一种伊蚊a型和库蚊沃尔巴克氏体的荧光检测引物及其检测方法和检测试剂盒的制作方法
【技术领域】：
[0001] 本发明属于分子生物学领域，具体涉及一种伊蚊A型和库蚊沃尔巴克氏体的荧光 检测引物及其检测方法和检测试剂盒。
【背景技术】：
[0002] 沃尔巴克氏体（Wolbachia)是广泛分布于节肢动物体内的共生微生物，它可能是 昆虫共生微生物中最为丰富的类群。它分布于鞘翅目、双翅目、半翅目、同翅目、膜翅目、鳞 翅目等昆虫种类中。它以垂直传播作为其在宿主世代间传递的基本模式。它稳定地存在于 宿主的生殖细胞内，通过卵细胞传递给宿主子代，并可通过多种方式如细胞质不亲和、雌性 化和杀雄性等调控宿主的生殖活动。通过这些调控作用促进其在宿主种群内广泛传播。
[0003] 在沃尔巴克氏体（Wolbachia)引起的宿主生殖行为改变中，细胞质不亲和 (Cytoplasmic Incompatibility，Cl)是最常见的一种类型。它表现为当被沃尔巴克氏 体（Wolbachia)感染的雄蚊与未感染雌蚊或感染不同种类Wolbachia的雌雄蚊交配时，精 子和卵子结合后胚胎无法发育。沃尔巴克氏体（Wolbachia)的胞质不亲和的特性可导致 Wolbachia感染的蚊能侵入未感染或感染不同种Wolbachia的蚊群进行种群压制和种群替 代。它的应用对蚊媒病防治具有巨大的价值。近期研宄发现，沃尔巴克氏体（Wolbachia) 不仅具有上述的特性外，同时它还能在蚊子体内与蚊子携带的一些重要的病原生物（如 登革病毒，疟原虫等）相互作用，抑制它们在蚊子体内的增值和扩散从而在阻断这些病原 生物传播于人类。沃尔巴克氏体（Wolbachia)的这种抑制作用与它在蚊子体内组织的分 布相关，所以，了解沃尔巴克氏体（Wolbachia)在蚊子体内组织分布有助于快速筛选出传 播阻断效果最好的沃尔巴克氏体（Wolbachia)感染的蚊子，也有助于监测沃尔巴克氏体 (Wolbachia)在蚊群中的垂直传播，同时也有利于高效率地监测大规模大地域范围的沃尔 巴克氏体（Wolbachia)在蚊子组织中的感染情况。
[0004] 在自然界中，蚊子的种类有很多，常见的有伊蚊和库蚊两种。伊蚊分为白纹伊蚊和 埃及伊蚊，其中埃及伊蚊不携带沃尔巴克氏体。由于沃尔巴克氏菌只能存活于宿主体内，不 能在体外自由生活，因而如何有效特异地检测沃尔巴克氏菌是对该细菌研宄的必备工具。 比较常用的检测手段有聚合酶链反应法（PCR法）和免疫染色法。免疫染色法耗时耗力，而 且特异性不好。随着PCR方法的普及，针对沃尔巴克氏体的检测有了很大的进步。不同蚊 种携带不同的沃尔巴克氏体，通过PCR结果能够直观的看出蚊子携带的不同沃尔巴克氏体 类型，这样为我们的日常检测提供了很大的便利。目前针对不同沃尔巴克氏体PCR检测的 方法还不完善。
【发明内容】
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[0005] 本发明的目的是提供一种专一性强、特异性高和灵敏度高的伊蚊A型和库蚊沃尔 巴克氏体的荧光检测引物。
[0006] 本发明的伊蚊A型和库蚊沃尔巴克氏体的荧光检测引物，其特征在于，包括
[0007] (1)针对伊蚊A型沃尔巴克氏体：
[0008] wAlbAF :5' -GACATCAGGGTTGATGTTGA-3'（其核苷酸序列如 SEQ ID NO. 1 所示）；
[0009] wAlbAR :5'-GGAGTGATAGGCATATCTTCAAT-3'（其核苷酸序列如 SEQ ID NO. 2 所示）；
[0010] 探针 A :5' -ATTTACCCCAGCAGATACTATTGCG-3'（其核苷酸序列如 SEQ ID NO. 3 所 示）；
[0011] 探针A的两端分别结合有荧光发生基团FAM和荧光淬灭基团BHQl ;
[0012] (2)针对库蚊沃尔巴克氏体：
[0013] wPipF :5' -GCAGGGCTATATTTTGGG-3'（其核苷酸序列如 SEQ ID NO. 4 所示）；
[0014] wPipR :5' -ATCAGTTTCTAGGTCATT-3'（其核苷酸序列如 SEQ ID NO. 5 所示）；
[0015] 探针 B :5' -TCATCTATTAATAAAATAGGAGTATTACTAT-3'（其核苷酸序列如 SEQ ID NO. 6所示）；
[0016] 探针B的两端分别结合有荧光发生基团HEX和荧光淬灭基团BHQl。
[0017] 本发明的第二个目的是提供一种非疾病的诊断和治疗目的的伊蚊A型和库蚊沃 尔巴克氏体的检测方法，其特征在于，提取样品DNA，以该样品DNA为模板，使用上述伊蚊A 型和库蚊沃尔巴克氏体的荧光检测引物wAlbAF、wAlbAR、探针A、wPipF、wPipR和探针B，进 行荧光定量PCR扩增，扩增反应完成后，根据探针标记的荧光发生基团的荧光信号，读取并 记录样品的PCR循环次数Ct，根据样品的Ct值，按照建立的判断标准，判断样品是否含有伊 蚊A型和库蚊沃尔巴克氏体。
[0018] 所述的进行荧光定量PCR扩增，其反应条件优选为：预变性50°C 5分钟，95°C 15分 钟；扩增94°C 15秒、55°C 45秒，40个循环；55°C的时候收集荧光信号。
[0019] 本发明的第三个目的是提供一种伊蚊A型和库蚊沃尔巴克氏体的检测试剂盒，包 括荧光检测引物和PCR试剂，其特征在于，所述的荧光检测引物包括
[0020] (1)针对伊蚊A型沃尔巴克氏体：
[0021] wAlbAF :5' -GACATCAGGGTTGATGTTGA-3' ；
[0022] wAlbAR :5' -GGAGTGATAGGCATATCTTCAAT-3' ；
[0023] 探针 A :5' -ATTTACCCCAGCAGATACTATTGCG-3' ；
[0024] 探针A的两端分别结合有荧光发生基团FAM和荧光淬灭基团BHQl ;
[0025] (2)针对库蚊沃尔巴克氏体：
[0026] wPipF :5' -GCAGGGCTATATTTTGGG-3' ；
[0027] wPipR :5' -ATCAGTTTCTAGGTCATT-3' ；
[0028] 探针 B :5' -TCATCTATTAATAAAATAGGAGTATTACTAT-3' ；
[0029] 探针B的两端分别结合有荧光发生基团HEX和荧光淬灭基团BHQl。
[0030] 利用本发明的荧光检测引物按照本发明的检测方法能够快速高效专一的检测出 伊蚊A型和库蚊沃尔巴克氏体，具有专一性强，特异性高（只检测出伊蚊A型和库蚊沃尔巴 克氏体，而伊蚊B型沃尔巴克氏体不发生扩增），灵敏度高，其最低检测限为lOOcopies/ml。
[0031] 因此，本发明具有快速高效、操作简便、高特异性、高灵敏度、鉴定简便等优点。
【附图说明】：
[0032] 图1是伊蚊A型沃尔巴克氏体的灵敏度的实验结果图，其中I、II、III、IV分别代表 DNA抽提液，10、100、1000倍稀释的DNA抽提液；
[0033] 图2是库蚊沃尔巴克氏体的灵敏度的实验结果图，其中I、II、III、IV分别代表DNA 抽提液，10、100、1000倍稀释的DNA抽提液；
[0034] 图3是伊蚊A型和库蚊沃尔巴克氏体的重复性的实验结果图，其中I、11分别代表 不同的样品的扩增曲线；
[0035] 图4是FAM检测通道对A型沃尔巴克氏体的特异性的实验结果图；
[0036] 图5是FAM检测通道对B型和wPip型沃尔巴克氏体（库蚊沃尔巴克氏体）的特 异性的实验结果图；
[0037] 图6是HEX检测通道对wPip型沃尔巴克氏体（库蚊沃尔巴克氏体）的特异性的 实验结果图；
[0038] 图7是HEX检测通道对A型和B型沃尔巴克氏体的特异性的实验结果图。
【具体实施方式】：
[0039] 以下实施例是对本发明的进一步说明，而不是对本发明的限制。
[0040] 实施例1 :灵敏度
[0041] 一、伊蚊A型沃尔巴克氏体的灵敏度
[0042] 1、一只携带伊蚊A型沃尔巴克氏体的蚊子经二氧化碳熏晕后，解剖腹部置于 0· 2ul EP 管中；
[0043] 2、加入 20ulDNA 提取液（DNA 提取液的配方为：30mM Na0H、0. 25mM EDTA、 15mMTris-HCl，溶剂为水，使用前需振荡，将白色片状物一同加入）；
[0044] 3、充分混匀；
[0045] 4、瞬时离心后，99°C温浴10分钟；
[0046] 5、得到DNA抽提液，-20 °C保存，即获得伊蚊A型沃尔巴克氏体的基因组DNA ;
[0047] 6、将DNA抽提液进行10,100,1000梯度稀释，每个梯度有两个平行，共8个样本， 作为模板DNA进行PCR扩增；
[0048] 7、PCR扩增体系：
[0049] 模板 DNA 2 μ I、PCR A 液 18 μ 1 和 PCR B 液 2 μ 1。
[0050] 所述的 PCR A 液，每 18 μ 1 含有 IOpmol 荧光检测引物 wAlbAF(5'-GACATCAGGGTTG ATGTTGA-3'）、10pmol 荧光检测引物 wAlbAR(5' -GGAGTGATAGGCATATCTTCAAT-3'）、5pmol 探 针A(5' -ATTTACCCCAGCAGATACTATTGCG-3'，探针的两端分别结合有荧光发生基团FAM和荧 光淬灭基团 BHQl)，IOpmol 荧光检测引物 wPipF(5' -GCAGGGCTATATTTT GGG-3'）、10pmol 荧 光检测引物 wPipR (5' -ATCAGITTCTAGGTCATT-3'）、5pmol 探针 B (5' -TCATCTATTAATAAAATAGG AGTATTACTAT-3'，探针的两端分别结合有荧光发生基团HEX和荧光淬灭基团BHQl)，其余为 pH值为8. 0的缓冲液。所述的缓冲液成份为50mmol/L Tri s-HCl、8mmol/L MgC12、250mmol/ L KCl，溶剂为水。
[0051] 所述的PCR B液由热启动Taq酶、逆转录酶、dNTPs组成，每2 μ I PCR B液中含有 热启动Taq酶5U、逆转录酶2. 5U和dNTPs lOmmol，其余为水。
[0052] 8、混匀后进行PCR扩增；
[0053] 9、PCR反应条件：
[0054] 预变性 5(TC 2min
[0055] 95 °C 15min
[0056] 扩增 94 °C 15s
[0057] 55°C 45s 40个循环，55°C时收集荧光
[0058] 10、扩增结束后观察扩增曲线。
[0059] 具体结果如图1所示，结果判断标准：如果出现待测基因的扩增反应曲线，且Ct值 小于38,则判断为阳性，如果38〈Ct〈40,判断为可疑，可疑加大模板量，重复扩增，如果得到 相同的实验结果，则判断为阳性，否则为阴性，如果Ct值为0或40,则判断为阴性。
[0060] 从图1可以看出，DNA抽提液、10、100、1000倍稀释的DNA抽提液都能扩增出反应 曲线，其Ct都小于38,判断为阳性，1000倍稀释的溶液中的DNA浓度为lOOcopies/ml。由 此，本发明的焚光检测引物的检测下限为l〇〇copies/ml。
[0061] 二、库蚊沃尔巴克氏体的灵敏度
[0062] 库蚊沃尔巴克氏体的灵敏度的实验流程同A型沃尔巴克氏体的灵敏度试验，只是 模板DNA换成库蚊沃尔巴克氏体的基因组DNA。
[0063] 具体结果如图2所示，结果判断标准：如果出现待测基因的扩增反应曲线，且Ct值 小于38,则判断为阳性，如果38〈Ct〈40,判断为可疑，