一种食品中致病菌定量检测方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及食品微生物检测领域，具体涉及一种食品微生物的快速检测方法，尤 其涉及一种食品中致病菌的定量检测方法。
【背景技术】
[0002] 食品安全是一个世界性的影响人类健康的重大问题，其与人类生存环境和社会稳 定息息相关。其中细菌性食物中毒的危害最为严重，感染者轻可造成发热、头痛、腹痛、腹泻 和呕吐，重则会出现肌肉痉挛，甚至休克直至死亡，因此微生物的检验成为食品检测必不可 少的重要组成部分，是衡量食品卫生质量的重要指标之一，也是判定被检食品能否食用的 科学依据之一。通过食品微生物检验，还可以判断食品加工卫生环境，能够对食品被细菌污 染的程度做出正确的评价，为各项卫生管理工作提供科学依据，提供传染病和人畜食物中 毒的防治措施。
[0003] 据统计，目前导致细菌性食物中毒的细菌种类中，最常见的主要是沙门氏菌、单核 细胞增生性李斯特菌、金黄色葡萄球菌、志贺氏菌、大肠杆菌等等。针对这些细菌及其他 易危害人体健康的食品微生物，现有的检测方法主要依赖于微生物富集培养-选择性分 离-生化鉴定方法，该方法存在手工操作繁琐费时、检测灵敏度低、易出现假阴性等缺陷， 且卫生指导反馈慢，给商品生产和流通带来一定的影响。此外还有常用的免疫学方法和基 因探针法，前者虽能弥补传统方法的一些不足，但也有误差大、周期长的局限性；而后者也 存在检测费用昂贵、实验步骤多且费时的缺点。因此研宄食品微生物快速、准确、经济的检 测方法以预防和控制食品安全事件的发生，具有重要的现实意义。
[0004] 针对上述问题，近年来微生物学专家和工程技术人员密切合作，采用了各种物理 化学及生物技术对如何快速准确经济的鉴定微生物进行了研宄分析，如采用了光散射技 术、发光技术、色谱技术、电气电子技术、免疫技术及放射技术等，并基于上述分析技术发明 了许多定性或定量鉴定微生物的分析方法。常见的有：（1)检测某些细菌的专有酶及代谢 产物进行快速鉴定；（2)应用免疫学方法检测微生物抗原或抗体，如放射免疫分析（RIA)、 酶免疫分析（EIA)、荧光免疫分析（FIA)、化学发光免疫分析（CIA)、生物发光免疫分析 (BIA)等；（3)细菌毒素的快速检测；(4)细菌对抗菌药物的敏感性试验的快速检测；(5)分 子生物学技术在检测微生物中的应用，如核酸探针（Nuclear acid probe)、聚合酶链反应 (Polymerase chain reaction，PCR)、基因芯片技术（microarray)等；（6)快速检测细菌生 化反应及成套鉴定系统；（7)病原微生物的自动化系统，其中最有代表性的是AMS微生物自 动分析系统。
[0005] 目前应用最多的是采用多重PCR方法来进行食品中微生物的检测，例如杨国兴在 多重PCR检测肉及肉制品中四种食源性致病菌的研宄中，根据金黄色葡萄球菌的耐热核酸 酶基因 nuc、沙门氏菌的侵染性质粒抗原B基因 ipaB、志贺氏菌的侵染性质粒抗原H基因 ipaH、单核增生李斯特氏菌的内化素 A基因 inlA设计了四对特异性引物，进行多重PCR反 应，可同时实现对四种食源性致病菌的检测；试验过程中对多重PCR反应体系中引物添加 量、镁离子浓度、dNTP混合物添加量及退火温度和循环数等影响要素进行优化，确定了适宜 的多重PCR反应体系和扩增程序（参见杨国兴，"多重PCR检测肉及肉制品中四种食源性 致病菌的研宄"，中国优秀硕士学位论文数据库，2008年6月10日）；另外，苏裕心在建立 几种食源性致病菌荧光定量PCR的检测方法时，采用通过lambda噬菌体DNA标准物质候选 物的制备研宄，进行金黄色葡萄球菌、痢疾志贺菌、沙门氏菌、肉毒梭菌等食源性致病菌DNA 基因组定量标准物质的制备研宄；并利用SmartCycler系统建立一种高敏、特异、简便、快 速的qPCR检测金黄色葡萄球菌、痢疾志贺菌、沙门氏菌、肉毒梭菌等食源性致病菌的方法， 并在LightCycler2. 0, ABI 7300仪器上对所建立的体系进行评估（参见苏裕心，"几种食 源性致病菌荧光定量PCR检测方法的建立"，中国优秀硕士学位论文数据库，2010年5月26 日）。从目前的研宄来看，对于食品微生物进行多重PCR检测时，主要集中在对PCR程序的 改进上，其存在微观、不易操作的缺陷，并对设备和实验室的要求比较高，而且容易出现假 阳性和假阴性样本。
[0006] 目前也有一些研宄证实，通过调整混合培养基可以有效增殖致病菌，从而有助于 定量检测食品中的微生物，例如杨军等研宄了多重PCR法对食品中3种致病菌的同时快速 检测，其通过调整混合培养基的配比摸索了食品中金黄色葡萄球菌、沙门氏菌和志贺氏菌 的快速共增菌条件，使得3种致病菌在37°C摇床培养后浓度达到IO fVmL(参见杨军等，"多 重PCR法对食品中3种致病菌的同时快速检测"，中国乳品工业，第38卷第4期，2010年4 月25日）。然而，由于该研宄只针对上述3种致病菌的检测，其存在一定的局限性，而对于 食品中的其它致病菌是否能够进行同时快速检测尚未知否。
[0007] 上述各种方法与传统检测方法相比，在高效快速方面虽已具有较大的进步，但仍 不能适应日益严格的食品质量检测方面的高要求。而且，上述各方法中PCR鉴定方法基本 上具备了食品微生物检验新要求的各种条件，但在实际操作中仍会存在假阳性和无法判断 微生物活性状态等问题，因此如何寻找一种灵敏度高、特异性好，经济、简便的食品尤其是 食品中致病菌的定量检测方法是目前亟待解决的问题。
[0008] CN103388031A中公开了一种结合非特异性扩增和多点RTQ-PCR的食品微生物检 测方法，虽然其公开了将非特异性扩增培养、多点实时定量采样及特异性实时定量PCR鉴 定技术结合起来，并根据PCR结果进行数据分析来检测食品微生物的方法，然而，其所用的 非特异性扩增培养基为缓冲蛋白胨水，其对于沙门氏菌的扩增效果较好，但对于其它微生 物的扩增效果却有限，因此，有必要寻找一种适合同时扩增多种食品微生物并使其均达到 良好扩增效率的非特异性扩增培养基；另外，该方法中对于最优的非零时刻的选取并不明 确，其分别在3h、6h、9h和24h进行了检测，在表1中列举了 6h、8h、10h和12h所对应的Ct 值，尽管从表1中可以看出Ct值成下降趋势，然而，其首先并未明确在哪个非零时刻的选取 可以同时使各种微生物的扩增实现最大效率，另外，更没有明确Ct值选取何值时可以判定 食品中含有致病菌，甚至致病菌中活菌和死菌的情况，因此，如何明确上述问题也是目前急 需解决的一个问题。
【发明内容】
[0009] 本发明的目的之一在于提供一种食品中致病菌的定量检测方法，特别提供了一种 在短时间内判断出食品中致病菌的污染程度、活菌比例、致病菌活性状况及污染历史的定 量检测方法，通过该方法可以由目前使用的7天的细菌培养方法缩短至24小时；准确度由 目前的生理生化标准提高至分子水平；灵敏度可以达到单个菌；准确度和特异性都可以在 99%以上。
[0010] 为达到此发明目的，本发明采用以下技术方案：
[0011] 第一方面，本发明提供了一种食品中致病菌定量检测方法，其包括以下步骤： [0012] (1)扩增步骤：将疑似含有目标致病菌的样品通过非特异性培养进行致病菌的扩 增；
[0013] (2)实时定量取样步骤：在步骤（1)所述