吩嗪二甲酯硫酸盐；
formazan 甲臜(为蓝紫色化合物)；
生成的f0rmazan的显色程度与待测体液的4_羟基丁酸浓度正相关，可以印制成标准色卡附加在包装材料(密封袋或说明书)上，显色的程度与标准色可比较从而半定量测定4-羟基丁酸浓度。因为被检出的底物浓度往往较高，检出的显色反应经常非常显著。
有益效果
本发明的诊断试纸可以组装成多种检测装置，且具有操作方便，检测快速，灵敏度好，准确性高等优点，可以定性和半定量检测常规液体(牛奶、酒类、碳酸饮料等等)。对于饮用者或者被害人的血液(如血清/全血)、尿液和唾液中残留的4-羟基丁酸的含量，也可以被检出，可以应用于对滥用药物和犯罪行为的打击，因此具有良好的应用前景。
图1为试剂块与PVC片所组成的检测装置；
图2为由试剂块、滤血膜、两片PVC片所组成的检测装置的显色面；
图3为由试剂块、滤血膜、两片PVC片所组成的检测装置的加样面。
具体实施方式
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明讲授的内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
实施例1
第一相酶溶液液总体积为IOOmL的配制过程如下
1)溶入阿拉伯胶5g ；
2)溶入牛血清白蛋白500mg ；
3)溶入草酸 300mg ；
4)溶入 NAD+0. 5g, NADP+O. 2g ；
5)溶入黄递酶，IOOOOiu ；
6)溶入4-羟基丁酸脱氢酶IOOOOu ；
7)加入 pH8. 0 的 50mmol/L Tris-丙二酸缓冲液至 IOOml ；
第一相溶液浸渍
溶液制备好后，加入浸渍机，将一卷Whatman 3匪滤纸安装好，烘干温度设定 30°C，走纸速度设定3. Omm/秒，开始浸渍走纸，溶液浸完后滤纸在烘干箱停留1小时，以便完全烘干；
第二相溶液制备
溶入氯化硝基四氮唑蓝250mg ；(即浓度为0. 25g/100ml)
吩嗪二甲酯硫酸盐IOOmg ；(即浓度为0. 10g/100ml)
以无水乙醇IOOml为溶剂。
第二相溶液浸渍
将第二相溶液加入浸渍机，将浸好第一相的滤纸安装好，烘干温度设定45°C，走纸速度设定3. Omm/秒，开始浸渍走纸，溶液浸完后滤纸在烘干箱停留1小时，以便完全烘干， 至此原纸制作完成。
试纸制作取一段原纸，单面贴好双面胶，用5mm滚刀切成5mm细条，将细条贴在 8cm*25cm宽的pvc薄片上，在用滚刀切成5mm宽的试剂条，放到黑色密闭瓶中，放好干燥剂
碳酸饮料4-羟基丁酸浓度的测定
4-羟基丁酸钠(sigma)
可乐饮料，称取12. 60mg 4_羟基丁酸钠，加入可乐饮料中溶解为100ml，分别用可乐饮料稀释成 0 μ mol/L, 50 μ mol/L, 100 μ mol/L, 200 μ mol/L, 500 μ mol/L, 1000 μ mol/L L 六种浓度。取六根实施例1制备的试剂条同时浸入上述六种溶液中，约十秒钟取出，用吸水纸吸去多余水分，然后两分钟看颜色，结果从阴性的黄色到1000 μ mol/L的深紫色各梯度区分明显。
实施例2
第一相酶溶液液总体积为IOOmL的配制过程如下
1)溶入阿拉伯胶IOg ；
2)溶入牛血清白蛋白20mg ；
3)溶入草酸 200mg;
4)溶入 NAD+0. lg, NADP+O. Olg ；
5)溶入黄递酶，200iu ；
6)溶入4-羟基丁酸脱氢酶200u ；
7)加入 pH6. 0 的 40mmol/L Tris-丙二酸缓冲液至 100ml ；
第一相溶液浸渍
溶液制备好后，加入浸渍机，将一卷Whatman 3匪滤纸安装好，烘干温度设定 30°C，走纸速度设定3. Omm/秒，开始浸渍走纸，溶液浸完后滤纸在烘干箱停留1小时，以便完全烘干；
第二相溶液制备
溶入氯化硝基四氮唑蓝IOOmg ；
吩嗪二甲酯硫酸盐20mg ；
以无水乙醇100ml为溶剂。
第二相溶液浸渍
将第二相溶液加入浸渍机，将浸好第一相的滤纸安装好，烘干温度设定45°C，走纸速度设定3. Omm/秒，开始浸渍走纸，溶液浸完后滤纸在烘干箱停留1小时，以便完全烘干， 至此原纸制作完成。
试纸制作取一段原纸，单面贴好双面胶，用5mm滚刀切成5mm细条，将细条贴在 8cm*25cm宽的pvc薄片上，在用滚刀切成5mm宽的试剂条，放到黑色密闭瓶中，放好干燥剂备用。(图1)
全血标本4-羟基丁酸浓度的测定
取一段原纸用8mm滚刀切成8mm细条，然后再用剪刀剪成方块备用，在8cm*25cm 宽的pvc薄片单侧贴好双面胶，然后用8mm滚刀切成8mm宽的细条，在距一端IOmm处打直径5mm的孔，将试剂块贴在打孔的位置上，试剂块上面覆盖一块10mm*5mm的滤血膜，备用。 (图2)
取10份用雅培C8000生化仪测定4_羟基丁酸的血样用上述试条测定，结果阴阳性，及阳性标本的浓度，基本和生化仪的结果相符。
实施例3
第一相酶溶液液总体积为IOOmL的配制过程如下
1)溶入明胶Ig;
2)溶入牛血清白蛋白2000mg ；
3)溶入草酸 2OOOmg ；
4)溶入 NAD+2g，NADP+Ig ；
5)溶入黄递酶，20000iu ；
6)溶入4-羟基丁酸脱氢酶IOOOOu ；
7)加入 ρΗ8· 7 的 80mmol/L Tris-丙二酸缓冲液至 150ml ；
第一相溶液浸渍
溶液制备好后，加入浸渍机，将一卷Whatman 3匪滤纸安装好，烘干温度设定 30°C，走纸速度设定3. Omm/秒，开始浸渍走纸，溶液浸完后滤纸在烘干箱停留1小时，以便完全烘干；
第二相溶液制备
溶入氯化硝基四氮唑蓝500mg ；
吩嗪二甲酯硫酸盐200mg ；
以无水乙醇150ml为溶剂。
第二相溶液浸渍
将第二相溶液加入浸渍机，将浸好第一相的滤纸安装好，烘干温度设定45°C，走纸速度设定3. 0mm/，开始浸渍走纸，溶液浸完后滤纸在烘干箱停留1小时，以便完全烘干，至此原纸制作完成。
试纸制作取一段原纸，单面贴好双面胶，用5mm滚刀切成5mm细条，将细条贴在 8cm*25cm宽的pvc薄片上，在用滚刀切成5mm宽的试剂条，放到黑色密闭瓶中，放好干燥剂备用。(图1)
尿液4-羟基丁酸浓度的测定
4-羟基丁酸钠(sigma)
阴性尿液3-羟基丁酸，称取12. 60mg3-羟基丁酸钠，加入IOOm阴性尿液中溶解， 分别用阴性尿液稀释成 0 μ mol/L, 100 μ mol/L 200 μ mol/L, 500 μ mol/L, 1000 μ mol/L 五种浓度。取5根实例3制备的试剂条同时浸入上述5种溶液中，约十秒钟取出，用吸水纸吸去多余水分。
然后两分钟看颜色，结果从0的黄色到1000 μ mol/L的深紫色各梯度区分明显。
权利要求
1. 一种伽马-羟基丁酸的测定诊断试纸，其特征在于所述试纸包括如下试剂 (1)第一相浸液稳定剂和/或保护剂I-IOg;补加缓冲液至总体积为100 150ml;(2)第二相浸液氯化硝基四氮唑蓝NBT 0. 1-0. 5g ； 吩嗪二甲酯硫酸盐PMS 0. 02-0. 2g ； 补加有机溶剂至总体积为100 150ml。
2.根据权利要求1所述的一种伽马-羟基丁酸的测定诊断试纸，其特征在于所述稳定剂和/或保护剂为明胶、阿拉伯胶、聚乙二醇、聚丙烯酸-丙烯酸酯中的一种或几种。
3.根据权利要求1所述的一种伽马-羟基丁酸的测定诊断试纸，其特征在于所述缓冲液为PH = 5. 8-8. 8的40-80mmol/L Tris-丙二酸缓冲液或磷酸盐缓冲液。
4.根据权利要求1所述的一种伽马-羟基丁酸的测定诊断试纸，其特征在于所述有机溶剂为乙醇或甲醇。
5.一种伽马-羟基丁酸的测定诊断试纸的制备方法，包括(1)将滤纸在第一相浸液中浸泡3-8分钟后，于20-50°C干燥，再在第二相浸液中浸泡 3-8分钟后，于20-50°C再次干燥，得到测定试纸的原纸；(2)将上述测定试纸的原纸粘贴在塑料片基上，切割成块，制得测定试剂条。
6.根据权利要求5所述的一种伽马-羟基丁酸的测定诊断试纸的制备方法，其特征在于所述步骤O)中的试剂条的规格为0. 3X0. 3 0. 8X0. 8cm2。牛血清白蛋白20-2000mg; NAD+ 0.1-2.0g; 黄递酶 200-20000iu;草酸 200-2000mg;NADP+ 0.01-1.0g;4-羟基丁酸脱氢酶200-10000U;
全文摘要
本发明涉及一种伽马-羟基丁酸的测定诊断试纸及其制备方法，试纸包括第一相浸液和第二相浸液。制备方法包括(1)将滤纸在第一相浸液中浸泡3-8分钟后，于20-50℃干燥，再在第二相浸液中浸泡3-8分钟后，于20-50℃再次干燥，得到测定试纸的原纸；(2)将上述测定试纸的原纸粘贴在塑料片基上，切割成块，制得测定试剂条。本发明的诊断试纸可以组装成多种检测装置，且具有操作方便，检测快速，灵敏度好，准确性高等优点，可以定性和半定量检测常规液体，对于饮用者或者被害人的血液、尿液和唾液中残留的4-羟基丁酸的含量，也可以被检出，因此具有良好的应用前景。
文档编号G01N21/76GK102520150SQ20111040580
公开日2012年6月27日 申请日期2011年12月8日 优先权日2011年12月8日
发明者孙大尼, 王福进, 管利丰 申请人:上海高丰医疗电器有限公司, 上海高丰科技有限公司